相關(guān)申請的交叉引用本申請主張2014年10月20日提交的第62/066,277號和2015年1月15日提交的第62/104,008號美國臨時專利申請案的優(yōu)先權(quán)，該美國臨時專利申請案各自的整體內(nèi)容通過引用而并入本文。
背景技術(shù)：
：埃博拉病毒造成出血熱，且被感染人類的四萬率高達50％至90％。埃博拉病毒(ebov)包括四種類型，扎伊爾型埃博拉(zaireebov)、蘇丹型埃博拉(sudanebov)、科特迪瓦型埃博拉(ivorycoastebov)和萊斯頓型埃博拉(restonebov)。人類感染埃博拉病毒典型為接觸感染埃博拉病毒的患者的被污染的血液、組織、及/或排泄物所致?；颊叩湫驮诟腥景２├《?至10天后顯現(xiàn)癥候。如此長的病毒潛伏期提供了病毒在攜帶者顯示任何患病跡象之前被攜帶至新地區(qū)的機會。埃博拉病毒感染的癥候包括發(fā)熱、發(fā)冷、精神萎靡和肌痛。由于多種病癥均顯示這些癥候，在埃博拉病毒感染的早期，存在極大的誤診風(fēng)險，從而促進疾病傳播。在晚期，感染埃博拉病毒的個體典型發(fā)展為嘔吐、腹瀉、咳嗽、血管癥候、頭痛、神志不清、昏迷、黏膜出血、血性腹瀉、最后器官衰竭，導(dǎo)致死亡。感染埃博拉病毒的患者的體液和埃博拉病毒致死的患者的尸體具有同樣的高度感染性。隨著2014年末西非的埃博拉病毒感染人數(shù)預(yù)計將為每周10,000人，對于埃博拉感染的公共衛(wèi)生關(guān)注逐漸增加。由于醫(yī)護人員與埃博拉病毒感染患者的體液有接觸，因此他們具有被來自埃博拉病毒感染患者的埃博拉病毒感染的風(fēng)險。隨著接觸程度和頻率的增加，感染的風(fēng)險也增加。在1976的蘇丹型埃博拉爆發(fā)中，81％的護理埃博拉患者的醫(yī)護人員被該病毒感染。為了醫(yī)護人員和衛(wèi)生保健工作者避免不必要的感染，埃博拉病毒的早期檢測是關(guān)鍵，因此，創(chuàng)建了適宜的感染控制措施并最小化傳播風(fēng)險。為了停止埃博拉病毒在西非和全球的傳播，快速診斷必不可少，因此，被感染的個體可立即隔離，并對護理這些個體的衛(wèi)生保健工作者使用適當(dāng)?shù)姆雷o設(shè)備。在患病過程中，高效價的傳染性線狀病毒存在在血液和組織中。目前，通過病毒分離、逆轉(zhuǎn)錄-pcr(rt-pcr)包括實時定量rt-pcr、抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附檢驗(elisa)、通過免疫染色的抗原檢測、以及使用真實病毒抗原的igg-elisa和igm-elisa來鑒別埃博拉病毒。不幸的是，因為這些測試只能對經(jīng)純化且分離的rna進行測試，這些設(shè)備耗時且需要使用實驗室設(shè)備及受訓(xùn)過的工作人員，而埃博拉病毒爆發(fā)的多數(shù)地區(qū)均缺乏這些設(shè)備和人員。據(jù)此，迫切需要改善的用于快速鑒別被埃博拉病毒感染的患者的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供使用恒溫核酸擴增反應(yīng)來快速鑒別埃博拉病毒感染的方法，該方法可對從未精制生物樣品中提取的rna進行檢測。一方面，本發(fā)明提供將恒溫擴增反應(yīng)與逆轉(zhuǎn)錄耦合來檢測特異性靶標(biāo)多核苷酸(如，rna)的方法，該方法包括(a)在容許cdna合成的條件下，令樣品中的靶標(biāo)多核苷酸分子與引物在逆轉(zhuǎn)錄酶和dntps的存在下接觸，從而產(chǎn)生cdna；(b)在容許cdna的恒溫擴增的條件下，令該cdna與正向引物和反向引物在切口酶、dntps、可檢測的寡核苷酸探針、及鏈置換聚合酶的存在下接觸，且每一引物在其各自5’-末端區(qū)域內(nèi)攜帶至少一個切口酶識別序列，并在其各自3’-末端區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合該cdna；以及(c)檢測該可檢測寡核苷酸探針雜交至擴增子的特異性信號，其中，檢測到該信號表明該樣品中靶標(biāo)多核苷酸的存在或數(shù)量，未檢測到該信號則表明該樣品中不存在靶標(biāo)多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供檢測樣品中rna病毒的方法，該方法包括(a)在容許cdna合成的條件下，令樣品中的rna病毒靶標(biāo)多核苷酸分子與引物在逆轉(zhuǎn)錄酶和dntps的存在下接觸，從而產(chǎn)生cdna；(b)在容許cdna的恒溫擴增的條件下，令該cdna與正向引物和反向引物在切口酶、dntps、可檢測的寡核苷酸探針、及鏈置換聚合酶的存在下接觸，且每一引物在其各自5’-末端區(qū)域內(nèi)攜帶至少一個切口酶識別序列，并在其各自3’-末端區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合該cdna；以及(c)檢測該可檢測寡核苷酸探針雜交至擴增子的特異性信號，其中，檢測到該信號表明該樣品中靶標(biāo)rna病毒多核苷酸分子的存在或數(shù)量，未檢測到該信號則表明不存在靶標(biāo)rna病毒。在相關(guān)的一方面，本發(fā)明提供檢測樣品中埃博拉病毒的方法，該方法包括(a)在容許cdna合成的條件下，令樣品中的埃博拉病毒多核苷酸與引物在逆轉(zhuǎn)錄酶和dntps的存在下接觸，從而產(chǎn)生cdna；(b)在容許cdna的恒溫擴增的條件下，令該cdna與正向引物和反向引物在切口酶、dntps、可檢測的寡核苷酸探針、及鏈置換聚合酶的存在下接觸，且每一引物在其各自5’-末端區(qū)域內(nèi)攜帶至少一個切口酶識別序列，并在其各自3’-末端區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合該cdna；以及(c)檢測該可檢測寡核苷酸探針雜交至擴增子的特異性信號，其中，檢測到該信號表明該樣品中埃博拉病毒多核苷酸的存在或數(shù)量，未檢測到該信號則表明該樣品中不存在埃博拉病毒多核苷酸。在本文中描述的發(fā)明上述方面或任何其它方面的多個具體實施形式中，通過令生物樣品與能提取該樣品中存在的rna分子的劑和能穩(wěn)定化rna分子而防止其降解的劑接觸，從而獲得埃博拉病毒多核苷酸。又一方面，本發(fā)明提供檢測樣品中埃博拉病毒的方法，該方法包括(a)令生物樣品與能提取該樣品中存在的多核苷酸分子的劑和能穩(wěn)定多核苷酸分子而防止其降解的劑接觸；(b)在容許cdna合成的條件下，令所提取并穩(wěn)定化的埃博拉病毒rna與引物在逆轉(zhuǎn)錄酶和dntps的存在下接觸，從而產(chǎn)生埃博拉病毒cdna；(c)在容許cdna的恒溫擴增的條件下，令該埃博拉病毒cdna與正向引物和反向引物在切口酶、dntps、可檢測的寡核苷酸探針、及鏈置換聚合酶的存在下接觸，從而產(chǎn)生擴增子；其中每一引物在其各自5’-末端區(qū)域內(nèi)攜帶至少一個切口酶識別序列，并在其各自3’-末端區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合該埃博拉病毒cdna；以及(d)檢測該擴增子，其中，檢測到埃博拉病毒擴增子的存在表明該樣品中存在埃博拉病毒多核苷酸分子，未檢測到該擴增子則表明該樣品中不存在埃博拉病毒多核苷酸。又一方面，本發(fā)明提供用于檢測rna病毒多核苷酸分子的試劑盒，包含特異性結(jié)合rna病毒序列的引物、特異性結(jié)合病毒(如，埃博拉病毒)擴增子的可檢測的探針、逆轉(zhuǎn)錄酶、切口酶、和鏈置換聚合酶。一種具體實施形式中，該引物含有下述序列：正向引物：gactcgatatcgagtcgcttcca[meoc]agttatc[meou][meoa][meoc][meoc][meog]反向引物：gactcgatatcgagtcgaaatgc[meoa]acga[meoc][meoa][meoc][meoc][meou]；且該探針含有下述序列：gctacacgactttygctgaaggtagc。另一具體實施形式中，該探針在5’端具有熒光染料且在3’端具有淬滅劑，或相反。一種具體實施形式中，該探針是5’-calred610nm-gctacacgactttygctgaaggtagcbhq2-3’或5’-fam或fitc-gctacacgactttygctgaaggtagc-bhq1-3’。一種具體實施形式中，該3’淬滅劑被dabsyl替換。另一方面，本發(fā)明提供用于在逆轉(zhuǎn)錄酶切口擴增反應(yīng)中擴增埃博拉病毒多核苷酸分子的試劑盒，該試劑盒含有下述引物：正向引物：gactcgatatcgagtcgcttcca[meoc]agttatc[meou][meoa][meoc][meoc][meog]反向引物：gactcgatatcgagtcgaaatgc[meoa]acga[meoc][meoa][meoc][meoc][meou]；下述探針：gctacacgactttygctgaaggtagc；逆轉(zhuǎn)錄酶、切口酶、鏈置換聚合酶、以及使用前述引物、探針和酶檢測埃博拉病毒多核苷酸分子的使用說明。一種具體實施形式中，該試劑盒進一步含有毛細(xì)管，且該毛細(xì)管可包含或不包含用于病毒多核苷酸提取的凍干細(xì)胞裂解液或rna穩(wěn)定化試劑。另一具體實施形式中，該試劑盒進一步含有一種或多種容器，該容器包含適用于進行逆轉(zhuǎn)錄酶和/或擴增反應(yīng)的緩沖液。另一具體實施形式中，該試劑盒進一步含有多個容器，該容器包含凍干形式的逆轉(zhuǎn)錄酶、切口酶、和鏈置換聚合酶。又一方面，本發(fā)明提供診斷人類或動物個體具有rna病毒的方法，該方法包括(a)令該個體的樣品與能提取該樣品中存在的rna病毒的劑和能穩(wěn)定化所提取的多核苷酸分子以防止其降解的劑接觸；(b)在容許cdna合成的條件下，令該多核苷酸分子與逆轉(zhuǎn)錄酶引物在逆轉(zhuǎn)錄酶和dntps的存在下接觸，從而產(chǎn)生該多核苷酸分子的cdna復(fù)本；(c)在容許該cdna的恒溫擴增的條件下，令該cdna與正向引物和反向引物在切口酶、dntps、可檢測的寡核苷酸探針、及鏈置換聚合酶的存在下接觸，從而產(chǎn)生擴增子；且每一引物在其各自5’-末端區(qū)域內(nèi)攜帶至少一個切口酶識別序列，并在其各自3’-末端區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合該cdna；以及(d)檢測該擴增子，其中，檢測到rna病毒擴增子的存在表明該個體體內(nèi)存在rna病毒感染，未檢測到該擴增子則表明該個體體內(nèi)不存在rna病毒感染。在本文中描述的任何方面的多個具體實施形式中，在缺少靶標(biāo)多核苷酸的對照檢驗中，在檢驗開始后第7、10和/或15分鐘無可檢測信號。在本文中描述的任何方面的其它具體實施形式中，步驟(a)中所用的引物具有與步驟(b)所用的引物相同或不同的序列。在上文任何其它具體實施形式中，步驟(a)至(c)在單一反應(yīng)中進行。上述方面的其它具體實施形式中，該逆轉(zhuǎn)錄酶與該鏈置換dna聚合酶是相同或不同的酶。再其它具體實施形式中，步驟(a)的cdna是在第一反應(yīng)容器內(nèi)產(chǎn)生的，隨后被轉(zhuǎn)移至第二反應(yīng)容器，而步驟(b)在該第二反應(yīng)容器內(nèi)進行。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該多核苷酸分子是埃博拉病毒多核苷酸分子。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該樣品是體液(如，唾液、汗液、淚液、體腔內(nèi)蓄積的液體、尿液、精液、陰道分泌物、腦脊髓液、淋巴液、糞便、痰、液體消化物、嘔吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血漿)。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該體腔是腹腔或心包腔。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，檢出限是每反應(yīng)10個或20個復(fù)本。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該方法進行約5、7、10、15、20、25或30分鐘。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，步驟(a)至(d)是對生物樣品進行的。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，埃博拉病毒rna并未從該生物樣品純化或分離(如，原樣品)。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該方法在便攜式電池供電裝置中的護理或診斷點進行。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，不需要單獨的逆轉(zhuǎn)錄酶引物，但使用正向引物和/或反向引物。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該樣品是生物樣品或環(huán)境樣品。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該生物樣品是從個體、蝙蝠、叢林肉或家畜獲得的。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該生物樣品是頰、鼻、眼、直腸及陰道黏膜的一種或多種黏膜拭片或皮膚。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該生物樣品是從個體、尸體、或培養(yǎng)基獲得的組織樣品。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該尸體是人類、靈長類、蝙蝠或其它哺乳動物的尸體。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該環(huán)境樣品是可能被患有埃博拉病毒感染或具有埃博拉病毒感染發(fā)展傾向的個體的生物體液污染的材料。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該環(huán)境樣品是寢具、坐墊、地毯、空調(diào)過濾器或其它材料。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該聚合酶是bstdna聚合酶i、gstdna聚合酶i、gkadna聚合酶i、gcadna聚合酶i、gandna聚合酶i、gbodna聚合酶i、gsp70dna聚合酶i、gspt3dna聚合酶i、gsp52dna聚合酶i及/或其片段的5’-exo-衍生物。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該切口酶是nt.bstnbi、nt.bspd6i、nt.bspqi、nt.bsmai、nt.alwi、n.bst9i、或n.bstsei的一種或多種。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該逆轉(zhuǎn)錄酶是m-mlvrt、amvrt、rsvrt、及/或其突變體/衍生物。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該可檢測的探針包含分子信標(biāo)。本文中描述的任何方面的多個具體實施形式中，擴增引物(如，正向引物及/或反向引物)在3’端包含一種或多種2’-改性的核苷酸(如，2’-o-甲基核糖核苷酸)。特別的具體實施形式中，該擴增引物在3’端包含一種或多種2’-o-甲基改性的核苷酸，包括，舉例而言，2’-o-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羥基、2’-烷基、2'-烯丙基、2'-o-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫、4'-ch2-o-2'-橋、4'-(ch2)2-o-2'-橋、2'-lna、及2'-o-(n-甲基氨基甲酸酯)。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，用于埃博拉病毒檢測的正向引物和反向引物分別包含下述序列：正向引物：gactcgatatcgagtcgcttcca[meoc]agttatc[meou][meoa][meoc][meoc][meog]反向引物：gactcgatatcgagtcgaaatgc[meoa]acga[meoc][meoa][meoc][meoc][meou]。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，使用具有下述序列的探針檢測擴增：gctacacgactttygctgaaggtagc。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該探針在5’端具有熒光染料且在3’端具有淬滅劑，或相反。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該探針是5‘-calred610nm-gctacacgactttygctgaaggtagcbhq2-3’或5’-fam或fitc-gctacacgactttygctgaaggtagc-bhq1-3”。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該3’淬滅劑被dabsyl替換。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，用于檢測hiv病毒的正向引物和反向引物分別包含下述序列：正向引物：gactcgatatcgagtctgactagmcggaggmcmtmamgmamamg、gactcgatatcgagtctgactagmcagaggmcmtmamgmamamg；以及反向引物：gactcgatatcgagtctattgacmgctcmtmcmgmcmamc、gactcgatatcgagtctactgacmgctcmtmcmgmcmamc。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，使用具有下述序列的探針來檢測擴增：cgcaagggagagagatgggtgcttgcg。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，用于檢測登革熱病毒的正向引物和反向引物分別包含下述一種或多種序列：正向引物：gactcgatatcgagtccaaaaacmagcatattmgmamcmgmc；以及反向引物：gactcgatatcgagtcagacagcmaggatcmtmcmtmgmg、gactcgatatcgagtcagacagcmaggatcmtmgmtmgmg。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，使用具有下述序列的探針來檢測擴增：cgcatctggtctttcccagcgatgcg。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，用于檢測乙型流感病毒的正向引物和反向引物分別含有一種或多種下述序列：正向引物：gactcgatatcgagtcaaatgcamgatggtctcmamgmcmtma、gactcgatatcgagtcaaatgcamaatggtctcmamgmcmtma、gactcgatatcgagtcaaatgcamgatggtttcmamgmcmtma；以及反向引物：gactcgatatcgagtcctcctttmtcccattccatmtmcmamtmt、gactcgatatcgagtcctcccttmtcccattccatmtmcmamtmt、gactcgatatcgagtcctcctttmccccattccatmtmcmamtmt。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，使用具有下述序列的探針來檢測擴增：gccaagctatgaacacagcaaacttggc。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，用于檢測bvdv1病毒的正向引物和反向引物分別含有一種或多種下述序列：正向引物：gactcgatatcgagtcggcccacmtgtattgctmamcmtmgmamama、gactcgatatcgagtcggcccacmtgcactgctmamcmtmamamama；以及反向引物：gactcgatatcgagtctgtgatcmaactccmamtmgmtmgmcmc。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，使用具有下述序列的探針來檢測擴增：cgctacatctctgctgtacatggtagcg。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該探針在5’端具有熒光染料且在3’端具有淬滅劑，或在3’端具有熒光染料且在5’端具有淬滅劑。在特別的具體實施形式中，該熒光染料是calred610nm，而該淬滅劑是bhq2或dabsyl。某些具體實施形式中，該熒光染料是fam或fitc，而該淬滅劑是bhq1或dabsyl。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該rna病毒是埃博拉病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)、登革熱病毒、流感病毒(如，乙型流感病毒)、牛病毒性腹瀉病毒(如，bvdv基因型1)、黃熱病毒、西尼羅河病毒、丙肝病毒、拉沙病毒、黃冰冰的、或單鏈rna病毒。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該能提取病毒的劑是十二烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、硫氰酸胍、及/或鹽酸胍的一種或組合。多個具體實施形式中，以約0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15、20、25、50、100、250、500mm或更大的濃度使用硫氰酸胍或其它能提取病毒的劑。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該方法用于醫(yī)護人員的日常篩查。本文中描述的任何方面的再其它具體實施形式中，該樣品經(jīng)匯集且對人類或動物群體進行該篩查。定義“埃博拉病毒(ebov)”意為具有與埃博拉病毒的至少約85％氨基酸序列一致性的絲狀病毒。例示性埃博拉病毒包括，但不限于，造成人體內(nèi)疾病的扎伊爾型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉病毒、科特迪瓦型埃博拉病毒、及本迪布焦型埃博拉病毒，以及影響非人靈長動物的萊斯頓型埃博拉病毒。例示性扎伊爾型埃博拉病毒基因組的序列提供為ncbi保藏號kc242800.1，其重現(xiàn)于下：本發(fā)明進一步提供具有與此序列至少約85、90、95、96、97、98、99或100％一致性的多核苷酸。其它扎伊爾型埃博拉基因組是該領(lǐng)域已知的，且揭示于例如baizeetal.,nengljmed2014；371:1418-25中，該文獻通過引用而并入本文?！昂颂呛怂崦竝rna成分h1(rpph1)”意為該rnasep核糖核蛋白的rna成分，一種內(nèi)切核糖核酸酶，其裂解trna前體分子以形成其trna序列的成熟5-終端(primetermini)。例示性核酸序列提供為ncbi保藏號nr_002312?！皵U增子”意為在感興趣的多核苷酸擴增過程中產(chǎn)生的多核苷酸。一個實施例中，擴增子是在聚合酶鏈反應(yīng)過程中產(chǎn)生的?！皵U增速率修飾劑”意為能影響聚合酶外延速率的劑?！皦A基取代”意為核酸堿基聚合物的取代基，其并不對互補核苷酸鏈間的雜交造成顯著破壞。本公開中，“包含(comprises、comprising)”、“含有”和“具有”等可具有美國專利法中所認(rèn)定的含義，且可意指“包括(includes、including)”等；同樣，“主要由…組成(consistingessentiallyof或consistsessentially)”具有美國專利法中所認(rèn)定的含義，且該術(shù)語是開放式的，允許超過其所引用者的存在，只要其所引用者的基本特征或新穎特征并未被超過其所引用者的存在所改變即可，但不包括先前技術(shù)的具體實施形式?！盎パa的”或“互補性”意為，一個核酸可通過傳統(tǒng)瓦特生-克里克(watson-crick)堿基配對或胡斯坦(hoogsteen)堿基配對與另一核酸序列形成一種或多種氫鍵?；パa堿基配對不僅包括g-c和a-t堿基配對，而且包括牽涉普適堿基如肌苷的堿基配對。互補性百分比表明核酸分子中可與第二核酸序列形成氫鍵(如，watson-crick堿基配對)的連續(xù)殘基的百分比(如，該第一寡核苷酸中總計10個核苷酸中的5、6、7、8、9、或10個核苷酸與具有10個核苷酸的第二核酸序列形成堿基配對，分別表示50％、60％、70％、80％、90％、和100％的互補性)。為了確認(rèn)互補性百分比是至少某一百分比，計算核酸分子中能與第二核酸序列形成氫鍵(如，watson-crick堿基配對)的連續(xù)殘基的百分比，并四舍五入至最接近的數(shù)字(如，第一寡核苷酸中總計23個核苷酸中的12、13、14、15、16、或17個核苷酸與具有23個核苷酸的第二核酸序列進行堿基配對，分別表示52％、57％、61％、65％、70％、和74％的互補性；以及分別具有至少50％、50％、60％、60％、70％、和70％互補性)。本文中，“大體上互補”指代鏈之間的互補性能令這些鏈在生物條件下雜交。大體上互補的序列具有60％、70％、80％、90％、95％、或甚至100％的互補性。據(jù)此，通過檢查兩條鏈的核苷酸序列而確定其能否在生物條件下雜交的技術(shù)是該領(lǐng)域中已知的。本文中，“雙鏈(duplex)”指代通過兩個單股核酸的相互反應(yīng)而形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙鏈典型通過兩個單鏈核酸間堿基的成對氫鍵鍵結(jié)即“堿基配對”而形成，該兩個單鏈核酸相對于彼此反平行對準(zhǔn)。雙鏈中的堿基配對一般以watson-crick堿基配對出現(xiàn)，例如，在dna和rna中，鳥嘌呤(g)與胞嘧啶(c)形成堿基對；在dna中，腺嘌呤(a)與胸腺嘧啶(t)形成堿基對；且在rna中，腺嘌呤(a)與尿嘧啶(u)形成堿基對?？尚纬蓧A基對的條件包括生理學(xué)或生物學(xué)有關(guān)條件(如，細(xì)胞內(nèi)：ph7.2，140mm鉀離子；細(xì)胞外：ph7.4，145mm鈉離子)。此外，雙鏈通過相鄰核苷酸間的堆疊反應(yīng)而得以穩(wěn)定化。本文中，雙鏈可通過堿基配對或通過堆疊反應(yīng)而得以建立或維持。通過兩條互補的核酸鏈形成雙鏈，該兩條核酸鏈可以是大體上互補或完全互補。大量堿基上形成堿基對的多個單鏈核酸稱為“雜交”?！皺z測”指代鑒別待檢測的被分析物的存在、不存在、或其量。一種具體實施形式中，該被分析物是埃博拉病毒多核苷酸或其它rna病毒多核苷酸?！翱蓹z測的部分”意為，當(dāng)鏈接至感興趣的分子時，使得后者可經(jīng)由光譜學(xué)、光化學(xué)、生化、免疫化學(xué)、或化學(xué)手段檢測的組成。舉例而言，可用的標(biāo)記包括放射性同位素、磁珠、金屬性微珠、膠體顆粒、熒光染料、高電子密度試劑、酶(例如，一般用于elisa中的酶)、生物素、地高辛(digoxigenin)、或半抗原。“片段”意為核酸分子的一部分。這一部分優(yōu)選含有參考核酸分子或多肽整個長度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。一個片段可含有5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或100個核苷酸。一種具體實施形式中，該片段包含埃博拉病毒多核苷酸或其它rna病毒多核苷酸的至少約50、75、80、85、89、90、或100個核苷酸?！白杂赡?δg)”意指恒溫恒壓下系統(tǒng)與其環(huán)境間的凈能量交換，以式δg＝δh–tδs揭示。自由能表示一個結(jié)構(gòu)如何是熱力學(xué)穩(wěn)定的，具有負(fù)δg(如，以kcal/mole表達)的結(jié)構(gòu)形式是熱力學(xué)穩(wěn)定的(即，δg較低的結(jié)構(gòu)比δg較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定)。當(dāng)系統(tǒng)在恒溫恒壓下達到平衡時，熱力學(xué)勢最小?！半s交”意為在互補的多核苷酸序列(如，本文中揭示的基因)之間或其部分之間在多種嚴(yán)格條件下形成雙鏈分子(見，如，wahl,g.m.ands.l.berger(1987)methodsenzymol.152:399；kimmel,a.r.(1987)methodsenzymol.152:507)。雜交通過互補性核酸堿基之間的氫鍵鍵結(jié)而出現(xiàn)，該氫鍵鍵結(jié)可以是watson-crick氫鍵鍵結(jié)、hoogsteen氫鍵鍵結(jié)或逆hoogsteen氫鍵鍵結(jié)。舉例而言，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過形成氫鍵而配對的互補性核酸堿基?！胺蛛x的多核苷酸”意為不包含基因的核酸(如，dna、rna)，而該基因在本發(fā)明核酸分子來源有機體的天然出現(xiàn)的基因組中，該核酸處于基因側(cè)翼。該術(shù)語因此包括，舉例而言，并入載體、并入自主復(fù)制質(zhì)?；虿《?、或并入原核生物或真核生物基因組dna的重組dna；或作為獨立于其它序列的單獨分子(舉例而言，通過pcr或限制性內(nèi)且核酸酶消解而生產(chǎn)的cdna或基因組或cdna片段)存在的重組dna。此外，該術(shù)語包括從dna分子轉(zhuǎn)錄的rna分子，以及作為編碼雜交基因的其它多肽序列的一部分的重組dna。術(shù)語“分離的”、“純化的”、或“生物純的”指代不同程度地不含有天然狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的正常伴隨組分的材料?！胺蛛x的”指示從原始來源或周遭環(huán)境中單獨的程度?！凹兓敝甘颈确蛛x更高的單獨程度?！凹兓摹被颉吧锛兊摹钡鞍踪|(zhì)足夠不含有其它材料，因此任何雜質(zhì)都不能材料性地影響該蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)或造成其它不利后果。也就是說，當(dāng)通過重組dna技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的核酸或肽，如果核酸或肽大體上不含細(xì)胞性材料、病毒性材料、或培養(yǎng)基，則其是純化的；或當(dāng)化學(xué)合成時，如果不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品，則其是純化的。典型使用分析化學(xué)技術(shù)，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜測定純度和同質(zhì)性。術(shù)語“純化的”可指示核酸偶蛋白質(zhì)在電泳凝膠中基本上導(dǎo)致一條帶。對于可進行改性如磷酸化或糖基化的蛋白，不同的改性可導(dǎo)致不同的分離的蛋白，它們可單獨純化。“解鏈溫度(tm)”意為處于平衡中的系統(tǒng)的溫度，該平衡為50％的分子群體處于一種狀態(tài)，而50％的群體處于另一種狀態(tài)。對于本發(fā)明的核酸，tm是50％的群體為單鏈而50％為雙鏈(如，分子內(nèi)雙鏈或分子間雙鏈)時的溫度?！氨O(jiān)控反應(yīng)”意為檢測反應(yīng)的進度。一種具體實施形式中，監(jiān)控反應(yīng)進度涉及檢測聚合酶擴展及/或檢測擴展反應(yīng)的完成。本文中，“獲得一劑”中的“獲得”包括合成、購買或其它途徑獲取該劑。本文中，術(shù)語“核酸”指代單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸、核糖核酸、或改性核苷酸、及其聚合物。該術(shù)語涵蓋含有已知核苷酸類似物或改性的骨架殘基或鏈接基的核酸，該核酸是合成的、天然出現(xiàn)的、和非天然出現(xiàn)的，它們具有與參考核酸相似的結(jié)合性質(zhì)，且它們以與參考核苷酸相似的方式被代謝。這些類似物的實例包括而不限于，2’-改性的核苷酸(如，2’-o-甲基核糖核苷酸、2’-f核苷酸)。本文中，“改性的核苷酸”指代具有對核苷酸、核酸堿基、戊糖環(huán)、或磷酸酯基的一種或多種改性的核苷酸。舉例而言，改性的核苷酸不包括含有單磷酸腺苷、單磷酸鳥苷、單磷酸尿苷、及單磷酸胞苷的核糖核苷酸和含有單磷酸脫氧腺苷、單磷酸脫氧鳥苷、單磷酸脫氧尿苷、及單磷酸脫氧胞苷的脫氧核糖核苷酸。改性包括那些通過改性核苷酸的酶如甲基轉(zhuǎn)移酶進行改性而得到的天然出現(xiàn)的改性。改性的核苷酸也包括合成核苷酸或非天然出現(xiàn)的核苷酸。核苷酸中合成的或非天然出現(xiàn)的改性包括那些具有2’-改性的，如，2’-o-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羥基(rna)、2'-烯丙基、2'-o-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫、4'-ch2-o-2'-橋、4'-(ch2)2-o-2'-橋、及2'-o-(n-甲基氨基甲酸酯)或那些包含堿基類似物的?！昂塑账峒雍衔铩币鉃楣矁r結(jié)合至或通過其它方式固定至標(biāo)準(zhǔn)核苷酸堿基的部分?！扒锌趧币鉃槟茏R別并接合至雙鏈核酸分子中的特定結(jié)構(gòu)的一個化學(xué)整體，其在結(jié)合至所識別的特定結(jié)構(gòu)時，能破壞單鏈上相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而在該切口位點之前的末端核苷酸上創(chuàng)建自由的3’-羥基。在優(yōu)選的具體實施形式中，該3’末端可通過核酸外切酶缺陷聚合酶來延伸。例示性的切口劑包括切口酶、rna酶(rnazymes)、dna酶(dnazymes)、和過渡金屬螯合劑?！盎匚?palindromic)”意為一類核酸序列，其在從一條鏈的5’端至3’端讀取的序列與從互補鏈的5’端至3’端讀取的序列完全相同或大體上相同。完美的回文指代具有兩個毗連子序列的序列，因此，當(dāng)以從5'至3'方向讀取一個子序列時，該子序列與從3’至5’方向讀取的另一子序列完全相同?！熬酆厦缸铚肿印币鉃榕c多核苷酸模板/引物相關(guān)的部分，其阻止或顯著降低聚合酶在多核苷酸模板上的前進。優(yōu)選地，該部分被并入該多核苷酸。一個優(yōu)選具體實施形式中，該部分阻止聚合酶在該模板上前進?！熬酆厦笖U展”意為聚合酶的正向前進，其將進入的單體匹配至它們的位于模板多核苷酸上的結(jié)合伙伴。本文中，“引物二聚體”意為兩個單體寡核苷酸引物的二聚體。本發(fā)明的寡核苷酸引物中，單體引物的5’尾部區(qū)域進行二聚。“半定量”意為提供基于內(nèi)部對照的相對數(shù)量的評估?！疤囟óa(chǎn)物”意為從引物寡核苷酸至互補靶標(biāo)序列的雜交和后續(xù)聚合酶介導(dǎo)的該靶標(biāo)序列的擴展獲得的多核苷酸產(chǎn)物?！按篌w上恒溫條件”意為處于單一溫度或并不顯著變化的窄溫度范圍內(nèi)。一種具體實施形式中，在大體上恒溫條件下進行的反應(yīng)是在僅變化1至5℃(如，變化1、2、3、4、或5度)的溫度下進行的。另一具體實施形式中，該反應(yīng)是在所用儀器的操作參數(shù)內(nèi)的單一溫度下進行的?！皵?shù)量閾方法”意為提供基于相對于比較標(biāo)準(zhǔn)的超量或不超量的數(shù)量評估?！皡⒖肌币鉃闃?biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諚l件。如該領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見，適宜的參考是為了確定要素的效果而改變該要素之處?！澳孓D(zhuǎn)錄酶”意為一種酶，其在脫氧核糖核苷酸和容許的反應(yīng)介質(zhì)的存在下，將引動的單鏈rna模板鏈復(fù)制為互補的dna鏈，該反應(yīng)介質(zhì)包含但不限于，緩沖劑(ph7.0至9.0)、鈉離子及/或鉀離子、以及鎂離子。如該領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見，容許的反應(yīng)介質(zhì)的濃度和ph范圍可關(guān)于具體逆轉(zhuǎn)錄酶而變動。該領(lǐng)域習(xí)知的適當(dāng)“逆轉(zhuǎn)錄酶”的實例是，但不限于，mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶及其商用衍生物“superscripti、ii和iii”(lifetechnologies)、“maxiscript”(fermentas)；rsv逆轉(zhuǎn)錄酶及其商用衍生物“omniscript”(qiagen)；amv逆轉(zhuǎn)錄酶及其商用衍生物“thermoscript”(sigma-aldrich)?！皞€體”意為哺乳動物，包括但不限于，人或非人哺乳動物如牛、馬、犬、羊或貓?！鞍袠?biāo)核酸分子”意為待分析的多核苷酸。這一多核苷酸可以是該靶標(biāo)序列的正義鏈或反義鏈。術(shù)語“靶標(biāo)核酸分子”也指代原始靶標(biāo)序列的擴增子。本文中提供的范圍理解為該范圍內(nèi)全部數(shù)值的縮寫。舉例而言，1至50的范圍理解為包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50所組成組中的任意數(shù)字、數(shù)字組合或子范圍。除非具體指明或從語境中明顯可見，術(shù)語“或”理解為包括性的。除非具體指明或從語境中明顯可見，本文中，“一”和“該”理解為單數(shù)或復(fù)數(shù)。除非具體指明或從語境中明顯可見，本文中，術(shù)語“約”理解為處于該領(lǐng)域正常公差范圍內(nèi)，舉例而言，處于均值的2標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。約可理解為處于與所指明數(shù)值偏差10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％的范圍內(nèi)。除非從語境中明確排除，本文中提供的全部數(shù)字值可由術(shù)語“約”修飾。本文中變量的任何定義中對化學(xué)基團的詳述和列舉包括該變量的作為所列舉基團的任何單一基團的定義或組合。對于本文中變量或方面的具體實施形式的詳述，包括其作為任何單一具體實施形式或其與任何其它具體實施形式或其一部分的組合。本文中提供的任何組成或方法可與本文中提供的任何其它組成及方法的一者或多者組合。附圖說明圖1是例示性說明檢驗埃博拉病毒(ebov)的候選設(shè)計的示意圖。圖2顯示所測試的多種探針和引物，以及檢驗發(fā)展中使用的埃博拉病毒gblock序列。gblock是大小為100bp至1000bp范圍的合成雙鏈dna片段，其完全在體外從合成單鏈寡核苷酸組裝，且表示基因組dna的序列已證實的合成嵌段。除非具體指明或從語境中明顯可見，本文中，每當(dāng)天然靶標(biāo)序列或靶標(biāo)基因組無法使用及/或無用時，“”作為合成性靶標(biāo)核酸而使用。任何靶標(biāo)序列的基因組dna的序列已證實的嵌段可作為自定義順序服務(wù)從idt技術(shù)公司(idttechnologiesinc.(1710commercialpark,coralville,iowa52241,usa))獲得，且術(shù)語“”是該公司的注冊商標(biāo)。圖3a至3x顯示使用檢驗1和檢驗2獲得的擴增結(jié)果。圖4顯示一步檢驗中以人類總rna為背景的埃博拉病毒的檢測。圖5顯示一步檢驗中以人類總rna為背景的合成性埃博拉病毒rna的檢測。圖6a至6c提供例示性說明樣品加工用于擴增和檢測儀器的流程圖，該儀器包括例如手持式裝置。圖6a表明穩(wěn)定/裂解試劑(如，異硫氰酸胍(gitc))被凍干至毛細(xì)管內(nèi)壁上。圖6b例示性說明浸有經(jīng)凍干的gitc和緩沖液(如，whatmantmftatmelutecards)的紙的使用。圖6c說明在多個管(如，8孔片)或單個管中的凍干檢驗過程。圖7a和7b顯示樣品制備方法。圖7a說明從拭片樣品制備的樣品。圖7b說明來自血液樣品的樣品制備。圖8是顯示從一步反應(yīng)過程中獲得的結(jié)果的圖，其中，該逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶包括于單一反應(yīng)中。圖9是顯示從兩步反應(yīng)過程中獲得的結(jié)果的圖，其中，該逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)在室溫或56℃進行，且該cdna被轉(zhuǎn)移至第二管，擴增反應(yīng)在該第二管內(nèi)在56℃進行。圖10是顯示對于1x10e4復(fù)本在56℃的rt、在56℃的dnable的圖。圖11a和11b顯示在含有細(xì)胞總rna的樣品中的靶標(biāo)rna的檢測。圖11a是顯示兩步反應(yīng)中檢測rpph1(rnaseprna組分)的圖。圖11b是顯示一步反應(yīng)中檢測rpph1的圖。圖12是顯示在一步反應(yīng)中檢測粗制血液制劑中扎伊爾型埃博拉病毒的圖。圖13是說明特異性檢測扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株(zaireebolamayinga)而非蘇丹型埃博拉病毒boniface株(sudanebolaboniface)的扎伊爾型埃博拉病毒檢驗的圖。圖14是說明多個扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株稀釋液儀器比較的圖。圖15a至15d說明該埃博拉病毒檢驗的檢測限。圖15a是說明在含有100復(fù)本的埃博拉病毒靶標(biāo)rna的樣品中檢測的圖。圖15b是說明在含有50復(fù)本的埃博拉病毒靶標(biāo)rna的樣品中檢測的圖。圖15c是說明在含有25復(fù)本的埃博拉病毒靶標(biāo)rna的樣品中檢測的圖。圖15d是說明在含有12復(fù)本的埃博拉病毒靶標(biāo)rna的樣品中檢測的圖。圖16a和16b顯示以一步檢驗法對人免疫缺陷病毒(hiv)的檢測。圖16a是顯示在檢驗引物和探針的設(shè)計中使用的序列的擴增子地圖。表明了正向引物和反向引物中的群體序列變異性。外部引物序列對hiv亞型c(用于所使用的純化的rna樣品)是特異性的。圖16b顯示一步檢驗中hiv的實時靶標(biāo)特異性擴增。對于每一復(fù)本數(shù)，顯示橫跨5個技術(shù)重復(fù)樣本的cp值(10ul反應(yīng))。通過cobastaqmanhiv-1v2.0測試進行定量，從而表明純化的hivrna(亞型c)(seracare)的復(fù)本。圖17a和17b顯示以一步檢驗法對4型登革熱病毒(denv-4)的檢測。圖17a是顯示在檢驗引物和探針的設(shè)計中使用的序列的擴增子地圖。表明了反向引物中的群體序列變異性。圖17b顯示一步檢驗中denv-4的實時靶標(biāo)特異性擴增。顯示橫跨4個技術(shù)重復(fù)樣本的cp值(10ul反應(yīng))。從細(xì)胞培養(yǎng)物分離的總rna(20pg)包括病毒rna和宿主細(xì)胞rna，而病毒rna的總復(fù)本數(shù)未知。圖18a和18b顯示以一步檢驗法對乙型流感病毒的檢測。圖18a是顯示在檢驗引物和探針的設(shè)計中使用的序列的擴增子地圖。表明了正向引物和反向引物中的群體序列變異性。圖18b顯示一步檢驗中乙型流感病毒的實時靶標(biāo)特異性擴增。顯示橫跨4個技術(shù)重復(fù)樣本的cp值(10ul反應(yīng))。來自細(xì)胞培養(yǎng)物的分離的總rna(20pg)包括病毒rna和宿主細(xì)胞rna，而病毒rna的總復(fù)本數(shù)未知。樣品1和2是不同的病毒隔離種。圖19a和19b顯示以一步檢驗法對牛病毒性腹瀉病毒基因型1(bvdv1)的檢測。圖19a是顯示在檢驗引物和探針的設(shè)計中使用的序列的擴增子地圖。表明了正向引物的群體序列變異性。圖19b顯示一步檢驗中牛病毒性腹瀉病毒基因型1(bvdv1)的實時靶標(biāo)特異性擴增。顯示技術(shù)重復(fù)樣本(10ul反應(yīng))。來自細(xì)胞培養(yǎng)物的分離的總rna(20pg)包括病毒rna和宿主細(xì)胞rna，而病毒rna的總復(fù)本數(shù)未知。使用未稀釋的和經(jīng)1:100稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)粗制裂解液。具體實施方式本發(fā)明提供使用恒溫核酸擴增反應(yīng)來快速鑒別rna病毒(如，埃博拉病毒)感染的方法，其可對從粗制生物樣品中提取的rna進行檢測。埃博拉病毒在臨床上難以診斷和辨別。在埃博拉疑似病例中，需要快速且可靠的實驗室診斷。本發(fā)明提供這一檢驗。本發(fā)明至少部分地基于下述發(fā)現(xiàn)：埃博拉病毒多核苷酸(如，rna)可在用于埃博拉病毒多核苷酸的一步或兩步實時逆轉(zhuǎn)錄-恒溫擴增檢驗中被檢出。埃博拉病毒埃博拉病毒是具有反向rna基因組的絲狀病毒。病毒體是含有病毒衣殼、基質(zhì)、和核蛋白殼組分的筒狀/管狀，其直徑約80nm且長度為800至1000nm。埃博拉病毒被歸為4級生物安全劑。埃博拉病毒出血熱的潛伏期一般為5至18天，但可延長2至21天，取決于所接觸的病毒株和被感染個體的狀況。埃博拉病毒作用迅速。埃博拉病的初始癥候類似瘧疾、流感、或多種細(xì)菌感染的癥候。因此，在埃博拉病毒感染被確診之前，可能已經(jīng)過去的幾天或幾周。次要癥候包括腹瀉；紅眼；吐血；鼻、口或直腸流血；甚至腦出血。約50％至90％的病毒感染者發(fā)展為全身性多器官衰減和死亡?；颊咴\斷和監(jiān)控通過檢測生物樣品中的埃博拉病毒多核苷酸并將這一檢測與埃博拉病毒感染的存在相關(guān)聯(lián)，可診斷患者是否罹患埃博拉病毒。一種具體實施形式中，使用本發(fā)明的方法和組合物來檢測患者生物樣品中的埃博拉病毒，可檢測該患者罹患埃博拉病毒的疾病狀態(tài)。例示性生物樣品包括體液(如，唾液、汗液、淚液、體腔內(nèi)蓄積的流體、尿液、精液、陰道分泌物、腦脊液、淋巴液、糞便、痰、液體消化物、嘔吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血漿)、組織提取物、培養(yǎng)基(如，其內(nèi)部已經(jīng)生長有細(xì)胞如病原體細(xì)胞的液體)、或從例如可能被個體生物流體污染的材料獲得的環(huán)境樣品。一種具體實施形式中，本發(fā)明提供以逆轉(zhuǎn)錄酶和切口擴增反應(yīng)來擴增靶標(biāo)多核苷酸的方法，該方法包括：(a)在容許cdna合成的條件下，令靶標(biāo)rna分子(如，埃博拉病毒基因組)與逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)引物在逆轉(zhuǎn)錄酶和dntps的存在下接觸，從而產(chǎn)生cdna；以及(b)在容許cdna的恒溫擴增的條件下，令該cdna與正向引物和反向引物在切口酶、dntps、及鏈置換聚合酶的存在下接觸，從而產(chǎn)生擴增子，其中，每一引物在其各自5’-末端區(qū)域內(nèi)攜帶至少一個切口酶識別序列，并在其各自3’-末端區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合該cdna。一種特別的具體實施形式中，本發(fā)明提供檢測生物樣品中埃博拉病毒的方法，該方法包括：(a)令樣品與能提取該樣品中存在的埃博拉病毒rna的劑(如，sds、月桂基硫酸鈉、異硫氰酸胍、鹽酸胍)和能穩(wěn)定化埃博拉病毒rna以防止其降解的劑(如，sds、rna酶抑制劑、對抗rnase的抗體、競爭性rnase抑制劑)或能對rna進行原位可逆化學(xué)改性的劑(如，乙酸酐)接觸；(b)在容許cdna合成的條件下，令埃博拉病毒rna與rt引物在逆轉(zhuǎn)錄酶和dntps的存在下接觸，從而產(chǎn)生埃博拉病毒rna的cdna復(fù)本；(c)在容許cdna的恒溫擴增的條件下，令該埃博拉病毒cdna與正向引物和反向引物在切口酶、dntps、及鏈置換聚合酶的存在下接觸，從而產(chǎn)生擴增子，其中，每一引物在其各自5’-末端區(qū)域內(nèi)攜帶至少一個切口酶識別序列，并在其各自3’-末端區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合該cdna；以及(d)檢測該擴增子，其中，檢測到埃博拉病毒擴增子的存在表明該樣品中存在埃博拉病毒感染，而未檢測到該擴增子則表明不存在埃博拉病毒感染。一種具體實施形式中，本文中揭示的本發(fā)明的方法提供不超過5、7、10、15、20、25或30分鐘內(nèi)的結(jié)果。有利的是，本發(fā)明的方法可用于從粗制生物樣品(如，唾液、汗液、淚液、體腔內(nèi)蓄積的流體、尿液、精液、陰道分泌物、腦脊液、淋巴液、糞便、痰、液體消化物、嘔吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血漿)中提取而非純化或分離的rna。該測試是現(xiàn)場(如，醫(yī)院、診所、醫(yī)生辦公室、急救中心、家、社區(qū)活動中心、機場、艦船(如，游輪或用于運輸人類或動物的其它船舶)、火車或火車站、或入境點(如，邊境通道))進行的。有利的是，一種具體實施形式中，該測試是使用便攜式電池供電裝置(如，amplifire)進行。一種具體實施形式中，該rna是使用離液序列高的鹽(如，gitc、ghcl)或清潔劑(如，sds、tween和triton)從生物樣品提取的。若需要，在該提取步驟之前、之中或之后，加入rna酶抑制劑。另一具體實施形式中，該逆轉(zhuǎn)錄酶與該鏈置換dna聚合酶是同一個。另一具體實施形式中，不需要單獨的引物或該rt引物與正向引物及/或反向引物相同。另一具體實施形式中，本發(fā)明提供使用mrna檢測用dualfret分子信標(biāo)(如，santagelo,nucleicacidsres.2004；32(6):e57揭示)、從dntps和使用鎂或鈣進行沉淀釋放的焦磷酸鹽濁度進行的ebov或其它病毒擴增子檢測。另一具體實施形式中，本發(fā)明提供使用橫向流裝置進行的埃博拉病毒擴增子檢測，其中，該埃博拉病毒擴增子包含一對結(jié)合伙伴(如，生物素和鏈霉親和素)的一個成員，且該橫向流裝置包含該成對伙伴的另一個成員；并提供檢測該擴增子的手段(如，比色法)。本發(fā)明的方法中使用的逆轉(zhuǎn)錄酶包括，但不限于，maloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(mmlvrt)及其包含相對于野生型mmlvrt突變的衍生物或變異型；禽成髓細(xì)胞瘤病毒(amvrt)及其包含令它們相對熱穩(wěn)定的突變的衍生物或變異型；魯斯氏肉瘤病毒(rsv)rt(如，omniscript、qiagen)及其衍生物或變異型；以及焦磷酸酯逆轉(zhuǎn)錄酶(pyroreversetranscriptase)(如，pyroscriptluceigen)及其衍生物或變異型，us7,094,539中揭示的一種rt，該專利通過引用而以其整體并入本文，或用于rtpcr和轉(zhuǎn)錄組分析的商用高保真恒溫逆轉(zhuǎn)錄酶(如，lucigen)。一種具體實施形式中，在56度，該引物與rna或擴增子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。一種具體實施形式中，超過50％的引物序列必需與該靶標(biāo)核酸分子互補。一種具體實施形式中，該rt引物長度約為18個堿基。一種具體實施形式中，該逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)引物是隨機引物(如，每個序列位置可能是四種堿基的任意一種，這些引物與該靶標(biāo)雜交)。一種具體實施形式中，該rt引物是六聚體、七聚體、八聚體、或九聚體。一種具體實施形式中，該rt源自嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geo嗜熱脂肪芽孢桿菌)，是m-mlvrt(即，superscript/lifetech、maxima/thermo-fisher)及/或其突變體/衍生物、amvrt(即，thermoscript/lifetech)及/或其突變體/衍生物、rsvrt(即，omniscript/qiagen)及/或其突變體/衍生物。本發(fā)明的方法提供高度敏感性。一種具體實施形式中，ebov是以1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、或1x109復(fù)本的ebovrna每毫升血液檢測的。另一具體實施形式中，本發(fā)明提供每反應(yīng)約1至10之間(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)復(fù)本的rna的檢測。通過從罹患或疑似罹患ebov感染的個體獲得樣品(如，生物樣品)或通過從家、病房、運輸工具獲得已經(jīng)或疑似被埃博拉病毒或含有ebov的生物流體污染的環(huán)境樣品，檢測ebov(或其它病毒)。一種具體實施形式中，通過獲得血液樣品、黏液樣品、糞便或通過擦拭被影響的組織而獲得生物樣品。可從鼻、咽、眼、或其它黏膜取得拭片。尸檢中，可從死者的血液或組織收集樣品。有利的是，本發(fā)明的診斷方法適用于近乎任何情況。ebov是包括利比里亞、尼日利亞、幾內(nèi)亞和塞拉利昂的西非大部分地區(qū)的流行病。西非的許多地區(qū)缺少基本的醫(yī)療設(shè)施和診斷實驗室。本發(fā)明可用于電池供電的手持裝置，這便于在不存在電力供應(yīng)的地區(qū)測試生物樣品。此外，本方法足夠簡單，它們能由接受有限的診斷技術(shù)使用訓(xùn)練的醫(yī)務(wù)人員實施。本發(fā)明提供使用恒溫核酸擴增反應(yīng)來快速鑒別ebov或其它病毒感染的方法，該方法可對從粗制生物樣品中提取的rna進行檢測。在疾病過程的早期，個體的生物樣品如血液樣品中僅存在低水平的病毒。若需要，可使用該領(lǐng)域已知的方法，舉例而言，通過加入peg和nacl令病毒體從樣品中沉淀，隨后使用納米孔過濾器將病毒體從樣品中濾出，富集樣品中存在的病毒體，從而提供對病毒多核苷酸的早期檢測?？墒褂帽景l(fā)明的方法和組合物監(jiān)控可能已經(jīng)暴露于埃博拉病毒(或其它病毒)的個體的疾病狀態(tài)和對該對象的治療。一種具體實施形式中，監(jiān)控對埃博拉病毒多核苷酸(或其它病毒多核苷酸)的檢測，而該病毒多核苷酸存在于體液如唾液、汗液、淚液、體腔中的蓄積液、尿液、精液、陰道分泌物、腦脊液、淋巴液、糞便、痰、液體消化物、嘔吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血漿中。舉例而言，該監(jiān)控可用于診斷該試驗對象罹患埃博拉病毒(或其它病毒)，或確定特定藥物在個體或在評價疾病級數(shù)中的功效。核酸擴增方法核酸擴增技術(shù)已經(jīng)提供了理解病原生物體如ebov或其它rna病毒的復(fù)雜生物過程、檢測、鑒別和定量的手段。本發(fā)明提供對生物樣品中ebov反義rna基因組的檢測，包括使用逆轉(zhuǎn)錄酶從rna基因組合成ebovdna分子，隨后以恒溫切口擴增反應(yīng)來擴增該dna。聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)是常用來擴增dna的熱循環(huán)依賴性核酸擴增技術(shù)，由重復(fù)加熱和冷卻的循環(huán)組成，該循環(huán)用于以dna聚合酶進行dna解鏈和dna的酶促復(fù)制反應(yīng)。實時定量pcr(qpcr)是用來定量生物樣品中給定核酸序列的復(fù)本數(shù)的技術(shù)。目前，qpcr使用貫穿該反應(yīng)進行對反應(yīng)產(chǎn)物的實時檢測，并將該擴增概況與對照組的擴增比較，其中，該對照組在每一反應(yīng)開始時含有已知量核酸(或相對比率已知的核酸與未知的被測試核酸)。使用對照組的結(jié)果，典型基于該標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)擴增曲線的對數(shù)部分，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。基于其擴增曲線與標(biāo)準(zhǔn)對照數(shù)量的比較，使用這些數(shù)值對未知物的數(shù)量進行插值。除pcr外，現(xiàn)有的非熱循環(huán)依賴性擴增系統(tǒng)或恒溫核酸擴增技術(shù)包括，而不限于：切口擴增反應(yīng)、滾環(huán)擴增(rca)、解旋酶依賴性擴增(hda)、環(huán)圈介導(dǎo)的擴增(lamp)、鏈置換擴增(sda)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(tma)、自我持續(xù)序列復(fù)制(3sr)、基于核酸序列的擴增(nasba)、單一引物恒溫擴增(spia)、q-β復(fù)制酶系統(tǒng)、及重組酶聚合酶擴增(rpa)。恒溫切口擴增反應(yīng)具有與pcr熱循環(huán)的相似性。類似pcr，切口擴增反應(yīng)采用與靶標(biāo)序列互補的寡核苷酸序列，指代為引物。此外，靶標(biāo)序列的切口擴增反應(yīng)導(dǎo)致靶標(biāo)序列的對數(shù)增長，恰似標(biāo)準(zhǔn)pcr所為。與標(biāo)準(zhǔn)pcr不同，切口擴增反應(yīng)是在恒溫下進行的。標(biāo)準(zhǔn)pcr中，升溫以允許dna的兩條鏈區(qū)隔開來。切口擴增反應(yīng)中，在測試樣品中存在的特異性切口位點將靶標(biāo)核酸序列切口。聚合酶浸潤該切口位點，并開始進行被切口的靶標(biāo)核苷酸序列(所加入的外源性dna)的互補鏈合成，同時進行現(xiàn)有互補dna鏈的置換。該鏈置換復(fù)制過程不需要升溫。此時，引物分子從所加入的外源性dna退火為被置換的互補序列?，F(xiàn)在，聚合酶從該模板的3’端延伸，創(chuàng)建與先前被置換鏈互補的鏈。隨后，第二寡核苷酸引物退火為新合成的互補鏈并延伸，作成包括該切口酶識別序列的dna雙鏈。隨后，該鏈容易被后續(xù)的通過該聚合酶進行的鏈置換延伸而被切口，導(dǎo)致dna雙鏈的生成，所生產(chǎn)的dna雙鏈在原始靶標(biāo)dna的另一側(cè)具有切口位點。一旦被合成，繼續(xù)通過復(fù)制被新模板分子置換的鏈而令該分子指數(shù)性擴增。此外，通過切口平移合成在模板引入的切口位點的重復(fù)動作，擴增也從每一產(chǎn)物分子線性前進。結(jié)果為非常迅速增長的靶標(biāo)信號擴增；比pcr熱循環(huán)迅速得多，擴增在不超過10分鐘內(nèi)完成。切口擴增檢驗本發(fā)明提供對在恒溫切口擴增檢驗中擴增的ebov靶標(biāo)核酸分子的檢測?？捎糜诒疚闹薪沂痉椒ǖ木酆厦改艽呋塑账岬牟⑷耄匝由戽I結(jié)至靶標(biāo)核酸分子的寡核苷酸(如，引物)的3'羥基端及/或位于具有鏈置換活性的雙鏈dna分子中切口位點的3'羥基端。該聚合酶也缺乏5'-3'核酸外切酶活性或該活性大幅度降低，且可包括那些嗜熱性聚合酶。對于牽涉在引物區(qū)域具有2’-改性核苷酸且包含6個3’-端核苷酸的引物的方法，可使用的dna聚合酶包括從嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophillus，也歸類為geobacillusstearothermophillus)分離、以及從密切相關(guān)的菌株、分離物和包含嗜熱菌屬的物種中分離的dna聚合酶i的衍生物和變異型，其缺乏5'-3'核酸外切酶活性或該活性大幅度降低，且具有鏈置換活性。例示性聚合酶包括，但不限于，bstdna聚合酶i的大片段、gstdna聚合酶i的大片段、和gkadna聚合酶i的大片段?？捎糜诒疚闹薪沂痉椒ǖ那锌趧┦悄茏R別并結(jié)合至雙鏈核酸分子中的特定結(jié)構(gòu)的化學(xué)整體，當(dāng)結(jié)合至其所識別的特異性結(jié)構(gòu)時，其破壞上部鏈上相鄰核苷酸間磷酸二酯鍵的速率大幅高于破壞底部鏈上相鄰核苷酸間磷酸二酯鍵的速率，從而在該切口位點之前的末端核苷酸上創(chuàng)建自由的3’-羥基，而該自由羥基可通過5’-3’-核酸外切酶不足的鏈置換聚合酶延伸。在本文中揭露方法的優(yōu)選具體實施形式中，該“切口劑”裂解上部鏈磷酸二酯鍵的速率接近100％，而裂解底部鏈磷酸二酯鍵的速率接近0％。本文中揭示的方法中使用的切口劑，可以是酶，即傳遞多個底物分子的自我再生催化劑；或僅以等摩爾比方式傳遞單一底物分子的非再生性催化劑。切口酶結(jié)合雙鏈dna并裂解該雙鏈性雙螺旋的一條鏈。本發(fā)明的方法中，該切口酶裂解上部鏈(包括該切口劑識別位點的5’-3’序列的鏈)。本文中揭露的本發(fā)明的一個特別的具體實施形式中，切口酶僅裂解上部鏈和該識別位點的3’下游。例示性具體實施形式中，該反應(yīng)包含使用裂解或切口該結(jié)合位點下游的切口酶，因此，產(chǎn)物序列不含有該切口位點。使用裂解該結(jié)合位點下游的酶，使得該聚合酶更容易延伸而不必一定置換該切口酶。事實上，該切口酶在與聚合酶相同的反應(yīng)條件下起作用。例示性切口酶包括，但不限于，n.bst9i、n.bstsei、nb.bbvci(neb)、nb.bpu10i(fermantas)、nb.bsmi(neb)、nb.bsrdi(neb)、nb.btsi(neb)、nt.alwi(neb)、nt.bbvci(neb)、nt.bpu10i(fermentas)、nt.bsmai、nt.bspd6i、nt.bspqi(neb)、nt.bstnbi(neb)、和nt.cvipii(neb)。切口酶識別位點的序列提供于表1中。表1.切口酶識別序列切口酶也包括通過改性限制性核酸內(nèi)切酶的裂解活性而創(chuàng)造的工程切口酶(nebexpressionsjuly2006,vol1.2)。當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶結(jié)合至它們在dna中的識別序列時，每一酶中用于水解每一鏈的兩個催化位點驅(qū)使兩個平行進行的單獨的水解反應(yīng)?？杉庸じ淖兊南拗菩悦福钇鋬H水解該雙鏈中的一條鏈，以生產(chǎn)“被切口的”(3′-羥基,5′-磷酸酯)而非裂解的dna分子。切口酶也可包括改性的crispr/cas蛋白、轉(zhuǎn)錄活化子樣效應(yīng)子核酸酶(talens)、以及具有切口酶活性的鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶。切口擴增反應(yīng)典型包含核苷酸如，舉例而言，三磷酸二脫氧核糖核苷酸(dntps)。該反應(yīng)也可在包括可檢測部分的dntps的存在下進行，該可檢測部分包括但不限于放射性標(biāo)記(如，32p、33p、125i、35s)、酶(如，堿性磷酸酶)、熒光標(biāo)記(如，異硫氰酸熒光素(fitc))、生物素、抗生物素蛋白、地高辛、抗原、半抗原、或熒光染料。該反應(yīng)進一步包含某些供養(yǎng)該切口酶和聚合酶活性的鹽和緩沖劑。有利的是，該切口擴增反應(yīng)在大體上恒溫的條件下進行，其中，在擴增反應(yīng)進程中，該反應(yīng)的溫度大于或小于恒定值。因為該溫度不需要在較高溫度與較低溫度之間循環(huán)，切口擴增反應(yīng)可在難以進行傳統(tǒng)pcr的條件下進行。典型地，該反應(yīng)在約35℃與90℃之間(如，約35、37、42、55、60、65、70、75、80、或85℃)進行。有利的是，以高精確度維持溫度并不是必需的。溫度的一些改變是可以接受的。將用于擴增反應(yīng)的引物集合選擇為其δδg’s≤-15、-16、17、-18、-19、-20、-25、-30kcal/mole或更低?？赏ㄟ^增加一種或多種寡核苷酸(如，一種或多種引物及/或探針)的濃度及/或其比例而改變擴增反應(yīng)的運行特性。高濃度的引物也促進引物二聚體的形成。多種具體實施形式中，引物的濃度為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000nm或更大。也可使用解鏈溫度(tm)修飾劑和反應(yīng)速率修飾劑來降低該寡核苷酸的解鏈溫度，該修飾劑為例如(但不限于)乙二醇和甘油。此外，dna聚合酶反應(yīng)速率修飾劑(如，dntp和鎂濃度)可用來改變反應(yīng)速率，以導(dǎo)致更大的定量精確度。特別的具體實施形式中，該正向引物和反向引物的5’尾部序列具有相同的核酸序列。本發(fā)明提供實時監(jiān)控切口擴增反應(yīng)的方法，包括，舉例而言，使用本文中揭示的擴增策略。一種具體實施形式中，定量核酸擴增采用靶標(biāo)核酸擴增以及并行的已知量的對照擴增。靶標(biāo)核酸的量可計算為絕對定量或基于該對照來源(外源性對照或內(nèi)源性對照)的相對定量(半定量)。通過將未知的對數(shù)閾值擴增與一系列已知靶標(biāo)序列在單獨的一組反應(yīng)中或在相同的反應(yīng)中比較，可實現(xiàn)未知核苷酸序列的定量；或作為產(chǎn)生閾值的內(nèi)部內(nèi)源性或外源性共擴增產(chǎn)物，表明一陽性結(jié)果(如果未知物超過閾值)或一陰性結(jié)果(如果未知物不超過閾值)。本發(fā)明也提供設(shè)計切口劑依賴性恒溫鏈置換擴增檢驗而不進行大批候選正向引物及/或大批反向引物的實驗篩選的方法。在具有tm≥檢驗溫度(如，～55℃)的中心部位，靶標(biāo)序列內(nèi)的35至70bp長的區(qū)域被鑒別為具有12至20bp序列。根據(jù)上述準(zhǔn)則，鑒別該15至20bp長的中心部位上游和下游緊鄰的12bp至20bp長的序列。所選擇的上游和下游相鄰雙鏈序列的tm彼此偏差小于±3℃。通過將用于形成穩(wěn)定的二聚體的引物的5’-尾部區(qū)域與該12至20堿基的上游相鄰序列的5’-末端和該12至20堿基的下游相鄰序列的互補鏈的5’-端接合，創(chuàng)造正向引物和反向引物的靶標(biāo)特異性配對。當(dāng)將該正向引物、反向引物、以及探針組合時，驅(qū)動與探針互補的鏈的合成的引物相對于另一引物過量，兩者的摩爾比為約1.1:1至10:1。該檢驗中引物的合并濃度不高于1000nm。該檢驗設(shè)計方法也可用來將用于擴增子≤70bp的預(yù)驗證pcr檢驗轉(zhuǎn)變?yōu)榍锌趧┮蕾囆院銣劓溨脫Q擴增檢驗。引物設(shè)計用于引物設(shè)計的傳統(tǒng)方法已經(jīng)聚焦在引物解鏈溫度、引物退火溫度、gc(鳥嘌呤和胞嘧啶)含量、引物長度、和最小化引物與除靶標(biāo)核酸外全部物質(zhì)的相互作用(見，如，www.premierbiosoft.com/tech_notes/pcr_primer_design.html)。與這些方法相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以術(shù)語生成自由能(δg)表達的形成穩(wěn)定的引物/二聚體的引物，在核酸擴增反應(yīng)中起的作用可預(yù)見。盡管自由能(δg)和解鏈溫度(tm)分擔(dān)焓(δh)和熵(δs)的主要成分，δg值和tm值以不同方式導(dǎo)出且不具有相關(guān)性，將給定δg與給定tm值關(guān)聯(lián)的唯一方法是明確知道導(dǎo)出這兩個值的δh值和δs值(manthey,“mfold,deltag,andmeltingtemperature”and2011integrateddnatechnologies)。圖1至11關(guān)于最佳引物的設(shè)計?？墒褂迷擃I(lǐng)域已知的公式計算分子間引物結(jié)構(gòu)的生成自由能(δg)。大量程序可用于確定多種分子內(nèi)和分子間引物結(jié)構(gòu)的生成和計算其δg，包括，舉例而言，mfold和unafold預(yù)測算法(見，如，markhamandzuker.unafold:softwarefornucleicacidfoldingandhybridization.bioinformatics:volume2,chapter1,pp3-31,humanapressinc.,2008；zukeretal.algorithmsandthermodynamicsforrnasecondarystructureprediction:apracticalguideinrnabiochemistryandbiotechnology,11-43,natoasiseries,kluweracademicpublishers,1999；m.zuker.predictionofrnasecondarystructurebyenergyminimization.methodsinmolecularbiology,267-294,1994；jaegeretal.predictingoptimalandsuboptimalsecondarystructureforrna.inmolecularevolution:computeranalysisofproteinandnucleicacid序列s,methodsinenzymology183,281-306,1990；zuker.onfindingallsuboptimalfoldingsofanrna分子.science244,48-52,1989)。oligoanalyzer3.1是用于引物設(shè)計的一種此類應(yīng)用程序(www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/)。舉例而言，參照oligoanalyzer3.1，可使用下列參數(shù)實施δg的計算：靶標(biāo)類型：dna；寡核苷酸濃度：0.25μm；na+濃度：60mm；mg++濃度：15mm；以及，dntps濃度：0.3mm。3’識別區(qū)域本發(fā)明提供具有3’識別序列的引物，該3’識別序列的引物-靶標(biāo)的生成是穩(wěn)定的(δg≤約-20kcal/mol或更低)且具有提升核酸擴增反應(yīng)效能的潛力。該3’識別區(qū)域特異性結(jié)合至核酸分子，例如該核酸分子的互補序列。某些具體實施形式中，該3’識別區(qū)域具有與核酸序列的12、13、14、15、16、17、18、19、或20個或更多堿基互補的序列。特別的具體實施形式中，該3’識別區(qū)域包含一種或多種肌苷堿基。特別的具體實施形式中，該3’識別區(qū)域包含不超過2/12肌苷。多種具體實施形式中，引物-靶標(biāo)解鏈溫度比該檢驗的擴展溫度低大于或等于8°或6℃(tm≥檢驗溫度-8°)。特別的具體實施形式中，該3’識別序列包含12至20、12至17、或12至14個堿基。特別的具體實施形式中，引物-靶標(biāo)的生成比自身二聚體的生成更穩(wěn)定(如，δδg≤約-15、-16、-17、-18、-19、-20kcal/mol或更低)。優(yōu)選該3’識別序列不含有自互補序列、短的反向重復(fù)序列(如，>4個堿基/重復(fù))、或反而促進分子內(nèi)相互作用的序列，這些序列具有干擾引物-靶標(biāo)退火的潛力。一種具體實施形式中，引物被設(shè)計為具有56℃的tm，且在引物的末端具有4個可能不對退火起作用的序列特異性堿基。一種具體實施形式中，該引物是16聚體、17聚體、18聚體、19聚體、20聚體、或21聚體。特別地，本發(fā)明的具有3’識別序列的引物可用于切口擴增檢驗中。此外，該ebov或其它病毒靶標(biāo)特異性的3’識別區(qū)域包含一種或多種2’改性的核苷酸(如，2’-o-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-烷基、2’-烯丙基、2'-o-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、2’-羥基(rna)、4’-硫、4’-ch2-o-2’-橋、4’-(ch2)2-o-2’-橋、及2'-o-(n-甲基氨基甲酸酯))。不欲受縛于理論，假定將一種或多種2’改性的核苷酸并入識別區(qū)域降低或消除引物/模板的分子間及/或分子內(nèi)相互作用(如，引物二聚體的生成)，且因此降低或消除恒溫控制中的背景信號。該2’改性的核苷酸優(yōu)選具有與靶標(biāo)序列配對的堿基。特別的具體實施形式中，該ebov或其它病毒靶標(biāo)特異性識別區(qū)域內(nèi)的兩個或更多個2’改性的核苷酸(如，2、3、4、5或更多個2’改性的核苷酸)是連續(xù)的(如，改性的核苷酸嵌段)。一些具體實施形式中，該2’改性的核苷酸嵌段位于該靶標(biāo)特異性識別區(qū)域的3’端。其它具體實施形式中，該2’改性的核苷酸嵌段位于該ebov或其它病毒靶標(biāo)特異性識別區(qū)域的5’端。當(dāng)該2’改性的核苷酸嵌段位于該靶標(biāo)特異性識別區(qū)域的5’端時，該2’改性的核苷酸可通過一種或多種未改性的核苷酸(如，2、3、4、5或更多個2’未改性的核苷酸)與切口位點區(qū)隔。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種或多種2’改性核苷酸或2’改性核苷酸嵌段的定位改變了擴增的動力學(xué)。當(dāng)一種或多種2’改性的核苷酸或2’改性的核苷酸嵌段位于或接近該識別區(qū)域的5’端或鄰近該切口位點時，實時擴增反應(yīng)顯示檢測時間縮短。此外，信號曲線收縮且該曲線的斜率變更。相關(guān)的具體實施形式中，可使用具有一種或多種2’改性核苷酸的引物的比來改變檢測所需時間及/或用于反應(yīng)“調(diào)諧”的反應(yīng)效率，導(dǎo)致對反應(yīng)動力學(xué)的可預(yù)見控制。增加在該識別序列3’端具有一種或多種2’改性核苷酸的引物與在該識別序列5’端具有一種或多種2’改性核苷酸的引物的比，收縮了信號曲線并變更了該曲線的斜率。提供用來操縱檢測時間以及反應(yīng)效率的手段對于能夠“調(diào)諧”反應(yīng)是有利的。使用內(nèi)部對照的相對定量需要符合兩個重要條件。首先，創(chuàng)建非競爭性反應(yīng)條件對于能夠改變反應(yīng)的檢測時間是有益的。因此，通過影響對照反應(yīng)以令其在較晚時間點(相對于感興趣的靶標(biāo))可檢測，甚至當(dāng)感興趣的靶標(biāo)處于低初始豐度時，對照反應(yīng)也未在與感興趣的特異性靶標(biāo)的競爭中具有優(yōu)勢。其次，為了確保真實的相對豐度計算，需要該對照反應(yīng)和特異性靶標(biāo)反應(yīng)具有相匹配的效率。通過控制使用“調(diào)諧”條件控制每一反應(yīng)的效率，令反應(yīng)能被匹配，從而能夠進行令人滿意的相對定量計算。調(diào)諧該反應(yīng)可用來匹配定量pcr(qpcr)中靶標(biāo)核酸擴增及參考核酸擴增(如，內(nèi)標(biāo))的效率。此外，可改變靶標(biāo)核酸及內(nèi)標(biāo)的擴增曲線，因此，它們的擴增產(chǎn)物的檢測時間被區(qū)隔開來，同時對靶標(biāo)核酸擴增和內(nèi)標(biāo)擴增提供相同的效率。通過反應(yīng)內(nèi)寡核苷酸結(jié)構(gòu)的特異性組合以及比率，可創(chuàng)造能調(diào)諧反應(yīng)性能的條件。5’尾部二聚作用區(qū)域本發(fā)明提供具有能自體二聚體化的5’尾部區(qū)域的引物，它能提升ebov或其它病毒核酸擴增反應(yīng)性能。不欲受縛于理論，在核酸擴增反應(yīng)中，該引物退火為靶標(biāo)核酸作為引物二聚體。舉例而言，切口擴增引物具有存在于5’端的切口劑識別位點，該位點與該引物對于靶標(biāo)識別序列的結(jié)合特異性不相關(guān)。來自非特異性引物相互作用的非特異性背景產(chǎn)物，具有隔絕將會被該特異性產(chǎn)物的擴增所采用的反應(yīng)組分。多種具體實施形式中，同源二聚體的生成是穩(wěn)定的(如，δg≤約-30、-35、-40、-45、-50、-55、-60kcal/mol或更低)。多種具體實施形式中，該同源二聚體的解鏈溫度高于擴展反應(yīng)溫度。特別的具體實施形式中，該5’尾部區(qū)域具有回文序列。進一步的具體實施形式中，該5’尾部區(qū)域的長度為至少12個堿基(如，12、13、14,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個堿基)。其它具體實施形式中，該5’尾部區(qū)域的gc含量為80至90％。某些具體實施形式中，二聚體的生成比其它較不穩(wěn)定引物二聚體構(gòu)型的生成更穩(wěn)定(如，δδg≤約-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-25、-30、-35、-40kcal/mol或更低)。特別地，本發(fā)明的具有5’尾部的引物可用于切口擴增反應(yīng)。對于在切口擴增反應(yīng)中的用途，該5’尾部區(qū)域包含一種或多種切口劑識別位點，且該5’尾部區(qū)域具有對稱的逆序列。特別的具體實施形式中，該5’尾部區(qū)域含有偶數(shù)個核苷酸(如，22、24個核苷酸)。切口位點設(shè)計為定位在5’尾部區(qū)域的3’端核苷酸與3’識別區(qū)域的5’端核苷酸之間。不欲受縛于理論，當(dāng)3’區(qū)域為單鏈時，切口酶并不在該切口位點裂解。然而，當(dāng)該3’區(qū)域為雙鏈時，裂解出現(xiàn)在該切口位點(如，當(dāng)在核酸擴增反應(yīng)進程中將該引物并入雙鏈靶標(biāo)核酸分子時)。多種具體實施形式中，該5’尾部序列包含從5’至3’的逆切口酶識別序列，該識別序列可操作地鏈接至回文序列(或自互補序列)，而該回文序列可操作地鏈接至切口酶識別序列。某些具體實施形式中，該間隔區(qū)域是偶數(shù)個核苷酸(如，2、4、6等)?；趎t.bstnbi切口酶識別序列(5’-gagtc-3’)的具有2、4、及6個核苷酸間隔的例示性5’尾部包含根據(jù)下式的核酸序列：5’‐gactcn1n1’gagtc‐3’5’‐gactcn2n1n1’n2’gagtc‐3’5’‐gactcn3n2n1n1’n2’n3’gagtc‐3’其中，“n”是任意核苷酸(如，具有腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、或鳥嘌呤(g)核糖堿基)，且n1與n1’完全互補，n2與n2’互補，以及，n3與n3’互補，以此類推。可基于下述模板產(chǎn)生長度為24個核苷酸的具有nt.bstnbi識別序列的例示性5’尾部區(qū)域序列：5’-nnnngactcnnnnnngagtcnnnn-3’?；谶@一目標(biāo)，存在537,824個具有下述性質(zhì)的5’尾部序列：δg＝-48kcal/mole至62kcal/mole；δδg<-40kcal/mole；以及，gc含量為68％至84％。其中，提供1050個所選擇的序列，代表了0.2％的整體序列空間(248,832)?？苫谙率瞿０瀹a(chǎn)生長度為22個核苷酸的具有nt.bstnbi識別序列的例示性5’尾部區(qū)域序列：5’-nnnngactcnnnngagtcnnnn-3’?；谶@一目標(biāo)，存在248,832個具有下述性質(zhì)的5’尾部序列：δg＝-47kcal/mole至-55kcal/mole；δδg<-40kcal/mole；以及，gc含量為72％至82％。其中，提供200個所選擇的序列，代表了0.08％的整體序列空間(248,832)。靶標(biāo)核酸分子本發(fā)明的方法和組合物可用于擴增及/或鑒別測試樣品中的ebov或其它病毒核酸分子。從保護病毒核酸分子，包括ebov核酸分子的幾乎任何樣品擴增該靶標(biāo)序列。特別地，本發(fā)明的方法和組合物可用于rna病毒的擴增及/或鑒別。除ebov外，可使用本發(fā)明的方法和組合物檢測的例示性rna病毒包括，而不限于，人免疫缺陷病毒(hiv)、登革熱病毒、流感病毒(如，乙型流感病毒)、牛病毒性腹瀉病毒(如，bvdv基因型1)、黃熱病病毒、西尼羅河病毒、丙肝病毒、拉沙病毒、黃病毒、沙粒病毒、及單鏈rna病毒。例示性測試樣品包括體液(如，唾液、汗液、淚液、體腔內(nèi)蓄積液、尿液、精液、陰道分泌物、腦脊液、淋巴液、糞便、痰、液體消化物、嘔吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血漿)、組織提取物、培養(yǎng)基(如，其中已經(jīng)生長有細(xì)胞如病原體細(xì)胞的液體)、環(huán)境樣品、農(nóng)產(chǎn)品或其它食品、及其提取物，以及dna鑒別標(biāo)簽。若需要，該樣品在加入切口擴增反應(yīng)之前純化，純化方法為典型用于從生物樣品分離核酸分子的任何標(biāo)準(zhǔn)方法。一種具體實施形式中，引物擴增病原體的靶標(biāo)核酸，以檢測樣品中ebov或其它病毒的存在。對于環(huán)境應(yīng)用，測試樣品可包括水、可能已經(jīng)暴露于ebov感染者的建筑材料(如，干式墻、吊頂板、壁板、紡織品、壁紙、和地板覆蓋物)的液體提取物、環(huán)境拭片、或任何其它樣品。本發(fā)明的方法提供對1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、或1x109復(fù)本ebovrna每毫升血液的檢測。應(yīng)用本發(fā)明的使用引物的靶標(biāo)核酸擴增，具有可用于病毒(如，ebov)核酸分子的快速檢測的特征。本發(fā)明的組合物和方法可用于需要快速診斷應(yīng)答(如，在20、15、10、9、8、7、6、5分鐘或更短時間內(nèi)的可檢測擴增)的人類診斷。特別的具體實施形式中，本發(fā)明提供ebov切口擴增反應(yīng)檢驗在臨床環(huán)境下或該領(lǐng)域中在人類診斷和獸醫(yī)診斷中的用途。其它具體實施形式中，本發(fā)明提供切口擴增反應(yīng)檢驗在熱循環(huán)設(shè)備不可用或太過昂貴的地區(qū)的診斷領(lǐng)域工作中的用途。再其它的具體實施形式中，本發(fā)明提供切口擴增反應(yīng)檢驗在需要快速定量應(yīng)答的臨床環(huán)境中的用途?？蓹z測的寡核苷酸探針本發(fā)明提供使用不可擴增的可檢測多核苷酸探針在切口擴增反應(yīng)中對靶標(biāo)核酸分子或其擴增子的檢測，該探針包含至少一個聚合酶捕獲分子(如，核苷酸改性或其它部分，其使得該寡核苷酸能結(jié)合靶標(biāo)核酸分子但不能支持使用該可檢測寡核苷酸探針作為靶標(biāo)的聚合酶擴展)。不欲受縛于理論，一種或多種不允許聚合酶前進的部分的存在，似乎造成了聚合酶被捕捉入除該寡核苷酸外的非核酸骨架中，或通過復(fù)制聚合酶的停頓而捕獲聚合酶(即，c3-間隔物、損壞的dna堿基、其它間隔物部分、o-2-me堿基)。這些構(gòu)造因此防止或降低切口擴增反應(yīng)進程中該探針的非法擴增。這將它們與傳統(tǒng)檢測探針區(qū)別開，而傳統(tǒng)探針必需在切口擴增反應(yīng)結(jié)束時加入以防止探針的擴增。已經(jīng)證實，傳統(tǒng)檢測探針不能實時檢測切口擴增反應(yīng)。若將傳統(tǒng)檢測探針并入切口擴增反應(yīng)中，這些傳統(tǒng)檢測探針將與靶標(biāo)同時擴增。由于反應(yīng)開始時檢測探針的起始分子數(shù)目，這些檢測分子的擴增遮蔽了合法靶標(biāo)擴增子的檢測。本發(fā)明提供不可擴增的可檢測多核苷酸探針，其包含至少一個聚合酶捕獲分子。本發(fā)明的聚合酶捕獲分子包括，但不限于，核苷酸改性或其它部分，其阻斷通過復(fù)制dna聚合酶的擴展，從而防止檢測分子的擴增；但可允許與靶標(biāo)分子或該靶標(biāo)分子的擴增復(fù)本間的適宜雜交或核苷酸間隔。一種具體實施形式中，本發(fā)明的可檢測寡核苷酸探針包含防止或降低檢測分子的非法擴增的3碳間隔物(c3-間隔物)。一種具體實施形式中，可檢測寡核苷酸探針包含一種或多種具有提升的與互補核苷酸親和性的改性核苷酸堿基。改性堿基的實例包括，但不限于，2'氟酰胺化物和2'omerna酰胺化物(也起聚合酶捕獲分子的作用)。本發(fā)明的可檢測寡核苷酸探針可合成為具有不同顏色的熒光團，且可設(shè)計為與幾乎任何靶標(biāo)序列雜交。就其卓越的特異性而言，本發(fā)明的不可擴增的可檢測多核苷酸探針被用來檢測樣品中的單一靶標(biāo)核酸分子，或與各自結(jié)合不同靶標(biāo)核酸分子的可檢測寡核苷酸探針合用。據(jù)此，本發(fā)明的不可擴增的可檢測多核苷酸探針可用來檢測相同反應(yīng)中的一種或多種靶標(biāo)核酸分子，允許這些靶標(biāo)的同步檢測。本發(fā)明涵蓋此類熒光團與本文揭示的可檢測寡核苷酸探針的協(xié)作用途。硬件和/或軟件的實現(xiàn)本文揭示的方法可在多用途或特異性程序化的硬件或軟件上實現(xiàn)。舉例而言，該方法可通過計算機可讀媒介實現(xiàn)。據(jù)此，本發(fā)明也提供配置為實施根據(jù)本發(fā)明任何具體實施形式的算法及/或方法的軟件及/或計算機程序產(chǎn)品。如何配置可實施本發(fā)明所提供的算法及/或方法的軟件，是該領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。該計算機可讀媒介可以是非瞬時的(non-transitory)及/或瞬時(tangible)的。舉例而言，該計算機可讀媒介可以是易失性存儲器(如，隨機存取存儲器等)或非易失性存儲器(如，只讀存儲器、硬盤、軟盤、磁帶、光碟、紙質(zhì)表格、打孔卡(punchcard)等)。該計算機可執(zhí)行指令可以適當(dāng)?shù)挠嬎銠C語言或若干語言的組合寫入?；镜挠嬎闵飳W(xué)方法揭示于例如下述文獻中：setubalandmeidanisetal.,introductiontocomputationalbiologymethods(pwspublishingcompany,boston,1997)；salzberg,searles,kasif,(ed.),computationalmethodsinmolecularbiology,(elsevier,amsterdam,1998)；rashidiandbuehler,bioinformaticsbasics:applicationinbiologicalscienceandmedicine(crcpress,london,2000)；以及oueletteandbzevanisbioinformatics:apracticalguideforanalysisofgeneandproteins(wiley&sons,inc.,2nded.,2001)。本發(fā)明也可利用多種計算機程序產(chǎn)品和軟件，該產(chǎn)品和軟件用于各種目標(biāo)，如探針設(shè)計、數(shù)據(jù)管理、分析、和儀器操作(見，us5,593,839、us5,795,716、us5,733,729、us5,974,164、us6,066,454、us6,090,555、us6,185,561、us6,188,783、us6,223,127、us6,229,911、及us6,308,170)。據(jù)此，本發(fā)明可具有優(yōu)選的具體實施形式，該具體實施形式包括用于提供在網(wǎng)絡(luò)如internet上提供基因信息的方法，如us10/197,621、us10/063,559(公開號us20020183936)、us10/065,856、us10/065,868、us10/328,818、us10/328,872、us10/423,403、及us60/482,389中所示。試劑盒本發(fā)明也提供用于擴增ebov或其它rna病毒核酸分子的試劑盒。此類試劑盒可用于對從個體獲得的生物樣品中的ebov或其它rna核酸的檢測或定量。本發(fā)明的試劑盒可包含，舉例而言，一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、正向引物和反向引物、以及一種或多種本文中揭示的切口酶、以及可檢測的探針。對于ebov或其它rna待擴增的應(yīng)用，該試劑盒中可包括一種或兩種切口酶。對于多種病原體序列待擴增的應(yīng)用，設(shè)計用于那些靶標(biāo)序列的模板包含用于相同切口酶的切口酶位點，則可包括一種或兩種切口酶。對于模板被不同切口酶識別的應(yīng)用，該試劑盒中可包括多種切口酶如，舉例而言，3種或更多。一方面，本發(fā)明提供用于核酸擴增的試劑盒，該試劑盒包含逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、初級引物、二級引物、具有與該引物內(nèi)切口酶結(jié)合位點的特異性的切口酶、以及三磷酸脫氧核苷酸(dntp’s)(如，處于含有足以用于擴增的組分的緩沖溶液中)。多種具體實施形式中，該初級引物和二級引物各自具有與靶標(biāo)序列互補或大體上互補的3’-端特異性識別區(qū)域序列，其中，該端特異性識別區(qū)域包含一種或多種2’改性核苷酸；含有位于3’端特異性識別區(qū)域序列上游的切口酶結(jié)合位點的5’端尾部區(qū)域，其可與自身二聚體化(如，自互補)。特別的具體實施形式中，一種或多種引物以引物二聚體構(gòu)造存在(如，通過在tm左右加熱再緩慢冷卻)。本發(fā)明的試劑盒也可包含處于任何數(shù)目的單獨容器、小包、管(如，<0.2ml、0.2ml、0.6ml、1.5ml、5.0ml、>5.0ml)、小瓶、微量滴定板(如，<96孔、96孔、384孔、1536孔、>1536孔)、陣列帶(arraytape)等中的一種或多種組分或可在這些容器內(nèi)以多種組合方式組合的組分。多種具體實施形式中，該試劑盒進一步包含一對能結(jié)合并擴增參考序列的引物。特別的具體實施形式中，該試劑盒包含以引物二聚體構(gòu)型存在的一種或多種引物(如，通過在tm作用加熱并緩慢冷卻而生產(chǎn)的)。又其它的具體實施形式中，該試劑盒包含無菌容器，該無菌容器含有該引物；這些容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、包、袋、泡罩包裝、或該領(lǐng)域中已知的其它適當(dāng)容器。這些容器可由塑料、玻璃、層壓板、金屬箔、或其它適用于容納核酸的材料制作。該試劑盒的組分可存在于例如一種或多種容器中，舉例而言，全部組分可處于一個容器內(nèi)，或者，舉例而言，酶可處于與引物隔離的容器內(nèi)。舉例而言，該組分可以是干燥的(如，粉末)或處于穩(wěn)定緩沖液(如，經(jīng)化學(xué)穩(wěn)定化的、經(jīng)熱穩(wěn)定化的)中。舉例而言，干燥組分可通過凍干、真空和離心輔助干燥、及/或環(huán)境干燥制備。多種具體實施形式中，該聚合酶和切口酶為處于單一容器內(nèi)的凍干形式；而該引物是處于不同容器內(nèi)的或經(jīng)凍干、冷凍干燥形式或處于緩沖液中。一些具體實施形式中，該聚合酶、切口酶、及引物是處于單一容器內(nèi)的凍干形式。其它具體實施形式中，該聚合酶和切口酶可隔離處于不同的容器中。試劑盒可進一步包含，舉例而言，該反應(yīng)中使用的dntps、或改性核苷酸、用于該反應(yīng)的比色皿或其它容器、或裝有用于將凍干組分再水合的水或緩沖液的小瓶。舉例而言，該緩沖液可以適用于聚合酶和切口酶兩者的活性。本發(fā)明的試劑盒也可包含實施本文中揭示的一種或多種方法的使用指南，及/或本文中揭示的一種或多種組分或試劑的說明書。使用指南及/或說明書可以是印刷形式或可包括于試劑盒插頁中。試劑盒也可包括提供這些使用指南或說明書的網(wǎng)址的書面說明。除非明確排除，本發(fā)明的實踐采用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)處于該領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。這些技術(shù)在下述例示文獻中具有完整解釋：《分子克?。簩嶒炇沂謨?第二版)》(“molecularcloning:alaboratorymanual”,secondedition(sambrook,1989))；《寡核苷酸合成》(“oligonecleotidesynthesis”(gait,1984))；《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(“animalcellculture”(freshney,1987))；《酶學(xué)方法》《實驗免疫學(xué)手冊》(“methodsinenzymology”“handbookofexperimentalimmunology”(weir,1996))；《哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因載體》(“genetransfervectorsformammaliancells”(millerandcalos,1987))；《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(“currentprotocolsinmolecularbiology”(ausubel,1987))；《pcr：聚合酶鏈反應(yīng)》(“pcr:thepolymaerasechainreaction”,(mullis,1994))；《免疫學(xué)現(xiàn)代方法》(“currentprotocolsinimmunology”(coligan,1991))。這些技術(shù)可應(yīng)用在本發(fā)明的多核苷酸和多肽的生產(chǎn)中，且就其本身而論，可考慮用于本發(fā)明的制作和實踐中。特別有用于特別的具體實施形式的技術(shù)將在下文中討論。提出下述實施例以向該領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何制作并使用本發(fā)明的檢驗、篩查和治療方法的完整揭露和說明，且并非意欲限制發(fā)明人所認(rèn)為的發(fā)明范疇。[實施例]實施例1.用于ebov的一步和兩步實時逆轉(zhuǎn)錄-恒溫擴增檢驗一步反應(yīng)指代逆轉(zhuǎn)錄和擴增出現(xiàn)在單一反應(yīng)方法中的逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)反應(yīng)。兩步反應(yīng)指代逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，于該反應(yīng)中，首先進行逆轉(zhuǎn)錄，之后轉(zhuǎn)移至第二擴增反應(yīng)。測試檢驗1和檢驗2對于檢測ebov多核苷酸ebov的能力(圖1)。用于這些檢驗的引物顯示于圖2中。圖3a至3x顯示使用檢驗1和檢驗2獲得的擴增結(jié)果。使用這些檢驗來檢測人cdna背景中的ebovgblock復(fù)本。反應(yīng)條件指定。圖4顯示使用一步檢驗對人總rna背景中ebov的檢測。圖5顯示使用一步檢驗對人總rna背景中合成性ebovrna的檢測。圖6a至6c提供例示性說明用于擴增和檢測儀器的樣品處理的流程圖。圖7a和7b分別顯示從拭片和血液制備樣品的方法。一個工作實施例中，使用下述引物和探針序列檢測埃博拉病毒：正向引物gactcgatatcgagtcgcttcca[meoc]agttatc[meou][meoa][meoc][meoc][meog]反向引物gactcgatatcgagtcgaaatgc[meoa]acga[meoc][meoa][meoc][meoc][meou]探針gctacacgactttygctgaaggtagc外部引物cttcttagcttggggcagtatca引物：[meon]表明甲氧基堿基探針序列：小寫字母為干序列，大寫字母為識別序列1:51000nm0.3u/ul切口酶上述序列中，gagtc是切口酶識別位點。嘧啶提供對埃博拉病毒株包括扎伊爾型病毒株的簡并檢測。合成性dna靶標(biāo)：aagatgactgcaggagtcaatgcgcagttggtcccggcagaccaggcgaacattaccgaattttacaacaagtccctttcatcctacaaggagaatgaggagaacatccagtgtggggagaacttcatggacatggagtgcttcatgattctgaaccccagtcagcagctggcaattgccgtcttgtctctcacactgggcaccttcacagttctggagaacttgctggtgctgtgtgtcaccacagttatctaccgaggaacgactttcgctgaaggtgtcgttgcatttctgattccttcactcccgcagcctccgctgccggccctcttaccacttcatcattagcctggccgtggccgaccttctggggagtgtcatttttgtctacagctttgttgactttcatgtgttccaccgcaaggacagccccaacgtctttctcttcaaattgggtggggtcaccgcctccttcacggcctctgtaggcagcctcttcc合成性rna靶標(biāo)：rgrarcrurgrcrargrgrargrurcrurgrcrurgrcrururcrcrarcrargrururarurcrurarcrcrgrargrgrararcrgrarcrurururcrgrcrurgrarargrgrurgrurcrgrururgrcrarurururcrurgrarururcrcrururcrarcrurcrcrcrg一步反應(yīng)和兩步反應(yīng)都含有最終濃度為166.7nm的正向引物和最終濃度為833.3nm的反向引物，以及濃度為200nm的探針和0.1x的sybr綠(最終濃度)。此外，一步反應(yīng)和兩步反應(yīng)都含有最終濃度為1x的提取緩沖液2，該緩沖液包含trisph8.0、nh4+、na+、和mg2+；dntps；0.4u/ulbst聚合酶；以及0.3u/ulnt.bstnbi切口酶。除這些組分外，該一步反應(yīng)含有10u/ul的maxima逆轉(zhuǎn)錄酶；1.0u/ul的rna酶抑制劑(suberasein，由lifetechnologies生產(chǎn))。合成性rna中還加入了1.0u/ul的rna酶抑制劑，以防止降解。所使用的全部水均為購買的不含核酸酶的水。反應(yīng)在冰上混合并保持寒冷，直至在rochelc480上運行位置。rochelc480在雙色檢測下運行，以檢測calfluor紅610信標(biāo)信號(abs590nm/em610nm)和sybr綠信號(abs495nm/em520nm)。一步反應(yīng)在56℃下進行20分鐘。結(jié)果顯示在圖8中。兩步反應(yīng)如下進行：遵循新英格蘭生物實驗室(newenglandbiolabs)概述的設(shè)置條件(https://www.neb.com/protocols/2012/10/03/first-strand-cdna-synthesis-kit-using-protoscript-ii-reverse-transcriptase-m0368)，逆轉(zhuǎn)錄酶步驟在56℃進行5分鐘(隔熱)或在室溫進行5分鐘(圖9)。兩個rt溫度都產(chǎn)生了1x105復(fù)本靶標(biāo)每反應(yīng)的信號。該逆轉(zhuǎn)錄酶步驟之后，在lc480上于56℃進行15分鐘的擴增步驟。這一檢驗的結(jié)果在圖10中顯示。使用供應(yīng)商的計算法測定每反應(yīng)中表明的復(fù)本數(shù)。實施例2.復(fù)雜rna混合物中靶標(biāo)rna的檢測為了確定一步反應(yīng)和兩步反應(yīng)能否檢測rna分子的復(fù)雜混合物中的靶標(biāo)rna，將檢驗設(shè)計為用于檢測人總rna中的rpph1(rna酶prna組分)。一個工作實施例中，使用下述引物序列和探針序列檢測rpph1。引物：mn表示甲氧基堿基兩步反應(yīng)中，使用隨機六聚體引物將人rna(10ng)轉(zhuǎn)化為cdna，通過靶標(biāo)特異性序列的擴增來檢測rpph1(圖11a)。一步反應(yīng)中，使用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物通過靶標(biāo)特異性序列的擴增來檢測人rna(20ng)(圖11b)。實施例3.生物樣品中埃博拉病毒的檢測另一工作實施例中，使用一步檢驗來檢測與粗制血液制劑混合時的埃博拉病毒rna靶標(biāo)。通過下述制備粗制血液制劑：將全血(20μl)與十二烷基硫酸鈉(0.5％sds；20μl)混合，將該混合物在室溫孵化(3min)。孵化后，加入牛血清白蛋白(2％bsa；20μl)，所得混合物在室溫孵化(1min)。向該粗制血液制劑(1μl)加入合成性埃博拉病毒rna靶標(biāo)(1000復(fù)本)。反應(yīng)在rochelc480上以一式三份在56℃運行。結(jié)果顯示在圖12中。其它實驗中，一步檢驗?zāi)軈^(qū)別扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株rna分子與蘇丹型埃博拉病毒boniface株rna分子間。以扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株或蘇丹型埃博拉病毒boniface株感染veroe6細(xì)胞，并純化病毒rna。使用經(jīng)純化的扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株rna(683復(fù)本)或蘇丹型埃博拉病毒boniface株rna(650復(fù)本)運行反應(yīng)集合。對于每一集合，在rochelc480上運行四個平行反應(yīng)(10μl)。這些檢驗檢測了扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株rna(圖13；曲線集合a)，且不檢測蘇丹型埃博拉病毒boniface株rna(圖13；曲線集合b)。因此，扎伊爾型埃博拉病毒檢驗對于扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株是特異性的。使用從101至107復(fù)本靶標(biāo)rna的扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株rna多級稀釋和無靶標(biāo)的對照(ntc)樣品進行儀器比較。所測試的儀器包括rochelightcycler480ii、axxin檢測器、及douglasscientificamplifire擴增和檢測儀器。盡管觀察到一些儀器變化性，這些儀器全部可檢測ebovrna的寬范圍復(fù)本(圖14)。為了確定一步ebov檢驗的檢出下限，測試含有100、50、25、及12復(fù)本扎伊爾型埃博拉病毒mayinga株rna的無菌稀釋樣品。該一步反應(yīng)(10μl)在rochelightcycler480上運行，每一級稀釋至少進行10次平行測試。對于100和500復(fù)本的反應(yīng)，進行二十(20)次平行測試。對于25復(fù)本的反應(yīng)，進行四十(40)次平行測試。對于100和50復(fù)本每反應(yīng)的檢測，觀察到了100％(20/20)檢出率(圖15a和15b)。對于25復(fù)本每反應(yīng)的檢測，觀察到了95％(38/40)的檢出率(圖15c)。因此，這些結(jié)果顯示了甚至當(dāng)作為一步檢驗實施時的ebov檢驗的敏感性和特異性。實施例4.生物樣品中人免疫缺陷病毒(hiv)的檢測一個工作實施例中，在以gag蛋白質(zhì)序列為靶標(biāo)的一步檢驗中檢測人免疫缺陷病毒(hiv)。獲得純化的hivrna(亞型c)(seracare)，且使用一步hiv檢驗來測試通過cobastaqmanhiv-1v2.0測試進行定量的已知數(shù)量的hivrna。使用下述引物和探針序列：hgag(hivgag靶標(biāo))引物序列hgag.f2agactcgatatcgagtctgactagmcggaggmcmtmamgmamamghgag.f2bgactcgatatcgagtctgactagmcagaggmcmtmamgmamamghgag.r1agactcgatatcgagtctattgacmgctcmtmcmgmcmamchgag.r1bgactcgatatcgagtctactgacmgctcmtmcmgmcmamchgag.rt3.subc*gcatctaatttttcgcc(外部引物)hgag.probe.tcgcaagggagagagatgggtgcttgcg引物：mn表示甲氧基堿基探針序列：小寫字母＝干序列，大寫字母＝識別序列*外部引物序列對于hiv亞型c(所使用的純化rna樣品)具有特異性圖16a是顯示所使用序列的定位的擴增地圖。該外部引物的序列對于hiv亞型c(所使用的純化rna樣品)具有特異性。該一步hiv檢驗設(shè)計為具有兩組正向引物和反向引物，以負(fù)責(zé)群體中的序列變種。上述序列中，gagtc是切口酶識別位點。該一步反應(yīng)含有最終濃度為9nm的正向引物(hgag.f2a+hgag.f2b的1:1混合物)和最終濃度為91nm的反向引物(hgag.r1a+hgag.r1b的1:1混合物)，正向引物與反向引物的引物比約為1:10。使用最終濃度為200nm的探針和最終濃度為100nm的外部引物。此外，該一步反應(yīng)含有最終濃度為1x的運行緩沖液(runbuffer)，該緩沖液包含tris、k+、及mg2+；硫氰酸胍(gitc)；dntps；0.4u/ulbst聚合酶；和0.3u/ulnt.bstnbi切口酶。除了這些組分之外，該一步反應(yīng)含有0.2u/μl的amv逆轉(zhuǎn)錄酶高光譜活性xl(lifesciencesadvancedtechnologies)和0.5u/μl的rna酶抑制劑(superasin；thermofisher)。所使用的水全部不含核酸酶。使用calfluor紅610信標(biāo)信號(abs590nm/em610nm)的實時檢測來運行反應(yīng)。使用125、250、500、和1000復(fù)本的hivrna在56℃進行20分鐘的一步反應(yīng)。使用一步hiv檢驗來演示全復(fù)本數(shù)的hivrna的特異性檢測(圖16b)。實施例5.生物樣品中4型登革熱病毒(denv-4)的檢測一個工作實施例中，在以3’utr序列為靶標(biāo)的一步檢驗中檢測4型登革熱病毒(denv-4)。從包括病毒和宿主細(xì)胞rna兩者的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離總rna，并用于該一步denv-4檢驗中。因此，總復(fù)本數(shù)未知。使用下述引物和探針序列：den4(4型登革熱病毒)引物序列den4.f2gactcgatatcgagtccaaaaacmagcatattmgmamcmgmcden4.r1agactcgatatcgagtcagacagcmaggatcmtmcmtmgmgden4.r1bgactcgatatcgagtcagacagcmaggatcmtmgmtmgmgden4.extrt1tctgtgcctggattgat(外部引物)den4.probe.bcgcatctggtctttcccagcgatgcgden4.f2gactcgatatcgagtccaaaaacmagcatattmgmamcmgmc引物：mn表示甲氧基堿基探針序列：小寫字母＝干序列；大寫字母＝識別序列圖17a是顯示所使用序列的定位的擴增地圖。該一步denv-4檢驗設(shè)計為具有兩組正向引物和反向引物，以負(fù)責(zé)群體中的序列變種。上述序列中，gagtc是切口酶識別位點。該一步反應(yīng)含有最終濃度為83nm的正向引物和最終濃度為17nm的反向引物(den4.r1a+den4.r1b的1:1混合物)，正向引物與反向引物的引物比約為5:1。使用最終濃度為200nm的探針和最終濃度為100nm的外部引物。此外，該一步反應(yīng)含有最終濃度為1x的運行緩沖液，該緩沖液包含tris、k+、及mg2+；dntps；0.4u/ulbst聚合酶；和0.3u/ulnt.bstnbi切口酶。除了這些組分之外，該一步反應(yīng)含有0.2u/μl的amv逆轉(zhuǎn)錄酶高光譜活性xl(lifesciencesadvancedtechnologies)和0.5u/μl的rna酶抑制劑(superasin；thermofisher)。所使用的水全部不含核酸酶。使用calfluor紅610信標(biāo)信號(abs590nm/em610nm)的實時檢測來運行反應(yīng)。使用20pg總rna在56℃進行20分鐘的一步反應(yīng)。使用一步denv-4檢驗來演示4型登革熱病毒rna的特異性檢測(圖17b)。實施例6.生物樣品中乙型流感病毒的檢測一個工作實施例中，在以流感病毒片段7序列為靶標(biāo)的一步檢驗中檢測乙型流感病毒。從包括病毒和宿主細(xì)胞rna兩者的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離總rna，并用于該一步乙型流感病毒檢驗中。因此，總復(fù)本數(shù)未知。使用下述引物和探針序列：flub(乙型流感病毒)引物序列flub.f2agactcgatatcgagtcaaatgcamgatggtctcmamgmcmtmaflub.f2bgactcgatatcgagtcaaatgcamaatggtctcmamgmcmtmaflub.f2cgactcgatatcgagtcaaatgcamgatggtttcmamgmcmtmaflub.r3agactcgatatcgagtcctcctttmtcccattccatmtmcmamtmtflub.r3bgactcgatatcgagtcctcccttmtcccattccatmtmcmamtmtflub.r3cgactcgatatcgagtcctcctttmccccattccatmtmcmamtmtflub.extrt1attttggacgtcttctcc(外部引物)flub.extrt1bttttgaacgtcttctcc(外部引物)flub.probe.tgccaagctatgaacacagcaaacttggc引物：mn表示甲氧基堿基探針序列：小寫字母＝干序列；大寫字母＝識別序列圖18a是顯示所使用序列的定位的擴增地圖。該一步乙型流感病毒檢驗設(shè)計為具有三組正向引物和反向引物以及兩種外部引物，以負(fù)責(zé)群體中的序列變種。上述序列中，gagtc是切口酶識別位點。該一步反應(yīng)含有最終濃度為9nm的正向引物(flub.f2a+flub.f2b+flub.f2c的1:1:1混合物)和最終濃度為91nm的反向引物(flub.r3a+flub.r3b+flub.r3c的1:1:1混合物)，正向引物與反向引物的引物比約為1:10。使用最終濃度為200nm的探針和最終濃度為100nm的外部引物。此外，該一步反應(yīng)含有最終濃度為1x的運行緩沖液，該緩沖液包含tris、k+、及mg2+；dntps；0.4u/ulbst聚合酶；和0.3u/ulnt.bstnbi切口酶。除了這些組分之外，該一步反應(yīng)含有0.2u/μl的amv逆轉(zhuǎn)錄酶高光譜活性xl(lifesciencesadvancedtechnologies)和0.5u/μl的rna酶抑制劑(superasin；thermofisher)。所使用的水全部不含核酸酶。使用calfluor紅610信標(biāo)信號(abs590nm/em610nm)的實時檢測來運行反應(yīng)。使用來自不同分離物的總rna在56℃進行20分鐘的一步反應(yīng)。使用一步乙型流感病毒檢驗來演示全部分離物中乙型流感病毒rna的特異性檢測(圖18b)。實施例7.生物樣品中牛病毒性腹瀉病毒基因型1(bvdv1)的檢測一個工作實施例中，在以流感病毒片段7序列為靶標(biāo)的一步檢驗中檢測牛病毒性腹瀉病毒基因型1(bvdv1)。從包括病毒和宿主細(xì)胞rna兩者的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離總rna，并用于該一步bvdv1檢驗中。因此，總復(fù)本數(shù)未知。使用下述引物和探針序列：1型牛病毒性腹瀉病毒(bvdv1)引物序列bvdv1.f1agactcgatatcgagtcggcccacmtgtattgctmamcmtmgmamamabvdv1.f1bgactcgatatcgagtcggcccacmtgcactgctmamcmtmamamamabvdv1.r1gactcgatatcgagtctgtgatcmaactccmamtmgmtmgmcmcbvdv1.rt1vtatgttttgtataaaagttcatttg(外部引物)bvdv1.探針tcgctacatctctgctgtacatggtagcg引物：mn表示甲氧基堿基探針序列：小寫字母＝干序列；大寫字母＝識別序列圖19a是顯示所使用序列的定位的擴增地圖。該一步bvdv1檢驗設(shè)計為具有兩組正向引物和反向引物，以負(fù)責(zé)群體中的序列變種。上述序列中，gagtc是切口酶識別位點。該一步反應(yīng)含有最終濃度為9nm正向引物的(bvdv1.f1a+bvdv1.f1b的1:1混合物)和最終濃度為91nm的反向引物，正向引物與反向引物的引物比約為1:10。使用最終濃度為200nm的探針和最終濃度為100nm的外部引物。此外，該一步反應(yīng)含有最終濃度為1x的運行緩沖液，該緩沖液包含tris、k+、及mg2+；dntps；0.4u/ulbst聚合酶；和0.3u/ulnt.bstnbi切口酶。除了這些組分之外，該一步反應(yīng)含有0.2u/μl的amv逆轉(zhuǎn)錄酶高光譜活性xl(lifesciencesadvancedtechnologies)和0.5u/μl的rna酶抑制劑(superasin；thermofisher)。所使用的水全部不含核酸酶。使用calfluor紅610信標(biāo)信號(abs590nm/em610nm)的實時檢測來運行反應(yīng)。使用來自bvdv1病毒培養(yǎng)物(牛宿主細(xì)胞rna與病毒的混合物)及細(xì)胞培養(yǎng)物粗制裂解液(未稀釋和1:100稀釋)的純化rna(20pg/技術(shù)重復(fù)樣本)在56℃進行20分鐘的一步反應(yīng)。使用一步bvdv1檢驗來演示全部樣品中bvdv1rna的特異性檢測(圖19b)。實施例8：埃博拉病毒株的分子信標(biāo)識別例示性信標(biāo)blast對其輸出和病毒株列表：僅有信標(biāo)的病毒株列表：埃博拉病毒株間的擴增子相似性分析例示性blast對齊輸出和病毒株列表：病毒株列表：其它實施形式從前述說明書可見，可對本文中揭示的本發(fā)明做出變更和修改，以令其適應(yīng)多種用法和條件。這些具體實施形式也處于權(quán)利要求書范疇內(nèi)。對本文中變量的任何定義中元件清單的描述，包括該變量作為任何單一元件或所列元件組合(或次級組合)的定義。對本文中具體實施形式的描述，包括該具體實施形式作為單一具體實施形式或與任何其它具體實施形式或其部分的組合。本申請可與2013年4月9日提交的國際專利申請案pct/us2013/035750關(guān)聯(lián)，該申請案主張2012年4月9日提交的美國臨時申請案us61/621,975的權(quán)益，上述兩份申請通過的整體內(nèi)容通過引用而并入本文。本申請可與2011年8月9日提交的國際專利申請案pct/us2011/047049關(guān)聯(lián)，該申請案主張2010年8月13日提交的美國臨時申請案us61/373,695的權(quán)益，上述兩份申請通過的整體內(nèi)容通過引用而并入本文。本說明書中提及的全部專利和出版物通過引用而并入本文，引用程度與每一獨立專利和出版物具體且個別地指明為通過引用而并入本文相同。當(dāng)前第1頁12