發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)來(lái)源于樣品的至少一種分析物的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及用于固體支持物上的分析物的超靈敏檢測(cè)法，以及用于進(jìn)行所述方法的試劑盒。

發(fā)明背景

免疫-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ipcr)為用于蛋白質(zhì)及其他抗原的超靈敏分析的有前景的技術(shù)。其將已充分建立的elisa方法與pcr的信號(hào)放大能力組合在一起。與常規(guī)elisa相比，ipcr得到在靈敏性上約1000倍至10,000倍的增加(adler,m.、wacker,r.&niemeyerc.m.用于蛋白質(zhì)的常規(guī)超靈敏定量的實(shí)時(shí)免疫pcr測(cè)定法(areal-timeimmune-pcrassayforroutineultrasensitivequantificationofproteins).生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(biochemicalandbiophysicalresearchcommunications)(2003)308，240-250。)，并顯示了高達(dá)六個(gè)數(shù)量級(jí)的非常寬的線性動(dòng)態(tài)范圍。因此，使用免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ipcr)和實(shí)時(shí)ipcr測(cè)定法使得能夠檢測(cè)通過常規(guī)免疫測(cè)定法難以檢出的復(fù)合生物樣品中的罕見生物標(biāo)志物。

常規(guī)elisa法已用于檢測(cè)來(lái)自涂布至903/guthrie卡的樣品的hiv、htlv、hcv和許多其他疾病標(biāo)志物(parker,s.p.&cubitt,w.d.，j.clin.pathol.(1999)52，633-639。)，例如，已針對(duì)用于干燥全血斑點(diǎn)(即涂布至903紙的血液)洗脫物，對(duì)市購(gòu)可得的人免疫缺陷病毒1型p24抗原elisa測(cè)定法成功進(jìn)行修改，并用作嬰兒診斷的可靠檢驗(yàn)(patton,j.c.、sherman,g.g.、coovadia,a.h.、stevens,w.s.&meyers,t.m.，clin.vaccine.immunol.(2006)，13(1)，152-155。)。免疫pcr已用于許多與傳統(tǒng)elisa相同的應(yīng)用，例如朊病毒、毒素、激素、殺蟲劑、病毒和其他抗原的檢測(cè)。ipcr已用于檢測(cè)原癌基因ets1(zhou,h.、fisherr.j.&papas,t.s.，用于超靈敏靶蛋白檢測(cè)的通用免疫pcr(universalimmune-pcrforultra-sensitivetargetproteindetection)，核酸研究(nucleicacidsresearch)，(1993)21，6038-6039。)、tnf-α(komatsu,m.等，如通過高靈敏性免疫pcr測(cè)量的患有炎性腸病的患者血清中的腫瘤壞死因子-α(tumournecrosisfactor-alphainserumofpatientswithinflammatoryboweldiseaseasmeasuredbyahighlysensitiveimmune-pcr).clin.chem.(2001)47，1297-1301。)、白介素-3和干細(xì)胞因子(putuckova,l.等，與免疫pcr和elisa相比，使用基于官能化金納米粒子的免疫pcr快速靈敏檢測(cè)細(xì)胞因子(rapidandsensitivedetectionofcytokinesusingfunctionalizedgoldnanoparticlesbasedimmune-pcr,comparisonwithimmuno-pcrandelisa).j.immunol.methods(2011)37，38-47；t-細(xì)胞受體(sperl,j.等，可溶性t細(xì)胞受體；經(jīng)由elisa或免疫pcr在流體相中的檢測(cè)和定量測(cè)定法(solubletcellreceptors;detectionandquantitativeassayinfluidphaseviaelisaorimmune-pcr).j.immunol.methods(1995)186，181-194。)、血管緊張素原(sugawara,k.等，使用相同的第一和第二多克隆抗體用于人血管緊張素原的高靈敏免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定法(ahighlysensitiveimmune-polymerasechainreactionassayforhumanangiotensinogenusingtheidenticalfirstandsecondpolyclonalantibodies).clin.chim.acta(2000)299，45-54。)、蛋白毒素(he,x.等，通過新型免疫pcr測(cè)定法靈敏檢測(cè)環(huán)境樣品中的志賀毒素2及其某些變體(sensitivedetectionofshigatoxin2andsomeofitsvariantsinenvironmentalsamplesbyanovelimmune-pcrassay).appl.environ.microbiol.(2011)77，3558-3564；zhang,w.等，用于檢測(cè)低濃度的shiga毒素2及變體的新型免疫pcr測(cè)定法(newimmune-pcrassayfordetectionoflowconcentrationsofshigatoxin2andvariants).j.clin.microbiol.(2008)46，1292-1297。)、朊病毒蛋白(barletta,j.a.等，使用實(shí)時(shí)免疫pcr檢測(cè)綿羊瘙癢病感染的倉(cāng)鼠腦勻漿中超低水平的病理性朊病毒蛋白(detectionofultra-lowlevelsofpathologicprionproteininscrapieinfectedhamsterbrainhomogenatesusingreal-timeimmuno-pcr)j.virol.methods(2005)127，154-164。)、潛在的病毒性及細(xì)菌性抗原(niemeyer,c.m.、adler,m.&wacker,r.免疫pcr：通過核酸擴(kuò)增的蛋白質(zhì)的高靈敏性檢測(cè)(immuno-pcr:highsensitivitydetectionofproteinsbynucleicacidamplification).trendsbiotechnol.(2005)3，208-216；perez,j.w.等，使用納米粒子擴(kuò)增的免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)呼吸道合胞體病毒(detectionofrespiratorysyncytialvirususingnanoparticleamplifiedimmunopolymerasechainreaction).anal.biochem.(2011)410，141-148。)、分枝桿菌rd抗原(mehta,p.k.等，基于分枝桿菌rd抗原的超靈敏聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的免疫測(cè)定法的開發(fā)：涉及結(jié)核的血清診斷(developmentofanultrasensitivepolymerasechainreaction-amplifiedimmunoassaybasedonmycobacterialrdantigens:implicationsfortheserodiagnosisoftuberculosis).診斷微生物學(xué)及傳染病(diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease)(2012)72，166-174。)，并且可修改為用于各種傳染病的新型診斷工具(malou,n.&raoult,d.檢測(cè)抗原和抗體的有前景的超靈敏診斷法(apromisingultrasensitivediagnosticmethodtodetectantigensandantibodies).trendsmicrobiol.(2011)19，295-392。)。

例如，ipcr可用于檢測(cè)固相固定的抗原。習(xí)慣上，將使用生物素化的igg和鏈霉抗生物素酶綴合物的elisa測(cè)定法用于檢測(cè)固相固定的抗原。實(shí)時(shí)ipcr可用作更靈敏的測(cè)定法，其使用抗體-dna綴合物。為了提高rt-ipcr測(cè)定法的性能，可在pcr擴(kuò)增之前向pcr混合物中加入內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)者dna片段。針對(duì)待擴(kuò)增的各dna，加入熒光基團(tuán)標(biāo)記的taqman探針。在pcr擴(kuò)增期間，通過聚合酶的外切核酸酶活性降解所述taqman探針，從而釋放熒光染料，其通過所述儀器原位定量。再如另一個(gè)實(shí)例，可將夾心ipcr測(cè)定法應(yīng)用于例如使用抗-r槲寄生素抗體-dna聚集物檢測(cè)人血漿樣品中的r槲寄生素。間接ipcr測(cè)定法使用對(duì)來(lái)自特定物種的igg具有結(jié)合特異性的dna-抗體綴合物，作為用于檢測(cè)與待測(cè)抗原偶聯(lián)的第一抗體的第二試劑。例如，將對(duì)兔-igg特異的dna-抗體綴合物，稱為抗兔第二試劑(“rsr，”chimerabiotec)，用于檢測(cè)兔-igg，或者將抗鼠第二試劑(“msr，”chimerabiotec)用于檢測(cè)鼠igg。(adler,m.、wacker,r.&niemeyerc.m.用于常規(guī)超靈敏定量蛋白質(zhì)的實(shí)時(shí)免疫pcr測(cè)定法(areal-timeimmune-pcrassayforroutineultrasensitivequantificationofproteins).生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(biochemicalandbiophysicalresearchcommunications)(2003)308，240-250。)。

存在對(duì)于將ipcr及相關(guān)方法應(yīng)用于檢測(cè)沉積在固體支持物上的低豐度分析物而無(wú)需將所述分析物從所述固體支持物分離的需求。所述干燥形式提供了增加的益處，其與以非液體形式儲(chǔ)存樣品的便利性和穩(wěn)定性相關(guān)。

發(fā)明概述：

本發(fā)明描述了使得能夠檢測(cè)來(lái)自樣品中的低豐度分析物的新方法和試劑盒。因此，在一方面，提供了用于檢測(cè)來(lái)源于樣品中的至少一種分析物的方法。所述方法包括步驟：

a)使所述樣品沉積在固體支持物的表面上；

b)將至少一部分所述固體支持物轉(zhuǎn)移至適于針對(duì)關(guān)注的一種或多種分析物進(jìn)行特異性結(jié)合測(cè)定的容器；

c)任選洗滌所述部分；

d)向所述容器中加入用于各關(guān)注分析物的單個(gè)特異性結(jié)合配偶體，所述結(jié)合配偶體經(jīng)寡核苷酸序列標(biāo)記；

e)將所述部分與核酸擴(kuò)增試劑混合；

f)使所述寡核苷酸序列擴(kuò)增；和

g)檢測(cè)擴(kuò)增的核酸。

在另一方面，本發(fā)明提供用于進(jìn)行所述新方法的試劑盒。所述試劑盒包含固體支持物；經(jīng)寡核苷酸序列標(biāo)記的用于各關(guān)注分析物的特異性結(jié)合配偶體；用于擴(kuò)增所述寡核苷酸序列的試劑；和用戶說明書。

本發(fā)明的另外的詳情和優(yōu)點(diǎn)，將因下文說明書和權(quán)利要求而顯而易見。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示來(lái)自固體支持物的模型蛋白(il-2)的測(cè)量結(jié)果。

圖2顯示來(lái)自經(jīng)肝素處理并保存在不同固體支持物上的人血的500bp基因組dna片段的直接擴(kuò)增的結(jié)果。

圖3顯示來(lái)自經(jīng)edta處理并保存在不同固體支持物上的人血的1kb、3.8kb和7.5kb基因組dna擴(kuò)增子的直接pcr的結(jié)果。

發(fā)明詳述：

在一方面，本發(fā)明提供使用ipcr來(lái)檢測(cè)與諸如903guthrie卡、31-etf紙、fta或fta洗脫紙等固體支持物結(jié)合的抗體或抗原的方法和試劑盒。本發(fā)明使得在濃度通常太低而不能通過現(xiàn)有應(yīng)用檢測(cè)診斷的用于單細(xì)胞分析的樣品或體液(例如唾液、血、尿、淋巴等)成為可能。其使得能夠使用903卡(和其他固體支持物)用于疾病的診斷，這在先前是不可行的。所述pcr擴(kuò)增法亦可替換成等溫?cái)U(kuò)增(例如使用phi29dna聚合酶的滾環(huán)擴(kuò)增)。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于檢測(cè)來(lái)源于樣品的至少一種分析物的方法，其包括步驟：

a)使所述樣品沉積在固體支持物的表面上；

b)將至少一部分所述固體支持物轉(zhuǎn)移至適于針對(duì)關(guān)注的一種或多種分析物進(jìn)行特異性結(jié)合測(cè)定的容器；

c)任選洗滌所述轉(zhuǎn)移的固體支持物的部分；

d)向所述容器中加入用于各關(guān)注分析物的單個(gè)特異性結(jié)合配偶體，所述結(jié)合配偶體經(jīng)寡核苷酸序列標(biāo)記；

e)將所述部分與核酸擴(kuò)增試劑混合；

f)使所述寡核苷酸序列擴(kuò)增；和

g)檢測(cè)擴(kuò)增的核酸。

對(duì)于術(shù)語(yǔ)“分析物”，其意指在分析程序中受關(guān)注且通常在實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)的物質(zhì)或化學(xué)成分。因此分析物為正在進(jìn)行分析的物質(zhì)或化學(xué)成分。

對(duì)于術(shù)語(yǔ)“容器”，其意指用于容納含所述分析物的固體支持物的一部分的空腔物體，用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案檢測(cè)所述分析物。容器的實(shí)例有但不限于管、試管、微孔板、叢式孔（clusterwells）、皿、瓶等。用于制造容器的材料的實(shí)例有但不限于玻璃、塑料、金屬、橡膠、聚四氟乙烯樹脂和聚乙烯。

特異性結(jié)合測(cè)定為測(cè)量分子的存在或濃度的生化試驗(yàn)，通常通過使用特異性結(jié)合配偶體、抗體或免疫球蛋白、適體、核酸序列、配體或特異性結(jié)合蛋白或受體在溶液中測(cè)量。通過特異性結(jié)合測(cè)定檢測(cè)的分子常常稱為分析物。使用特異性結(jié)合測(cè)定法測(cè)量的分析物時(shí)常用于臨床、研究、環(huán)境、法醫(yī)及其他分析目的。

術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指長(zhǎng)度為15-500nt、優(yōu)選20-400nt、更優(yōu)選30-300nt的單鏈dna或rna分子。對(duì)于pcr或pcr擴(kuò)增反應(yīng)的變體，所述寡核苷酸與抗體或特異性結(jié)合部分連接并用作擴(kuò)增的標(biāo)簽或模板。在另一些其它擴(kuò)增方法中，所述寡核苷酸可用作引物，例如在其中所述抗體與線性寡核苷酸結(jié)合的rca的情況下。然后可加入與所述線性寡核苷酸結(jié)合的單鏈環(huán)狀寡核苷酸(其包含所述線性寡核苷酸的互補(bǔ)序列)。然后所述線性寡核苷酸將成為用于dna/rna復(fù)制的引物。

在某些實(shí)施方案中，用于檢測(cè)來(lái)源于樣品中的至少一種分析物的所述方法進(jìn)一步包括基于擴(kuò)增核酸的數(shù)量來(lái)定量關(guān)注的分析物。例如，可使用核酸成像系統(tǒng)或者通過qpcr/taqman測(cè)定法來(lái)定量擴(kuò)增的核酸。

在某些實(shí)施方案中，所述固體支持物包括：纖維素基紙、機(jī)織或非機(jī)織纖維材料(包括人造的或天然存在的聚合纖維，例如藻酸鹽)、礦物纖維基材料(例如玻璃纖維材料)或者經(jīng)表面處理的固體材料，例如化學(xué)處理或機(jī)械處理的材料，包括激光蝕刻表面，均提供有粗糙度足以支持的表面微粗糙度，均任選經(jīng)穩(wěn)定試劑或穩(wěn)定試劑混合物進(jìn)行化學(xué)處理。所述固體支持物亦可由尼龍或硝酸纖維素材料制成。

在某些實(shí)施方案中，所述固體支持物為纖維的，例如纖維素纖維材料，或者玻璃纖維/微纖維材料。

在某些實(shí)施方案中，所述固體支持物為多孔聚合物，例如多孔膜材料，如聚酯、聚醚砜(pes)、聚酰胺(尼龍)、聚丙烯、聚四氟乙烯(ptfe)、聚碳酸酯、硝酸纖維素、醋酸纖維素、藻酸鹽或氧化鋁。

在某些其他的實(shí)施方案中，所述固體支持物為但不限于fta紙、fta洗脫紙、whatman903紙、whatman31-etf紙、藻酸鹽或藻酸鹽包被的支持物。

在本文中，fta(包括fta微型卡、fta指示卡和fta經(jīng)典卡)為使用例如弱堿、螯合劑和陰離子表面活性劑等穩(wěn)定化化學(xué)品處理的纖維素纖維紙，借此所述支持物表面浸透有所述穩(wěn)定化化學(xué)品。以此方式，所述生物樣品材料可作為干燥材料儲(chǔ)存在所述固體支持物上達(dá)多個(gè)月乃至數(shù)年，從而在需要的情況下，允許用于在環(huán)境溫度下將所述固體支持物運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間。然后可能進(jìn)行簡(jiǎn)單的回收，通過例如從所述固體支持物純化所述生物樣品材料?；蛘?，可使用直接的或經(jīng)洗滌的打孔方案處理所述樣品。將樣品儲(chǔ)存在所述固體支持物上，亦使得能夠通過移出一部分所述樣品并根據(jù)需要檢測(cè)所述部分，隨時(shí)間重新檢測(cè)所述樣品。

在本文中，fta洗脫紙描述類似的紙，但經(jīng)諸如硫氰酸胍等離液劑包被。在本文中，whatman903描述未包被的纖維素纖維紙。

在某些實(shí)施方案中，所述固體支持物表面為經(jīng)化學(xué)品浸透的，例如弱堿、螯合劑、陰離子表面活性劑及任選抗氧化劑。

在某些實(shí)施方案中，所述固體支持物表面為經(jīng)離液劑浸透的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離液鹽為胍鹽。在另一些實(shí)施方案中，所述胍鹽選自硫氰酸胍、氯化胍和鹽酸胍。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離液鹽為鈉鹽，例如碘化鈉。

在某些實(shí)施方案中，所述固體支持物為纖維素基基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述固體支持物為經(jīng)表面活性劑處理的纖維素基固體支持物。術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”是指降低兩種液體之間或者液體與固體之間的表面張力(或界面張力)的化合物。表面活性劑可充當(dāng)去污劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、起泡劑和分散劑。

某些固體支持物描述于wo2012113911、wo2012113907、wo2012113906和wo2013165870，所述公開內(nèi)容各自通過引用以其整體結(jié)合。

意圖上述固體支持物用于大致平坦的構(gòu)造，但備選地，可例如用于卷形物上。

在某些實(shí)施方案中，直接從自含所述樣品的固體支持物上切下的沖孔片進(jìn)行所述一個(gè)或多個(gè)測(cè)定。因此，可直接從自樣品已涂布于其上的固體支持物切下的沖孔片進(jìn)行所述測(cè)定。可將含所述樣品的沖孔片直接加至測(cè)定反應(yīng)中。任選的是，可進(jìn)行簡(jiǎn)單的“打孔”加入，其中在加至所述反應(yīng)之前，將所述切下的沖孔片(固體支持物加樣品)洗滌以去除任何可能的抑制性化學(xué)品。

在某些實(shí)施方案中，在存在多價(jià)螯合劑的情況下進(jìn)行添加和混合步驟，以抵消特異性結(jié)合配偶體結(jié)合或酶活性的表面活性劑抑制。在某些實(shí)施方案中，所述多價(jià)螯合劑為環(huán)糊精。環(huán)糊精充當(dāng)去污劑的多價(jià)螯合劑，其包被在特定固體支持物的外部，從而可進(jìn)行改進(jìn)的dna擴(kuò)增和特異性結(jié)合測(cè)定。

在某些實(shí)施方案中，所述固體支持物包被有特異性結(jié)合部分或者表面電荷改性劑。所述特異性結(jié)合部分例如抗體(多克隆和單克隆抗體二者)、特異性受體蛋白、配體、核酸序列及類似試劑，通過與標(biāo)本中的物質(zhì)特異性結(jié)合或起化學(xué)反應(yīng)，意圖其用于鑒定、測(cè)量和定量標(biāo)本中獨(dú)立的化學(xué)物質(zhì)或分析物。所述表面電荷改性劑包括離子交換紙，例如帶陽(yáng)離子或陰離子電荷的纖維素紙。

在某些實(shí)施方案中，所述樣品來(lái)源于生物樣品。生物樣品(或者生物標(biāo)本，亦稱為生物樣本)為這樣的生物樣品，其包括但不限于血、血漿、血清、腦脊液、滑液、淋巴液、唾液、頰的、尿、糞便、皮膚、毛發(fā)或組織。其他生物樣品為傳染性物質(zhì)(例如細(xì)菌、病毒、立克次氏體、寄生蟲或真菌)和獲自動(dòng)物的樣品。

在某些實(shí)施方案中，所述樣品為藥物或來(lái)源于環(huán)境，例如污染物、除草劑、殺蟲劑、重金屬或藥物。對(duì)于“環(huán)境”，其意指作為整體或者特定地理區(qū)域中的自然界。

在某些實(shí)施方案中，所述樣品來(lái)源于犯罪現(xiàn)場(chǎng)且用于法醫(yī)目的，例如但不限于血、精液、毛根、纖維、酒精、藥物濫用、爆炸物和火藥。對(duì)于“犯罪現(xiàn)場(chǎng)”，其意指犯罪發(fā)生的位置或者可發(fā)現(xiàn)犯罪證據(jù)的另一位置，且包括執(zhí)法機(jī)關(guān)人員從其回收物證的區(qū)域。

在某些實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合配偶體為抗體。

在某些其他的實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合配偶體為適體。

在其他實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合配偶體為天然蛋白或重組蛋白。

在又另外的實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合配偶體為重組普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域、fyve結(jié)構(gòu)域、px結(jié)構(gòu)域、enth結(jié)構(gòu)域、calm結(jié)構(gòu)域、pdz結(jié)構(gòu)域、ptb結(jié)構(gòu)域、ferm結(jié)構(gòu)域或金屬硫蛋白。這些特異性結(jié)合配偶體均為肌醇磷脂識(shí)別模塊，即，其均為磷酸肌醇的特異性結(jié)合配偶體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合配偶體為網(wǎng)格蛋白銜接蛋白和抑制蛋白家族的成員。網(wǎng)格蛋白銜接蛋白充當(dāng)特定蛋白質(zhì)(例如可溶性受體)和脂質(zhì)的特異性結(jié)合配偶體，而抑制蛋白為g蛋白偶聯(lián)受體的特異性結(jié)合配偶體。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合配偶體為金屬硫蛋白，其為富含半胱氨酸的低分子量(mv范圍為500-14000da)蛋白質(zhì)的家族。金屬硫蛋白可用作生理性污染物和重金屬污染物二者的特異性結(jié)合配偶體。金屬硫蛋白具有通過半胱氨酸殘基的巰基來(lái)結(jié)合鋅、銅、硒、鎘、汞、銀、砷、鉛、鐵金屬的能力。

所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)可包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。因此，本發(fā)明的某些方面涉及應(yīng)用免疫pcr用于沉積在固體支持物上的樣品。如前所述的，常規(guī)的elisa法已用于檢測(cè)來(lái)自沉積于諸如903/guthrie卡等固體支持物上的樣品中的hiv、htlv、hcv和許多其他的疾病標(biāo)志物(parker,s.p.&cubitt,w.d.j.clin.pathol.(1999)52，633-639)。例如，已針對(duì)用于干燥全血斑點(diǎn)(即涂布至903濾紙的血液)洗脫物，對(duì)市購(gòu)可得的人免疫缺陷病毒1型p24抗原elisa測(cè)定法成功進(jìn)行修改，并用作嬰兒診斷的可靠檢驗(yàn)(patton,j.c.、sherman,g.g.、coovadia,a.h.、stevens,w.s.&meyers,t.m.，clin.vaccine.immunol.(2006)，13(1)，152-155。)。隨著免疫pcr的顯著增加的靈敏性，使用根據(jù)本發(fā)明的某些方面的方法，目前成功檢測(cè)低豐度樣品。

在某些實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)可包括等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)可包括滾環(huán)擴(kuò)增。當(dāng)所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)包括滾環(huán)擴(kuò)增時(shí)，可使用t4連接酶將所述寡核苷酸環(huán)化，并使用phi29dna聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。或者，使用環(huán)狀dna，所述寡核苷酸可充當(dāng)與所述環(huán)狀dna雜交的引物，且可在存在phi29dna聚合酶的情況下進(jìn)行rca。

在某些實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、t7rna聚合酶、重組酶聚合酶擴(kuò)增或基于核酸序列的擴(kuò)增。

在某些實(shí)施方案中，用于檢測(cè)來(lái)源于樣品中的至少一種分析物的所述方法可以進(jìn)一步包括基于擴(kuò)增核酸的數(shù)量來(lái)定量關(guān)注的分析物。用于定量所述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為眾所周知的。例如，所述擴(kuò)增產(chǎn)物可通過雜交反應(yīng)來(lái)測(cè)量。

在某些實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)行多重組合。因此，通過檢測(cè)與各特異性結(jié)合配偶體締合的擴(kuò)增核酸序列，可同時(shí)分別檢測(cè)多于一種分析物，所述特異性結(jié)合配偶體各自經(jīng)獨(dú)特的寡核苷酸序列標(biāo)記?！岸嘀販y(cè)定法”或“多重方法”涉及或者為測(cè)量或傳遞來(lái)自相同來(lái)源的兩個(gè)或更多個(gè)報(bào)告(message)的信息或信號(hào)的方法。簡(jiǎn)單地說，多重測(cè)定法為在所述測(cè)定法的單次運(yùn)行/循環(huán)中同時(shí)測(cè)量多重分析物的一類測(cè)定法。其與每次測(cè)量一種分析物的程序存在區(qū)別。(多重測(cè)定法的一個(gè)實(shí)例通過ugozzoli等，(分析生物化學(xué)(analyticalbiochemistry)，2002，307，47-53)闡述)。

在某些實(shí)施方案中，使用凍干試劑進(jìn)行所述一個(gè)或多個(gè)測(cè)定法。諸如gehealthcare’sillustraready-to-go(rtg)產(chǎn)品等凍干試劑為眾所周知的。這些試劑可包含特異性結(jié)合配偶體，和/或用于分析所述特異性寡核苷酸的試劑等。

在某些實(shí)施方案中，預(yù)先將所述樣品保存在固體支持物上并于室溫儲(chǔ)存?？扇菀椎貙⑺鰳悠吠坎贾了龉腆w支持物，并允許于環(huán)境溫度干燥以用于保存。保存在固體支持物上的生物樣品可以在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)為穩(wěn)定的，參見例如，gehealthcarelifesciences應(yīng)用筆記29-0082-33aa。因此，所述樣品可在所述固體支持物上儲(chǔ)存達(dá)至少30分鐘?？蓪⑺鰳悠饭潭ㄔ谒龉腆w支持物上達(dá)更長(zhǎng)時(shí)期，例如至少24小時(shí)、至少7天、至少30天、至少90天、至少180天、至少1年以及至少10年。以此方式，所述樣品可以適于后續(xù)分析的干燥形式儲(chǔ)存。通常，將樣品儲(chǔ)存在-200℃-40℃的溫度。此外，任選將儲(chǔ)存的樣品儲(chǔ)存在干性或脫水條件中或者惰性氣氛下。

ipcr的能力允許超靈敏檢測(cè)來(lái)自沉積在固體支持物材料上的樣品中的抗體或抗原，其帶來(lái)檢測(cè)微生物疾病的新工具，尤其是用于檢測(cè)病毒感染或者用于難以分離的難養(yǎng)菌。本方法亦顯著有助于某些細(xì)菌性或病毒性疾病的血清學(xué)診斷，例如立克次氏體或巨細(xì)胞病毒感染，其中傳統(tǒng)的血清學(xué)方法未能在感染早期檢出抗體且其中在數(shù)周后檢出血清轉(zhuǎn)換。

在另一方面，本發(fā)明提供用于進(jìn)行所述方法的試劑盒，其用以檢測(cè)來(lái)源于樣品中的至少一種分析物。所述試劑盒包含固體支持物；經(jīng)寡核苷酸序列標(biāo)記的用于各關(guān)注分析物的特異性結(jié)合配偶體；用于擴(kuò)增所述寡核苷酸序列的試劑；和用戶說明書。

在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒亦包含適于進(jìn)行用于一種或多種關(guān)注分析物的特異性結(jié)合測(cè)定的容器。

在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒中的特異性結(jié)合配偶體或用于擴(kuò)增所述寡核苷酸序列的試劑，以在環(huán)境溫度下穩(wěn)定、干燥的形式提供。

實(shí)施例：

意圖下列實(shí)施例僅闡述根據(jù)本發(fā)明的方法和實(shí)施方案，并因此不應(yīng)將其理解為對(duì)權(quán)利要求加以限制。

實(shí)施例1：從固體支持物直接測(cè)量白介素

以50pg或100pg/μl將重組il-2±載體(r&dsystems；分別為目錄202-il-cf-10μg；批號(hào)ae4309112和目錄202-il-10μg；批號(hào)ae4309081)溶于血液(tcsbiosciences)。將等份(1μl包含50(b)或100(a)pg的il-2)涂布至gehealthcare903濾紙。

允許這些樣品于環(huán)境溫度和濕度干燥過夜。使用適當(dāng)大小的打孔器從各種濾紙類型取得3mm直徑?jīng)_孔出的圓片。使用來(lái)自完整配置的il-2quantikineelisa試劑盒(r&dsystems，目錄d2050，批號(hào)273275)的試劑對(duì)單個(gè)圓片直接分析il-2。以“洞中沖孔片”進(jìn)行直接測(cè)定，即，其中沖孔出所述903濾紙的一部分并存放在常規(guī)多層板的反應(yīng)孔中。

在所述測(cè)定完成時(shí)，于450nm監(jiān)測(cè)光密度。通過將值與已知il-2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)確定il-2的回收?；厥章试趫D1中顯示，且證實(shí)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)沉積在固體支持物上時(shí)，可回收有效量的蛋白質(zhì)。

因此，來(lái)自諸如血液或腦脊液等生物樣品中的蛋白質(zhì)在固體支持物上為穩(wěn)定的，且可使用諸如elisa等免疫學(xué)方法檢測(cè)和定量。

實(shí)施例2：從儲(chǔ)存在whatmanfta和903卡上的血液進(jìn)行直接pcr

thermoscientific高保真血液直接pcr試劑盒被證實(shí)為支持直接從儲(chǔ)存于一系列固體支持物上的血樣進(jìn)行dna擴(kuò)增，所述固體支持物包括whatman903、fta和fta洗脫卡(chum和andre2013；thermofisherscientific)。fta和fta洗脫卡為化學(xué)包被紙基卡的實(shí)例，而903卡為未經(jīng)化學(xué)包被的。在直接擴(kuò)增工作流程中，無(wú)需預(yù)先的dna提取或純化步驟，且簡(jiǎn)單地將所述卡加入pcr反應(yīng)混合物中。

樣品制備：根據(jù)制造商說明書，將新鮮血液或者使用肝素(1.4iu/ml)、k2edta(1.8mg/ml)或檸檬酸鈉(109mm)保存的血液涂布至whatman903卡、fta洗脫卡或者ftagene卡并干燥。對(duì)于直接pcr，對(duì)卡中的樣品沖孔1mm直徑圓片并用于以下pcr反應(yīng)體積：whatman903：10-50μl，fta洗脫卡：25-50μl和ftagene卡：50μl。

當(dāng)使用較大的沖孔片或較小的反應(yīng)體積時(shí)，于50℃用20μl的水將沖孔片洗滌3分鐘。去除水之后，將pcr組分直接加至所述經(jīng)漂洗的沖孔片。使用的參數(shù)和試劑在下表1、2、3中列出。

表1.pcr反應(yīng)混合物

表2.pcr熱循環(huán)方案。當(dāng)引物tm值為69-72℃時(shí)，使用2步方案。

表3.用于擴(kuò)增關(guān)注的示例性基因的引物

圖2顯示從經(jīng)肝素處理并保存在不同卡上的人血直接擴(kuò)增500bp基因組dna片段的結(jié)果。從經(jīng)漂洗的1mm沖孔片或者直接置于體積為50、25或10μl的pcr反應(yīng)中的1mm沖孔片進(jìn)行反應(yīng)。使用所述的2步pcr方案。

圖3顯示來(lái)自經(jīng)edta處理并保存在不同卡上的人血的1kb、3.8kb和7.5kbgdna擴(kuò)增子的直接pcr的結(jié)果。以50μl反應(yīng)從1mm沖孔片進(jìn)行反應(yīng)(對(duì)于7.5kb片段，通過用水漂洗來(lái)洗滌ftagene卡沖孔片)。將2步方案用于1kb和7.5kg片段，將3步方案用于3.8kb擴(kuò)增子。

所述pcr研究證實(shí)，可從儲(chǔ)存在不同濾紙卡上的血液直接擴(kuò)增dna。

來(lái)源于903卡的樣品幾乎未顯示抑制，且可以低至10μl的反應(yīng)體積使用1mm沖孔片。fta洗脫卡和fta卡表現(xiàn)出不同水平的抑制。fta洗脫卡略微抑制直接pcr反應(yīng)；25-50μl反應(yīng)中的1mm圓片運(yùn)行良好，但是當(dāng)置于10μl反應(yīng)中時(shí)，所述pcr被完全抑制。ftagene卡顯示最大水平的抑制。未經(jīng)任何預(yù)處理的情況下，ftagene卡的1mm沖孔片僅在50μl反應(yīng)體積中運(yùn)行良好。對(duì)于更小的反應(yīng)體積，非常簡(jiǎn)單的洗滌方案足以從fta洗脫卡和ftagene卡二者中去除抑制劑。用水將卡沖孔片洗滌3分鐘之后，所述樣品純度足以以測(cè)試的所有反應(yīng)體積用于使用高保真血液直接pcr試劑盒的直接pcr反應(yīng)中。

將來(lái)自903卡的沖孔片和來(lái)自fta洗脫卡和ftagene卡的漂洗沖孔片(直徑均為1mm)用于使用對(duì)1kb、3.8kb和7.5kb擴(kuò)增子特異的引物的50μl反應(yīng)體積。在所有情況下，所述pcr反應(yīng)產(chǎn)生適當(dāng)大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。

固體支持物上的ipcr的實(shí)施例

將重組人il-2用madb緩沖液(150mmnacl、20mmtris-hclph7.4、2m胍)稀釋，并于4℃加至所述固體支持物過夜。此簡(jiǎn)單添加足以使所述抗原與所述固體支持物永久結(jié)合。用tris緩沖鹽水(tbs)將固定的抗原洗滌三次并使用mestbs(補(bǔ)充有4.5%脫脂奶粉、0.1mmedta、1mg/ml鮭精dna和0.2%疊氮化鈉的tbs)于37℃將所述固體支持物上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉1小時(shí)。使用tetbs(補(bǔ)充有0.04%吐溫和0.1mmedta的tbs)將所述固體支持物洗滌3次。所有后續(xù)洗滌步驟均遵循此程序。

使用一次性harris3mmuni-core打孔器從所述固體支持物切下多個(gè)沖孔片，然后加至適于pcr的96孔板中。

使用由1份mestbs加9份tetbs組成的試劑稀釋緩沖液(rdb)稀釋生物素化的羊抗il-2(r&dsystems，目錄編碼baf202)并將其加至含有所述固體支持物沖孔片的96孔板中。于室溫(22℃)將il-2抗原及生物素化的抗體孵育一小時(shí)，接著使用tetbs進(jìn)行三分鐘洗滌步驟。重復(fù)洗滌5次。

如描述于genbank登錄號(hào)bc003596的共同對(duì)應(yīng)于p53cdna的217-1255的p53mrna的1038bp片段(image；3544714，mgc；646)，用作免疫pcr反應(yīng)的模板。將所述適當(dāng)大小的p53dna片段從載體上切下并使用隨機(jī)引物dna生物素化試劑盒(kpl，目錄編碼60-01-00)、使用klenowdna聚合酶的exo-minus片段用生物素d-ctp進(jìn)行生物素化。

將游離的鏈霉抗生物素(sigma目錄編碼s4762)用于將所述生物素化的抗體與所述生物素化的p53片段連接。

所述ipcr檢測(cè)反應(yīng)包括使用p53特異性正向引物1；5’-gcgcacagaggaagagaatc-3’和反向引物2；5’-ccaaggcctcattcagctct-3(sigmagenosys)產(chǎn)生250bppcr產(chǎn)物。

使用pcr預(yù)混液(95μl；1utaqdna聚合酶，20pmol正向和反向引物)生成pcr擴(kuò)增子并相應(yīng)地進(jìn)行擴(kuò)增(變性94℃，3min。30個(gè)循環(huán)的94℃，30s；55℃，1min；72℃，2min；最后浸浴于72℃，10min)。

在1%瓊脂糖凝膠上使所得擴(kuò)增子顯影(未顯示數(shù)據(jù))。

盡管已顯示和闡述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將顯而易見的是，在不背離本發(fā)明的教導(dǎo)的情況下，可進(jìn)行修改和變動(dòng)。在前文詳述和附圖中陳述的事件，僅以舉例說明而提供且并非作為限制。當(dāng)基于先有技術(shù)以其適當(dāng)?shù)挠^點(diǎn)考慮時(shí)，意圖本發(fā)明的實(shí)際范圍在下列權(quán)利要求中界定。