本發(fā)明涉及培養(yǎng)和分離分枝桿菌的方法。更特別地，本發(fā)明涉及可用于檢測(cè)、鑒別、分離和/或分析性研究分枝桿菌、例如存在于生物學(xué)標(biāo)本和樣品中的那些分枝桿菌的微生物學(xué)方法和培養(yǎng)基。
分枝桿菌屬于放線菌目(actinomycetales)，是直線或者有時(shí)略為彎曲形狀的細(xì)小桿菌。由于其具有脂質(zhì)富集的細(xì)胞壁限制染料滲透，因此難以通過(guò)常規(guī)技術(shù)和染料對(duì)分枝桿菌染色。然而，一旦染色，所述分枝桿菌的染色可以抵擋酸和醇二者的脫色。為此，其被描述為“酸-醇抗性”細(xì)菌。
根據(jù)一種基本分類法，根據(jù)兩種主要類別列出不同的分枝桿菌種。
第一個(gè)類別是歸并了嚴(yán)格病原性分枝桿菌，其寄生感染動(dòng)物和人類。這些分枝桿菌是造成結(jié)核(結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝桿菌(mycobacteriumbovis)、非洲分枝桿菌(mycobacteriumafricanum)、田鼠分枝桿菌(mycobacteriummicroti)和卡氏分枝桿菌(mycobacteriumcanetti))或者麻風(fēng)病(麻風(fēng)分枝桿菌(mycobacteriumleprae))的原因。
第二個(gè)類別歸并了腐生或共生分枝桿菌，其通常是非致病性的。由此使用的術(shù)語(yǔ)是“非典型”分枝桿菌或者“非結(jié)核性”分枝桿菌(ntm)。后者普遍存在于我們的環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)其散播于土壤、植物、灰塵、水和分配網(wǎng)絡(luò)、食物等中無(wú)處不在。一些非結(jié)核性分枝桿菌通常對(duì)人類無(wú)害，而在免疫抑制對(duì)象中可以導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染，主要影響肺、皮膚和淋巴系統(tǒng)。
因此，從臨床觀點(diǎn)及也從衛(wèi)生觀點(diǎn)出發(fā)，無(wú)論其是否是病原性或者非結(jié)核性的，分枝桿菌的檢測(cè)和/或鑒別是相當(dāng)重要的。早期及特異性檢測(cè)這些細(xì)菌使得可以提出關(guān)于治療性處理、衛(wèi)生消毒等的合適方案。就此而言存在各種技術(shù)，例如基因擴(kuò)增(通過(guò)pcr)特定的核酸序列、抗原的免疫檢測(cè)、質(zhì)譜分析、微生物檢測(cè)酶活性等。
無(wú)論其是什么，這些檢測(cè)/鑒別方法通常需要培養(yǎng)待分析樣品/標(biāo)本中可能存在的分枝桿菌，以獲得適于檢測(cè)其的量。無(wú)論其是什么，這些檢測(cè)/鑒別方法具有相同的障礙：分枝桿菌生長(zhǎng)(croissance)和發(fā)展(développement)緩慢。
事實(shí)上，與其它細(xì)菌、酵母和真菌相比，病原性和腐生性分枝桿菌特征均在于相對(duì)緩慢的生長(zhǎng)和發(fā)展。此外，在存在待研究的分枝桿菌的生物學(xué)樣品中，所述分枝桿菌很少被分離；其通常污染有生長(zhǎng)和發(fā)展快得多的伴隨菌群。由于細(xì)胞分裂周期進(jìn)展，樣品中分枝桿菌的比例降低，由此增加了能觀測(cè)和鑒別其的難度。
為了克服這種生長(zhǎng)和發(fā)展緩慢和/或其污染其它微生物的問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了對(duì)于分枝桿菌或者對(duì)于分枝桿菌特定種具有或多或少選擇性的許多富集培養(yǎng)基和肉湯。
在最常用的這些中，
相似組成的coletsos瓊脂培養(yǎng)基另外含有丙酮酸和谷氨酸、向日葵藍(lán)(bleudetournesol)和明膠。
最近出現(xiàn)的middlebrook7h9、7h10和7h11培養(yǎng)基是半合成培養(yǎng)基，其具有基于氨基酸、脂肪酸、丙酮酸和礦物質(zhì)鹽的營(yíng)養(yǎng)成分。這些培養(yǎng)基還含有過(guò)氧化氫酶和牛白蛋白(級(jí)分v)，其為分枝桿菌提供對(duì)抗可能存在于生物學(xué)樣品和標(biāo)本中的各種有害物質(zhì)(特別是毒性過(guò)氧化物)的保護(hù)作用。middlebrook7h10培養(yǎng)基存在孔雀石綠而與middlebrook7h9培養(yǎng)基不同。middlebrook7h11培養(yǎng)基與middlebrook7h10培養(yǎng)基不同在于其富集胰腺酪蛋白胨。也設(shè)計(jì)了這三種middlebrook培養(yǎng)基的許多變化方式以增加其對(duì)于分枝桿菌的選擇性，例如向其中加入如下選擇劑：多粘菌素、兩性霉素b、萘啶酸、甲氧芐啶、阿洛西林和萬(wàn)古霉素。
最后，最初為了培養(yǎng)和檢測(cè)洋蔥伯克霍爾德菌(burkholderiacepacian)而開(kāi)發(fā)的bcsa(洋蔥伯克霍爾德氏菌(burkholderiacepacia)選擇性瓊脂)培養(yǎng)基已經(jīng)被描述為特別適于分枝桿菌的發(fā)展與生長(zhǎng)，更特別是“快速生長(zhǎng)”分枝桿菌(estheretal.–journalofclinicalmicrobiology；2011,1421-1425)。這是從包含酪蛋白胨、糖(乳糖和蔗糖)、酵母提取物和選擇劑如慶大霉素、萬(wàn)古霉素、結(jié)晶紫和多粘菌素b的營(yíng)養(yǎng)成分配制的瓊脂培養(yǎng)基。
本發(fā)明旨在改良用于檢測(cè)、鑒別和/或分離生物學(xué)樣品中存在的分枝桿菌的方法和技術(shù)。為此，本發(fā)明旨在改良用于這些方法和技術(shù)中的富集肉湯和培養(yǎng)基的繁殖力及其對(duì)于分枝桿菌的選擇性這兩個(gè)方面。同樣，本發(fā)明旨在提供新的富集肉湯和/培養(yǎng)基成分，能允許分枝桿菌的培養(yǎng)和增殖，且在繁殖力和/或?qū)τ诜种U菌的選擇性方面具有改良的性能水平。
在陳述本發(fā)明之前，給出如下定義以更好地理解本發(fā)明。
術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”是指包含新陳代謝的表達(dá)和/或微生物生長(zhǎng)所需的所有元素的基質(zhì)。培養(yǎng)基可以是固體、半固體或者液體。術(shù)語(yǔ)“固體基質(zhì)”是指例如膠凝的基質(zhì)或者凝固的基質(zhì)。瓊脂在培養(yǎng)微生物的微生物學(xué)中是常規(guī)的膠凝劑，但是也可以是使用明膠、瓊脂糖或者其它天然或人工膠凝劑。
術(shù)語(yǔ)“富集肉湯”更特別是指液體培養(yǎng)基。
當(dāng)培養(yǎng)基成分僅包含被培養(yǎng)的微生物的生長(zhǎng)和增殖嚴(yán)格要求的化學(xué)元素時(shí)，該培養(yǎng)基被描述為基本培養(yǎng)基。如下是在其中常見(jiàn)的：
-水(通常是蒸餾水或者去離子水)；
-營(yíng)養(yǎng)成分，通常包含：
-基于碳的能量來(lái)源(通常是葡萄糖)；
-鈣源(例如cacl2)；
-氮源(例如(nh4)2so4)；
-硫源(例如(nh4)2so4)；
-鎂源(例如mgcl2)；
-鐵源(例如檸檬酸鐵)；
-微量元素來(lái)源(例如cu、zn、co、ni、b、ti的鹽)；
-任選將培養(yǎng)基維持在合適ph的ph緩沖劑；及
對(duì)于固體或半固體培養(yǎng)基而言任選存在的膠凝劑(例如瓊脂、明膠或瓊脂糖)。
加入特定生長(zhǎng)因子和/或不同營(yíng)養(yǎng)素使得可以加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)成分的特性及增加培養(yǎng)基的繁殖能力。然后使用術(shù)語(yǔ)“富集的”培養(yǎng)基?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)限定的化合物或組合物、或者通過(guò)復(fù)雜組合物(例如新鮮血液、血清、酵母提取物、全蛋、卵黃、蛋白胨等)進(jìn)行加入這些生長(zhǎng)因子和/或這些營(yíng)養(yǎng)素。
當(dāng)培養(yǎng)基包含使得所述培養(yǎng)基促進(jìn)不是伴隨菌群的靶向微生物或者靶微生物群的生長(zhǎng)的至少一種選擇劑時(shí)，稱之為是選擇性的。這些選擇劑基本是具有抗生素和/或抗真菌作用的化合物，其具有毒性特異性(對(duì)于靶微生物比對(duì)于伴隨菌群的毒性更低)。
術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品”是指來(lái)自人或動(dòng)物來(lái)源標(biāo)本的臨床樣品，或者來(lái)自任何類型食物的食物樣品。這種生物學(xué)樣品可以是液體或固體，非限制性地可以提及的是臨床血液、血漿、尿液或糞便樣品，或者鼻、咽喉、皮膚、傷口、腦脊液、支氣管肺泡液或者咳出樣品，來(lái)自水、飲料如奶或果汁、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚(yú)等的食物樣品，得自動(dòng)物飼料的食物樣品，如特別是得自動(dòng)物膳食的樣品。為了簡(jiǎn)便詞匯使用，“生物學(xué)樣品”與“生物學(xué)標(biāo)本”的表述無(wú)差別。
本發(fā)明因此涉及富集和選擇性培養(yǎng)生物學(xué)樣品中包含的分枝桿菌的方法，其中將全部或部分所述樣品接種于包含適于分枝桿菌發(fā)展和生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基之中/之上，特征在于所述培養(yǎng)基還包含作為選擇劑的至少9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氫-10-苯基吖啶氫氯化物及能抑制銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)的物質(zhì)。
本發(fā)明基于將9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氫-10-苯基吖啶摻入預(yù)計(jì)培養(yǎng)分枝桿菌的培養(yǎng)基組成成分中以增加所述培養(yǎng)基對(duì)于分枝桿菌的選擇性的一般原理。也已知這種選擇劑的通用名稱是c-390(cas77769-31-4)。迄今為止基本用于銅綠假單胞菌的選擇性培養(yǎng)(us4263398和campbelletal.–journalofclinicalmicrobiology；1988,1910-1912)或者洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合物的基因型的分離的目的(vermisetal.,–systematicandappliedmicrobiology；2003(26)595-600)，本發(fā)明人證實(shí)在培養(yǎng)基中使用這種化合物也可以獲得分枝桿菌的良好分離及伴隨菌群的良好消除，特別是屬于如下菌屬的微生物：假單胞菌屬(pseudomonas)、腸桿菌科(enterobacteriaceae)、鏈球菌屬(streptococcus)、伯克霍爾德氏菌屬(burkholderia)、狹長(zhǎng)平胞屬(stenotrophomonas)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、腸球菌屬(enterococcus)、無(wú)色桿菌屬(achromobacter)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、pandoraea、芽孢桿菌屬(bacillus)、elizabethkingiamiricola、嗜血菌屬(haemophilus)、摩拉克氏菌屬(moraxella)、奈瑟氏菌屬(neisseria)、曲霉菌屬(aspergillus)、絲孢菌屬(scedosporium)、念珠菌屬(candida)和geosmithia。
本發(fā)明人還注意到c-390還賦予培養(yǎng)基輕微的附加藍(lán)色，其可顯著改良在這些培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顯示及目視檢測(cè)。
有利地及根據(jù)本發(fā)明，用于進(jìn)行本發(fā)明的富集和選擇性培養(yǎng)過(guò)程的培養(yǎng)基的c-390濃度為2mg/l-1000mg/l，優(yōu)選為大約4mg/l-大約256mg/l、更優(yōu)選為大約8mg/l-大約128mg/l。
能抑制銅綠假單胞菌的物質(zhì)可以特別提及的例子由甲磺酸多粘菌素e、磷霉素、萘啶酸、氨曲南、頭孢磺啶和mangrolidea組成。
有利地及根據(jù)本發(fā)明，在所述培養(yǎng)基中還可以使用能抑制洋蔥伯克霍爾德菌的物質(zhì)，優(yōu)選選自磷霉素、氨曲南和mangrolidea的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基還包含選自如下的至少一種另外的選擇劑：
-兩性霉素b，特別是濃度優(yōu)選為1mg/l-200mg/l，更優(yōu)選為2mg/l-50mg/l；
-萘啶酸，特別是濃度優(yōu)選為5mg/l-200mg/l，更優(yōu)選為15mg/l-100mg/l；
-萬(wàn)古霉素，特別是濃度優(yōu)選為1mg/l-50mg/l，更優(yōu)選為2mg/l-20mg/l；
-甲磺酸多粘菌素e，特別是濃度優(yōu)選為10mg/l-200mg/l，更優(yōu)選為15mg/l-150mg/l；
-磷霉素，特別是濃度優(yōu)選為100mg/l-3000mg/l，更優(yōu)選為200mg/l-2000mg/l；及
-孔雀石綠，特別是濃度優(yōu)選為0.05mg/l-2mg/l，更優(yōu)選為0.2mg/l-1mg/l。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，所述培養(yǎng)基包含作為另外的選擇劑的如下物質(zhì)：
-兩性霉素b，濃度為2mg/l-50mg/l，
-甲磺酸多粘菌素e，濃度為15mg/l-150mg/l，
-磷霉素，濃度為200mg/l-2000mg/l。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，除了磷霉素之外，所述培養(yǎng)基還有利地包含葡萄糖-6-磷酸，特別是濃度優(yōu)選為10mg/l-50mg/l。
根據(jù)一個(gè)特定方面，本發(fā)明旨在改良目前使用的培養(yǎng)和/或分離分枝桿菌的方法，通過(guò)干預(yù)常用培養(yǎng)基(如middlebrook培養(yǎng)基、
在這方面，本發(fā)明的富集和選擇性培養(yǎng)分枝桿菌的方法有利地使用其營(yíng)養(yǎng)成分再現(xiàn)選自如下培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基進(jìn)行：
-middlebrook培養(yǎng)基(特別是middlebrook培養(yǎng)基7h9、7h10和7h11之一)，任選補(bǔ)加了甘油和/或oadc補(bǔ)充劑；
-
-columbia培養(yǎng)基，任選補(bǔ)加oadc補(bǔ)充劑和/或新鮮血液，特別是馬血；及
-bcsa培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選方面，本發(fā)明的富集和選擇性培養(yǎng)分枝桿菌的方法使用包含再現(xiàn)middlebrook培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基進(jìn)行，補(bǔ)加：
-甘油，特別是濃度優(yōu)選為2ml/l-20ml/l，
-oadc補(bǔ)充劑，特別是濃度優(yōu)選為50ml/l-200ml/l，及任選
-一或多種選自如下的營(yíng)養(yǎng)素：新鮮血液、酵母提取物、α酮戊二酸、酪蛋白、丙酮酸、蛋白胨、莧菜紅、卵黃、rna、聚氧化乙烯硬脂酸酯和泰洛沙泊。
有利地及根據(jù)本發(fā)明，所述oadc補(bǔ)充劑是水相組合物，包含50g/l牛白蛋白、20g/l葡萄糖、0.04g/l過(guò)氧化氫酶和0.5g/l油酸。
有利地及根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明的富集和選擇性培養(yǎng)分枝桿菌的方法使用包含再現(xiàn)middlebrook培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基進(jìn)行，補(bǔ)加：
-甘油，特別是濃度優(yōu)選為2ml/l-20ml/l，
-oadc補(bǔ)充劑，特別是濃度優(yōu)選為50ml/l-200ml/l，及
-酵母提取物，特別是濃度優(yōu)選為0.1g/l-20g/l。
有利地及根據(jù)本發(fā)明，所述方法更特別適于富集和選擇性培養(yǎng)屬于如下菌種的分枝桿菌：膿腫分枝桿菌(m.abscessus)、m.bolletii、m.massiliense、龜分枝桿菌(m.chelonae)、m.immunogenum、m.salmoniphilum、鳥(niǎo)分枝桿菌(m.avium)、結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌(m.intracellulare)、瑪爾摩分枝桿菌(m.malmoense)、戈登分枝桿菌(m.gordonae)、堪薩斯分枝桿菌(m.kansasii)和偶發(fā)分枝桿菌(m.fortuitum)。
有利地及根據(jù)本發(fā)明，在所述培養(yǎng)基上發(fā)展的分枝桿菌的菌落使用特異于待檢測(cè)的分枝桿菌表達(dá)的酶活性的生色和/或熒光合成底物目測(cè)定位。為此，可以提及的是4-甲基傘形基-β-d-葡糖苷，其可以標(biāo)記表達(dá)β-葡糖苷酶活性的菌落。
本發(fā)明還擴(kuò)展至適于進(jìn)行本發(fā)明的富集和選擇性培養(yǎng)分枝桿菌的方法的培養(yǎng)基。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含適于分枝桿菌發(fā)展和生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分，特征在于其還包含作為選擇劑的9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氫-10-苯基吖啶氫氯化物及能抑制銅綠假單胞菌的物質(zhì)。
根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基不含結(jié)晶紫。
有利地及根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基包含適于分枝桿菌發(fā)展和生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分，及作為選擇劑的9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氫-10-苯基吖啶氫氯化物以及能抑制銅綠假單胞菌的物質(zhì)。所述培養(yǎng)基特征還在于如下所有或一些技術(shù)特征：
-c-390濃度為2mg/l-1000mg/l，優(yōu)選為大約4mg/l-大約256mg/l，更優(yōu)選為大約8mg/l-大約128mg/l；
-所述培養(yǎng)基包含至少一種另外的選擇劑(除了c-390及選擇用于抑制銅綠假單胞菌的物質(zhì)之外)，選自：
-兩性霉素b，特別是濃度優(yōu)選為1mg/l-200mg/l，更優(yōu)選為2mg/l-50mg/l；
-萘啶酸，特別是濃度優(yōu)選為5mg/l-200mg/l，更優(yōu)選為15mg/l-100mg/l；
-萬(wàn)古霉素，特別是濃度優(yōu)選為1mg/l-50mg/l，更優(yōu)選為2mg/l-20mg/l；
-甲磺酸多粘菌素e，特別是濃度優(yōu)選為10mg/l-200mg/l，更優(yōu)選為15mg/l-150mg/l；及
-磷霉素，特別是濃度優(yōu)選為100mg/l-3000mg/l，更優(yōu)選為200mg/l-2000mg/l，及任選存在的葡萄糖-6-磷酸，特別是濃度優(yōu)選為10mg/l-50mg/l；
-所述培養(yǎng)基包含作為另外的選擇劑的如下物質(zhì)：
-兩性霉素b，濃度為2mg/l-50mg/l；
-甲磺酸多粘菌素e，濃度為15mg/l-150mg/l；
-磷霉素，濃度為200mg/l-2000mg/l，及葡萄糖-6-磷酸，特別是濃度優(yōu)選為10mg/l-50mg/l；
-所述培養(yǎng)基包含再現(xiàn)選自如下培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分的營(yíng)養(yǎng)成分：
-middlebrook培養(yǎng)基，任選補(bǔ)加甘油和/或oadc補(bǔ)充劑；
-
-columbia培養(yǎng)基，任選補(bǔ)加oadc補(bǔ)充劑和/或新鮮血液，特別是馬血；及
-bcsa培養(yǎng)基；
-所述培養(yǎng)基包含再現(xiàn)middlebrook培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分的營(yíng)養(yǎng)成分，補(bǔ)加：
-甘油，特別是濃度優(yōu)選為2ml/l-20ml/l，
-oadc補(bǔ)充劑，特別是濃度優(yōu)選為50ml/l-200ml/l，及任選
-選自如下的一或多種營(yíng)養(yǎng)素：新鮮血液，酵母提取物，α酮戊二酸，酪蛋白，丙酮酸，蛋白胨，莧菜紅，卵黃，rna，聚氧化乙烯硬脂酸酯和泰洛沙泊。
有利地，本發(fā)明涉及包含由middlebrook7h9培養(yǎng)基組成的營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，補(bǔ)加：
-甘油，濃度為2ml/l-20ml/l，
-oadc補(bǔ)充劑，濃度為50ml/l-200ml/l，及
-酵母提取物，濃度為0.1g/l-20g/l；
及包含作為選擇劑的如下物質(zhì)：
-c-390，濃度為2mg/l-50mg/l，
-兩性霉素b，濃度為2mg/l-50mg/l，
-甲磺酸多粘菌素e，濃度為15mg/l-150mg/l，
-磷霉素，濃度為200mg/l-2000mg/l，連同葡萄糖-6-磷酸，濃度為10mg/l-50mg/l。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)有利的實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基的成分可包含能允許檢測(cè)和/或目視鑒別在所述培養(yǎng)基中或之上發(fā)展的分枝桿菌的一或多個(gè)標(biāo)記。其可特別是具有生色和/或熒光性質(zhì)的合成的酶底物。
本發(fā)明還涉及富集和選擇性培養(yǎng)分枝桿菌的方法、過(guò)程，涉及c-390在培養(yǎng)和/或分離分枝桿菌中的應(yīng)用，及涉及特征在于上述和下述全部或一些技術(shù)特征的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢(shì)根據(jù)如下實(shí)施例的描述將顯現(xiàn)，所述實(shí)施例的目的是便于理解本發(fā)明及其應(yīng)用。這些實(shí)施例只是闡述本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例：本發(fā)明的選擇性培養(yǎng)基的產(chǎn)生和評(píng)估
1/-選擇培養(yǎng)分枝桿菌的“基本”成分
檢測(cè)從文獻(xiàn)中已知能繁殖分枝桿菌的培養(yǎng)基的各個(gè)成分并對(duì)比其使得分枝桿菌生長(zhǎng)的能力。一些成分是預(yù)先富集的。檢測(cè)的培養(yǎng)基如下所示：
-培養(yǎng)基a：middlebrook瓊脂，
-培養(yǎng)基b：middlebrook瓊脂，富含甘油(4ml/l)，
-培養(yǎng)基c：middlebrook瓊脂，具有tween80(1g/l)，
-培養(yǎng)基d：middlebrook瓊脂，富含甘油(4ml/l)和oadc補(bǔ)充劑(100ml/l)，
-培養(yǎng)基e：middlebrook瓊脂，補(bǔ)加/富含tween80和oadc補(bǔ)充劑，
-培養(yǎng)基f：columbia瓊脂(oxoid)，
-培養(yǎng)基g：columbia瓊脂(oxoid)，富含oadc補(bǔ)充劑，
-培養(yǎng)基h：columbia瓊脂，具有血液，
-培養(yǎng)基i：bcsa培養(yǎng)基(biomérieux,france)。
a)培養(yǎng)基a-e的制備
從由10倍濃縮的middlebrook7h9培養(yǎng)肉湯(10×middlebrook7h9)組成的原液制備培養(yǎng)基a-e，具有如下成分：
硫酸銨(5g/l)，
l-谷氨酸(5g/l)，
磷酸二鈉(25g/l)，
磷酸一鉀(10g/l)，
檸檬酸鈉(1g/l)，
硫酸鎂(0.5g/l)，
氯化鈣(0.005g/l)，
硫酸鋅(0.01g/l)，
硫酸銅(0.01g/l)，
檸檬酸鐵銨(0.4g/l)，
吡多辛(0.01g/l)，及
生物素(0.005g/l)。
將這個(gè)肉湯的ph調(diào)節(jié)為6.6±0.2。然后將肉湯在116℃高壓滅菌10分鐘。將其貯存在冰箱中直至使用。
為了獲得培養(yǎng)基a，將50ml肉湯加入450ml去離子水中。將5g細(xì)菌學(xué)瓊脂加入整個(gè)混合物中以獲得middlebrook瓊脂。然后將整個(gè)混合物在116℃高壓滅菌10分鐘。
與制備培養(yǎng)基a相似地制備培養(yǎng)基b、c、d和e，其另外含有：
-甘油(4ml/l)，及任選存在的基于油酸、白蛋白、葡萄糖和過(guò)氧化氫酶的補(bǔ)充劑(oadc補(bǔ)充劑，100ml/l)，
或者：
-tween80(1g/l)及任選存在的oadc補(bǔ)充劑(100ml/l)。
b)培養(yǎng)基f-i
培養(yǎng)基f、h和i是可商購(gòu)的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基g與培養(yǎng)基f相似制備，另外含有oadc補(bǔ)充劑(100ml/l)。
c)評(píng)估培養(yǎng)基a-i關(guān)于分枝桿菌的繁殖力
利用如下20個(gè)分枝桿菌菌株評(píng)估a-i每一培養(yǎng)基的繁殖力：
12株膿腫分枝桿菌菌株
3株mycobacteriumbolletii菌株，
5株mycobacteriummassiliense菌株。
將最初在-20℃貯存在甘油中的這些菌株首先在具有馬血(5％)的columbia瓊脂上解凍并培養(yǎng)。然后將每株菌株懸浮于1ml鹽水溶液(0.85％)中直至其達(dá)到等于mcfarland0.5標(biāo)準(zhǔn)的濁度(等于大約1.5×108cfu/ml)。
對(duì)于具有凝集傾向的分枝桿菌，將細(xì)胞在含有3個(gè)直徑為3mm的玻璃珠的試管中渦旋分散10分鐘。
將1μl等份的每一分枝桿菌懸浮液接種于每一待評(píng)估的培養(yǎng)基上，鋪板以獲得分離的菌落。將培養(yǎng)物在30℃保溫。觀察7天菌落的生長(zhǎng)。
獲得的結(jié)果在下表1中示出。
表1
2/-評(píng)估各種營(yíng)養(yǎng)素對(duì)于分枝桿菌生長(zhǎng)的作用
基于先前檢測(cè)的培養(yǎng)基d的配方，評(píng)估各種營(yíng)養(yǎng)素對(duì)于分枝桿菌培養(yǎng)的作用：活性炭、馬血、酵母提取物、α酮戊二酸、酪蛋白、丙酮酸、蛋白胨、莧菜紅、卵黃乳狀液、rna(sigma,ref.r6625-25g)、聚氧化乙烯硬脂酸酯、泰洛沙泊。
以與制備培養(yǎng)基d極為相似的方式，制備如下培養(yǎng)基(標(biāo)示為j-v)：
-培養(yǎng)基j：培養(yǎng)基d+活性炭(2g/l)，
-培養(yǎng)基k：培養(yǎng)基d+5％馬血(50ml/l)，
-培養(yǎng)基l：培養(yǎng)基d+酵母提取物(4g/l)，
-培養(yǎng)基m：培養(yǎng)基d+α酮戊二酸(15g/l)，
-培養(yǎng)基n：培養(yǎng)基d+酪蛋白(1g/l)，
-培養(yǎng)基o：培養(yǎng)基d+丙酮酸鈉(7g/l)，
-培養(yǎng)基p：培養(yǎng)基d+蛋白胨(10g/l)，
-培養(yǎng)基k：培養(yǎng)基d+莧菜紅(0.04g/l)，
-培養(yǎng)基r：培養(yǎng)基d+卵黃乳狀液(33ml/l)，
-培養(yǎng)基s：培養(yǎng)基d+rna(0.05g/l)，
-培養(yǎng)基t：培養(yǎng)基d+聚氧化乙烯硬脂酸酯(0.1g/l)，
-培養(yǎng)基u：培養(yǎng)基d+泰洛沙泊(5ml/l)，
-培養(yǎng)基v：培養(yǎng)基d+卵黃乳狀液(33ml/l)+活性炭(4g/l)。
這些培養(yǎng)基的繁殖力通過(guò)使用在先前描述的檢測(cè)中使用的相同的20株分枝桿菌菌株評(píng)估，及在接種之前相同處理。
將培養(yǎng)物在30℃保溫。監(jiān)測(cè)7天菌落的生長(zhǎng)。下表2示出在培養(yǎng)第3天和第7天的觀測(cè)結(jié)果。
表2
3/-評(píng)估對(duì)于分枝桿菌具有選擇性的各種物質(zhì)的作用
基于先前開(kāi)發(fā)和檢測(cè)的培養(yǎng)基l的配方，評(píng)估不同濃度的各種選擇劑對(duì)于分枝桿菌的選擇性水平的作用：兩性霉素b(抗真菌劑)，萘啶酸，萬(wàn)古霉素，甲磺酸多粘菌素e，c-390(biosynth,switzerland)，磷霉素及孔雀石綠。
下表3示出對(duì)先前所述檢測(cè)中使用的20株分枝桿菌菌株及對(duì)于不屬于分枝桿菌屬的95株微生物菌株在保溫7天后進(jìn)行的這個(gè)評(píng)估結(jié)果。所述95株菌株是：
-50株銅綠假單胞菌菌株，
-10株其它非發(fā)酵性細(xì)菌菌株：
-1株氧化木糖無(wú)色桿菌(achromobacterxylosoxidans)菌株，
-1株不動(dòng)桿菌屬(acinetobactersp.)菌株，
-1株多噬伯克霍爾德氏菌(burkholderiamultivorans)菌株，
-1株burkholderiacenocepacia菌株，
-1株洋蔥伯克霍爾德氏菌菌株，
-1株污染伯克霍爾德氏菌(burkholderiacontaminans)菌株，
-1株pandoraeaapista菌株，
-1株pandoraeapnomenusa菌株，
-2株嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)菌株，
-7株腸桿菌菌株：
-1株大腸桿菌(escherichiacoli)菌株，
-1株肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)菌株，
-1株providentiarettgeri菌株，
-1株陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)菌株，
-1株產(chǎn)氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)菌株，
-1株粘質(zhì)沙雷菌(serratiamarcescens)菌株，
-1株弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)菌株，
-10株革蘭氏陽(yáng)性菌菌株：
-2株金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)菌株，
-1株表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)菌株，
-1株釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)菌株，
-1株肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)菌株，
-1株唾液鏈球菌(streptococcussalivarius)菌株，
-1株格氏鏈球菌(streptococcusgordonii)菌株，
-1株屎腸球菌(enterococcusfaecium)菌株，
-1株糞腸球菌(enterococcusfaecalis)菌株，及
-1株枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)菌株。
-8株真菌/酵母株：
-1株白色念珠菌(candidaalbicans)菌株，
-1株光滑念珠菌(candidaglabrata)菌株，
-2株煙曲霉菌(aspergillusfumigatus)菌株，
-1株土曲霉(aspergillusterreus)菌株，
-1株尖端賽多孢子菌(scedosporiumapiospermum)菌株,
-1株scedosporiumprolificans菌株，
-1株rasamsonia(geosmithia)argillacea菌株。
在這個(gè)表3中，結(jié)果以在培養(yǎng)7天后在討論的培養(yǎng)基上示出生長(zhǎng)的菌株的數(shù)目和百分比表示。符號(hào)ns和nt分別是指“不顯著”(兩性霉素b對(duì)細(xì)菌的抑制作用)和“未檢測(cè)”(抗細(xì)菌劑對(duì)于酵母和真菌的作用)。
表3
4/-優(yōu)化本發(fā)明的分枝桿菌選擇性培養(yǎng)基
根據(jù)前文數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)兩個(gè)進(jìn)一步的選擇性培養(yǎng)基，稱作培養(yǎng)基w和培養(yǎng)基x。這些培養(yǎng)基根據(jù)培養(yǎng)基l的成分開(kāi)發(fā)，l是如前所述富集培養(yǎng)基，其中加入了特定的選擇劑組合。所述選擇性培養(yǎng)基的組成如下所述：
-培養(yǎng)基w：培養(yǎng)基l+甲磺酸多粘菌素e(32mg/l)
+磷霉素(400mg/l)+葡萄糖-6-磷酸(25mg/l)
+兩性霉素b(5mg/l)
-培養(yǎng)基x：培養(yǎng)基l+甲磺酸多粘菌素e(32mg/l)
+磷霉素(400mg/l)+葡萄糖-6-磷酸(25mg/l)
+兩性霉素b(5mg/l)
+c-390(32mg/l)。
在188株微生物檢測(cè)這兩個(gè)培養(yǎng)基：
-98株非結(jié)核性分枝桿菌：
-52株膿腫分枝桿菌，
-3株mycobacteriumbolletii，
-34株龜分枝桿菌，
-1株mycobacteriumimmunogenum，
-6株mycobacteriummassiliense，
-2株mycobacteriumsalmoniphilum，
-94株不屬于分枝桿菌屬的微生物：
-54株銅綠假單胞菌，
-15株其它非發(fā)酵性細(xì)菌：
-1株無(wú)色桿菌(achromobacter)sp1菌株,
-1株氧化木糖無(wú)色桿菌,
-1株不動(dòng)桿菌屬菌株,
-1株鮑氏不動(dòng)桿菌(acinetobacterbaumannii),
-1株洋蔥伯克霍爾德氏菌,
-1株污染伯克霍爾德氏菌,
-1株多噬伯克霍爾德氏菌,
-1株burkholderiastabilis,
-1株elizabethkingiamiricola,
-1株pandoraeaapista,
-1株pandoraeapnomenusa,
-4株嗜麥芽窄食單胞菌,
-7株腸桿菌(與先前提及的那些相同),
-10株革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(與先前提及的那些相同)，
-8株真菌/酵母菌株(與先前提及的那些相同)。
在這株表4中，結(jié)果以在討論的培養(yǎng)基上在培養(yǎng)7天后示出生長(zhǎng)的菌株的數(shù)目和百分比表示。
表4
5/-校驗(yàn)培養(yǎng)和選擇結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基x的組成
基于上述培養(yǎng)基x的組成，配制液態(tài)選擇性培養(yǎng)基。測(cè)試這種液態(tài)培養(yǎng)基x(無(wú)瓊脂)在分析源自未患有囊性纖維化的32名患者及患有囊性纖維化的56名患者的痰液樣品的情況中檢測(cè)分枝桿菌、特別是結(jié)核分枝桿菌。
為此，使用
這種試劑的組成相應(yīng)于middlebrook7h9培養(yǎng)基，補(bǔ)加了油酸、甘油、牛血清白蛋白、莧菜紅和抗生素混合物(兩性霉素b、阿洛西林、萘啶酸、多粘菌素b、甲氧芐啶和萬(wàn)古霉素)。
通過(guò)在顯微鏡下檢驗(yàn)及金胺染色，在從未患有囊性纖維化的患者收集的32個(gè)痰液樣品中證實(shí)存在酸-醇抗性桿菌。在將其接種于含有
至于從患者囊性纖維化的患者收集的56個(gè)樣品，對(duì)其進(jìn)行兩個(gè)不同的去污染方案，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)british方法用酸處理及用氫氧化鈉處理，之后接種于
-56個(gè)含有
-56個(gè)含有
-56個(gè)含有肉湯x的培養(yǎng)瓶，其中接種用酸預(yù)處理的樣品，
-56個(gè)含有肉湯x的培養(yǎng)瓶，其中接種用氫氧化鈉預(yù)處理的樣品。
這些各種培養(yǎng)的結(jié)果在下表5、6和7中示出。
表5和6示出關(guān)于在樣品(分別從未患有囊性纖維化患者和患有囊性纖維化患者收集)中鑒別的分枝桿菌的性質(zhì)及在其中檢測(cè)出其的培養(yǎng)瓶數(shù)目的信息。
表7示出檢測(cè)和鑒別的每一分枝桿菌菌種的平均檢測(cè)時(shí)間(天)，作為使用的培養(yǎng)基的函數(shù)。
表5
表6
表7
總之，從88個(gè)最初標(biāo)本中回收39株分枝桿菌分離株。使用
6/-本發(fā)明的選擇性培養(yǎng)基-培養(yǎng)基y-的制備和驗(yàn)證
a)培養(yǎng)基y的組成和制備
培養(yǎng)基y的組成如下所示(大約1600ml組合物)：
馬鈴薯淀粉(30g)，
天冬酰胺(3.6g)，
磷酸一鉀(2.4g)，
檸檬酸鎂(0.6g)，
硫酸鎂(0.24g)，
全蛋勻漿(1l)，
甘油(12ml)，及
c-390(51.2mg)。
這種組成相應(yīng)于
b)培養(yǎng)基y對(duì)于分枝桿菌的繁殖力和選擇性的評(píng)估概況
檢測(cè)在斜管中配制的培養(yǎng)基y對(duì)不同的細(xì)菌菌株的培養(yǎng)：
1株偶發(fā)分枝桿菌菌株(在0.5mcfarland校準(zhǔn)的接種物并稀釋為1/10,000),
4株金黃色葡萄球菌菌株(在0.5mcfarland校準(zhǔn)的接種物并稀釋為1/100)，及
3株銅綠假單胞菌菌株(在0.5mcfarland校準(zhǔn)的接種物并稀釋為1/100)。
這些菌株在37℃保溫，一天天生長(zhǎng)。獲得的結(jié)果在下表8中示出，以斜面覆蓋百分比表示。
第一個(gè)檢測(cè)的結(jié)果與使用基于middlebrook組成配制的培養(yǎng)基x的結(jié)果相對(duì)一致，即：分枝桿菌菌株良好生長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌菌株全部抑制，及對(duì)于銅綠假單胞菌菌株具有不同選擇性的部分抑制。
表8
還檢測(cè)在斜管中配制的培養(yǎng)基y對(duì)緩慢生長(zhǎng)的分枝桿菌菌株的培養(yǎng)：
-1株結(jié)核分枝桿菌，
-1株牛分枝桿菌，及
-1株戈登分枝桿菌。
使用在0.5mcfarland校準(zhǔn)并稀釋為1/10,000的接種物進(jìn)行這些檢測(cè)。
獲得的結(jié)果在下表9中示出，以斜面覆蓋百分比表示，并與在
表9
7/-補(bǔ)充數(shù)據(jù)：各個(gè)細(xì)菌和各個(gè)真菌菌種對(duì)于c-390的敏感性
進(jìn)行能感染呼吸道的各個(gè)微生物對(duì)于c-390敏感性的評(píng)估。這個(gè)評(píng)估使用實(shí)施例4的含有不同濃度c-390的培養(yǎng)基w進(jìn)行。下表10示出關(guān)于作為培養(yǎng)基中c-390濃度的函數(shù)而檢測(cè)的菌株生長(zhǎng)強(qiáng)度收集的觀測(cè)結(jié)果?？s寫(xiě)ng(無(wú)生長(zhǎng))和tr(微量)表示觀測(cè)到無(wú)生長(zhǎng)或者僅極少非常不顯著的量。