專利名稱：多種生物醫(yī)學(xué)用途的無(wú)朊病毒膠原和膠原衍生物以及植入物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種清除膠原或膠原衍生物中朊病毒的方法，特別是通過(guò)脫水熱滅活或化學(xué)滅活。
在生物學(xué)材料中，膠原特別是Ⅰ型膠原是各種結(jié)締組織包括骨中的一種主要成分。由于膠原的存在，用人或動(dòng)物來(lái)源的組織如皮膚或骨移植物替代人的組織加速創(chuàng)傷愈合過(guò)程。因而，由于(ⅰ)這些產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞的生物學(xué)支持物和組織修復(fù)或再生的支架，(ⅱ)可避免取出植入物的生物可降解性和(ⅲ)它們的生物相容性，膠原衍生物作為生物材料的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)中具有巨大的作用。膠原已被用于設(shè)計(jì)生物材料，如創(chuàng)傷敷料、人造皮膚、骨或肌腱替代物、組織工程設(shè)備和整形外科中的可注射材料1-5。利用動(dòng)物特別是來(lái)自牛的膠原的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是便于制備大量的純的Ⅰ型或Ⅰ/Ⅲ型膠原。
新的病毒或新的感染性疾病的出現(xiàn)，特別是自從發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)如朊病毒的傳播同感染相關(guān)(即牛海綿狀腦病)6后，要求提高對(duì)生物制劑安全的警惕性。針對(duì)朊病毒的生物產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)由于缺少能夠在初始材料中檢查瘙癢癥樣因子的檢測(cè)方法而復(fù)雜化。從人源純化的膠原也可能是人海綿狀腦病7或者病毒性疾病(已知和未知)的載體。
瘙癢癥因子對(duì)熱和物理滅活具有極強(qiáng)抵抗力8。常規(guī)的瘙癢癥樣因子的滅活和消毒建議延長(zhǎng)暴露于濃NaOH溶液以及在130℃以上溫度高壓滅菌的時(shí)間9。然而，對(duì)于這種方法是否僅僅延長(zhǎng)孵育時(shí)間仍然有爭(zhēng)議10。此外，只有NaOH可被用于膠原，因?yàn)楦邏簻缇茐哪z原。
在相似的濃度和孵育時(shí)間下(推薦的)由NaOH處理膠原已被研究用于清除其它感染性因子，如細(xì)菌或病毒(RNA或DNA病毒)。在堿性環(huán)境中，我們已經(jīng)通過(guò)瓊脂糖凝膠間接地證明DNA和RNA并未被充分片段化，以實(shí)現(xiàn)清除感染性疾病及其傳播。
在另一研究中，我們比較了通常用于交聯(lián)膠原產(chǎn)品(即Yannas皮膚、心臟生物瓣膜、血管移植物以及其它生物學(xué)植入物)的戊二醛處理的效果。已經(jīng)測(cè)試了兩種用戊二醛溶液處理膠原的方法。一種是利用水而另一種用稀乙酸作為交聯(lián)膠原的緩沖液。后者的條件描述于Yannas專利U.S.4,060,081，這是關(guān)于人造皮膚的。許多研究人員聲稱戊二醛處理膠原及其衍生的產(chǎn)品(即明膠膠囊)可以消毒最終的交聯(lián)化產(chǎn)物。利用這兩種戊二醛處理方法，我們的研究(利用瓊脂糖凝膠)清楚地顯示摻入我們的膠原中的DNA和RNA沒(méi)有被完全降解，而隨后極有可能有病毒和細(xì)菌傳播的風(fēng)險(xiǎn)。
其它如8M尿素的處理也已被推薦。然而，觀察到了DNA和RNA的部分降解。這種降解是部分的而不足以提供無(wú)病毒產(chǎn)品的保證。另一方面，蟻酸(FA)、SDS、氟化醇以及三氟乙酸(TFA)對(duì)同瘙癢癥感染性的失活相關(guān)的朊病毒(PrP27-30)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)具有顯著的效果11-12。在該領(lǐng)域沒(méi)有膠原會(huì)耐受那些處理的跡象。
如上所述，當(dāng)前聯(lián)合NaOH和高壓滅菌用于清除朊病毒。我們已經(jīng)證實(shí)NaOH本身不能保證DNA或RNA的分解。另外已知在大約130℃高壓滅菌破壞膠原。將其它利用劇烈的脫水熱處理的方法用于交聯(lián)聚合物成分。脫水熱處理也已用于消毒產(chǎn)品以及交聯(lián)聚合物成分。沒(méi)有人研究過(guò)是否加熱消毒可以清除朊病毒而保留含膠原產(chǎn)品的完整性。
由于上述原因，需要有一種制備無(wú)朊病毒的含膠原產(chǎn)品的方法，其中朊病毒被清除而膠原沒(méi)有超出預(yù)期程度或不可避免程度的顯著變性。
本發(fā)明的目的是提供一種從含膠原產(chǎn)品中清除朊病毒而基本保留這些產(chǎn)品的完整性的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這樣一種方法利用一種溶液pH低于大約2的強(qiáng)酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)浸滲作用被直接用于凍干的含膠原產(chǎn)品的強(qiáng)酸是純?nèi)宜峄蚍宜?pH1)。反應(yīng)的時(shí)間可依酸的性質(zhì)從大約1到5小時(shí)而變化，如酸性越強(qiáng)，清除朊病毒而不影響產(chǎn)品完整性所需的時(shí)間越短。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，脫水熱處理取代化學(xué)滅活例如強(qiáng)酸。在該特定的方法中，將膠原或膠原衍生物如明膠用足以清除朊病毒而不對(duì)膠原完整性產(chǎn)生超過(guò)預(yù)期范圍的顯著影響的溫度和時(shí)間條件處理。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，那些條件是在干氣氛中(高度真空下)110℃的溫度和1-3天的時(shí)間。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將上述的兩個(gè)消毒方法結(jié)合。首先，用TFA處理膠原一段時(shí)間，這依是否欲期將膠原轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z而定。當(dāng)希望有向凝膠的實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)變時(shí)，可以用TFA或一種具有等價(jià)作用的酸處理膠原5個(gè)小時(shí)以上，優(yōu)選在6到12小時(shí)之間。然后將膠原或膠原衍生物(例如膠原、TFA處理過(guò)的膠原或明膠)進(jìn)行具有清除朊病毒和可能有的交聯(lián)產(chǎn)品的效果的脫水熱處理。加熱處理具有通過(guò)交聯(lián)而穩(wěn)定產(chǎn)品以及清除朊病毒的雙重效果。
本發(fā)明的另一目的是提供含有通過(guò)酸和/或加熱滅活方法制備的膠原和膠原衍生物的產(chǎn)品，上述滅活方法具有獲得一種安全的無(wú)朊病毒膠原的優(yōu)點(diǎn)。在制備膠原產(chǎn)品中作為一種初始材料的膠原，已制成薄膜、海綿、藥物輸送系統(tǒng)或創(chuàng)傷敷料的膠原；聯(lián)接于其它酸穩(wěn)定分子的膠原以及膠原衍生物或片段都是可進(jìn)行滅活處理的材料的例子。
通過(guò)下列特定的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，其目的是用于闡明而不是限制本發(fā)明的范圍。

圖1未處理的(A)和由蟻酸(B)；三氟乙酸(C)；三氟乙醇(D)和六氟-2-丙醇(E)處理的(暴露時(shí)間為1小時(shí))膠原材料的FTIR譜圖。圖2純蟻酸(FA)和三氟乙酸(TFA)的FTIR譜圖。圖3在光譜去褶合之前(a&b)和之后(c&d)在酰胺Ⅰ區(qū)中膠原材料的FTIR譜圖。將未處理的膠原(全線)同由蟻酸(點(diǎn)劃相間的線)、三氟乙酸(劃線)、三氟乙醇(點(diǎn)線)和六氟-2-丙醇(劃雙點(diǎn)相間的線)處理1小時(shí)(a&c)或5小時(shí)(b&d)的膠原比較。圖4細(xì)胞生長(zhǎng)。將人皮膚成纖維細(xì)胞接種于多孔板液體培養(yǎng)基中同未處理的(空心正方形)或經(jīng)暴露于FA(實(shí)心三角形)、TFA(實(shí)心正方形)、TFE(實(shí)心圓形)或HFIP(空心圓形)處理的膠原海綿接觸。通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)胞隨時(shí)間的變化確定細(xì)胞的生長(zhǎng)。給出了均值和均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N=18)。圖5FA(A,B&C)、TFA(D)和TFE(E)處理過(guò)的膠原海綿的觀察。在植入之前(A組織切片，×181；B:TEM,×19,200)，F(xiàn)A對(duì)有孔膠原海綿的處理導(dǎo)致具有周期性的膠原束(箭號(hào))的崩潰結(jié)構(gòu)(B)。在小鼠中進(jìn)行皮下植入，隨后分析。給出了第30天取出的植入物的組織切片(C,D&E；×90)。在此期間，在植入的膠原材料的膠原束(箭號(hào))之間出現(xiàn)細(xì)胞浸潤(rùn)(箭頭)。在B中，注意到細(xì)胞外基質(zhì)(*)的沉積。在D中，在膠原材料中出現(xiàn)脂肪組織(f)以及炎性細(xì)胞(ⅰ)。圖6在牛Ⅰ型膠原中和經(jīng)下列不同化學(xué)處理過(guò)的膠原中所含的核酸的平均片段長(zhǎng)度。A中的泳道含有膠原海綿加5μg酵母RNA；B中的泳道含有膠原海綿加5μg牛胸腺DNA；而C中的泳道僅含有膠原海綿。這些樣品都用下列化學(xué)物質(zhì)處理無(wú)化學(xué)物質(zhì)(1號(hào)泳道)、蟻酸(2號(hào)泳道)、三氟乙酸(3號(hào)泳道)、三氟乙醇(4號(hào)泳道)和六氟-2-丙醇(5號(hào)泳道)。將1.5％的瓊脂糖凝膠用溴化乙錠(1μg/ml)染色。該凝膠的第一個(gè)和最后一個(gè)泳道分別含有HindⅢλ噬菌體+HaeⅢ消化的φX174DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖7經(jīng)暴露于FA或TFA處理1小時(shí)的凍干膠原海綿的水的攝取量。在用FA或TFA處理之前和之后還比較了復(fù)合PEG-膠原材料。圖8在由FA或TFA處理1小時(shí)的膠原和PEG-膠原海綿中吸收的放射性標(biāo)記的生長(zhǎng)因子(125I-bFGF)的動(dòng)力學(xué)曲線。海綿被植入不同的時(shí)間階段并測(cè)量作為植入后時(shí)間函數(shù)的放射性。圖9透明的膠原水凝膠和薄膜的光密度。用不同的波長(zhǎng)對(duì)于由TFA處理8小時(shí)的多種膠原材料的研究。材料和方法化學(xué)試劑蟻酸(FA)(23.4N)購(gòu)自BDH公司(Ville St-Laurent,QC,加拿大)；三氟乙酸(TFA)(安瓿中的游離酸)購(gòu)自Sigma化學(xué)公司，(St-Louis,MI,美國(guó))；2,2,2-三-氟乙醇(99％；TFE)和1,1,1,3,3,3,-六氟-2-丙醇(99％；HFIP)購(gòu)自Aldrich化學(xué)公司(Milwaukee,WI,美國(guó))。樣品制備從成年牛皮中通過(guò)乙酸分散體提取膠原并通過(guò)NaCl鹽沉淀純化以獲得不溶膠原纖維束的分散體13-14。如以前所報(bào)道的14，這些膠原纖維的周期性是高度保守的。按以前所描述的14，通過(guò)凍干一種1％的膠原分散體(w/v膠原比水)來(lái)獲得膠原海綿。然后，按照由Safar等11所描述的方法將海綿暴露于純FA(pH:1)、TFA(pH:1)、TFE(pH:5)和HFIP(pH:4.5-5)不同的時(shí)間。然后將真空干燥的樣品重新水化于蒸餾的并去離子的水中，在室溫下充分洗滌24小時(shí)。在這個(gè)過(guò)程中，pH在不到1小時(shí)內(nèi)恢復(fù)到最初水的5-6的pH范圍并保持穩(wěn)定。然后空氣干燥大部分樣品以用于分析。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物研究，在無(wú)菌環(huán)境中操作海綿。傅立葉變換紅外光譜法(FTIR)用裝備了MCT/A探測(cè)器和鍺包被的KBr光束分裂器的NicoletMagna-550傅立葉變換光譜儀記錄FTIR光譜。常規(guī)需要100次以0.5cm的光學(xué)遲滯的掃描，經(jīng)三角形變跡及傅立葉轉(zhuǎn)換來(lái)獲得2cm-1的分辨率。以裝備有一個(gè)Si半球形、3mm直徑內(nèi)部反射元件的Split Pea附件以衰減的全反射模式來(lái)記錄膠原海綿的紅外光譜。按照所描述的15利用7.5的收縮因子和0.14的變跡濾波器進(jìn)行酰胺Ⅰ光譜區(qū)的傅立葉去褶合。將這些參數(shù)用來(lái)最小化在未觀察到膠原帶的1720-1750cm-1區(qū)的側(cè)波瓣。每種處理對(duì)不同的膠原批次包括對(duì)照進(jìn)行三次測(cè)定。差異掃描量熱法(DSC)在Perkin Elmer DSC7差異掃描量熱儀上測(cè)定變性溫度。為了便于測(cè)量，制備一種3％(v/w)膠原分散體然后空氣干燥以獲得致密的薄膜。將樣品引入一潔凈的可卷曲鋁盤并加入大約15ml蒸餾水。將注入相同體積蒸餾水的對(duì)照盤設(shè)置在設(shè)備的參照口中。在DSC中注入液氮并用氦吹清。在-50℃到90℃以10℃/min的加熱率進(jìn)行分析。通過(guò)測(cè)定達(dá)到變性峰最高點(diǎn)的溫度確定變性溫度。重復(fù)進(jìn)行測(cè)量，并且變性溫度值具有±3℃的精確度范圍。膠原酶測(cè)試對(duì)于膠原酶測(cè)試，將干的膠原海綿浸入含有緩沖液A(25mM Tris緩沖液和10mM CaCl2)的膠原酶(每mg膠原250單位膠原酶；來(lái)自溶組織梭狀芽孢桿菌(Clostridium histolyticum)的LA型，Sigma)中性溶液(pH7.5)。將樣品在37℃孵育并在孵育過(guò)程中以5分鐘的間隔進(jìn)行觀察。導(dǎo)致膠原海綿完全消失(即所有片段)的孵育時(shí)間認(rèn)為與材料對(duì)酶降解的抗性相關(guān)。另外，根據(jù)以前描述的一種方法16，在膠原酶消化1小時(shí)后測(cè)定羥脯氨酸含量。測(cè)定三次樣品，并利用學(xué)生t檢驗(yàn)同設(shè)定為≤0.05的顯著水平進(jìn)行比較。成纖維細(xì)胞培養(yǎng)用以1×103細(xì)胞/cm2的低細(xì)胞密度接種于孔底的人包皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)研究。將膠原材料引入細(xì)胞培養(yǎng)插入物(3.0μm聚乙烯對(duì)苯二酸酯有孔濾膜，購(gòu)自Becton Dickinson Labware)。在37℃下含5％CO2的潮濕空氣中將細(xì)胞培養(yǎng)于添加5％胎牛血清的Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基(Sigma)中。在24、72小時(shí)和7天，按照所描述的追蹤細(xì)胞的方法17利用體外活體DNA染料(Hoechst 33342；Polysciences,Inc.)在孔中直接確定細(xì)胞數(shù)。利用Wilcoxon秩和(雙尾)檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。皮下植入麻醉下在小鼠中進(jìn)行海綿的皮下植入。按照加拿大動(dòng)物照料委員會(huì)的準(zhǔn)則并由研究性動(dòng)物照料委員會(huì)批準(zhǔn)后，在無(wú)菌條件下進(jìn)行外科手術(shù)。在每只動(dòng)物的背部通過(guò)醫(yī)學(xué)切口在每一側(cè)制備兩個(gè)皮下囊。在同一動(dòng)物中植入FA、TFA、TFE和HFIP處理的海綿(1平方厘米)，在4個(gè)囊的每一個(gè)中植入一塊海綿。每個(gè)植入時(shí)間段用3只動(dòng)物。在植入后第7、15、30和90天處死動(dòng)物。收集膠原標(biāo)本并固定在甲醛中，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)(2個(gè)連續(xù)切片)并用蘇木素-根皮紅-藏紅花染色。通過(guò)在篩網(wǎng)上直接干燥膠原分散體隨后用檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色進(jìn)行透射電鏡觀察。DNA和RNA檢測(cè)的樣品處理及瓊脂糖凝膠對(duì)于DNA和RNA的檢測(cè)，有3組5個(gè)樣品1組包括膠原和RNA，2組包括膠原和DNA，而3組只包括膠原。對(duì)于含有DNA或RNA的樣品，在膠原海綿制備的分散步驟中引入牛胸腺DNA(CalbiochemCorp.)和酵母RNA(Boehringer Mannheim)。DNA和RNA所用的濃度為0.2-0.5μg/mg膠原，其相當(dāng)于每個(gè)樣品最終DNA或RNA的量分別為5μg。對(duì)于每個(gè)組，將每個(gè)樣品用如上所述的化學(xué)試劑處理或不處理(對(duì)照組)?；瘜W(xué)試劑處理后，將海綿用高度純化的膠原酶(Ⅶ型，購(gòu)自Sigma)在37℃于緩沖液A中消化2小時(shí)。膠原酶消化后立即在1.5ml體積中進(jìn)行蛋白酶K消化。向膠原酶緩沖液中加入NaCl、EDTA(pH7.8)、蛋白酶K和SDS至終濃度分別為85mM、12.5mM、300μg/ml以及0.5％。在37℃孵育樣品3小時(shí)。2小時(shí)后，如果海綿沒(méi)有被消化為小片，則每管加入額外的200μg蛋白酶K。在3次酚-氯仿抽提前，3小時(shí)消化階段后所有海綿全部消化。為了沉淀核酸，加入2μl糖原(20μg/μl)和80μl 5M NaCl、420μl H2O和4ml 100％乙醇。將核酸重懸于200μl水中并轉(zhuǎn)入1.5ml微量試管中。使水蒸發(fā)，并加入20μl水將核酸重懸于較小的體積。加入5μl的5×上樣緩沖液〔5×TAE(40mM Tris-乙酸和1mM EDTA,pH:8)，0.025％溴酚藍(lán)，30％購(gòu)自Pharmacia的Ficoll 400水溶液和2％SDS〕。將每個(gè)樣品的全部體積(25μl)上樣于中性瓊脂糖凝膠中，于TAE中在50伏電壓下電泳2小時(shí)10分鐘。結(jié)果和討論膠原的化學(xué)處理和其物理化學(xué)特性通過(guò)FTIR光譜學(xué)和DSC的研究可以分別確定膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象變化，以及在膠原分子中實(shí)現(xiàn)從三螺旋向隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變所需的溫度。這些與分子內(nèi)和分子間鍵相關(guān)。
由于這些樣品的紅外光譜同純膠原的紅外光譜幾乎重合，所以FTIR數(shù)據(jù)提示在膠原樣品和TFE或HFIP之間未觀察到強(qiáng)的相互作用(圖1)。因而，這些試劑不會(huì)促進(jìn)膠原的任何化學(xué)修飾，而且在洗滌過(guò)程中被從膠原海綿中清除。另一方面，用FA或TFA處理的樣品表現(xiàn)出一些額外的帶，主要的一條帶對(duì)于FA定位于大約1190和1715cm-1而對(duì)于TFA則定位于大約1170和1782cm-1(圖1)。這些新的紅外峰的頻率和相對(duì)強(qiáng)度同那些在純FA和TFA的紅外光譜中所觀察到的緊密相配，表明這些分子仍存在于膠原結(jié)構(gòu)中(圖2)。由于蛋白質(zhì)肽鍵的振動(dòng)，分別位于1650和1550cm-1附近的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ帶的頻率表明這些分子采用的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖3中所見(jiàn)，由于如氨基酸組成、在三聯(lián)體中殘基的序列、復(fù)合物的凝集狀態(tài)、樣品的濕度以及溶劑類型的幾種因素，酰胺Ⅰ帶表示一種多成分的結(jié)構(gòu)。膠原酰胺Ⅰ帶的主要紅外特征是中心位于1631cm-1(圖3A和3B)，這是膠原中非亞氨基酸殘基的特征。雖然對(duì)于TFE處理過(guò)的樣品酰胺Ⅰ光譜區(qū)保持不變，但當(dāng)同未處理過(guò)的膠原相比較時(shí)，對(duì)于用FA、TFA和HFIP處理過(guò)的樣品可以觀察到一種酰胺Ⅰ帶形狀的改變。在圖3C和3D中去褶合酰胺Ⅰ帶提供了在以前被歸為膠原中亞氨基酸殘基的在1655cm-1處的一種額外光譜成分的證據(jù)。除了TFE處理的膠原海綿，一旦與FA、TFA和HFIP相互作用，所有的化學(xué)試劑都引起1655/1631吸收值比率的降低。這種1655/1631比率的降低已被證實(shí)隨膠原變性而被觀察到。由于處理1小時(shí)的樣品的紅外光譜的酰胺Ⅰ區(qū)同未處理的膠原相比已經(jīng)被修飾，所以這種修飾似乎發(fā)生在處理的第一階段。另外，對(duì)于處理1小時(shí)的樣品的1655和1631cm-1特征值的相對(duì)強(qiáng)度同處理5小時(shí)的樣品非常相似。然而，暴露5小時(shí)后的TFA處理樣品的紅外光譜由于TFA在1740cm-1處光譜供獻(xiàn)的存在表現(xiàn)出酰胺Ⅰ特征的帶寬的可觀的增加。因而，在膠原中存在的TFA量在暴露5小時(shí)后比暴露1小時(shí)要高。隨著暴露時(shí)間的增加，在結(jié)構(gòu)構(gòu)象上的變化可能提高FA或TFA的捕獲和植入。通過(guò)擴(kuò)大的去褶合酰胺Ⅰ特征可展示出膠原變性為明膠。然而，發(fā)現(xiàn)純明膠的光譜(即熱的膠原)比TFA處理后的光譜更大(資料未示)。另一方面，已經(jīng)描述了同蛋白質(zhì)堿性基團(tuán)形成FA鹽，并且FA在肽鍵處的直接結(jié)合也是一種可能性。這些現(xiàn)象表明FA可以結(jié)合于我們的膠原。以前已經(jīng)表明TFA摻入的聚甘氨酸的多聚體導(dǎo)致幾乎充分伸展的肽鏈，其在平行或反平行片層中形成β樣結(jié)構(gòu)構(gòu)型。當(dāng)將聚-L-賴氨酸溶于TFA中時(shí)出現(xiàn)類似的具有可逆性的現(xiàn)象。這些現(xiàn)象在TFA處理的膠原中可能發(fā)生。另外，如用有機(jī)溶劑時(shí)所觀察到的氫鍵斷裂引起在膠原殼水合過(guò)程中的干擾，這可能影響膠原纖維通過(guò)疏水效應(yīng)的自身相連。后者可以解釋膠原結(jié)構(gòu)的失穩(wěn)定。
同未處理過(guò)的膠原變性相關(guān)的熱致轉(zhuǎn)換引起一個(gè)大的吸熱峰，跨度從45到80℃，中心位于61±3℃(表1)。這種變性溫度同從牛心包中提取的膠原所報(bào)道的65℃的值一致22。除了TFE處理的未引起顯著變化外，所有化學(xué)處理的膠原海綿都表現(xiàn)變性溫度的顯著降低(表1)。TFA誘導(dǎo)的變性溫度降低最大，特別是在暴露于化學(xué)試劑很長(zhǎng)一段時(shí)間后。對(duì)于FA、TFA和HFIP處理的膠原所觀察到的變性溫度的降低可能同二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變相關(guān)。這些試劑也可以引起膠原結(jié)構(gòu)中氫鍵的減少。另一方面，暴露于TFA5小時(shí)后吸熱溫度也同用明膠所觀察到的相近(資料未示)。膠原的化學(xué)處理和其生物學(xué)特性在膠原酶消化過(guò)程中，除了HFIP處理的膠原比用FA或TFE處理的膠原降解得明顯更快外，未處理過(guò)的膠原海綿的完全降解發(fā)生在同處理過(guò)的海綿相同的時(shí)間內(nèi)(平均從57到73分鐘)。然而，發(fā)現(xiàn)在膠原酶處理1小時(shí)后，所釋放的羥脯氨酸的量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上彼此相近。由于膠原酶以在膠原的三重螺旋部分中的氨基酸序列為靶，所以這個(gè)結(jié)構(gòu)在化學(xué)處理之后可能被部分保留。
在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定可以反映化學(xué)試劑或副產(chǎn)品從材料泄漏的可能性。除了TFE處理過(guò)的海綿以外，在處理過(guò)的膠原上細(xì)胞的生長(zhǎng)以時(shí)間的函數(shù)增加(圖4)，這與用對(duì)照海綿所看到的接近。在后一條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)在第7天被明顯抑制。對(duì)這種抑制的解釋還無(wú)法明確地確定或聯(lián)系到特定的改變。相反，如通過(guò)FTIR所示的殘余FA或TFA產(chǎn)物或副產(chǎn)物的最終泄漏似乎沒(méi)有作用于培養(yǎng)中的細(xì)胞。
未處理過(guò)的膠原材料在植入前以形成有孔結(jié)構(gòu)的周期性膠原纖維束形式出現(xiàn)14-23。在TFE或HFIP處理過(guò)的膠原中觀察到相似的結(jié)構(gòu)。相反，在FA或TFA處理的樣品中，膠原纖維束被緊密包裹(圖5A)，類似一崩潰的孔結(jié)構(gòu)。如通過(guò)透射電鏡所觀察到的，這些纖維在用FA而不是用TFA處理后仍是周期性的(圖5B)。后一觀察(即TFA處理)表明在每個(gè)纖維中發(fā)生了變性而未完全溶化整個(gè)膠原材料。相反，F(xiàn)A處理的變性可被局限于某些膠原纖維。
這些材料體內(nèi)行為的研究使得可以在復(fù)雜的細(xì)胞和組織環(huán)境中探討它們的生物學(xué)特性。植入7天后，細(xì)胞浸潤(rùn)由在膠原植入物中的少數(shù)炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成。炎癥反應(yīng)也出現(xiàn)在環(huán)繞植入物的組織中，特別是在由TFA和HFIP處理過(guò)的海綿中(表2)。至15天時(shí)，炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)出現(xiàn)在特別是由FA、TFE和HFIP處理過(guò)的植入物中。在TFE處理過(guò)的膠原材料內(nèi)觀察到脂肪細(xì)胞或脂肪變性。炎癥在TFA處理過(guò)的膠原的外周尤其可見(jiàn)。至1個(gè)月時(shí)，在所有化學(xué)處理的海綿中出現(xiàn)細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)。對(duì)于FA、HFIP和TFE處理過(guò)的膠原，細(xì)胞浸潤(rùn)出現(xiàn)在整個(gè)膠原材料的內(nèi)部，另外，在植入的膠原束之間的各個(gè)位點(diǎn)處出現(xiàn)新的結(jié)締組織。對(duì)于TFA處理過(guò)的膠原樣品，植入物表現(xiàn)出被脂肪組織部分再吸收以及炎癥反應(yīng)的存在。至90天時(shí)，除了HFIP處理過(guò)的膠原植入物未收回外，雖然觀察到一些殘余膠原束，但植入物大部分被再吸收。在變性溫度表現(xiàn)出明顯降低的FA和TFA處理后，殘余的膠原被輕微的炎癥反應(yīng)所包圍并被新沉積的膠原浸潤(rùn)。
同其它處理相比，在FA處理的植入物的周圍和內(nèi)部炎癥反應(yīng)是最輕的。另外，反應(yīng)明顯持續(xù)少于30天。由TFE處理的海綿也觀察到這些反應(yīng)。相反，TFA處理的海綿引起重要的炎癥反應(yīng)，這可以通過(guò)同那些由FA處理的膠原相比在膠原內(nèi)存在高殘余量的TFA來(lái)解釋。對(duì)HFIP處理海綿的炎癥反應(yīng)明顯是重的，但局限于植入的早期階段。
同以前的利用膠原海綿作為創(chuàng)傷支架的研究相比23-24，由于FA和TFA處理導(dǎo)致的崩潰的有孔結(jié)構(gòu)的植入引起快速的細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)于變性的膠原植入物或在用明膠混合膠原纖維后也描述過(guò)相似的現(xiàn)象25,26。如由FTIR和DSC處理所示，變性和非變性的膠原可出現(xiàn)在我們的材料中。酸中的膠原膨脹，伴有纖維長(zhǎng)度和厚度的改變，而三重鏈單位仍保持完整27。對(duì)于FA或TFA的處理，由于我們初始的膠原由硬質(zhì)纖維單位組成，它們能夠通過(guò)這些纖維的抵抗力而減慢變性過(guò)程，所以在酸處理下膠原完全轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z是不大可能的。然而，如用變性劑和我們的透射電鏡觀察所證實(shí)的，用TFA處理特別是處理5小時(shí)后，可能比用FA處理誘導(dǎo)膠原纖維更多地解離。由于在長(zhǎng)時(shí)間暴露于化學(xué)試劑后變性的能力增加，所以將暴露1小時(shí)的樣品用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)生物相容性研究?；瘜W(xué)處理對(duì)膠原中核酸的效應(yīng)在瓊脂糖凝膠中的單鏈RNA片段和雙鏈DNA片段遷移率分布的分析是一種確定同核酸降解程度相關(guān)的鏈斷裂頻數(shù)(由Drouin等29綜述)的有效方法。中性瓊脂糖凝膠可在0.5cm寬帶中顯現(xiàn)少至2ng30。對(duì)于單鏈DNA和RNA的靈敏度比雙鏈DNA低5到10倍。這意味著需要大約20ng的單鏈核酸以便于檢測(cè)。獲自牛皮革的膠原的確含有一些核酸(圖7,C中的泳道)。這些核酸可能主要是平均片段長(zhǎng)度低于100個(gè)核苷酸的RNA。彌漫帶的上部可能是聚集的核糖體RNA和tRNA。DNA可能只是牛皮革提取物中存在的核酸的一小部分。微量核酸的存在可能是由于(ⅰ)如通過(guò)微生物學(xué)分析證實(shí)的細(xì)菌(環(huán)境桿菌和分枝桿菌；“資料未示”)；(ⅱ)病毒(未證實(shí))和/或(ⅲ)在皮革廠從牛皮清除毛發(fā)后和/或通過(guò)乙酸分散體和鹽沉淀純化后所剩余的細(xì)胞殘余物。在利用特定DNA染料對(duì)凍干純化的膠原和原膠原海綿的觀察中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核存在(“資料未示”)。
另一方面，TFA將任何核酸水解為非常小的片段(低于10個(gè)核苷酸)，甚至將所加的DNA和RNA完全降解(泳道A3和B3，圖6)。FA也將在膠原海綿中所含的任何核酸不可恢復(fù)地水解為非常小的片段，而將加入的RNA和DNA降解為低于40個(gè)核苷酸的平均片段長(zhǎng)度。其它化學(xué)處理似乎不產(chǎn)生任何顯著數(shù)量的鏈斷裂(泳道A4、B4和C4；圖6)。FA(pH:1)和TFA(pH:1)處理的非常酸的條件多數(shù)情況下引起廣泛的DNA變性、核酸脫嘌呤以及RNA和DNA磷酸二酯鍵的水解。相反，如由大多數(shù)生產(chǎn)膠原的公司所推薦的用1N NaOH處理膠原的方法正如最近通過(guò)中性瓊脂糖凝膠所證實(shí)的沒(méi)有分解DNA或RNA(資料未示)。
在本研究中所測(cè)試的每個(gè)化學(xué)處理都包括一個(gè)強(qiáng)的(pH:1)或溫和的(pH:4.5-5)酸性環(huán)境并且在室溫下進(jìn)行處理至少1小時(shí)。在強(qiáng)酸性條件下，出現(xiàn)DNA的變性、DNA和RNA的廣泛脫嘌呤以及多聚脫氧核糖核酸和多聚核糖核酸磷酸二酯鍵的水解31。通過(guò)溫和的酸處理，易于從DNA中清除嘌呤堿基。在溫和的酸性條件下，DNA被部分變性和部分脫嘌呤；RNA基本上無(wú)改變以及在RNA和DNA中極少的磷酸二酯鍵水解。總之，強(qiáng)酸處理膠原海綿絕對(duì)使DNA過(guò)度脫嘌呤化并使RNA和DNA帶有太多的鏈斷裂而不能被任何DNA或RNA聚合酶所利用而具有感染性；而溫和的酸性處理留有可被容易地復(fù)制以合成DNA的RNA分子，這時(shí)DNA的脫嘌呤程度可能非常嚴(yán)重從而杜絕其感染性。另外，通過(guò)一種化學(xué)的瘙癢癥滅活劑(例如，F(xiàn)A或TFA)的處理引起同瘙癢癥感染性的滅活相關(guān)的朊病毒的β片層樣二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的丟失11?；诒卷?xiàng)關(guān)于通過(guò)FA和TFA處理降解核酸的研究以及那些以前報(bào)道11的結(jié)果，我們可以總結(jié)出化學(xué)處理的膠原無(wú)瘙癢癥感染性和病毒的傳播?？傊?，這樣一種化學(xué)處理可以組成一種制備安全的無(wú)朊病毒和病毒的膠原/明膠材料的方法。FA因其在降解核酸中作為一種化學(xué)滅活物的活性而似乎是四種被測(cè)試劑中最有效的，并且盡管其在膠原分子中存在，但它的應(yīng)用產(chǎn)生一種好的生物可容的膠原/明膠材料。正如用其它生物可降解和非生物可降解生物材料所觀察到，后者僅產(chǎn)生一種短暫炎癥反應(yīng)，伴有最輕的炎癥。
從上面的結(jié)果可以推斷出，實(shí)現(xiàn)清除朊病毒的兩種酸是具有大約1的pH的強(qiáng)有機(jī)酸。兩種其它具有大約5.0的pH的化合物并不有效。其它強(qiáng)有機(jī)酸和/或無(wú)機(jī)酸只要達(dá)到低于大約2.0的溶液pH并且不會(huì)將膠原降解至非預(yù)期的程度，可能等價(jià)于TFA和FA?？筛鶕?jù)酸試劑酸性程度調(diào)節(jié)反應(yīng)的時(shí)間。脫水熱處理如上面提到的，為制備安全的膠原產(chǎn)品已經(jīng)嘗試了許多已知的消毒方法(例如NaOH、戊二醛、尿素)。從推薦使用NaOH作為一種膠原的處理方法中可以推斷出將避免熱處理。然而我們利用較溫和的條件而不是在134℃高壓滅菌來(lái)消毒膠原。將膠原在爐中于真空下在110℃脫水1-3天。通過(guò)處理，膠原輕度交聯(lián)且無(wú)菌而未變性。在這些條件中，我們通過(guò)瓊脂糖凝膠分析了DNA和RNA的降解，并觀察到了這些分子被完全分解(利用加入膠原中的DNA和RNA)。當(dāng)溫度固定于110℃時(shí)脫水熱處理的時(shí)間可以從1到3天不等，在較高溫度時(shí)可或多或少的縮短，而在較低溫度時(shí)延長(zhǎng)。
由于高壓滅菌對(duì)于維持膠原完整性并不理想，所以顯然具有溫度和壓力值限制，超過(guò)此限則膠原被破壞至無(wú)法接受的比例，并且這在如高壓消毒中出現(xiàn)的濕的條件下或在大氣濕度下干加熱中都可觀察到。如果在升高溫度前沒(méi)有完全消除水蒸氣或濕度(例如利用高度真空)，膠原將開(kāi)始變性然后比病毒、細(xì)菌或朊病毒還要快地被降解。
熱處理可直接用于明膠，并將具有通過(guò)交聯(lián)來(lái)穩(wěn)定明膠以及制備安全的無(wú)朊病毒產(chǎn)品的雙倍優(yōu)點(diǎn)。如果通過(guò)用一種如TFA的強(qiáng)酸處理膠原很長(zhǎng)的時(shí)間(超過(guò)5天)來(lái)制備明膠，則熱處理會(huì)提供雙倍安全的產(chǎn)品(TFA和熱是清除朊病毒的兩個(gè)步驟)并且還將穩(wěn)定明膠(其是一種改變的膠原)。例如可將交聯(lián)的明膠用來(lái)實(shí)現(xiàn)用于給藥的明膠膠囊的腸內(nèi)抗性。作為給藥系統(tǒng)的TFA處理的膠原海綿的性質(zhì)(ⅰ)TFA處理膠原(暴露1小時(shí))引起高的水分吸附作用和吸收作用(見(jiàn)圖7)，而FA處理似乎損害水分吸著作用。這通過(guò)肽如生長(zhǎng)因子的吸收作用也已經(jīng)被觀察到。我們的研究表明通過(guò)放射自顯影測(cè)定放射性標(biāo)記的生長(zhǎng)因子在TFA處理的膠原有孔結(jié)構(gòu)中是均勻分布的，而在FA處理后，放射性標(biāo)記的生長(zhǎng)因子的分布仍然在海綿周圍。TFA的性質(zhì)對(duì)于實(shí)現(xiàn)在一膠原材料例如當(dāng)前所描述的材料上的藥物吸收的設(shè)計(jì)是非常有意義的。
(ⅱ)無(wú)朊病毒和病毒膠原海綿的穩(wěn)定的有孔結(jié)構(gòu)可用作創(chuàng)傷敷料或給藥系統(tǒng)?？梢杂肍A或TFA處理如在專利公開(kāi)CA2,164,262(PEG-膠原)中所描述的通過(guò)聚乙二醇(PEG)穩(wěn)定的膠原材料。然而，為了保留有孔結(jié)構(gòu)，應(yīng)在PEG接枝后進(jìn)行FA或TFA處理。已經(jīng)對(duì)這些復(fù)合產(chǎn)品的生物相容性進(jìn)行了研究。它們具有同未處理過(guò)的PEG-膠原相似的行為。細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果表明產(chǎn)品無(wú)細(xì)胞毒性(細(xì)胞生長(zhǎng)同對(duì)照相似)，而且動(dòng)物(小鼠)研究表現(xiàn)輕度的伴有細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥反應(yīng)。除了TFA處理的PEG-膠原外，在小鼠中有孔結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定達(dá)180天。TFA處理的PEG-膠原植入后維持90天，隨后發(fā)生生物降解。這種穩(wěn)定性的變化對(duì)于提供一系列具有一定的生物降解率的產(chǎn)品是有益的。TFA處理的PEG-膠原可進(jìn)一步進(jìn)行劇烈的促進(jìn)交聯(lián)并增加穩(wěn)定性的脫水熱處理。我們驗(yàn)證了PEG接枝的膠原是否會(huì)削弱FA或TFA處理對(duì)DNA和RNA的破壞。瓊脂糖凝膠清楚地顯示正如以前在膠原海綿中所報(bào)道的核酸的降解。
(ⅲ)在PEG處理前引入FA和TFA，膠原海綿難以保持有孔。然而，所獲的膠原產(chǎn)品允許細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有傷口愈合過(guò)程中的一些延遲。這種有趣的性質(zhì)可用來(lái)穩(wěn)定如上所述由明膠(如由TFA誘導(dǎo)的)制備的膠囊。
(ⅳ)復(fù)合的PEG-膠原可用作生長(zhǎng)因子運(yùn)輸系統(tǒng)，因?yàn)橥瑔渭兡z原比其能維持較高濃度的生長(zhǎng)因子。由FA或TFA對(duì)這些復(fù)合PEG-膠原的處理在體內(nèi)保留了這種特性(見(jiàn)圖8)。另外，通過(guò)放射自顯影，生長(zhǎng)因子良好地分布在有孔結(jié)構(gòu)中。透明產(chǎn)品和植入物依據(jù)膠原的批次，通過(guò)從6到12小時(shí)不等的長(zhǎng)時(shí)間暴露于TFA可以獲得透明膠原。因此，處理過(guò)的膠原海綿表現(xiàn)為水凝膠樣材料，具有透明的特性。處理過(guò)的膠原薄膜(空氣干燥的分散體)比處理過(guò)的膠原海綿(或水凝膠)更脆弱。
透明的膠原材料可被制成從10到500μm范圍內(nèi)的各種厚度。膠原分散體的濃度也是在獲得透明度中的一個(gè)重要參數(shù)。因此，0.5到0.75％(膠原的重量對(duì)水的體積)顯得透明。在1％的膠原分散體時(shí)，永遠(yuǎn)也達(dá)不到透明。
另一方面，透明質(zhì)酸(HA)(一種糖胺聚糖)的加入提高膠原的透明度(每份重量的膠原5％(w/w)HA，將HA加入膠原分散體)。這已通過(guò)測(cè)量在不同波長(zhǎng)吸收處的光密度而被證實(shí)(見(jiàn)圖9)。其它糖胺聚糖和蛋白多糖的加入以及其它百分比的HA在獲得更透明的材料中也是有益的。另外，如在細(xì)胞培養(yǎng)中所示的，透明質(zhì)酸的加入刺激細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)入植入物。
那些透明的材料可被用于眼科應(yīng)用，而且更具體地是用于透明的角膜創(chuàng)傷敷料。為了同樣的目的使用膠原屏。然而，它們是從牛、豬或人制備的。但它們的安全性仍然是一個(gè)問(wèn)題。我們的產(chǎn)品可以安全地使用。
在上文中已經(jīng)描述了本發(fā)明并且對(duì)于懂技術(shù)的讀者來(lái)說(shuō)可以很容易地進(jìn)行修改而不背離上面的教導(dǎo)。這些修改是在如所附的權(quán)利要求中所規(guī)定的本發(fā)明的范圍內(nèi)的。參考文獻(xiàn)1．E.Bell,B.Ivarsson和C.Merril，“體外由不同增殖潛能的人成纖維細(xì)胞通過(guò)膠原網(wǎng)格的收縮制備一種組織樣結(jié)構(gòu)”《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),76,1274-1278(1979)。2．I.V.Yannas,J.F.Burke,D.P.Orgill和E.M.Skrabut，“創(chuàng)傷組織可使用多聚物模板合成皮膚的功能性延伸”，《科學(xué)》(Science),215,174-176,(1982)。3．T.Miyata,T.Taira和Y.Noishiki，“用于生物醫(yī)藥的膠原工程”，《臨床材料》(Clin.Mater.),9,139-148,(1994)。4．G.Ellender.R.Papli,R.Hammond,K.Mitrahgas,J.F.Bateman,V.Glattauer,J.M.Thyer,J.A.Werkmeister和J.A.M.Ramshaw，“在修復(fù)建立的牙周缺陷中膠原的成骨能力”，《臨床材料》，9,201-209,(1994)。5．J.Keefe,L.wauk,S.Chu和F.DeLustro,“可注射牛膠原的臨床應(yīng)用十年的經(jīng)驗(yàn)”《臨床材料》9,155-162(1994)。6．S.B.Prusiner,“新型蛋白質(zhì)感染性顆粒引起瘙癢癥”《科學(xué)》216,136-144(1982)。7．S.B.Prusiner,“遺傳性朊病毒疾病”《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》91,4611-4614(1994)。8．P.Brown,P.P.Liberski,A.Wolff和D.C.Gajdusek,“在甲醛固定后瘙癢癥感染性對(duì)蒸汽高壓消毒的抗性和360℃灰化后有限的存活實(shí)踐和理論應(yīng)用”《感染性疾病雜志》(J.Infect.Dis.)161,467-472(1990)。9．R.N.Rosenberg,C.L.White,P.Brown,D.C.Gajdusek,J.J.Volpe,J.Posner和P.J.Dyck,“在處理來(lái)自確診或可疑的克雅氏病患者的組織、液體和其它污染材料中的警告”《神經(jīng)病學(xué)年鑒》(Ann.Neurol.)19,75-77(1986)。10．J.Tateichi,T.Tashima和T.Kitamoto,“克雅氏病病原體的滅活”《神經(jīng)病學(xué)年鑒》24,466-(1988)。11．J.Safar,P.P.Roller,D.C.Gaidusek和C.J.Gibbs,“瘙癢癥淀粉樣(前)蛋白的熱穩(wěn)定性及構(gòu)象轉(zhuǎn)換同感染性相關(guān)”《蛋白質(zhì)科學(xué)》(Protein Sci.)2,2206-2216(1993)。12．W.E.Klunk,C.-J.Xu和J.W.Pettegrew,“在阿爾茲海默爾氏淀粉樣蛋白中蟻酸修飾的殘基的NMR鑒定”《神經(jīng)化學(xué)雜志》(J.Neurochem)62,349-354(1994)。13．E.J.Miller和R.K.Rhodes,“不同類型膠原的制備和鑒定”《酶學(xué)方法》(Methods Enzymol.)82,33-64(1982)。14．M.-F.Cote,E.Sirois和C.J.Doillon,“海綿形基質(zhì)中膠原的體外收縮率”《生物材料科學(xué)雜志》(J.Biomater.Sci.)-Polym.編，3,301-313(1992)。15．P.R.Griffiths和G.L.Pariente,“光譜去褶合導(dǎo)論”《分析化學(xué)趨勢(shì)》(Trends Anal.Chem.)5,209-215(1986)。16．R.A.Berg,“3-和4-羥脯氨酸的確定”《酶學(xué)方法》82,372-398(1982)。17．J.L.Ellwart和P.Domer,“利用在Hoechst 33342染色細(xì)胞中的光譜移動(dòng)評(píng)價(jià)活力”《細(xì)胞術(shù)》(Cytometry)11,239-243(1990)18．Y.A.Lazarev,B.A.Grishkovskii和T.B.Khromova,“IR光譜的酰胺Ⅰ帶和膠原的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的多肽”《生物多聚體》(Biopolymers)27,1449-1678(1985)。19．K.Payne,A.Veis,“膠原和明膠溶液的傅立葉變換IR光譜學(xué)用于構(gòu)象研究的酰胺Ⅰ帶的去褶合”《生物多聚體》27,1749-1760(1988)。20．A.Veis,明膠的大分子化學(xué)，《分子生物學(xué)》，第5卷，Horecker,B．Kaplan,N.O.&Scheraga H.A.(編)，學(xué)院出版社，紐約-倫敦，(1964)。21．A.V.Kajava,“在Ⅰ型膠原纖維中的分子折疊一個(gè)同軸向排列的鄰近膠原分子的模型”《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)218,815-823(1991)。22．J.M.Lee,C.A.Pereira,D.Abdulla,W.A.Naimark和I.Crawford,“用于膠原生物材料的一個(gè)多樣本變性溫度測(cè)試儀”《醫(yī)學(xué)工程物理學(xué)》(Med.Eng.Phys.)17,115-121(1995)。23．C.DeBlois,M.-F.Cote和C.J.Doillon,“肝素-FGF-血纖蛋白復(fù)合物對(duì)膠原為基礎(chǔ)的材料的體外和體內(nèi)應(yīng)用”《生物材料》15,665-672(1994)。24．C.J.Doillon,M.G.Dunn,R.A.Berg和F.H.Silver,“創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的膠原沉積”《掃描顯微》(Scan.Microsc.)2,897-903(1985)。25．K.Yoshizato和E.Yoshikawa,“用于生物皮膚的雙層明膠底物的發(fā)展一種新的由有孔皮膚基質(zhì)和薄的基底膜組成的皮膚結(jié)構(gòu)框架”《材料科學(xué)與工程》仿生材料卷，傳感器和系統(tǒng)(Mater.Sci.Eng.C-BiomimeticMaterials,Sensor&Systems)1,95-105,(1994)。26．M.Koide,K.Osaki,J.Konishi,K.Oyamada,T.Katakura,A.Takahashi和K.Yoshizato,“用于人造皮膚的一種新型生物材料纖維和變性膠原的脫水熱交聯(lián)的復(fù)合物”《生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志》(J.Biome.Mater.Res.)27,79-87(1993)。27．GN Ramachandran,膠原，Ramanathan N.(編)，WileyInterscience,紐約，(1962)。28．J.H.Lillie,D.K.MacCallum,L.J.Scaletta和J.C.Occhino,“膠原結(jié)構(gòu)膠原纖維的一種螺旋組構(gòu)的證據(jù)”《超結(jié)構(gòu)研究雜志》(J.Ultrastruct.Res.)58,134-143(1977)。29．R.Drouin,S.Gao,G.P.Holmquist,“用于DNA損傷分析的瓊脂糖凝膠電泳”于《用于DNA損傷和突變檢測(cè)的技術(shù)》G.P.Pfeifer(編),Plenum Press,紐約，1996,(出版中)。30．J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Manistis編，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989。31．D.M.Brown,“聚核苷酸和核酸的化學(xué)反應(yīng)”于《核酸化學(xué)中的基本原理》Ⅱ卷，Ts′O Paul OP編，學(xué)院出版社，紐約-倫敦，1-90頁(yè)(1974)。
表1未處理或化學(xué)處理后膠原海綿的變性溫度
用FA、TFA、TFE或HFIP化學(xué)處理達(dá)1小時(shí)(A)和5小時(shí)(B)暴露時(shí)間的膠原海綿。
表2化學(xué)處理過(guò)的膠原海綿植入后炎癥反應(yīng)的定性衡量
通過(guò)相對(duì)度量定性評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)++表示廣泛；+表示中度；±表示輕度，以及0表示無(wú)到零散輕度。已注明反應(yīng)在植入物的周圍(P)和內(nèi)部(I)。
權(quán)利要求
1．一種用于制備基本上無(wú)朊病毒的含膠原產(chǎn)品的方法，其包括以下步驟a)獲得預(yù)期形式的膠原產(chǎn)品；并且b)用溶液pH低于大約2的有機(jī)酸處理步驟a)的含膠原產(chǎn)品至少大約1小時(shí)；從而，基本上清除朊病毒而含膠原產(chǎn)品保持基本上未變性。
2．一種用于制備基本上無(wú)朊病毒的膠原衍生產(chǎn)品的方法，其包括以下步驟a)獲得預(yù)期形式的膠原衍生產(chǎn)品；并且b)用溶液pH低于大約2的有機(jī)酸處理步驟a)的膠原衍生產(chǎn)品至少大約5小時(shí)；從而，基本上清除朊病毒而至少部分膠原轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z。
3．權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所定義的方法，其中所說(shuō)的酸是基本上純的未稀釋的有機(jī)酸。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的有機(jī)酸是三氟乙酸或蟻酸。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的有機(jī)酸是基本上純的三氟乙酸
6．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的有機(jī)酸是基本上純的蟻酸。
7．根據(jù)權(quán)利要求1和3到6的任一項(xiàng)的方法，其中所說(shuō)的處理時(shí)間是大約1小時(shí)。
8．在權(quán)利要求2到6的任一項(xiàng)中所定義的方法，其還包括在步驟b)后交聯(lián)明膠的步驟。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中交聯(lián)是通過(guò)一種有機(jī)醛或脫水熱處理實(shí)現(xiàn)的。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中脫水熱處理包括在高度真空下于大約110℃加熱大約1到3天。
11．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟a)的膠原產(chǎn)品獲自含有大約0.5至大約0.75％(w/v)膠原的溶液，而且其中所說(shuō)的在步驟b)后獲得的膠原產(chǎn)品是透明的。
12．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說(shuō)的步驟a)的膠原產(chǎn)品是一種呈有孔樣材料形式的聚乙二醇接枝的膠原。
13．一種用于制備基本上無(wú)朊病毒的膠原產(chǎn)品的方法，其包括在大約110℃的溫度下處理膠原產(chǎn)品達(dá)足以清除朊病毒而未使膠原產(chǎn)品實(shí)質(zhì)上變性的一段時(shí)間。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的一段時(shí)間在大約1天到大約3天之間。
15．一種膠原產(chǎn)品，其基本上是無(wú)朊病毒的。
16．一種膠原產(chǎn)品，其是通過(guò)權(quán)利要求1到14中任何一項(xiàng)的方法制備的。
17．一種制成品，其含有在權(quán)利要求15或16中所定義的膠原產(chǎn)品。
18．權(quán)利要求17中所定義的制成品，其是一種創(chuàng)傷敷料、一種植入物或一種給藥系統(tǒng)。
19．一種制成品，其含有通過(guò)權(quán)利要求11的方法制備的膠原產(chǎn)品，并且其中在所說(shuō)的步驟a)的膠原溶液中加入糖胺聚糖或蛋白多糖。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的制成品，其中所說(shuō)的溶液含有每份重量膠原5％(w/w)的透明質(zhì)酸。
全文摘要
作為一種生物醫(yī)學(xué)植入物的膠原的使用對(duì)病毒和朊病毒提出了安全性問(wèn)題。研究了用熱和通過(guò)蟻酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、四氟乙醇(TFE)和六氟－異丙醇(HFIP)處理過(guò)的膠原的物理化學(xué)變化以及體外和體內(nèi)生物相容性。FA和TFA引起核酸的廣泛脫嘌呤化而HFIP和TFE有程度較輕的同樣作用。FA分子以及最重要的TFA分子仍然保留在膠原內(nèi)。雖然這兩種酸誘導(dǎo)膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)中的修飾,但對(duì)膠原酶的抗性并未受影響,且體外細(xì)胞生長(zhǎng)未受損害。劇烈的脫水熱處理,例如在高度真空下110℃處理1—3天,也成功地徹底清除核酸。因?yàn)檫@種處理也導(dǎo)致輕度的交聯(lián),所以可將其有利地用來(lái)清除朊病毒和穩(wěn)定膠原產(chǎn)品。最后,用TFA的長(zhǎng)時(shí)間處理提供了一種透明的膠原,其透明度通過(guò)加入糖胺聚糖或蛋白多糖,特別是透明質(zhì)酸而被進(jìn)一步提高。所有的上述處理可以通過(guò)提供一種無(wú)病毒或朊病毒的產(chǎn)品而為多種生物醫(yī)學(xué)用途提供一種安全的生物相容的膠原衍生材料。
文檔編號(hào)A61L15/64GK1212707SQ97192757
公開(kāi)日1999年3月31日 申請(qǐng)日期1997年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月29日
發(fā)明者C·多爾隆, R·德羅因, G·拉羅克 申請(qǐng)人:診斷醫(yī)治公司