擴(kuò)增和檢測(cè)朊病毒的方法
【專利摘要】公開(kāi)了用于檢測(cè)朊病毒和/或朊病毒蛋白的朊病毒疾病相關(guān)形式的方法。這些方法提供了生物樣品和環(huán)境樣品中朊病毒的靈敏且特異性的鑒定。這些方法包括使用免疫沉淀和在沒(méi)有超聲處理的情況下使用搖動(dòng)的擴(kuò)增測(cè)定，例如QuIC（SQ）或RT-QuIC（RTQ）。在具體非限制性實(shí)例中，所述方法包括使用單克隆抗體15B3和/或RT-QuIC（RTQ），和/或底物替換步驟。
【專利說(shuō)明】擴(kuò)增和檢測(cè)朊病毒的方法
[0001]優(yōu)先權(quán)要求
[0002]本申請(qǐng)要求享有2011年I月18日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)N0.61/433，881的權(quán)益，所述美國(guó)專利申請(qǐng)以引用的方式全文納入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本公開(kāi)涉及用于檢測(cè)樣品中傳染性蛋白或朊病毒(包括診斷朊病毒相關(guān)疾病)的方法及組合物。
[0004]聯(lián)合研究協(xié)議締約方
[0005]普利奧尼克斯股份公司(Prionics AG)和由美國(guó)國(guó)立過(guò)敏和傳染病研究所(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的一個(gè)研究所)代表的美國(guó)政府、美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部是與本文公開(kāi)的技術(shù)有關(guān)的聯(lián)合研究協(xié)議的締約方。
【背景技術(shù)】
[0006]傳染性海綿狀腦病(TSE)或朊病毒疾病是致死性神經(jīng)退行性疾病，包括人克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、牛海綿狀腦病(BSE)、綿羊瘙癢病、鹿慢性消耗性疾病(cervid chronic wasting disease, CWD)和傳染性水紹腦病(TME)0 TSE的傳染原或朊病毒似乎主要由異常的、錯(cuò)折疊的、低聚的并且通常是部分蛋白酶抗性的形式的朊病毒蛋白(例如，PrP-res、PrPvCJ\ PrPsc)組成。PrP-res由正常的細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPc)在翻譯后形成(Borchelt et al., J Cell Biol, 110，743-752，1990 ;Caughey and Raymond, J Biol Chem, 266，18217-18223，1991 )。PrP-res，其純化的形式可類似于淀粉狀蛋白纖維，可在多種體外反應(yīng)中誘導(dǎo)PrPe聚合和構(gòu)象改變?yōu)閭魅拘訮rP-res/PrPSc (Castilla et al., Cell, 121, 195-206, 2005;Deleault et al., Proc NatlAcad Sci U S A, 104，9741-9746，2007)或?yàn)?PrPse 樣部分蛋白酶抗性的形式(Caughey etal.,Annu Rev Biochem，78，177-204，2009 ;Deleault et al.，2007，supra ;Kocisko et a
1.,Nature，370，471-474，1994; Saborio et al.，Nature，411，810-813，2001)。這些研究證明了，PrP-res可自我增殖，并且，雖然機(jī)制沒(méi)有被完全了解，但其似乎是有種子的或有模板的聚合(Gadjusek，Infectious amyloids:Subacute Spongiform Encephalopathiesas Transmissible Cerebral Amyloidoses.1n Fields, B.N., Knipej D.M., and Howleyj P.M.(Eds.)，F(xiàn)ield，s Virology,Lippincott-Ravenj Philadelphia, pp.2851-2900，1996 ；Horiuchi et al., Proc Natl Acad Sci U S A，97，5836-5841，2000 ;Jarrett and Lansbury, Jr.，Cell, 73，1055-1058，1993)。
[0007]快速且靈敏地檢測(cè)朊病毒的能力將是處理TSE中的重點(diǎn)。個(gè)體中的早期朊病毒檢測(cè)對(duì)于防止擴(kuò)散以及開(kāi)始可能的治療是關(guān)鍵的。朊病毒可在受感染的哺乳動(dòng)物宿主的多種組織和可獲得的體液中找到，包括血液(Brown etal.，Transfusion, 38，810-816，1998 ；Manuelidis et al.，Science,200，1069-1071，1978 ；Mathiason et al.，Science，314，133-136，2006 ;Saa et al., 2006a;Terry et al., JVirol, 83, 12552-12558, 2009 ；Thorne and Terry, J Gen Virol, 89，3177-3184，2008)、母乳(Konold et a1., BMC Vet Res,4, 14, 2008 ；Lacroux et a1., PLoSPathog, 4，el000238,2008)、唾液(Mathiason et al.，Science,314，133-136，2006 ;Vascellari et al., J Virol, 81，4872-4876，2007)、尿(Gregori et al.,EmergInfect Dis, 14, 1406-1412, 2008 ；Murayama et al., PLoS ONE, 5，2007)、糞便(Safar et al., J Infect Dis,198,81-89, 2008)和鼻液(Bessen et al., PLoSPathogens, 6，el000837, 2010)。在大多數(shù)情況中，快速測(cè)量這些流體中朊病毒傳染性的能力受限于低量的傳染原。知道這些流體或組織及其產(chǎn)品中的朊病毒滴度對(duì)于朊病毒診斷以及評(píng)估公眾衛(wèi)生暴露于這些物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)是重要的。此外，能夠用于檢測(cè)環(huán)境樣品、食品或動(dòng)物飼料中的朊病毒。因此，仍需要對(duì)朊病毒的快速、靈敏且特異性的測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]公開(kāi)了檢測(cè)朊病毒蛋白的方法。這些方法提供了對(duì)生物和環(huán)境樣品中朊病毒的靈敏且特異性的鑒定。這些方法包括使用免疫沉淀法以及在沒(méi)有超聲處理的情況下使用搖動(dòng)的擴(kuò)增測(cè)定，例QuIC或RT-QuIC。
[0009]在一些實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)朊病毒蛋白的方法，其包括使樣品與有效量的特異性結(jié)合PrP-res的抗體接觸充足的時(shí)間以形成免疫復(fù)合物，將所述免疫復(fù)合物與純化的重組朊病毒蛋白(rPrPe)混合以獲得反應(yīng)混合物。所述免疫復(fù)合物可從所述樣品中分離。進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其包括孵育所述反應(yīng)混合物以使得PrP-res與rPrPG在所述反應(yīng)混合物中共聚集并保持可促進(jìn)rPrPG與PrP-res共聚集的孵育條件以產(chǎn)生rPrPG到rPrP_res(s。)的轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制(例如防止)自發(fā)形成rPrP-res(sp°n)的發(fā)生。攪動(dòng)所述反應(yīng)混合物，其中攪動(dòng)包括搖動(dòng)所述反應(yīng)混合物，而不進(jìn)行超聲處理。檢測(cè)所述反應(yīng)混合物中的rPrP-res(Se)，其中在所述反應(yīng)混合物中檢測(cè)到rPrP-res(s。)表明所述樣品中存在PrP-res。
[0010]在一些實(shí)施方案中，可以定量所述反應(yīng)混合物中rPrP-res(Se)的量。在另外的實(shí)施方案中，檢測(cè)所述反應(yīng)混合物中的rPrP-res(Se)包括使用硫磺素T (ThT)0
[0011]在另外的實(shí)施方案中，可通過(guò)添加另外的rPrPG底物來(lái)補(bǔ)充rPrPG，然后在所述反應(yīng)混合物中檢測(cè)。
[0012]在另外的實(shí)施方案中，所述免疫復(fù)合物可例如與包含洗滌劑例如十二烷基硫酸鈉的緩沖液預(yù)孵育，然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。特異性結(jié)合PrP-res的抗體可結(jié)合到固體基質(zhì)，包括但不限于，磁珠。在另外的實(shí)施方案中，所述抗體為15B3。
[0013]在另外的實(shí)施方案中，所述rPrPG可以為嵌合的rPrPG，例如嵌合的倉(cāng)鼠-綿羊rPrPe。在具體的非限制性實(shí)例中，所述測(cè)定可檢測(cè)vCJD和其他形式的STE。
[0014]在一個(gè)具體的非限制性實(shí)例中，提供了檢測(cè)生物樣品中朊病毒蛋白的方法，其中所述方法包括使所述生物樣品，例如血漿、血液、血清、腦脊液或組織樣品與有效量的偶聯(lián)到固體基質(zhì)的抗體15B3接觸充足的時(shí)間以在所述固體基質(zhì)上形成免疫復(fù)合物。將所述基質(zhì)上的免疫復(fù)合物與所述生物樣品的其他組分分離。將所述固體基質(zhì)上的免疫復(fù)合物與包含約0.01%至約0.05%十二烷基硫酸鈉的緩沖液孵育。將所述固體基質(zhì)上的免疫復(fù)合物與純化的重組朊病毒蛋白(rPrPG)，例如倉(cāng)鼠綿羊嵌合重組朊病毒蛋白(rPrPG)，以及硫磺素T混合，以制成反應(yīng)混合物，并進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。所述擴(kuò)增反應(yīng)包括:(a)孵育所述反應(yīng)混合物以使得PrP-res與所述反應(yīng)混合物中存在的rPrPG共聚集；(b)保持可促進(jìn)rPrPG與PrP-res共聚集的孵育條件以產(chǎn)生rPrPG到rPrP-res(s。)的轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制rPrP_res(sp°n)的形成；(c)攪動(dòng)步驟(i)中形成的聚集物，其中搖動(dòng)所述反應(yīng)混合物，然后不搖動(dòng)，持續(xù)基本相同的時(shí)間，例如搖動(dòng)持續(xù)約60秒然后不搖動(dòng)持續(xù)約60秒，或者搖動(dòng)持續(xù)約30秒然后不搖動(dòng)持續(xù)約30秒；(d)向所述反應(yīng)混合物加入另外的重組朊病毒蛋白(rPrPG)，例如倉(cāng)鼠綿羊嵌合朊病毒蛋白，然后形成可檢測(cè)的rPrP-res(Se)?？扇芜x地重復(fù)所述步驟，例如步驟(c)和(d)。在一些實(shí)施方案中，使用ThT熒光檢測(cè)所述反應(yīng)混合物中的rPrP-res(Se)，其中所述反應(yīng)混合物的熒光表明所述樣品中存在PrP-res。在另外的實(shí)例中，所述rPrPG可通過(guò)添加另外的rPrPG底物來(lái)補(bǔ)充，然后檢測(cè)所述反應(yīng)混合物中的rPrP-res(Se)。在另外的實(shí)例中，
[0015]從下面參照附圖進(jìn)行的對(duì)若干實(shí)施方案的具體描述，本發(fā)明的上述以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)將變得更加明顯。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1a-1b.摻入人血漿中的≥IOfgAvCJD PrP-res的IP-S-QuIC檢測(cè)。將人非朊病毒(腫瘤，T)對(duì)照或vCJD腦勻漿物的稀釋物摻入到500 μ I人血漿中以得到4X10_7 (T);4Χ 10_7、4Χ 10_9 和 4Χ Kr10 (vCJD ;分別含約 IOpgUOOfg 和 IOfg PrP-res)的最終稀釋物。將PrPvai1進(jìn)行免疫沉淀并如材料和方法中所述進(jìn)行S-QuIC。第一輪S-QuIC在50°C下進(jìn)行8小時(shí)(h)(圖1a)并將所述第I輪反應(yīng)物體積的1/10用作第2輪的種子(45°C下進(jìn)行IOh)(圖lb)。不含血漿的陽(yáng)性和陰性對(duì)照反應(yīng)直接用2μ I的倉(cāng)鼠未感染的(N)或綿羊瘙癢病的(Sc)腦的5Χ10_7稀釋物作為種子，綿羊瘙癢病的腦含有約IOOfg PrFes種子。在所有的反應(yīng)中倉(cāng)鼠rPrPG23-231被用作底物并與25kDa標(biāo)記物共遷移。PK-消化的產(chǎn)物按先前報(bào)道通過(guò)使用多克隆R20抗體的免疫印跡進(jìn)行分析(24)?？招膱A標(biāo)出17-kDa片段，方括號(hào)表不較低分子量條帶(10_13kDa)。
[0017]圖2a_2b.通過(guò)IP-S-QuIC對(duì)感染綿羊瘙癢病的倉(cāng)鼠血漿中內(nèi)源性PrPse進(jìn)行IP-S-QuIC檢測(cè)。(圖2a)如實(shí)施例部分所述用來(lái)自綿羊瘙癢病263K和未感染(N)倉(cāng)鼠的血漿樣品(500 μ I)進(jìn)行IP-S-QuIC，第I輪S-QuIC在50°C下進(jìn)行10小時(shí)(h)，第2輪(圖2b)在50°C下進(jìn)行8小時(shí)，星號(hào)標(biāo)記的泳道除外，星號(hào)標(biāo)記的泳道示出以樣品#6作為種子的第I輪產(chǎn)物用于比較。不含血漿的陽(yáng)性和陰性對(duì)照反應(yīng)，rPrPc23-231底物和對(duì)PK消化的產(chǎn)物的分析如對(duì)圖1所進(jìn)行的描述。空心圓標(biāo)記17-kDa片段，方括號(hào)表示較低分子量條帶(10_13kDa)。
[0018]圖3a-3b.感染綿羊瘙癢病倉(cāng)鼠的血漿和血清中內(nèi)源性PrPse的IP-RT-QuIC檢測(cè)。(圖3a)來(lái)自綿羊瘙癢病263K和正常倉(cāng)鼠的血漿樣品和來(lái)自綿羊瘙癢病263K倉(cāng)鼠的血清樣品的IP-RT-QuIC分析。(圖3b)來(lái)自9只綿羊瘙癢病263K和I只未感染倉(cāng)鼠的血漿樣品的分析。在所有的情況中，將500 μ I樣品在37°C下用15B3包被的微珠免疫沉淀約20h。將所述微珠的五分之一在室溫下與PBS中的0.05%SDS預(yù)孵育約20分鐘并用于作為含300mMNaCl的RT-QuIC的種子。RT-QuIC反應(yīng)在42°C下孵育，在所有反應(yīng)中倉(cāng)鼠rPrPG90_231被用作底物?？v軸表示來(lái)自4個(gè)重復(fù)反應(yīng)孔的平均熒光。在(圖3a)中誤差棒顯示選擇的重復(fù)組的標(biāo)準(zhǔn)差。在(圖3b)中，記錄陽(yáng)性熒光的所有單獨(dú)反應(yīng)達(dá)到幾乎相同的最大熒光值(約260k單位)，而在許多綿羊瘙癢病作為種子的情況中，僅有重復(fù)反應(yīng)的一個(gè)亞組在63h內(nèi)上升超過(guò)背景熒光。因?yàn)橹貜?fù)中這種全有反應(yīng)或全無(wú)反應(yīng)，所以標(biāo)準(zhǔn)差不能從所有的重復(fù)中計(jì)算；而是，在右側(cè)，在反應(yīng)結(jié)束處標(biāo)明了每個(gè)總重復(fù)中陽(yáng)性孔的比例。代表對(duì)于在>40-h時(shí)間點(diǎn)下的陽(yáng)性重復(fù)(僅)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)差的誤差棒，如果有的話，僅僅超出符號(hào)的大小，因此未示出。
[0019]圖4a_4b.摻入人血漿中的人PrPvGJI)的eQuIC檢測(cè)。將人非朊病毒(腫瘤和阿爾茨海默病)對(duì)照或vCJD腦組織的稀釋物摻入到500 μ I的人血漿中以得到4X10—7 (腫瘤和阿爾茨海默病);和4Χ10-12、4Χ10-13和4Χ10-14 (vCJD ;分別含有約IOOagUOag和lagPrP-res)的最終稀釋物。將PrPvGJI)使用15B3包被的微珠(圖4a)或模擬抗IgM的抗體包被的微珠(圖4b)進(jìn)行免疫沉淀并將所述微珠的一部分用于作為重復(fù)eQuIC反應(yīng)的種子。24h之后，替換底物。在所有反應(yīng)中嵌合Ha-S rPrPG被用作底物。縱軸表示來(lái)自4個(gè)重復(fù)孔的平均熒光，右側(cè)的比例表示與相鄰跡線相關(guān)的陽(yáng)性/總重復(fù)反應(yīng)。
[0020]圖5a_5b.感染綿羊瘙癢病倉(cāng)鼠的血漿中內(nèi)源性PrPse的eQuIC檢測(cè)。(圖5a)來(lái)自8只未感染倉(cāng)鼠和6只感染綿羊瘙癢病倉(cāng)鼠(一個(gè)在30dpi (臨床前)收集，5個(gè)在80dpi(臨終)收集)的血漿樣品(不進(jìn)行預(yù)清除)的eQuIC分析?？v軸表示來(lái)自4個(gè)重復(fù)孔的平均熒光，右側(cè)的比例表示與相鄰跡線相關(guān)的陽(yáng)性/總重復(fù)反應(yīng)。雖然用所述綿羊瘙癢病樣品作為種子的所有重復(fù)反應(yīng)均為陽(yáng)性，但是在60小時(shí)時(shí)對(duì)于所述樣品中的3個(gè)觀察到次最大平均熒光。在后者的情況中，孔中的微珠分布部分地干擾熒光讀數(shù)；當(dāng)用移液管手動(dòng)攪拌之后在64小時(shí)時(shí)重新讀這些孔(n=3)，熒光達(dá)到了最大水平(灰色跡線)。相比之下，攪拌未感染對(duì)照孔(n=4)沒(méi)有增加其熒光。倉(cāng)鼠rPrPG90-231被用作底物。(圖5b)來(lái)自3只未感染倉(cāng)鼠和7只感染綿羊瘙癢病倉(cāng)鼠(3只在80dpi收集；2只在30dpi收集；1只在IOdpi收集)的預(yù)清除血漿樣品的eQuIC分析。
[0021]圖6.底物替換效應(yīng)的可能機(jī)制的示意圖。
[0022]圖7a-7b.在摻入的人血漿中使用15B3的PrPse檢測(cè)的較好IP-S-QuIC靈敏度和一致性(與模擬微珠對(duì)比)。(圖7a)使用來(lái)自100 μ I血漿的2-h IP和2輪S-QuIC比較15B3和模擬微珠。將未感染 的“正?！?N)或感染綿羊瘙癢病263K (Sc)的倉(cāng)鼠腦勻漿物摻入100 μ I人血漿中以得到Kr8 (N);和ΙΟ'ΙΟ-9和10, (Sc ;分別為約100、10和IfgPrP-res)的最終腦稀釋物。將PrPse在37°C下使用40 μ I (1.6Χ107個(gè)總微珠)的15Β3包被的微珠(15Β3)或模擬抗IgM的抗體包被的微珠(C)免疫沉淀2h。將微珠重懸在10 μ I PBS中。將所述微珠的五分之一用于作為第I輪S-QuIC的種子(50°C下10h)，將所述第I輪反應(yīng)物體積的1/10用于作為第2輪的種子(50°C下10h)。(圖7b)來(lái)自500μ1血漿的20-hIP和單輪S-QuIC的15B3微珠。將N或Sc腦勻漿物的稀釋物摻入500 μ I人血漿中以得到2Χ Kr8 (N);和2Χ ΙΟ-8 - 2Χ Kr11 (Sc ;分別含有約lpg-lfg PrP-res)的最終腦組織稀釋物。將PrPse在37°C下使用15B3微珠免疫沉淀約20h。剩余步驟同圖7a中一樣，不同之處是僅進(jìn)行單輪S-QuIC (50°C下10h)。不含血漿的陽(yáng)性和陰性對(duì)照反應(yīng)用2 μ I倉(cāng)鼠N或Sc腦的5Χ 10_7稀釋物直接作為種子，Sc腦的稀釋物含有約IOOfg PrP-res種子。在所有S-QuIC反應(yīng)中，倉(cāng)鼠rPrPG23-231被用作底物。按以前的報(bào)道(Orru et al., 2009.ProteinEng Des Sel 22:515-521，2009)使用多克隆R20抗體通過(guò)免疫印跡對(duì)PK消化的產(chǎn)物進(jìn)行分析。空心圓標(biāo)記17-kDa片段,方括號(hào)表不較低的分子量條帶(10_13kDa)。
[0023]圖8a-8b.15B3結(jié)合的PrPse的SDS預(yù)處理加快了 RT-QuIC檢測(cè)。將倉(cāng)鼠N或Sc263K腦勻漿物的稀釋物摻入500 μ I人血漿中以得到2Χ 10-7(在Sc的情況中含有約1OpgPrP-res)的最終腦稀釋物。與微珠的IP孵育在37°C下持續(xù)約20h。將所述微珠的五分之一用于作為RT-QuIC的種子(圖8a)，將相同數(shù)目的微珠在室溫下用PBS中的0.05%SDS預(yù)處理約20分鐘，用于作為含300mM NaCl的RT-QuIC反應(yīng)的種子(圖8b)。將反應(yīng)物在42°C下孵育，在所有反應(yīng)中倉(cāng)鼠rPrPG90-231被用作底物?？v軸表示來(lái)自4個(gè)重復(fù)孔的平均熒光，右側(cè)的比例表示與相鄰跡線相關(guān)的陽(yáng)性/總重復(fù)反應(yīng)。
[0024]圖9a_9c.使用不同NaCl，以倉(cāng)鼠-綿羊嵌合rPrPG (Ha-S rPrPc)與以人rPrPc23-231對(duì)比，對(duì)結(jié)合15B3的人PrPvGTD的RT-QuIC檢測(cè)的改善。將人非朊病毒(腫瘤)對(duì)照或vCJD腦組織的稀釋物摻入至500 μ I的人血漿中以得到4Χ 10_7 (圖9a_9b，在vCJD的情況中含有約10pgPrP-res)或4X 10-7和4Χ 10-9和4Χ 10,(圖9c，在vCJD的情況中，分別含有約IOpgUOOfg和IOfg PrPrlres)的最終稀釋物。除了標(biāo)出的NaCl濃度和rPrPG底物變化外，依材料和方法部分所述將樣品進(jìn)行IP-RT-QuIC?？v軸表示來(lái)自4個(gè)重復(fù)孔的平均熒光，右側(cè)的比例表示與相鄰跡線相關(guān)的陽(yáng)性/總重復(fù)反應(yīng)。
[0025]圖1Oa-1Ob.eQuIC中15B3微珠與Magnabeads的比較。將人非TSE阿爾茨海默病(AD)對(duì)照或vCJD腦組織的稀釋物摻入0.5ml人血漿中以得到4X 10_7 (AD);和4X 10'Axio-1cUxio-1Iwxio-14 (vCjd ;分別含有約 10pg、i0fg、i0ag 和 lag PrP-res)的最終稀釋物。使用免疫沉淀緩沖液(Prionics)，將PrPvcjd在371:下使用總計(jì)1.6\107個(gè)的15B3包被的微珠(圖1Oa)或相同數(shù)目的MAGNABIND?微珠(圖1Ob)免疫沉淀約20h。將微珠用洗滌緩沖液(Prionics)洗滌2次并在10 μ I PBS中重懸。剩余步驟如材料和方法中所述，以PBS中的0.05%SDS的預(yù)孵育開(kāi)始?？v軸表示來(lái)自4個(gè)重復(fù)孔的平均熒光，右側(cè)的比例表示與相鄰跡線相關(guān)的陽(yáng)性/總重復(fù)反應(yīng)。使用MAGNABIND? PrPse捕獲條件獲得相似的結(jié)果(Miller and Supattapone, 2011，J.Virol.85:2813-2817)。
[0026]圖11.在微珠上使用更高的15B3含量改善IP-RTQ的速度和靈敏度。將正常(NBH)或有綿羊瘙癢病263K的倉(cāng)鼠腦勻漿物的稀釋物摻入500 μ I的人血漿中以得到出2Χ10_9(NBH);和2Χ 10-9和2X10, (263Κ ;分別含有約100或IOfg PrP-res)的最終腦組織稀釋物。將PrP-res在37°C下使用40 μ I的15Β3微珠在37°C下免疫沉淀約20小時(shí)。將微珠用0.2%肌氨酰/TBS洗滌2次并重懸在10 μ I PBS中。0.05%SDS預(yù)處理之后，將所述微珠的五分之一用于作為RTQ反應(yīng)的種子。在所有反應(yīng)中倉(cāng)鼠rPrPG90-231被用作底物?？v軸表不來(lái)自2個(gè)重復(fù)孔的平均突光。
[0027]圖12用于摻入血漿中的綿羊綿羊瘙癢病腦勻漿物的eQuIC檢測(cè)的15B3抗體滴定。結(jié)果證明了 15B3的量增加導(dǎo)致綿羊eQuIC的靈敏度提高，這使得可更快檢測(cè)0.5ml血漿中含HlOOfg的PrP-res的綿羊瘙癢病腦組織稀釋物。
[0028]圖13.摻入綿羊血漿中的ARQ綿羊腦勻漿物的eQuIC檢測(cè)。所述測(cè)定提供了對(duì)500ul綿羊血漿中≥約IOOag PrP-res (腦組織的5X 10_13稀釋物)的檢測(cè)。
[0029]圖14.綿羊瘙癢病陽(yáng)性綿羊的血漿中內(nèi)源性PrP-res的eQuIC檢測(cè)。所述測(cè)定在來(lái)自3只臨床(slinically)感染的感染綿羊瘙癢病綿羊的血漿中檢測(cè)到內(nèi)源性PrP-res。在來(lái)自4只未感染綿羊的血漿樣品中未檢測(cè)到朊病毒。
[0030]圖15.通過(guò)e-QuIC檢測(cè)摻入血漿中的sCJD腦勻漿物的靈敏度。所述測(cè)定檢測(cè)了在0.5mL人血漿中含有低至約IOag的PrPlres的sCJD腦勻漿物摻入物。[0031]圖16.通過(guò)e-QuIC檢測(cè)摻入腦脊液(CSF)的sCJD腦勻漿物的靈敏度。所述測(cè)定檢測(cè)了在0.5ml人腦脊液中含有低至約IOag的PrPres的sCJD腦組織稀釋物。
[0032]圖17.通過(guò)e-QuIC檢測(cè)摻入血漿中的小鼠適應(yīng)的RML綿羊瘙癢病腦勻漿物的靈敏度。所述測(cè)定了檢測(cè)0.5ml血漿中低至10_13RML綿羊瘙癢病腦組織稀釋物(含約100ag_PrP-res)ο
[0033]圖18.綿羊瘙癢病陽(yáng)性野生型(WT)和GP1-小鼠的血漿中內(nèi)源性PrPres的eQuIC檢測(cè)。所述測(cè)定檢測(cè)了來(lái)自野生型小鼠和缺乏糖磷脂酰肌醇錨(GPD的僅表達(dá)PrP-sen的轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿中的內(nèi)源性PrP-res。在來(lái)自未感染野生型正常小鼠的血漿樣品中沒(méi)有檢測(cè)到朊病毒。
[0034]序列表
[0035]序列表
[0036]使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸堿基字母縮寫(xiě)和氨基酸的三字母代碼(如在37 C.F.R.1.822中所定義的)顯示所列出的核酸序列和氨基酸序列。對(duì)于核酸序列，只顯示每個(gè)核酸序列的一條鏈，但應(yīng)理解互補(bǔ)鏈通過(guò)任何提及所示出的鏈而被包括在內(nèi)。
[0037]SEQ ID NO:1為重組敘利亞金倉(cāng)鼠蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0038]KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGTWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQGGGTHNQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHFGNDWEDRYYRENMNRYPNQVYYRPVDQYNNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCTTQYQKESQAYYDGRRS
[0039]SEQ ID NO:2為重組小鼠(Prnp_a)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0040]KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGTWGQPHGGGffGQPHGGSffGQPHGGSffGQPHGGGffGQGGGTHNQffNKPSKPKTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLG
[0041]SAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCVTQYQKESQAYYDGRRS
[0042]SEQ ID NO:3為重組人(129M)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0043]KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQGGGTHSQffNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYML
[0044]GSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSS
[0045]SEQ ID NO:4為重組人(129V)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0046]KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVL
[0047]GSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFIETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSS
[0048]SEQ ID NO:5為重組牛(6_八肽重復(fù)(octar印eat))蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0049]KKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGGffGQGGTHGQffNKPSKPKTNMKHVAGAAAAG
[0050]AVVGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITVKEHTVTTTTKGENFTETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGAS[0051]SEQ ID NO:6為重組羊(136A154R171Q)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0052]154R171Q)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白。
[0053]KKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGGffGQGGSHSQWNKPSKPKTNMKHVAGAAAAGAVVGGLGG
[0054]YMLGSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGAS
[0055]SEQ ID NO:7為重組鹿(96G132M138S)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0056]KKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGGffGQGGTHSQWNKPSKPKTNMKHVAGAAAAGAVVGGLGG
[0057]YMLGSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYNNQNTFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFIETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGAS
[0058]SEQ ID NO:8為全長(zhǎng)敘利亞金倉(cāng)鼠蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0059]MANLSYWLLALFVAMWTDVGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGTWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQGGGTHNQffNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHFGNDWEDRYYRENM
[0060]NRYPNQVYYRPVDQYNNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFIETDIKIMERVVEQMCTTQYQKESQAYYDGRRSSAVLFSSPPVILLISFLIFLMVG
[0061]SEQ ID NO:9為全長(zhǎng)小鼠(Prnp_a)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0062]MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGTWGQPHGGGffGQPHGGSWGQPHGGSffGQPHGGGWGQGGGTHNQffNKPSKPKTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMIHFGNDffEDRYYRENMYRYPNQV
[0063]YYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFIETDVKMMERVVEQMCVTQYQKESQAYYDGRRSSSTVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0064]SEQ ID NO:10為全長(zhǎng)人(129M)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0065]MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQGGGTHSQffNKPSKPKTNMK
[0066]HMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0067]SEQ ID NO: 11為全長(zhǎng)人(129V)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。
[0068]MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQGGGTHSQffNKPSKPKTNMK
[0069]HMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFIETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0070]SEQ ID NO:12為全長(zhǎng)嵌合倉(cāng)鼠-綿羊(H_s)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列，其中殘基23-137為敘利亞倉(cāng)鼠序列，剩余殘基138-231與綿羊殘基141-234 (R154，Q171多形體)同源。
[0071]HMKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGTWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQGGGTHNQffNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCTTQYQRESQAYYQRGAS.【具體實(shí)施方式】
[0072]本文公開(kāi)的方法允許在許多生物樣品中檢測(cè)朊病毒污染、進(jìn)行診斷和/或監(jiān)測(cè)，所述生物樣品包括血液、血液級(jí)分、血液制品、尿、鼻液、唾液、腦脊液、糞便、肌肉活組織、淋巴組織、皮膚樣品、用于移植的組織樣品等。這些方法具有醫(yī)療和獸醫(yī)的應(yīng)用，并且還可用于檢測(cè)生物技術(shù)制品和環(huán)境樣品(例如水、土壤、植物、垃圾、污水)以及農(nóng)業(yè)樣品(例如基于動(dòng)物的食物、基于動(dòng)物的飼料&營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、動(dòng)物廢物、副產(chǎn)物、動(dòng)物尸體、屠宰場(chǎng)廢物、規(guī)定的危險(xiǎn)物質(zhì))以確保沒(méi)有朊病毒污染。本文公開(kāi)的方法還可用于例如牛、綿羊和鹿中無(wú)朊蛋白的牲畜群認(rèn)證。本文公開(kāi)的方法還可用于檢測(cè)自發(fā)性克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病。
[0073]目前，用于檢測(cè)TSE傳染性的最直接和可靠的測(cè)定是動(dòng)物生物測(cè)定。傳染性的量化可通過(guò)終點(diǎn)(Stamp et al.，1959)或有限稀釋生物測(cè)定(Gregori et al.，2004)來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于朊病毒因子和宿主種類的一些組合，在實(shí)驗(yàn)室嚙齒類動(dòng)物中已經(jīng)建立了傳染性滴度和疾病潛伏期之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)，這使得可使用潛伏期來(lái)測(cè)量傳染性水平(Hunter et al., 1963 ；Prusiner et al.，1982)。這些生物測(cè)定的缺點(diǎn)是它們是動(dòng)物密集型的、費(fèi)時(shí)且昂貴的。對(duì)于某些鼠類適應(yīng)的綿羊瘙癢病毒株，基于標(biāo)準(zhǔn)的綿羊瘙癢病細(xì)胞測(cè)定(SSCA)的細(xì)胞培養(yǎng)物還可用于通過(guò)終點(diǎn)和有限稀釋法測(cè)量傳染性水平(Klohn et al.，2003)。SSCA較動(dòng)物生物測(cè)定提供了若干優(yōu)點(diǎn)，但是其仍然需要數(shù)周來(lái)完成并且已被限于少許小鼠適應(yīng)的綿羊瘙癢病毒株。已經(jīng)報(bào)道了類似的針對(duì)鹿朊病毒的基于細(xì)胞的測(cè)定法(稱為CPCA)(Bian et al.，JVirol, 84，8322-8326，2010)。動(dòng)物生物測(cè)定SSCA和CPCA的局限意味著需要更多實(shí)用的用于朊病毒定量的測(cè)定法。
[0074]已經(jīng)報(bào)道了多種在體外高度靈敏的檢測(cè)朊病毒的方法(Atarashi et al.，NatMethods,4，645-650，2007 ；Atarashi et al.，Nat Methods,5，211-212，2008 ；Bieschke et al., Proc Natl Acad Sci U S A，97，5468-5473，2000 ;Chang etal., J Virol Methods，159，15-222009 ;Colby et al., Proc Natl Acad Sci U
SA, 104,9741-9746,2007 ；Fujihara et al.,FEBS J，276，284卜2848，2009 ;Orru et al., Protein Eng Des Sel，22，515-521，2009 ;Rubenstein et al.,J GenVirol,91, 1883-1892，2010;Saa et al.，Science, 313，92-94，2006a;Saa et al., JBiol Chemj 281,35245-35252, 2006b ；Terry et al., J Virol,83,12552-12558, 2009 ；Trieschmann et al., BMC B i o t e chno I，5，26，2005 ; Wi Iham et al., PLoSPathog, 6, el001217, 2010)。熒光相關(guān)光譜可用于檢測(cè)用熒光標(biāo)記抗體處理的腦脊液(CSF)樣品中 PrP-res 聚集體的飛摩爾(femtomolar)濃度(Bieschke et al., supra, 2000)。突光標(biāo)記的重組PrPG CrPrPc)與合成的朊病毒蛋白聚集體結(jié)合使得可通過(guò)FACS分析對(duì)其進(jìn)行超靈敏檢測(cè)，并且相似的方法使得可鑒別若干感染BSE和未感染的牛的血清(Trieschmannet al.，2005)。在用腦源PrPG作為底物的多輪超聲處理反應(yīng)中，使用蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊循環(huán)擴(kuò)增(PMCA)反應(yīng),可檢測(cè)到少至lag的PrP-res (Saa et al.，supra, 2006b)。有限的系列PMCA與高靈敏度熒光檢測(cè)技術(shù)(稱為環(huán)繞光纖免疫測(cè)定(SOPHIA))的偶聯(lián)使得可更快速檢測(cè)低至IOag的PrP-res和區(qū)分朊病毒感染的血液樣品和未感染血液樣品(Chang etal., supra, 2009;Rubenstein et al.,.J Gen Virol, 91，1883-1892，2010)。
[0075]PMCA測(cè)定的速度和實(shí)用性已經(jīng)通過(guò)使用rPrP。(Atarashi et al., supra, 2007)以及如對(duì)震動(dòng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(QuIC)反應(yīng)(Atarashi et al., supra, 2008; Orru etal.，supra, 2009)所描述的通過(guò)用搖動(dòng)替換超聲處理步驟來(lái)改善。標(biāo)準(zhǔn)的QuIC (也稱為“SQ”)測(cè)定可在一天內(nèi)檢測(cè)倉(cāng)鼠腦勻衆(zhòng)物(BH)中亞飛克(sub-femtogram)量的PrP-res(低于一個(gè)致死大腦內(nèi)劑量XSQ用于朊病毒檢測(cè)的有效性被其使用2μ I的CSF樣品(Atarashiet al.,上文，2008 ；0rru et al.,上文，2009)或鼻灌洗物(Bessen et al., PLoSPathogens, 6，el000837, 2010)區(qū)分出正常倉(cāng)鼠和感染朊病毒的倉(cāng)鼠的能力所證明。SQ反應(yīng)的適應(yīng)性改變已經(jīng)導(dǎo)致了對(duì)人組織中變體CJD (vCJD)和綿羊組織中綿羊瘙癢癥的靈敏檢測(cè)(Orru et al.,上文，2009)。
[0076]SQ和PMCA測(cè)定的讀出是通過(guò)免疫印跡檢測(cè)抗具體蛋白酶的朊蛋白作為種子的rPrP產(chǎn)物，這難以適應(yīng)性改變成自動(dòng)化的高通量形式。一種替代的潛在更高通量的方法被用于淀粉狀蛋白播種測(cè)定(ASA)，其中熒光染料硫磺素T (ThT)被用于檢測(cè)朊病毒作為種子的 rPrPG 聚合(Colby et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104，20914-20919，2007，以引用的方式納入本文)。所述ASA還可以檢測(cè)導(dǎo)致的蛋白酶敏感疾病的朊病毒，并且與朊病毒疾病的神經(jīng)病理性癥狀有98%的相關(guān)性(Colby et al., PLoS Pathog, 6，el000736，2010)。然而，ASA的一個(gè)潛在混淆的方面是在約兩倍的朊病毒作為種子的反應(yīng)的延滯期內(nèi)常見(jiàn)的rPrP原纖維的自發(fā)形成(沒(méi)有朊病毒作為種子)(Colby et al., Proc Natl AcadSci U S A，104，20914-20919，2007)。自發(fā)的原纖維形成的問(wèn)題在另一朊病毒作為種子的rPrP。聚合測(cè)定——實(shí)時(shí)(RT)-QuIC (也稱為RTQ，參見(jiàn)例如Wilham et al.，PLoSPathog, 6, el001217, 2010，其描述了所述測(cè)定，以引用的方式納入本文)中極大地減少，其結(jié)合了 SQ測(cè)定的若干方面(間歇搖動(dòng)、rPrPc制備、樣品制備和沒(méi)有離液鹽)，其熒光ThT讀出與ASA的類似。
[0077]直到最近，PMCA、SQ、RTQ和ASA方法的主要限制是缺乏朊病毒定量。Chen和同事報(bào)道了一種稱為定量PMCA (qPMCA)的方法，其中PrPse含量通過(guò)陽(yáng)性反應(yīng)所需的PMCA的輪數(shù)來(lái)估計(jì)(Chen et al.，Nat Methods, 7，519-520，2010)。最近，與所述 RTQ 結(jié)合描述了一種使用終點(diǎn)稀釋滴定的不同方法，作為用體外朊病毒播種測(cè)定來(lái)確定相對(duì)朊病毒定量的方法(Wilham et al.，supra，2010)。此外，測(cè)量了感染朊病毒倉(cāng)鼠的鼻液和CSF中的朊病毒作為種子的活性。因此，與終點(diǎn)稀釋分析結(jié)合，所述RTQ可快速確定相對(duì)朊病毒濃度，靈敏度可比得上動(dòng)物生物測(cè)定的靈敏度，而時(shí)間和成本極大地減少。
[0078]本文描述的方法大大地提高朊病毒播種/擴(kuò)增測(cè)定例如SQ和RTQ的靈敏度和實(shí)用性，部分是通過(guò)將它們與新的朊病毒/PrP-res/PrPSe免疫沉淀和處理方案整合。所述方法能夠捕獲和檢測(cè)多種液體或組織提取物(包括復(fù)雜的生物樣品例如血漿，其可包含朊病毒的強(qiáng)抑制劑)中極低水平的朊病毒。
[0079]術(shù)語(yǔ)
[0080]除非另有說(shuō)明，技術(shù)術(shù)語(yǔ)依其常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)中的常用術(shù)語(yǔ)的定義可見(jiàn)于 Benjamin Lewin, Gene V,由 Oxford University Press 出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew et al(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN0-632-02182-9)和 Robert A.Meyers(ed.) , Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0081]為了有助于閱讀本公開(kāi)的各個(gè)實(shí)施方案，提供了對(duì)具體術(shù)語(yǔ)的如下解釋:
[0082]聚集體:締合的多于一個(gè)的分子，例如朊病毒蛋白質(zhì)的二聚體、多聚體和聚合體，例如PrP-res或rPrP_res(s。)的聚集體、二聚體、多聚體和聚合體。
[0083]攪動(dòng):向混合物或反應(yīng)混合物引入任何類型的湍流或運(yùn)動(dòng)，例如通過(guò)超聲處理、攪拌或搖動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)包括使用足以使rPrP-res(Se)聚集體成碎片的力，其分散rPrP_res(Se)聚集體和/或聚合體以便于進(jìn)一步擴(kuò)增。在一些實(shí)例中，碎片化包括完全碎片化,而在其他實(shí)例中,碎片化僅是部分的,例如,聚集體總體可以通過(guò)攪動(dòng)使約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%成碎片。示例性的攪動(dòng)方法被描述于下文的實(shí)施例部分。
[0084]抗體:至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽配體，其可特異性識(shí)別和結(jié)合抗原或其片段的表位。抗體可特異性結(jié)合PrP-res/PrP'抗體可以由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈和輕鏈各自具有可變區(qū)，即重鏈可變(Vh)區(qū)和輕鏈可變(')區(qū)。所述Vh區(qū)和\區(qū)一同負(fù)責(zé)結(jié)合被所述抗體識(shí)別的抗原。
[0085]所述術(shù)語(yǔ)抗體包括完整的免疫球蛋白和本領(lǐng)域熟知的它們的變體和部分，例如Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、單鏈Fv蛋白(“scFv”)和二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)與免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)通過(guò)接頭結(jié)合的融合蛋白，而在dsFv中，所述鏈已經(jīng)被突變以引入二硫鍵來(lái)穩(wěn)定所述鏈之間的締合。所述術(shù)語(yǔ)還包括基因工程的形式例如嵌合抗體(例如，人源化抗體)、雜綴合抗體(例如雙特異性抗體)。還參見(jiàn)，Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical C0., Rockford, IL)；Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., ff.H.Freeman&C0., New York, 1997。
[0086]通常，天然存在的免疫球蛋白具有通過(guò)二硫鍵互相連接的重(H)鏈和輕(L)鏈。存在兩種類型的輕鏈，lambda ( λ )和kappa ( κ )。存在確定抗體分子的功能活性的5類主要重鏈(或同種型):IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
[0087]重鏈和輕鏈各自含有恒定區(qū)和可變區(qū)，(所述區(qū)也被稱為“結(jié)構(gòu)域”)。所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相結(jié)合可特異性結(jié)合抗原。重鏈和輕鏈可變區(qū)含有被三個(gè)高變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”)隔開(kāi)的“框架”區(qū)。已經(jīng)確定了框架區(qū)和⑶R的范圍(參見(jiàn)Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.Department of Healthand Human Services, 1991,其以引用的方式納入本文)。目前,Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)是在線維持的。不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在物種內(nèi)是相對(duì)保守的?？贵w的框架區(qū)，即組分輕鏈和重鏈的結(jié)合框架區(qū)，用于在三維空間中定位和對(duì)齊CDR。
[0088]所述⑶R主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。每條鏈的⑶R通常是指從N末端開(kāi)始依次編號(hào)的⑶R1、⑶R2和⑶R3，并且還通常由具體的⑶R所在的鏈來(lái)標(biāo)識(shí)。因此，VfDR3位于其中發(fā)現(xiàn)它的抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，而'CDRl為其中發(fā)現(xiàn)它的抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDRl。結(jié)合目的抗原的抗體具有特異的Vh區(qū)序列和\區(qū)序列，因此具有特異的CDR序列。具有不同特異性(由于不同抗原的不同結(jié)合位點(diǎn))的抗體具有具有不同的CDR。雖然抗體的CDR各有不同，但是CDR內(nèi)僅有有限數(shù)目的氨基酸位置直接參與抗原結(jié)合。這些CDR內(nèi)的位置被稱為特異性決定殘基(SDR)。[0089]提及“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括FV、SCFV、dSFV或Fab的那些。提及“VJ或“VL”是指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括FV、SCFV、dSFV或Fab的那些。
[0090]“單克隆抗體”是由B-淋巴細(xì)胞的單個(gè)克隆產(chǎn)生或者由轉(zhuǎn)染單個(gè)抗體的輕鏈和重鏈基因的細(xì)胞或其子代產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生，例如通過(guò)由骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的融合來(lái)制備雜交抗體形成細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。單克隆抗體包括人源化單克隆抗體。
[0091]抗體結(jié)合親和力:抗體對(duì)抗原,例如PrP-res的親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，親和力通過(guò) Frankel et al., Mol.1mmunol., 16:101-106, 1979 描述的改進(jìn)的 Scatchard 法來(lái)計(jì)算。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合親和力通過(guò)抗原/抗體的離解速率來(lái)測(cè)量。在另一實(shí)施方案中，高結(jié)合親和力通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫測(cè)定來(lái)測(cè)量。在若干實(shí)例中，高結(jié)合親和力為至少約1X10_8M。在其他實(shí)施方案中，高結(jié)合親和力為至少約1.5父10_1、至少約2.0父10_%、至少約2.5父10-%、至少約3.0父10-1、至少約3.5\10-8厘、至少約4.0父10-8厘、至少約4.5 X KT8M或至少約5.0Χ10-8Μ。
[0092]抗原:可在動(dòng)物中刺激抗體產(chǎn)生或T-細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物或物質(zhì)，包括被注射或吸收至動(dòng)物的組合物。抗原與特異性的體液免疫或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物(包括由異源免疫原誘導(dǎo)的那些)發(fā)生反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“抗原”包括所有相關(guān)的抗原表位?！氨砦弧被颉翱乖瓫Q定簇”是指抗原上的B-和/或T-細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答的位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)表位與MHC分子綴合而被呈現(xiàn)時(shí)，T-細(xì)胞對(duì)所述表位產(chǎn)生應(yīng)答。表位可由連續(xù)的氨基酸形成，也可由通過(guò)蛋白質(zhì)的三級(jí)折疊靠近的不連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于變性劑時(shí)得以保留，而通過(guò)三級(jí)折疊形成的表位通常在用變性劑處理時(shí)會(huì)失去。在獨(dú)特的空間構(gòu)象中，表位通常包括至少3個(gè)，更通常地至少5個(gè)、約9個(gè)或約8-10個(gè)氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括，例如，X射線衍射晶體分析和2-維核磁共振?？乖梢允墙M織特異性抗原，或疾病特異性抗原，例如PrP-res。這些術(shù)語(yǔ)不是排他的，如組織特異性抗原也可以是疾病特異性抗原。
[0093]保守變體:在朊病毒蛋白的情形中，其是指與另一氨基酸序列僅在一個(gè)或若干個(gè)氨基酸置換為具有相似生化 性質(zhì)的氨基酸的置換(也稱為保守置換)中有偏差的肽或氨基酸序列。保守氨基酸置換可能對(duì)所得的蛋白的活性有最小的影響。關(guān)于保守置換的其他信息可在例如 Ben Bassat et al (J.Bacteriol.，169:751-757，1987)、O，Regan etal.(Gene, 77:237-251，1989)、Sahin-Toth et al.(Protein Sc1.，3: 240-247，1994)、Hochuli et al.(Bio/Technology, 6:1321-1325，1988)和廣泛使用的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的教科書(shū)中找到。在一些實(shí)例中，朊病毒蛋白變體可具有不多于1、2、3、4、5、10、15、30、45或更多的保守氨基酸改變。
[0094]在一個(gè)實(shí)例中，保守變體朊病毒蛋白是在功能上與相似的基礎(chǔ)組分基本上一樣的朊病毒蛋白，例如與參考朊病毒蛋白相比具有序列變化的朊病毒蛋白。例如，朊病毒蛋白或該朊病毒蛋白的保守變體，會(huì)與PrP-res(或PrPse)聚集，例如會(huì)將rPrPG轉(zhuǎn)化為rPrP-res(Sc;)(或會(huì)被轉(zhuǎn)化為rPrP-res(Se))。在該實(shí)例中，朊病毒蛋白和保守變體朊病毒蛋白不具有相同的氨基酸序列。保守變體的序列可具有，例如，I個(gè)變化、2個(gè)變化、3個(gè)變化、4個(gè)變化，或5或更多個(gè)變化，只要所述保守變體仍與相應(yīng)的朊病毒蛋白互補(bǔ)。
[0095]在一些實(shí)施方案中，與其衍生自的朊病毒蛋白相比，保守變體朊病毒蛋白包括一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸置換，且仍保留了朊病毒蛋白的生物活性。例如，保守變體朊病毒蛋白可保留其衍生自的親本朊病毒蛋白分子的生物活性的至少10%，或者至少20%、至少30%或至少40%。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，保守變體朊病毒蛋白保留了其衍生自的親本朊病毒蛋白分子的生物活性的至少50%。保守變體朊病毒蛋白中的保守氨基酸置換可發(fā)生在朊病毒蛋白的任何結(jié)構(gòu)域中。
[0096]接觸:“接觸”包括在溶液和固相中，例如使樣品與特異性結(jié)合劑例如特異性結(jié)合PrP-res的抗體接觸。
[0097]足以進(jìn)行檢測(cè)的條件:容許所需活性的任何環(huán)境，例如容許抗體結(jié)合抗原例如PrP-res和待檢測(cè)的相互作用的任何環(huán)境。例如,這種條件包括合適的溫度、緩沖溶液和檢測(cè)裝置例如數(shù)字成像設(shè)備。
[0098]檢測(cè):是為確定是否存在物質(zhì)(例如信號(hào)或蛋白質(zhì)，例如PrP-res)。在一些實(shí)例中，該檢測(cè)還可包括定量，例如定量樣品(例如血清樣品或樣品的級(jí)分)中PrP-res的量。
[0099]診斷:鑒定病理狀態(tài)的存在或性質(zhì)，例如，但不限于，鑒定PrP-res的存在情況，例如在克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病中。診斷方法在靈敏度和特異性上不同。診斷測(cè)定的“靈敏度”為測(cè)試為陽(yáng)性的患病個(gè)體的百分?jǐn)?shù)(真陽(yáng)性百分?jǐn)?shù))。診斷測(cè)定的“特異性”為I減去假陽(yáng)性率，其中所述假陽(yáng)性率被定義為沒(méi)有患有所述疾病而被測(cè)試為陽(yáng)性的那些個(gè)體的比例。雖然具體的診斷方法可能不提供狀態(tài)的確定診斷，但是如果所述方法提供有助于診斷的陽(yáng)性指示，那么其是滿足需要的?！邦A(yù)后”是病理狀態(tài)發(fā)展(例如嚴(yán)重程度)的概率。
[0100]解聚:部分或完全破壞聚集體,例如PrP-res或rPrP_res(s。)的聚集體。
[0101]編碼:其中聚合的大分子或序列中的信息被用于指導(dǎo)產(chǎn)生與第一分子或序列不同的第二分子或序列的任何過(guò)程。如本文所用，所述術(shù)語(yǔ)被廣義地解釋，并且可具有多種應(yīng)用。在一些方面中，術(shù)語(yǔ)“編碼”描述其中雙鏈DNA分子的一條鏈被用作模板以通過(guò)DNA依賴性DNA聚合酶編碼新合成的互補(bǔ)姊妹鏈的半保留DNA復(fù)制過(guò)程。
[0102]在另一方面中，術(shù)語(yǔ)“編碼”是指其中一個(gè)分子中的信息被用于指導(dǎo)產(chǎn)生具有與第一分子不同的化學(xué)性質(zhì)的第二分子的任何過(guò)程。例如，DNA分子可編碼RNA分子(例如，通過(guò)結(jié)合DNA依賴性RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過(guò)程)。同樣，RNA分子可以在翻譯過(guò)程中編碼肽。當(dāng)用于描述翻譯過(guò)程時(shí)，術(shù)語(yǔ)“編碼”還延伸至編碼氨基酸的三聯(lián)密碼子。在一些方面中，RNA分子可編碼DNA分子，例如，通過(guò)結(jié)合RNA依賴性DNA聚合酶的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在另一方面中，DNA分子可編碼肽，其中應(yīng)當(dāng)理解，在這種情況中使用的“編碼”包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過(guò)程。
[0103]熒光團(tuán):一種化合物，當(dāng)其由暴露于的特定刺激，例如確定波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，可發(fā)光(發(fā)突光)，例如，以不同的波長(zhǎng)發(fā)光(例如波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光)。突光團(tuán)是更大的發(fā)光類化合物的一部分。發(fā)光化合物包括化學(xué)發(fā)光分子，其發(fā)光不需要特定的波長(zhǎng)的光，而是使用化學(xué)能量來(lái)源。因此，使用化學(xué)發(fā)光分子(例如水母發(fā)光蛋白)可以消除對(duì)外源電磁輻射例如激光的需要。
[0104]可與特異性結(jié)合PrPse的抗體相連的具體突光團(tuán)的實(shí)例提供于Nazarenko etal.的美國(guó)專利5，866，366，例如4-乙酰胺基_4’ -異硫氰酸芪_2，2’ 二磺酸、吖啶和衍生物例如吖啶和吖啶異硫氰酸酯、5-(2’ -氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N_[3_乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亞胺_3，5 二磺酸酯(Lucifer Yellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來(lái)酰亞胺、氨基苯甲酰胺、亮黃(Brilliant Yellow)、香豆素和衍生物例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC, Coumarinl20)、7_氨基_4_三氟甲基香豆素(Coumaranl51)；焰紅染料；4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ;5’，5〃- 二溴連苯三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7_ 二乙氨基-3-(4’ -異硫氰酸苯)-4-甲基香豆素；二乙撐三胺戊乙酸；4，4’ - 二異硫氰酸二氫-均二苯乙烯_2，2’ - 二磺酸；4，4’ - 二異硫氰酸芪_2，2’ - 二磺酸；5_[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)；4- 二甲氨基偶氮苯_4’ -異硫氰酸酯(DABITC);伊紅和衍生物例如伊紅和伊紅異硫氰酸酯；赤蘚紅和衍生物例如赤蘚紅B和赤蘚紅異硫氰酸酯；乙啡啶；熒光素和衍生物例如5-羧基熒光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪基-2-基)氨基熒光素(DTAF)、2’ 7’ -二甲氧基-4’ 5’ - 二氯-6-羧基熒光素(JOE)、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)和QFITC (XRITC);熒胺；IR144 ；IR1446 ;孔雀綠異硫氰酸酯；4~甲基饊形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酹磺酞；B-藻紅蛋白；鄰苯二醛；芘和衍生物例如芘、芘丁酸和玻拍酸亞胺 1-花丁酸；活性紅(Reactive Red) 4 (Cibacron?Br i 11 iant Red3B_A);羅丹明和衍生物例如6-羧基-X-羅丹明(R0X)、6-羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸酯、磺酰羅丹明B、磺酰羅丹明101和磺酰羅丹明101的磺酰氯衍生物(德克薩斯紅)；N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA);四甲基羅丹明；四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC);核黃素；玫紅酸和鋱螯合物衍生物；LightCyCler Red640 ；Cy5.5 ;和Cy56_羧基熒光素；5_羧基熒光素(5-FAM)；硼二吡咯亞甲基二氟(BODIPY) ；N, N, N’，N’ -四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA);吖啶、均二苯乙烯、-6-羧基-熒光素(HEX)、TET (四甲基熒光素)、6_羧基-X-羅丹明(R0X)、德克薩斯紅、2’，7’ - 二 甲氧基-4’，5’ - 二氯-6-羧基熒光素(JOE)、Cy3、Cy5、VIC? (AppliedBiosystems)、LC Red640、LC Red705、Yakima yellow 等。
[0105]其他合適的突光團(tuán)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些,例如可從Molecular Probes(Eugene, OR)獲得的那些。在具體的實(shí)例中，熒光團(tuán)被用作供體熒光團(tuán)或者被用作受體熒光團(tuán)。在一些實(shí)例中，熒光團(tuán)為可檢測(cè)標(biāo)簽，例如與抗體相連的可檢測(cè)標(biāo)簽。
[0106]免疫測(cè)定:利用抗體與其相應(yīng)抗原的反應(yīng)，例如抗體與蛋白例如PrP-res的特異性結(jié)合，測(cè)量樣品例如生物樣品例如獲自受試者的血清樣品中物質(zhì)的存在情況或濃度的生化測(cè)試?？乖拇嬖谇闆r或存在的抗原的量均可被測(cè)量。在一些實(shí)例中，測(cè)量了 PrP-res的量。
[0107]免疫沉淀(IP):使用特異性結(jié)合具體蛋白的抗體或肽使該蛋白質(zhì)抗原從溶液中沉淀出來(lái)的技術(shù)。這些溶液經(jīng)常為動(dòng)物組織的粗裂解液的形式。其他樣品類型可以為體液或生物來(lái)源的其他樣品。通常，在IP中抗體或肽在所述步驟中的某一時(shí)刻被偶聯(lián)至固體基質(zhì)上。
[0108]分離的:“分離的”生物組分例如肽或多肽的集合(例如PrPSe)、細(xì)胞、核酸或血清樣品已基本上從所述組分天然存在的生物的細(xì)胞中的其他生物組分(例如，其他的染色體DNA和RNA、染色體外DNA和RNA以及蛋白質(zhì))分離、分開(kāi)而產(chǎn)生或純化出來(lái)。已被“分離的”核酸、肽和蛋白質(zhì)因此包括通過(guò)常規(guī)的純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。所述術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)而制備的核酸、肽和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的肽和核酸。術(shù)語(yǔ)“分離的”或“純化的”不要求絕對(duì)純凈，而是意在作為一個(gè)相對(duì)的術(shù)語(yǔ)。因此，舉例來(lái)說(shuō)，分離的肽制劑是其中肽或蛋白質(zhì)比其細(xì)胞內(nèi)天然環(huán)境中的所述肽或蛋白質(zhì)更富集的肽制劑。優(yōu)選地，對(duì)制劑進(jìn)行純化，使得所述蛋白質(zhì)或肽提供所述制劑的總肽或蛋白質(zhì)含量的至少50%，例如所述肽或蛋白質(zhì)濃度的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至至少99%。
[0109]核酸分子:核苷酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因組DNA的正義鏈和反義鏈以及上述這些的合成形式和混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或任一類型核苷酸的修飾形式。本文使用的“核酸分子”是與“核酸”和“多核苷酸”同義的。除非另有說(shuō)明，核酸分子的長(zhǎng)度通常為至少10個(gè)堿基。所述術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式的DNA。核酸分子可包括天然存在的核苷酸和修飾的核苷酸之一或兩者，其通過(guò)天然存在和/或非天然存在的核苷酸鍵連接在一起。
[0110]朊病毒:一種主要由蛋白質(zhì)組成的傳染原。朊病毒在多種動(dòng)物中引起多種疾病，包括牛海綿狀腦病(BSE，又稱為瘋牛病)和人的克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病。所有已知的朊病毒疾病會(huì)影響腦或其他神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)，并且其所有都是不能治療且致命的?！皞魅拘院＞d狀腦病(TSE)”或朊病毒疾病是致命的神經(jīng)退行性病癥，包括人克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)、牛海綿狀腦病(BSE)、綿羊瘙癢病、鹿慢性消耗性疾病(CWD)和傳染性水貂腦病(TME)0
[0111]朊病毒被認(rèn)為可通過(guò)異常地重折疊成為能夠?qū)⒄５鞍踪|(zhì)分子轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)異常形式(例如，綿羊瘙癢病中的PrPse或變體CJD的PrPvejl1)的結(jié)構(gòu)而傳染和增殖，所述結(jié)構(gòu)異常形式通常部分地抗蛋白酶K消化，因此在本文中廣義上被指定為PrP-抵抗的PrP-res。大多數(shù)(如果不是全部)已知的朊病毒可聚合成富含緊密排列的β片層的淀粉狀蛋白原纖維。這種改變的結(jié)構(gòu)使得它們對(duì)化學(xué)和物理因素引起的變性有非常規(guī)的抗性，使得難以處理和遏制這些顆粒。
[0112]在朊病毒疾病中，朊病毒蛋白的通?？沟鞍酌傅牟±硇问健狿rP-res，似乎可在感染的宿主中通過(guò)誘導(dǎo)其正常的宿主編碼的蛋白酶敏感的前體PrP-sen或PrPG (對(duì)蛋白酶K消化敏感)轉(zhuǎn)化為PrP-res而自我增殖。PrP-sen (PrPe)為連接單體糖磷脂酰肌醇的糖蛋白，其β_片層含量低，且對(duì)蛋白酶高度敏感。相反，PrP-res (例如PrPse)聚集體的β-片層含量高且部分地抗蛋白酶。所述轉(zhuǎn)化的機(jī)制細(xì)節(jié)尚不清楚地理解，但其涉及PrP-res和PrPc之間的直接相互作用，導(dǎo)致在后者被招募至正在生長(zhǎng)的PrP-res多聚體時(shí)PrPe構(gòu)象變化(由Caughey&Baron, Nature443, 803-810，2006綜述)。因此,所述轉(zhuǎn)化機(jī)制已被初步描述為自催化種子(或有核)聚合。在本文公開(kāi)的測(cè)定中，加入包含PrP-res或朊病毒的生物樣品可導(dǎo)致反應(yīng)混合物中重組PrPG (rPrPG)轉(zhuǎn)化為rPrP-res(s。)，其然后可被檢測(cè)。所述重組蛋白rPrP-res(Se)為朊病毒誘導(dǎo)的rPrP轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的總稱，而不管所述朊病毒來(lái)源的物種和毒株。所述重組蛋白rPrP-res(Se)，不是傳染性的。
[0113]PMCA或蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊循環(huán)擴(kuò)增:一種通過(guò)以下步驟擴(kuò)增樣品中PrP-res的方法:將PrPG與所述樣品混合,孵育所述反應(yīng)混合物以使得PrP-res起始PrPG到PrP-res聚合體的轉(zhuǎn)化，使孵育步驟中形成的任何聚集體成碎片(通常通過(guò)超聲處理)，重復(fù)所述孵育和破碎步驟一個(gè)或多個(gè)循環(huán)。
[0114]多肽:其中單體為通過(guò)酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。當(dāng)氨基酸是α -氨基酸時(shí)，不論L-光學(xué)異構(gòu)體還是D-光學(xué)異構(gòu)體都可以使用，優(yōu)選L-異構(gòu)體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋白質(zhì)”意在包括任何氨基酸序列并包括修飾的序列例如糖蛋白。術(shù)語(yǔ)“多肽”特別地意在包括天然存在的蛋白質(zhì)，以及重組或合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。[0115]術(shù)語(yǔ)“多肽片段”是指多肽的部分，其展現(xiàn)出至少一個(gè)有用表位。術(shù)語(yǔ)“多肽的功能性片段”是指多肽的保留所述多肽的活性的所有片段。例如，生物學(xué)功能性片段的大小可從與能夠結(jié)合抗體分子的表位一樣小的多肽片段到能夠參與細(xì)胞內(nèi)特征誘導(dǎo)或表型改變的編程的大多肽改變。
[0116]QuIC或震動(dòng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化:一種具體類型的PrP擴(kuò)增測(cè)定，其中用搖動(dòng)反應(yīng)容器代替超聲處理以破壞聚集的rPrPG和rPrP-res(Sc)。
[0117]實(shí)時(shí)(RT) -QuIC:一種測(cè)定，其包括間歇搖動(dòng)以破壞聚集的PrPG和PrP_res，并包括使用熒光讀出，例如熒光染料硫磺素T (ThT)0示例性的方法公開(kāi)于例如，Wilham etal., PLOS Pathog.6(12):el001217,第1_15頁(yè)。通常，該測(cè)定使用PrPc作為底物，間歇地?fù)u動(dòng)反應(yīng)物，基本無(wú)洗滌劑(例如< 0.002%的SDS)或無(wú)洗滌劑，且使用無(wú)離液劑的反應(yīng)條件，以及使用基于ThT的熒光檢測(cè)朊病毒作為種子的rPrPe淀粉狀蛋白原纖維。
[0118]樣品:獲自受試者例如人或獸醫(yī)學(xué)受試者的生物樣品，其含有例如核酸和/或蛋白質(zhì)。本文使用的生物樣品包括可用于檢測(cè)受試者中PrP-res/朊病毒的所有臨床樣品，包括但不限于細(xì)胞、組織和體液，例如:血液；血液的衍生物和級(jí)分例如血清；提取的膽汁；活檢或手術(shù)除去的組織，包括例如未固定的、冷凍的、在甲醛溶液中固定和/或在石蠟中包埋的組織；淚；乳；皮膚刮削物；表面洗出液、尿、痰、腦脊液、前列腺液；膿；或者骨髓穿刺物。在具體的實(shí)施方案中，所述生物樣品以例如血液樣品的形式，例如血清樣品，獲自受試者。樣品還包括環(huán)境樣品，例如土壤或水樣品。
[0119]序列同一性:兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)氨基酸序列之間的相似性表示為所述序列之間共有的序列同一性水平。序列同一性通常表示為同一性百分比；所述百分比越大，則兩條序列越相似。用于對(duì)齊待比較的序列的方法在下文【具體實(shí)施方式】iv E部分中詳細(xì)描述。
[0120]單輪:進(jìn)行一種方法，其中未進(jìn)行系列擴(kuò)增。例如，rPrP-res(Sc)可在樣品中通過(guò)如下進(jìn)行擴(kuò)增:將所述樣品與純化的rPrPlg合以制備反應(yīng)混合物；進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其包括(i)孵育所述反應(yīng)混合物以使得rPrPG與所述反應(yīng)混合物中可能存在的PrP-res共聚集，維持可促進(jìn)rPrPG與PrP-res共聚集的孵育條件,導(dǎo)致rPrPG轉(zhuǎn)化為rPrP_res(s。)，同時(shí)抑制rPrP-res(spon)(在沒(méi)有朊病毒或PrP-res的情況下自發(fā)產(chǎn)生的抗蛋白酶的rPrP產(chǎn)物)的形成；(ii)攪動(dòng)步驟(i)中形成的聚集體；(iii)任選地重復(fù)步驟(i)和(ii) 一次或多次。在所述反應(yīng)混合物中檢測(cè)rPrP-res(s。)，其中在所述反應(yīng)混合物中檢測(cè)到rPrP_res(s。)表明所述樣品中存在PrP-res。可在所述反應(yīng)中例如延滯期(在加入所述樣品和形成可檢測(cè)的rPrP-res(s。)之間)中加入另外的底物(rPrPG)。然而，所述反應(yīng)混合物的一部分沒(méi)有被除去并且與另外的rPrPe在單獨(dú)的反應(yīng)混合物中孵育。
[0121]超聲處理:使用聲波能量破壞或分散生物材料的過(guò)程。
[0122]特異性結(jié)合劑:基本上僅與確定的靶結(jié)合的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合PrP-res而不結(jié)合PrPe的抗體。
[0123]術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指抗體或其他配體整個(gè)或部分地與抗原的優(yōu)先締合。特異性結(jié)合可被區(qū)分，這通過(guò)特異性識(shí)別抗原來(lái)介導(dǎo)。雖然選擇性反應(yīng)的抗體可結(jié)合抗原，但是它們以低親和力結(jié)合抗原。在另一方面，特異性結(jié)合可導(dǎo)致所述抗體(或其他配體)和抗原(或攜帶所述抗原的細(xì)胞)之間的締合比被結(jié)合的抗體(或其他配體)和另一蛋白(或沒(méi)有所述抗原的細(xì)胞)之間的締合更強(qiáng)。特異性結(jié)合通常導(dǎo)致結(jié)合到表達(dá)靶表位的細(xì)胞或組織的抗體或其他配體(每單位時(shí)間)的量是沒(méi)有該表位的細(xì)胞或組織的大于2倍，例如大于5倍、大于10倍或大于100倍。多種免疫測(cè)定方式適合用于選擇與具體蛋白特異性免疫反應(yīng)的抗體或其他配體。例如，固相ELISA免疫測(cè)定常規(guī)地被用于選擇與蛋白特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。關(guān)于可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定方式和條件的描述參見(jiàn)Harlow&Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NewYork (1988)。
[0124]除非另有說(shuō)明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開(kāi)內(nèi)容所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。除非上下文另有明確說(shuō)明，單數(shù)術(shù)語(yǔ)“一種”、“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)的指代物。類似地，除非上下文另有明確說(shuō)明，詞“或(或者)”意欲包括“和(并且)”。還應(yīng)理解，對(duì)核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子質(zhì)量值都是近似值，并且為描述的目而給出。雖然與本文描述的方法和材料類似或等同的方法和材料可用于本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施或測(cè)試，但是下文描述了合適的方法和材料。術(shù)語(yǔ)“包含”意指“包括”。本文提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)均以引用的方式全文納入本文。在有沖突的情況下，以包括術(shù)語(yǔ)解釋的本說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)例僅是示例性的，不是意欲進(jìn)行限制。
[0125]下文描述了用于實(shí)施或測(cè)試本公開(kāi)的合適的方法和材料。但是，所提供的材料、方法和實(shí)例僅是示例性的，不意欲進(jìn)行限制。因此，除非另有說(shuō)明，本公開(kāi)的方法和技術(shù)可依照類似或等同于描述的那些的方法和材料和/或依照本領(lǐng)域熟知常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行，如本說(shuō)明書(shū)全文中引用和論述的多種綜合性或更專業(yè)的參考文獻(xiàn)所述(參見(jiàn)，例如Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989 ；Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3ded., Cold Spring Harbor Press, 2001 ；Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates, 1992(and Supplements to2000) ；Ausubel etal., Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology,4th ed.，Wiley&Sons，1999)。
[0126]本文公開(kāi)的方法利用親和純化，例如朊病毒蛋白的免疫沉淀，然后通過(guò)另外的檢測(cè)方法例如但不限于震動(dòng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化測(cè)定(QuIC)或?qū)崟r(shí)震動(dòng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化測(cè)定(RT-QuIC)以檢測(cè)樣品例如生物樣品中的朊病毒。本文公開(kāi)的方法允許在多種生物樣品中檢測(cè)朊病毒污染、進(jìn)行診斷和/或監(jiān)測(cè)，所述生物樣品包括血液、血液級(jí)分和血液制品、尿、鼻液、唾液、腦脊液、糞便、肌肉活組織、淋巴組織、皮膚樣品、用于移植的組織樣品等。這些方法具有醫(yī)療和獸醫(yī)的應(yīng)用，并且還可用于測(cè)試生物技術(shù)制品和環(huán)境樣品(例如水、土壤、植物、垃圾、污水)以及農(nóng)業(yè)樣品(例如基于動(dòng)物的食物、基于動(dòng)物的飼料&營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、動(dòng)物廢物、副產(chǎn)物、動(dòng)物尸體、屠宰場(chǎng)廢物、規(guī)定的危險(xiǎn)物質(zhì))以確保沒(méi)有朊病毒污染。本文公開(kāi)的方法還可用于例如牛、羊和鹿中無(wú)朊病毒的牲畜群的認(rèn)證。親和純化(例如免疫沉淀)和QuIC或RT-QuIC的結(jié)合可提供檢測(cè)PrP-res的出乎意料的出色靈敏度和特異性。
[0127]1.朊病毒和朊病毒疾病的綜述
[0128]傳染性海綿狀腦病(TSE，或朊病毒疾病)是哺乳動(dòng)物的傳染性神經(jīng)退行性疾病，其包括(但不限于)，綿羊的綿羊瘙癢癥；牛的牛海綿狀腦病(BSE，又稱瘋牛病)；水貂的傳染性水貂腦病(TME);麋鹿、麋和鹿的慢性消耗性疾病(CWD);貓的貓海綿狀腦病；尼牙藪羚、羚羊和大彎角羚羊的外來(lái)有蹄類腦病(EUE);以及人的克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)及其變種(醫(yī)源性克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(iCJD)、變異型克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(vCJD)、家族性克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(fCJD)和散發(fā)性克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(sCJD))、Gerstmann-StrMussler-Scheinker綜合征(GSS)、致死性家族性失眠癥(fFl)、散發(fā)性致死性失眠癥(SFl)和庫(kù)魯病。TSE具有數(shù)月至數(shù)年的潛伏期，但是臨床癥狀出現(xiàn)后經(jīng)常是快速發(fā)展、不能治愈且總是致死的。降低TSE風(fēng)險(xiǎn)的企圖已經(jīng)導(dǎo)致了農(nóng)產(chǎn)品、藥物、化妝品和生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)和貿(mào)易的深刻變化。
[0129]在TSE中，朊病毒蛋白的病理、抗蛋白酶形式，稱為PrPse或PrP-res，似乎可在感染的宿主中通過(guò)誘導(dǎo)其正常的宿主編碼的前體PrP-sen (也稱為PrPG)轉(zhuǎn)化為PrP-res而自我增殖。PrPeS單體的連接糖磷脂酰肌醇的糖蛋白，其β_片層含量低，且對(duì)蛋白酶高度敏感。相反，PrP-res聚集體的β-片層含量高且部分地抗蛋白酶。所述轉(zhuǎn)化的機(jī)制細(xì)節(jié)尚不完全清楚，但其涉及PrP-res和PrPG之間的直接相互作用，其導(dǎo)致在后者被招募至正在生長(zhǎng)的 PrP-res 多聚體時(shí) PrPc 構(gòu)象變化(由 Caughey&Baron (2006) Nature443, 803-810 綜述)。因此，所述轉(zhuǎn)化機(jī)制已被初步描述為自動(dòng)催化的種子(或有核)聚合。
[0130]為了更好的理解朊病毒增殖的機(jī)制，已經(jīng)進(jìn)行了許多在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中重現(xiàn)PrP-res形成的嘗試。初期的實(shí)驗(yàn)表明，PrP-res可誘導(dǎo)PrPe轉(zhuǎn)化為具有毒株-和物種-特異性的PrP-res樣產(chǎn)物，盡管產(chǎn)率是亞化學(xué)計(jì)量的。最近，表明了 PrP-res形成和TSE傳染性可在粗腦勻漿物——含有多種用于轉(zhuǎn)化的潛在輔因子的介質(zhì)——中無(wú)限擴(kuò)增(Castillaet al.，(2005)Celll21，195-206)。對(duì)該“蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊循環(huán)擴(kuò)增”(PMCA)反應(yīng)的分析表明，只要加入聚陰離子例如RNA，PrP-res和朊病毒傳染性還可以用從腦組織純化的PrPG來(lái)擴(kuò)增(Deleault et al., (2007) Proc Natl Acad Sci USA.104 (23): 9741-6)。來(lái)自大腸桿菌的重組PrPG CrPRPc,也稱為rPrP-sen)缺乏糖基化，并且GPI錨可被誘導(dǎo)以自發(fā)地或在由先形成的rPrP原纖維作為種子時(shí)聚合成淀粉狀蛋白原纖維。雖然大多數(shù)rPrP淀粉狀蛋白制劑是沒(méi)有傳染性的，但是一些僅由rPrPe組成或與脂質(zhì)和核酸結(jié)合的制劑具有至少適度的傳染性[Legname et al.(2004) Science305, 673-676 ；Kim et al., (2010)J Biol Chem285 (19):14083-7 ;Wang et al., (2010)Science327 (5969):1132-5 ；Makarava et al., (2010)Acta Neuropathl19(2):177-87 ；Colby et al., (2010)PLoSPath6(l):el000736]。
[0131]在應(yīng)對(duì)TSE中，一個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是通過(guò)快速的方法對(duì)低水平的TSE傳染性(朊病毒)進(jìn)行檢測(cè)。TSE感染最常使用的標(biāo)記物是PrP-reS，PMCA反應(yīng)使得可極靈敏地檢測(cè)受感染組織中水平低于單個(gè)感染單位的PrP-res。然而，如前所述，目前PMCA的限制包括實(shí)現(xiàn)最佳靈敏度所需的時(shí)間(約3周)和使用腦PrPe作為擴(kuò)增底物。
[0132]動(dòng)物中最常見(jiàn)的TSE是綿羊瘙癢癥，但是最有名和危險(xiǎn)的TSE是BSE，BSE感染牛并且以其非專業(yè)術(shù)語(yǔ)“瘋牛病”而為人所知。在人中，最常見(jiàn)的TSE是CJD，CJD在全球范圍內(nèi)發(fā)生，發(fā)病率為每年每一百萬(wàn)人0.5-1.5個(gè)新病例。三種不同形式的CJD已在傳統(tǒng)上被識(shí)別:散發(fā)性(sCJD ；85%的病例)、家族性(fCJD ；10%)和醫(yī)源性(iCJD ;5%)。然而，在1996年，CJD的一種新變異形式(vCJD)出現(xiàn)在UK，其與消費(fèi)被BSE感染的肉有關(guān)。與典型的sCJD相比，vCJD感染平均年齡為27歲的年輕患者，并引起相對(duì)長(zhǎng)的患病時(shí)間(14個(gè)月，相比之下sCJD為4.5個(gè)月)。因?yàn)榭傻玫降挠嘘P(guān)潛伏期及暴露于受污染牛源食品的水平的信息不足，難以預(yù)測(cè)未來(lái)vCJD的發(fā)病率。在動(dòng)物中，幾乎沒(méi)有所述疾病的遺傳形式的證據(jù)，大多數(shù)病例似乎通過(guò)水平或垂直傳播獲得。
[0133]sCJD的臨床診斷基于快速進(jìn)行性多病灶癡呆與錐體和錐體束外征兆、肌陣攣、視覺(jué)或小腦征兆的結(jié)合，并結(jié)合特征性周期性腦電圖(EEG)。將sCJD與阿爾茨海默病和其他癡呆區(qū)分開(kāi)的一個(gè)關(guān)鍵診斷特征為臨床癥狀的快速發(fā)展和該疾病的短的持續(xù)時(shí)間，經(jīng)常少于2年。fCJD的臨床表現(xiàn)非常相似，不同之處是所述疾病發(fā)病略早于sCJD。雖然沒(méi)有家族史不能排除遺傳來(lái)源，但是遺傳的CJD的家族史或?qū)﹄貌《镜鞍谆蛑型蛔兊倪z傳篩查仍被用于建立fCJD診斷。
[0134]變異型CJD最初作為進(jìn)行性神經(jīng)精神病癥出現(xiàn)，該病癥的特征為焦慮、抑郁、情感冷漠、退縮和妄想癥狀，且伴有持續(xù)的痛苦感覺(jué)癥狀，然后為共濟(jì)失調(diào)、肌陣攣和癡呆。變異型CJD可通過(guò)疾病的持續(xù)時(shí)間(通常長(zhǎng)于6個(gè)月)和EEG分析(vCJD不會(huì)顯示出在sCJD中觀察到的非典型圖形)而區(qū)分于sCJD。MRI中記錄的高雙側(cè)丘腦枕信號(hào)經(jīng)常被用于幫助診斷vCJD。此外，基于已被證明在淋巴組織(例如扁桃體和闌尾)中PrPvOT染色測(cè)試為陽(yáng)性的數(shù)個(gè)vCJD病例，扁桃體活檢可用于幫助診斷vCJD。然而，由于所述測(cè)試的侵入性質(zhì)，其僅在滿足vCJD臨床標(biāo)準(zhǔn)(其中腦的MRI不會(huì)顯示出特征性丘腦枕征兆)的患者中實(shí)施。
[0135]GSS為顯性遺傳疾病，其特征為癡呆、帕金森病癥狀和相對(duì)長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間(通常為5-8年)。在臨床上，除了經(jīng)常伴有共濟(jì)失調(diào)和癲癇發(fā)作以外，GSS類似于阿爾茨海默病。診斷通過(guò)臨床檢查和對(duì)朊病毒蛋白突變進(jìn)行遺傳篩查而建立。FFI也是顯性遺傳的，并且與朊病毒蛋白突變相關(guān)。然而，與FFI有關(guān)的主要臨床發(fā)現(xiàn)為失眠癥，在后期是肌陣攣、幻覺(jué)、共濟(jì)失調(diào)和癡呆。
[0136]仍需要能夠檢測(cè)TSE，包括CJD，以及能夠檢測(cè)生物和環(huán)境樣品中的朊病毒，包括但不限于檢測(cè)血液制品中的朊病毒污染。因此，需要用于檢測(cè)朊病毒的快速和靈敏的測(cè)定。本公開(kāi)提供了一種測(cè)定系統(tǒng)，其使用免疫沉淀，然后是第二種檢測(cè)方法例如QuIC和RT-QuIC以提供用于檢測(cè)朊病毒的靈敏且特異性的方法。在一些實(shí)施方案中，在QuIC或RT-QuIC測(cè)定中使用了預(yù)先補(bǔ)充的rPrPC底物。不囿于理論，該結(jié)合測(cè)定提供了靈敏度的意料之外的提高和測(cè)定時(shí)間的令人驚訝的減少。這些測(cè)定使得可在短時(shí)間例如兩天內(nèi)，從極低滴度(例如，0.001感染單位/ml)和/或載有抑制因子的流體例如血漿中捕獲和檢測(cè)朊病毒。
[0137]I1.免疫沉淀
[0138]本文公開(kāi)的方法包括使樣品例如生物樣品與僅特異性結(jié)合朊病毒蛋白的疾病相關(guān)的構(gòu)象(例如，PrPse、PrPvOT或PrP-res)的抗體接觸。在本文公開(kāi)的方法中，使所述樣品例如生物樣品與可固化在固體基質(zhì)上的捕獲單克隆抗體(或其表位結(jié)合片段)接觸?？蛇x擇特異性結(jié)合在PrP-res (而不是PrPG)上表達(dá)的表位的單克隆抗體。
[0139]所述特異性結(jié)合PrP-res或PrPse的單克隆抗體可以來(lái)自任何物種，例如鼠抗體。所述單克隆抗體可通過(guò)已知的單克隆抗體產(chǎn)生技術(shù)產(chǎn)生。通常，單克隆抗體如下制備:再生用目的蛋白免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞，用常規(guī)方式例如通過(guò)與骨髓瘤細(xì)胞融合或通過(guò)Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化來(lái)永生化所述細(xì)胞,篩選表達(dá)所需要的抗體的克隆。參見(jiàn)，例如，Kohler and Milstein Eur.J.1mmunol.6:511 (1976)。單克隆抗體或單克隆抗體的表位結(jié)合區(qū)，還可以通過(guò)重組方法產(chǎn)生。因此，在一些實(shí)施方案中，利用了嵌合或人源化形式的單克隆抗體，其中所使用的抗體包括特異性結(jié)合PrP-res或PrPse的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。
[0140]例如，當(dāng)目的蛋白為能夠改變構(gòu)象以形成PrP-res聚集體的朊病毒蛋白時(shí)，所述單克隆抗體可以是通過(guò)用重組的正常小鼠細(xì)胞蛋白(PrPe)免疫“敲除”鼠產(chǎn)生的鼠單克隆抗體。然后，可將來(lái)自所述免疫的小鼠的脾細(xì)胞(壽命有限的產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞)與非生產(chǎn)的骨髓瘤細(xì)胞(“永生”的腫瘤淋巴細(xì)胞)融合以形成雜交瘤細(xì)胞。然后，根據(jù)對(duì)PrP-res或PrPse有特異性的抗體的產(chǎn)生和在組織培養(yǎng)中增殖的能力對(duì)所述雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。然后，可培養(yǎng)這些雜交瘤細(xì)胞以提供特異性單克隆抗體的長(zhǎng)久和穩(wěn)定的來(lái)源。通過(guò)該方法產(chǎn)生的具體單克隆抗體公開(kāi)于美國(guó)專利6，528，269中。這些單克隆抗體包括由細(xì)胞系PrP2F8、PrP5B2、PrP6H3、PrP8C6、PrP8H4 和 PrP9H7 產(chǎn)生的 2F8、5B2、6H3、8C6、8H4 和 9H7，其可特異性結(jié)合人PrP-res，還結(jié)合來(lái)自小鼠、牛、綿羊和其他物種的PrP-res，還參見(jiàn)美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)N0.2005/0118720，其以引用的方式納入本文。
[0141]本文公開(kāi)的方法還可利用單克隆抗體15B3，該抗體描述于2008年9月I日公開(kāi)的美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)N0.2008/0220447，其以引用的方式納入本文。所述抗體15B3可從Prionics AG, Zurich, Switzerland獲得，產(chǎn)生該抗體的方法公開(kāi)于PCT公開(kāi)文本N0.WO98/37210，其以引用的方式納入本文。該P(yáng)CT公開(kāi)文本還描述了結(jié)合PrP-res而不結(jié)合PrPG的抗體。PCT公開(kāi)文本N0.WO 98/37210公開(kāi)了產(chǎn)生抗體15B3的雜交瘤細(xì)胞根據(jù)布達(dá)佩斯條約以登錄號(hào)DSM ACC2298保藏在DSMZ—德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(德國(guó))(德國(guó)布倫瑞克 Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβ e 7 B38124)。
[0142]IgM單克隆抗體15B3可特異性識(shí)別朊病毒蛋白的疾病相關(guān)的形式(即，PrP-res或PrPse)并且能夠檢測(cè)腦勻衆(zhòng)物中的異常PrP,而無(wú)需PK消化(Korth et al., Nature1997;390:74-77, 1997,其以引用的方式納入本文)。此外，已經(jīng)表明在GerstmannStraussler Scheinker綜合征的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中抗體15B3可結(jié)合PrPse的蛋白酶敏感形式,這是相當(dāng)重要的，因?yàn)檫@表明了血液中的傳染性對(duì)蛋白酶消化敏感(Nazor et al.，EMBO J.24(13):2472-80, 2005;Yakovleva et al., Transfusion 44:1700-5,2004)。
[0143]所述捕獲單克隆抗體(例如15B3、Ig261、Igff226或262)可在所述測(cè)定步驟之前通過(guò)不溶解所述捕獲單克隆抗體而固定在固相上，例如通過(guò)吸附至不溶于水的基質(zhì)或表面(美國(guó)專利N0.3，720，760，其以引用的方式全文納入本文)或通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)偶聯(lián)，例如在用例如硝酸和還原劑事先激活支持物或不激活的情況下，使用戊二醛或碳二亞胺交聯(lián)(如美國(guó)專利 N0.3，645，852 或 Rotmans et al., J.1mmunol.Methods 57:87-98，1983 中所述)，或者在所述測(cè)定步驟之后，例如通過(guò)免疫沉淀而固定在固相上。
[0144]用于固定化的固相可以是基本上不溶于水且用于免疫測(cè)定的任何惰性支持物或載體，包括形式為例如表面、顆粒、多孔基質(zhì)、瓊脂糖等的支持物。常用的支持物的實(shí)例包括小片、葡聚糖凝膠、聚氯乙烯、塑料微珠、磁珠，以及用聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯制造的測(cè)定平板或試管等，包括96孔微量滴定板和384孔微量滴定孔板，以及微粒材料，例如濾紙、瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖和其他多糖。或者，有活性的不溶于水的基質(zhì)例如溴化氰激活的碳水化合物和描述于美國(guó)專利N0.3，969，287,3, 691，016,4, 195，128,4, 247，642、4，229，537和4，330，440的反應(yīng)性底物適用于捕獲單克隆抗體固定化。在一個(gè)實(shí)例中，固定化的捕獲單克隆抗體包覆在微量滴定板上，尤其地，所述固相可以為多孔微量滴定板。例如，所述多孔微量滴定板可以是微測(cè)試96-孔ELISA板。所述固相可以為磁珠，例如DYNABEADS? (Invitrogen)或其他磁珠，例如可從 NEW ENGLAND BIOLABS?.獲得
的那些或DYNAL?磁珠。
[0145]通常，將所述捕獲單克隆抗體(例如，但不限于，15B3)連接在固體基質(zhì)上。根據(jù)需要，這種連接可以通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)相互作用或物理連接。用于連接的技術(shù)包括描述于美國(guó)專利N0.4，376，110和本文引用的參考文獻(xiàn)中的那些。如果使用共價(jià)結(jié)合，那么可在本領(lǐng)域熟知的條件下用交聯(lián)劑和捕獲劑一起孵育所述平板、微珠或其他固相。
[0146]所述固體基質(zhì)還可具有抗體，例如與所述固體基質(zhì)共價(jià)連接的兔抗小鼠抗體或兔抗人抗體。然后，可將連接到所述固體基質(zhì)的抗體與第二目的抗體(例如小鼠或人抗體)孵育以實(shí)現(xiàn)所述第二抗體與所述固體基質(zhì)的連接。在一個(gè)具體的非限制性實(shí)例中，將兔抗小鼠抗體與固體基質(zhì)偶聯(lián)，然后將其與特異性結(jié)合朊病毒蛋白的第二抗體例如但不限于15B3、IgG W226 或 IgG261 孵育。
[0147]用于將捕獲單克隆抗體連接到固體基質(zhì)的常用交聯(lián)劑包括，例如1，1-雙(重氮乙?；?-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、與4-疊氮水楊酸形成的酯、同型雙功能亞氨酸酯包括二琥珀酰亞胺酯例如3，3’ -二硫代雙(琥珀酰亞胺丙酸酯)，以及雙官能團(tuán)馬來(lái)酰亞胺例如二 -N-馬來(lái)酰亞胺-1，8-辛烷。衍生劑，例如甲基_3-[ (P-疊氮苯基)二硫代]丙酰亞胺(propioimidate)可產(chǎn)生能夠在光的存在下形成交聯(lián)的光活化中間體。
[0148]如果使用微量滴定孔板(例如,96-孔板或384-孔板),那么可將它們?cè)诶缡覝叵掠糜H和純化的捕獲單克隆抗體(通常在緩沖液中稀釋)包被約2-約3小時(shí)。也可直接用特異性結(jié)合PrP-res或PrPse的抗體包被所述板。在測(cè)定本身之前可堆積和包被所述板很久，然后以手動(dòng)、半自動(dòng)或自動(dòng)的方式，例如通過(guò)使用機(jī)器人同時(shí)在若干樣品上進(jìn)行所述測(cè)定。
[0149]類似地，如果使用DYNABEADS?，例如 DYNABEADS? M-450 (大鼠抗小鼠IgM)，那么可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法用所述抗體來(lái)包被所述微珠。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，使用渦旋將DYNABEADS?懸浮在小瓶中，然后將適量的DYNABEADS?:移至聚丙烯或聚苯乙烯管中。將所述管置于磁體上持續(xù)較短的時(shí)間，然后從所述磁體上移開(kāi)。加入包被緩沖液，例如通過(guò)使用渦旋混合所述微珠。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，使用了包含磷酸鹽緩沖鹽水中約ο.01%-1%例如約0.1%的牛血清白蛋白的包被緩沖液。用于所述包被緩沖液的另外阻斷劑的實(shí)例包括但不限于卵白蛋白、酪蛋白和脫脂乳。加入目的抗體(例如，但不限于，15B3、IgG W226或IgG261)，并且用所述目
的抗體孵育DYNABEADS?,輕柔混合足夠的時(shí)間以使所述抗體附著到所述微珠。然后，可使用磁體從上清液分離包被的微珠，并加入包被緩沖液?？蓪⑴悸?lián)到所述抗體的DYNABEADS?重復(fù)洗滌，并保存?zhèn)溆谩?br> [0150]在一個(gè)實(shí)例中，可將抗體(例如但不限于15B3)以約5μ g抗體Λ00μ I DYNABEADS?.偶聯(lián)到所述基質(zhì)。在另一實(shí)例中，可將抗體(例如但不限于15B3)以每IX l(T6 DYNABEADS?, / μ gl5B3抗體偶聯(lián)到所述基質(zhì)。在另一實(shí)例中，可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20或30倍的抗體，例如每100 μ LDYNABEADS? (例如4X IO8個(gè)微珠/ml)中30-50 μ g，例如36 μ g的抗體，例如15B3。在其他實(shí)施方案中，對(duì)于IX IO8個(gè)微珠可使用Ing-1O μ g的抗體。在另一實(shí)例中,可以使用I X 10_8 DYNABEADS? (例如，4X IO8 個(gè)微珠 /ml) 100-300 μ g 的抗體，例如 15B3。在一些非限制性實(shí)例中，磁珠上抗體的濃度為約10-500μ gl5B3/lX108個(gè)微珠。
[0151]包被的板或微珠任選地可用非特異性地結(jié)合于結(jié)合位點(diǎn)并使所述結(jié)合位點(diǎn)飽和的阻斷劑處理以防止游離配體與所述板孔上的過(guò)量位點(diǎn)的不需要的結(jié)合。用于該目的的合適阻斷劑的實(shí)例包括明膠、牛血清蛋白、卵白蛋白、酪蛋白和脫脂奶。
[0152]在進(jìn)行包被和阻斷后，將待分析的樣品加入到固定化的抗體。所述樣品可以是生物樣品或環(huán)境樣品?？蓪⑺鰳悠穭蛸|(zhì)化(例如對(duì)于組織樣品，例如腦樣品)，并用例如裂解緩沖液(例如，含有l(wèi)%Nonidet P_40、0.5%去氧膽酸鈉、5mM EDTA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，PH8.0)適當(dāng)稀釋?？墒褂闷渌礈靹珀庪x子型、陽(yáng)離子型或非離子型洗滌劑，包括但不限于十二烷基硫酸鈉(SDS)，以勻質(zhì)化樣品。或者，可以使用機(jī)械方式，例如使用吹打或裝置例如攪拌器和勻漿器。生物樣品可以是血液、血清、血漿或另外的生物流體樣品，例如但不限于腦脊液或鼻液。所述樣品可以為組織樣品，例如腦樣品或淋巴組織樣品(例如扁桃體)。可將所述樣品被稀釋，例如在緩沖液例如含有牛血清白蛋白的緩沖液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述樣品在緩沖液例如任選地包含洗滌劑的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(TBS)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋。所述洗滌劑可以是陽(yáng)離子型、陰離子型或非離子型洗滌齊U。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗滌劑為肌氨酰(Sarkosyl)。例如，可將所述微珠在TBS中在約0.1%至約1%，例如約0.4%肌氨酰的存在下與所述樣品接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將所述微珠在TBS中在約0.1 %至約I %肌氨酰的存在下，例如在緩沖液例如TBS或PBS中在
0.4%至約1%肌氨酰的存在下與所述樣品接觸。在一些實(shí)例中，使用了在緩沖液，例如TBS或PBS中約0.1%、約0.4%、約1%、約2%、約3%或約4%的肌氨酰。
[0153]為了足夠的靈敏度，向所述固定化的捕獲單克隆抗體加入的樣品的量可以是這樣的，即使得所述固定化的捕獲單克隆抗體相對(duì)于生物樣品適當(dāng)稀釋之后所述樣品中預(yù)計(jì)的構(gòu)象改變的蛋白質(zhì)的最大摩爾濃度是摩爾過(guò)量的。
[0154]選擇孵育所述生物樣品和固定化的單克隆抗體的條件以使所述測(cè)定的靈敏度最大以及使解離最少。優(yōu)選地，所述孵育在十分恒定的溫度，約0°C -約40°C，例如在約4°C、室溫(例如，約25°C)、約35°C至約39°C下，或者在約37°C，或者約35°C至40°C下完成。在一些實(shí)施方案中，所述溫度約19至約40°C，例如在室溫下。孵育時(shí)間可以為例如，2小時(shí)至12小時(shí)，例如過(guò)夜。在一些實(shí)例中，在約0°C至約40°C下，例如在約4°C、室溫(例如約25°C)或37°C下，所述孵育時(shí)間為2、4、6、8、10、12、20或24小時(shí)，例如過(guò)夜。在具體的非限制性實(shí)例中，所述孵育為室溫下約2小時(shí)，或4°C下過(guò)夜，例如4°C下約12小時(shí)，或室溫下約10至20小時(shí)，例如室溫或37°C下20小時(shí)。
[0155]在所述生物樣品與固定化的捕獲單克隆抗體(例如15B3)接觸之后，洗滌所述生物樣品。洗滌介質(zhì)通常為具有使用孵育步驟常用的因素和緩沖液確定的PH的緩沖液(“洗滌緩沖液”)?？蛇M(jìn)行所述洗滌例如I次、兩次、3次或更多次。所述洗滌可在任意的溫度下進(jìn)行，例如約0°C至約40°C，例如在室溫下(例如，25°C)或在37°C下。在另外的實(shí)施方案中，所述方法包括使用緩沖液中的SDS，例如0.01%至0.1%SDS，例如約0.01%,0.02%,0.03%、0.04%,0.05%,0.06% 或 0.07%SDS,例如 0.04% 至 0.06%SDS,例如約 0.05%SDS。洗滌緩沖液的實(shí)例包括但不限于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(TBS)，任選地包括肌氨酰，例如約0.05-0.5%肌氨酰，例如0.1%、0.2%、0.3%或0.4%肌氨酰。一個(gè)示例性的洗滌緩沖液為T(mén)BS中0.2%肌氨酰。
[0156]然后，可對(duì)已經(jīng)與所述樣品接觸的固體基質(zhì)，例如磁珠，進(jìn)行處理以檢測(cè)結(jié)合的朊病毒蛋白，例如使用下文所述的標(biāo)準(zhǔn)QuIC(SQ)反應(yīng)或?qū)崟r(shí)QuIC(RTQ)反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在檢測(cè)結(jié)合的朊病毒蛋白之前，不釋放(洗脫)結(jié)合到抗體的朊病毒蛋白(例如PrPSc;)，而是將包含含所述抗體的固體基質(zhì)和朊病毒蛋白兩者的反應(yīng)混合物直接用于測(cè)定(例如但不限于SQ或RTQ)中以檢測(cè)PrP-res或PrPs。。因此，沒(méi)有將包含特異性結(jié)合PrP-res的抗體的免疫復(fù)合物從所述反應(yīng)混合物中分離，而是將其直接用于SQ或RTQ測(cè)定。
[0157]II1.QuIC (SQ)和 RT-QuIC (RTQ)
[0158]稱為蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊循環(huán)擴(kuò)增(PMCA)的朊病毒檢測(cè)方法基于朊病毒在含PrPe的組織勻漿物中體外復(fù)制的能力(參見(jiàn)，例如PCT公開(kāi)文本N0.W00204954)。PMCA涉及:通過(guò)與源自腦組織的合適朊病毒蛋白底物孵育來(lái)擴(kuò)增PrP-res，系列地?cái)U(kuò)增PrPe(例如通過(guò)交替的孵育和超聲處理步驟)以及檢測(cè)所得的PrP-res。在一些實(shí)例中，在約3周的時(shí)間內(nèi)交替孵育和超聲處理，并間歇地將所述反應(yīng)混合物的一部分移出并與另外的PrPe孵育以系列地?cái)U(kuò)增所述樣品中的PrP-res。在所述重復(fù)的孵育/超聲處理/稀釋步驟之后，檢測(cè)所述反應(yīng)混合物中得到的PrP-res。雖然基于腦提取物的PMCA是用于檢測(cè)PrP-res的非常靈敏的測(cè)定，但是其有數(shù)個(gè)限制，特別是實(shí)現(xiàn)最佳靈敏度所需的時(shí)間(2-3周)和使用腦源的PrPe作為擴(kuò)增底物。該方法還使用超聲處理。
[0159]相反，在QuIC方法(SQ和RTQ)中，攪動(dòng)通過(guò)搖動(dòng)而不是超聲處理進(jìn)行。這些測(cè)定使用可以以高純度大量快速獲得的重組表達(dá)的rPrPM乍為底物(Atarashi et al.，(2008) NatMethods, 5，211-212，其以引用的方式納入本文)，而來(lái)自腦組織的天然存在的PrPG的純化是困難的，并且有更低的產(chǎn)率(Deleault et al.(2005) J.Biol.Chem.280, 26873-26879 ；Pan et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90, 10962-10966 ；Hornemann et al., (2004)EMBO R印.5，1159-1164)。此外，與腦勻漿物中或從腦純化的PrPG不同，rPrPG可容易被突變或在策略上用探針標(biāo)記以簡(jiǎn)化和加快相關(guān)產(chǎn)物的檢測(cè)。
[0160]存在兩種類型的利用rPrPG的PrP-res擴(kuò)增方法，一種是使用超聲處理CrPrP-PMCAXAtarashi et al., (2007) Nat Methods, 4，645-650)，一種是利用搖動(dòng)(QuIC)(Atarashi et al., (2008)Nat Methods, 5，211-212)。這些方法有利于關(guān)于 PrP-res 結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)化機(jī)制的基礎(chǔ)研究。定點(diǎn)突變使得可用多種可報(bào)告構(gòu)象變化以及rPrP-res(Se)聚集體內(nèi)分子間和分子內(nèi)距離的探針精確標(biāo)記rPrPG。此外，RTQ使得可使用硫磺素T (ThT)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在增強(qiáng)的RTQ中，在許多可檢測(cè)的(ThT-陽(yáng)性)的聚合發(fā)生之前(例如，在24小時(shí)孵育之前)，事先補(bǔ)充rPrPG，同時(shí)保留存在的rPrP-res(Sc;)。
[0161]QuIC和RT-QuIC方法通常包括將樣品(例如，懷疑含有朊病毒或PrP-res的組織樣品、CSF樣品或血漿樣品)與純化的rPrPe混合以制備反應(yīng)混合物，進(jìn)行初步反應(yīng)以在所述混合物中形成和擴(kuò)增特定形式的rPrP-res(Se)。所述初步反應(yīng)包括孵育所述反應(yīng)混合物以使PrP-res起始rPrPG到rPrP_res(Se)的特定聚集體或聚合物的轉(zhuǎn)化；使所述孵育步驟中形成的任何聚集體或聚合物成碎片；重復(fù)所述孵育和碎片化步驟I次或多次，例如約I至2次、I至4次、I至10次或10至約50次。在所述方法的一些實(shí)施方案中，通過(guò)移出所述反應(yīng)混合物的一部分并將其與另外的沖1 孵育來(lái)進(jìn)行系列擴(kuò)增。在其他實(shí)施方案中，向所述反應(yīng)加入另外的rPrPG,例如在所述延滯期中(在形成可檢測(cè)的rPrP-res(s。)之前,例如所述24小時(shí)反應(yīng)之前)，并重復(fù)所述孵育和碎片化步驟。
[0162]在其他的實(shí)施方案中，所述方法在沒(méi)有系列擴(kuò)增的情況下進(jìn)行，以使得結(jié)合朊病毒的底物保留在反應(yīng)容器中，并補(bǔ)充所述底物而不除去潛在的PrP-res種子。例如，PrP-res可通過(guò)如下步驟在樣品中擴(kuò)增:將所述樣品與純化的rPrPG混合以制備反應(yīng)混合物；進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其包括(i)孵育所述反應(yīng)混合物以使rPrPG與所述反應(yīng)混合物中可能存在的PrP-res/PrPs。共聚集，并且保持可促進(jìn)rPrPG與PrP-res共聚集的孵育條件，導(dǎo)致rPrPG至rPrP_res(s。)的轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制rPrP_res(sp°n)的形成；(ii)攪動(dòng)步驟(i)中形成的聚集體；(iii)任選地重復(fù)步驟(i)和(ii) I次或多次。檢測(cè)所述反應(yīng)混合物中的rPrP-res(s。)，其中在所述反應(yīng)混合物中檢測(cè)到rPrP_res(s。)表明所述樣品中存在PrP-res?？稍谒龇磻?yīng)中例如在加入所述樣品和檢測(cè)rPrP-res(Se)形成之間的延滯期中加入另外的底物(rPrPe)。然而，當(dāng)使用單輪擴(kuò)增時(shí)，沒(méi)有將所述反應(yīng)混合物的一部分移出且將其與另外的rPrPG孵育。在一些實(shí)施方案中，所述rPrPG可通過(guò)向所述反應(yīng)混合物加入另外的rPrPG底物來(lái)補(bǔ)充。
[0163]通常，對(duì)于QuIC或RT-QuIC (SQ或RTQ)，所述反應(yīng)包括在沒(méi)有超聲處理的情況下使用搖動(dòng)(QuIC反應(yīng))，以及在持續(xù)時(shí)間內(nèi)使用約1:1的搖動(dòng)/靜止周期。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，所述反應(yīng)交替進(jìn)行60秒的搖動(dòng)和60秒的不搖動(dòng)(靜止)。在另一非限制性實(shí)例中，所述反應(yīng)交替進(jìn)行30秒的搖動(dòng)和30秒的不搖動(dòng)(靜止)。然而，可改變所述時(shí)間，例如45秒的搖動(dòng)和45秒的不搖動(dòng)或者70秒的搖動(dòng)和70秒的不搖動(dòng)。因此，靜止的時(shí)間和搖動(dòng)的時(shí)間是相等的。在其他實(shí)施方案中，總周期的靜止時(shí)間和搖動(dòng)時(shí)間的長(zhǎng)度為120秒。因此，在一些實(shí)例中，所述反應(yīng)包括90秒的搖動(dòng)和30秒的不搖動(dòng)，100秒的搖動(dòng)和20秒的不搖動(dòng)，或者80秒的搖動(dòng)和40秒的靜止。在另外的實(shí)施方案中，所述總循環(huán)時(shí)間的長(zhǎng)度約60、70、80、90、100、110或120秒，包括至少30秒、至少40、或至少50秒的搖動(dòng)。
[0164]還發(fā)現(xiàn)反應(yīng)在37_60°C下，例如45_55°C，例如約50°C，或者在約42°C _46°C下，尤其有效。這些條件對(duì)于促進(jìn)rPrP-res(Se)(特別是17kDaPK抗性類型)的形成并同時(shí)降低在無(wú)種子的反應(yīng)的開(kāi)始24小時(shí)中rPrP-res(sp°n)的形成尤其有效。因此，所述反應(yīng)可進(jìn)行3-12小時(shí)，例如6-12小時(shí)，例如8-10小時(shí)。然而，取決于反應(yīng)溫度，14小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)，例如至少45小時(shí)、48小時(shí)或者甚至65或96小時(shí)的較長(zhǎng)擴(kuò)增反應(yīng)也可提供極佳的結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)進(jìn)行3-96小時(shí)。例如，所述反應(yīng)可進(jìn)行不多于12小時(shí)、不多于24小時(shí)、不多于36小時(shí)、不多于48小時(shí)、不多于72小時(shí)、不多于96小時(shí)或不多于120小時(shí)。在一些實(shí)例中，所述反應(yīng)進(jìn)行約5小時(shí)-約120小時(shí)。
[0165]在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)使用濃度為100mM-500mM的氯化鈉(NaCl)，例如約100mM、200mM、300mM、400mM NaCl進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，所述反應(yīng)使用200_400mM NaCl進(jìn)行。
[0166]在其中使用免疫沉淀和實(shí)時(shí)QuIC的方法(IP-RTQ反應(yīng)或eQuIC)中，將ThT用于檢測(cè)rPrP-res(Se)。如果固體基質(zhì)是微珠，例如磁珠，那么所述微珠和任何締合的朊病毒或朊病毒誘導(dǎo)的RTQ轉(zhuǎn)化產(chǎn)物傾向于緊貼所述反應(yīng)容器例如孔的底部。因此，可容易地改變反應(yīng)流體，以其RTQ前狀態(tài)補(bǔ)充底物，而不從所述孔移出許多微珠或結(jié)合的反應(yīng)產(chǎn)物。所述rPrPe底物可在延滯期中事先補(bǔ)充，例如在表明由轉(zhuǎn)化為朊病毒接子的淀粉狀蛋白產(chǎn)物造成大量消耗的ThT陽(yáng)性之前。因?yàn)檠a(bǔ)充，IP-RTQ是高度靈敏的，使得RTQ的總靈敏度增加達(dá)至少1000倍，并且總反應(yīng)時(shí)間極大的減少。底物的濃度通常為0.lmg/mL.[0167]因此，QuIC反應(yīng)可以為RT-QuIC反應(yīng)，并因此可包括使得可檢測(cè)所述rPrP-res(Sc)的硫磺素T (ThT)0 RT-QuIC測(cè)定包括rPrPG作為底物，例如在96孔板中間歇地?fù)u動(dòng)反應(yīng)物，無(wú)洗滌劑且無(wú)離液劑的反應(yīng)條件，以及對(duì)朊病毒作為種子的rPrPG淀粉狀蛋白原纖維進(jìn)行基于ThT的熒光檢測(cè)。使用ThT的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其可包括在所述反應(yīng)混合物中。硫磺素T為結(jié)合淀粉狀蛋白原纖維時(shí)顯示出增強(qiáng)的熒光的苯并噻唑染料(參見(jiàn)Khurana et al.，J.Structural Biol.151:229-238，2005)，并且常被用于檢測(cè)淀粉狀蛋白原纖維。
[0168]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)朊病毒蛋白的方法，包括: 使樣品與有效量的特異性結(jié)合朊病毒、PrPse *PrP-res的抗體接觸足夠的時(shí)間以形成免疫復(fù)合物； 從所述樣品中分離所述免疫復(fù)合物； 將所述免疫復(fù)合物與純化的重組朊病毒蛋白(rPrPG)混合以制備反應(yīng)混合物；和 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述擴(kuò)增反應(yīng)包括: (i)孵育所述反應(yīng)混合物以使所述PrP-res與所述反應(yīng)混合物中存在的rPrPG共聚集； (ii)保持促進(jìn)所述rPrPG與PrP-res共聚集的孵育條件以導(dǎo)致所述rPrPG到rPrP-res(Sc)的轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制rPrP_res(sp°n)的形成； (iii)攪動(dòng)步驟Q)中形成的聚集體，其中所述反應(yīng)條件包括搖動(dòng)所述反應(yīng)混合物而不是進(jìn)行超聲處理；和 (iv)重復(fù)步驟(i)-(iii) 檢測(cè)所述反應(yīng)混合物中的rPrP-res(s。)，其中在所述反應(yīng)混合物中檢測(cè)到rPrP-res(Sc)表明所述樣品中存在PrP-res。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述特異性結(jié)合朊病毒、PrP-res或PrPse的抗體與固體基質(zhì)偶聯(lián)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所`述固體基質(zhì)為磁珠。
4.權(quán)利要求3的方法，其中分離所述免疫復(fù)合物包括使用磁體。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體為15B3、其人源化形式或其抗原結(jié)合片段。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體與磁珠偶聯(lián)，并且其中所述磁珠上所述抗體的濃度約360 μ g/ml，或者其中所述磁珠上所述抗體的濃度約10-500 μ gl5B3/l X IO8個(gè)微珠。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中使生物樣品在約19-40°C的溫度下與所述抗體接觸。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品為生物樣品。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述生物樣品為血液、血漿、血清或腦脊液樣品。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，包括用含十二烷基硫酸鈉或肌氨酰的緩沖液孵育所述磁珠，然后使所述生物樣品與所述磁珠接觸。
11.權(quán)利要求10的方法，包括用0.01%-0.1%十二烷基硫酸鈉洗滌所述磁珠。
12.權(quán)利要求10的方法，包括用約0.05%十二烷基硫酸鈉洗滌所述磁珠。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)rPrP-res(Se)的存在情況包括使用硫磺素T (ThT)0
14.權(quán)利要求13的方法，其中在所述反應(yīng)混合物中不包括高于0.002%的洗滌劑。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，還包括在檢測(cè)rPrP-res(Se)的存在情況之前向所述反應(yīng)混合物加入另外的rPrPG,而不除去rPrP-res(Se)
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述另外的rPrPG被加入到所述反應(yīng)混合物，而不進(jìn)行系列的多輪擴(kuò)增。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述rPrPG為嵌合的倉(cāng)鼠-綿羊rPrPG，并且其中所述 PrP-res 為 PrPCJD。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述倉(cāng)鼠-綿羊rPrPG包含敘利亞倉(cāng)鼠PrP序列的氨基酸23-137和綿羊PrP的殘基141-234。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述綿羊PrP包括R154和Q171。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行所述擴(kuò)增反應(yīng)包括在0.05%-0.8%的洗滌劑中孵育所述反應(yīng)混合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述洗滌劑包括十二烷基硫酸鈉。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述洗滌劑包含0.05-0.4%十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.05-0.4%Triton X-1OO0
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述洗滌劑包含0.4%十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.4%Triton X-100。
24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)PrP-res的存在情況包括使所述反應(yīng)混合物與特異性結(jié)合朊病毒、PrP-res或PrPse的第二抗體接觸。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述特異性結(jié)合PrP-res的第二抗體不是15B3。
26.權(quán)利要求20-25任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)PrP-res的存在情況包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、側(cè)流測(cè)定、SOPHIA (環(huán)繞光纖免疫測(cè)定)或蛋白質(zhì)印跡。
27.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法，還包括定量 所述PrP-res/PrP'
28.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中攪動(dòng)所述聚集體包括搖動(dòng)所述反應(yīng)混合物一段時(shí)間而不進(jìn)行超聲處理，所述一段時(shí)間基本上等于所述搖動(dòng)之前的靜止時(shí)間。
29.權(quán)利要求28的方法，其中將所述反應(yīng)混合物搖動(dòng)約60秒然后不搖動(dòng)約60秒。
30.權(quán)利要求1的方法,其中重復(fù)步驟(iii)約1-約200次。
31.一種檢測(cè)朊病毒蛋白的方法，其包括: 使生物樣品與有效量的偶聯(lián)到固體基質(zhì)的抗體15B3接觸足夠的時(shí)間以在所述固體基質(zhì)上形成免疫復(fù)合物； 將所述固體基質(zhì)上的免疫復(fù)合物與所述生物樣品分離； 用含0.5%十二烷基硫酸鈉的緩沖液洗滌所述固體基質(zhì)上的免疫復(fù)合物； 將所述固體基質(zhì)上的免疫復(fù)合物與純化的倉(cāng)鼠綿羊嵌合重組朊病毒蛋白(rPrPe)和硫磺素T混合以制備反應(yīng)混合物；并且 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述擴(kuò)增反應(yīng)包括: (i)孵育所述反應(yīng)混合物以使得所述PrP-res與所述反應(yīng)混合物中存在的rPrPG共聚集; (ii)保持促進(jìn)所述rPrPG與所述PrP-res共聚集的孵育條件以導(dǎo)致所述rPrPG至rPrP-res(Sc)的轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制rPrP_res(sp°n)的形成； (iii)攪動(dòng)步驟(i)中形成的聚集體，其中搖動(dòng)所述反應(yīng)混合物約60秒，然后不搖動(dòng)約60秒； (iv)在形成可檢測(cè)的rPrP-reS(Se)之前，向所述反應(yīng)混合物加入另外的倉(cāng)鼠綿羊嵌合重組朊病毒蛋白(rPrPG)，和 (V)任選重復(fù)步驟(iii)和/或(iv) 使用熒光檢測(cè)所述反應(yīng)混合物中的rPrP-res(Se)，其中所述反應(yīng)混合物的熒光表明所述樣品中存在PrP-res。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述生物樣品為來(lái)自人的血液、血清、血漿、腦脊液或組織樣品 。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103460049SQ201280013852
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月18日
【發(fā)明者】C·D·奧魯, B·W·考赫伊, F·庫(kù)恩, B·施羅德, A·賴博 申請(qǐng)人:美國(guó)政府(由衛(wèi)生和人類服務(wù)部的部長(zhǎng)所代表), 普利奧尼克斯股份公司