本發(fā)明涉及與靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)的分辨。

背景技術(shù)：

為了檢測(cè)靶核酸序列，作為實(shí)時(shí)檢測(cè)方式廣泛利用以一邊監(jiān)控靶擴(kuò)增，一邊可檢測(cè)靶核酸序列的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。通常，在實(shí)時(shí)檢測(cè)方法中使用與靶核酸序列特異性雜交的已標(biāo)志的探針或引物。作為使用已標(biāo)志的探針及靶核酸序列之間的雜交的方法的例，包括使用具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙重標(biāo)志的探針的分子信標(biāo)(molecularbeacon)方法(tyagietal,naturebiotechnologyv.14march1996)、hybeacon方法(frenchdjetal.,mol.cellprobes,15(6):363-374(2001))、利用分別標(biāo)志成供體及受體的2個(gè)探針的雜交探針方法(bernadetal,147-148clinchem2000；46)及使用單一標(biāo)志的寡核苷酸的lux方法(美國專利第7537886號(hào))。在本技術(shù)領(lǐng)域中廣泛利用taqman方法(美國專利第5210015號(hào)及第5538848號(hào))，上述taqman方法(美國專利第5210015號(hào)及第5538848號(hào))利用借助雙重標(biāo)志的探針及脫氧核糖核酸(dna)聚合酶的5’-核酸酶活性的上述探針的切割。

作為使用標(biāo)志的引物的方法的例，包括日出(sunrise)引物方法(nazarenkoetal,2516-2521nucleicacidsresearch,1997,v.25no.12及美國專利第6117635號(hào))、蝎形(scorpion)引物方法(whitcombeetal,804-807,naturebiotechnologyv.17august1999及美國專利第6326145號(hào))及tsg引物方法(wo第2011/078441號(hào))。

作為代替接近法，提出使用以依賴于靶核酸序列的存在的方式形成的二聚體的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，例如，侵入物(invader)分析(美國專利第5691142號(hào)、美國專利第6358691號(hào)及美國專利第6194149號(hào))、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸(ptoce，ptocleavageandextension)方法(wo第2012/096523號(hào))、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交(pce-sh，ptocleavageandextension-dependentsignalingoligonucleotidehybridization)方法(wo第2013/115442號(hào))及探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交(pce-nh，ptocleavageandextension-dependentnon-hybridization)方法(第pct/kr2013/012312號(hào))。

如上所述的現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)在與靶擴(kuò)增相關(guān)或無關(guān)的信號(hào)擴(kuò)增過程中，在一個(gè)所選擇的檢測(cè)溫度下檢測(cè)從熒光標(biāo)志產(chǎn)生的信號(hào)。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)管中利用單一類型的標(biāo)志來檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列時(shí)，互不分辨針對(duì)靶核酸序列產(chǎn)生的多個(gè)信號(hào)。因此，為了檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列，在現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)中一般利用不同類型的標(biāo)志。在利用單一類型的標(biāo)志的情況下，利用tm值差異的解鏈分析可檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列，但是，解鏈分析具有如下缺點(diǎn)：解鏈分析的進(jìn)行時(shí)間長于實(shí)時(shí)技術(shù)進(jìn)行時(shí)間，且隨著靶核酸序列的增加，使具有不同的tm值的探針的設(shè)計(jì)變得越來越難。

因此，若開發(fā)不依賴于解鏈分析且在一個(gè)反應(yīng)容器及單一類型的檢測(cè)器中使用單一類型的標(biāo)志來檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列的新方法或接近法，則能夠以便利性、費(fèi)用效果及效率性大大提高的方式檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。并且，若結(jié)合上述新方法與其他檢測(cè)方法(例如，解鏈分析)，則能夠以效率大大提高的方式在一個(gè)反應(yīng)容器中使用單一類型的標(biāo)志檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。

在本說明書全文中，參照了多篇專利及文獻(xiàn)，并用括號(hào)表示了其引用。為了更加明確地說明本發(fā)明及本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水平，這種專利及文獻(xiàn)的公開內(nèi)容全部插入于本說明書作為參照。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人為了開發(fā)檢測(cè)靶核酸序列的方法，尤其為了開發(fā)以更準(zhǔn)確且簡單的方式定性或定量地檢測(cè)的方法而進(jìn)行了努力研究。其結(jié)果確認(rèn)，本發(fā)明人在檢測(cè)溫度下與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)后，通過使用適合的方程式來處理檢測(cè)結(jié)果，從而能夠以便利性、費(fèi)用效果及效率性大大提高的方式在一個(gè)反應(yīng)容器中利用單一類型的標(biāo)志及單一類型的檢測(cè)器檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。

因此，本發(fā)明的一目的在于，提供對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法及試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于，提供對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法及試劑盒。

本發(fā)明的另一目的在于，提供計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法。

本發(fā)明的還有一目的在于，提供計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法。

本發(fā)明的又一目的在于，提供用于對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的裝置。

本發(fā)明的又一目的在于，提供用于對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的裝置。

本發(fā)明的又一目的在于，提供計(jì)算機(jī)程序，運(yùn)行用于執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法的處理器且儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

本發(fā)明的又一目的在于，提供計(jì)算機(jī)程序，運(yùn)行用于執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法的處理器且儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

通過結(jié)合發(fā)明要求保護(hù)范圍及附圖和下述詳細(xì)說明更加明確本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1a示出在第一檢測(cè)溫度(60℃)及第二檢測(cè)溫度(72℃)下對(duì)第一靶核酸序列(淋病奈瑟氏菌的基因組脫氧核糖核酸，ng)、第二靶核酸序列(沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸，ct)及它們的組合進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。通過taqman探針方法來產(chǎn)生與淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原體有關(guān)的信號(hào)。ntc表示無模板的對(duì)照組。

圖1b示出基于圖1a的檢測(cè)結(jié)果獲得基準(zhǔn)值。在第一檢測(cè)溫度下的信號(hào)對(duì)在第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)的比率為基準(zhǔn)值的一例。

圖1c示出對(duì)解聯(lián)立方程式1來得到的st1d1及st2d1進(jìn)行繪制的結(jié)果。使用通過實(shí)驗(yàn)來獲得基準(zhǔn)值。虛線表示為了確認(rèn)所獲得的擴(kuò)增曲線的重要性而參照?qǐng)D1a中的淋病奈瑟氏菌單獨(dú)樣品及沙眼衣原體單獨(dú)樣品的結(jié)果來確定的閾值。

圖1d示出對(duì)解聯(lián)立方程式2來得到的st1d2及st2d2進(jìn)行繪制的結(jié)果。使用通過實(shí)驗(yàn)來獲得的基準(zhǔn)值。虛線表示閾值。

圖2a示出在第一檢測(cè)溫度(60℃)及第二檢測(cè)溫度(72℃)下對(duì)第一靶核酸序列(淋病奈瑟氏菌的基因組脫氧核糖核酸，ng)、第二靶核酸序列(沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸，ct)及它們的組合進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。通過探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法來產(chǎn)生與淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原體有關(guān)的信號(hào)。ntc表示無模板的對(duì)照組。以在60℃及72℃的溫度下提供感興趣的信號(hào)的方式涉及與沙眼衣原體有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，以在60℃的溫度下提供感興趣的信號(hào)的方式涉及與淋病奈瑟氏菌有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

圖2b示出基于圖2a的檢測(cè)結(jié)果獲得基準(zhǔn)值。在第一檢測(cè)溫度下的信號(hào)對(duì)在第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)的比率為基準(zhǔn)值的一例。

圖2c示出對(duì)解方程式組2(st1d2＝0)來得到的st1d1及st2d1進(jìn)行繪制的結(jié)果。虛線表示為了確認(rèn)所獲得的擴(kuò)增曲線的重要性而參照?qǐng)D2a中的淋病奈瑟氏菌單獨(dú)樣品及沙眼衣原體單獨(dú)樣品的結(jié)果來確定的閾值。

圖2d示出對(duì)解方程式組2(st1d2＝0)來得到的st1d2及st2d2進(jìn)行繪制的結(jié)果。虛線表示閾值。

圖2e示出對(duì)解方程式組3來得到的st1d1及st2d1進(jìn)行繪制的結(jié)果，在上述方程式組3中使用通過實(shí)驗(yàn)來獲得的基準(zhǔn)值。虛線表示閾值。

圖2f示出對(duì)解方程式組3來得到的st1d2及st2d2進(jìn)行繪制的結(jié)果，在上述方程式組3中使用通過實(shí)驗(yàn)來獲得的基準(zhǔn)值。虛線表示閾值。

圖2g示出對(duì)解方程式組4來得到的st1d1及st2d1進(jìn)行繪制的結(jié)果，在上述方程式組4中使用作為rvt1d1/d2的任意選擇的常數(shù)值(arbitrary-selectedconstantvalue)。虛線表示閾值。

圖2h示出對(duì)解方程式組4來得到的st1d2及st2d2進(jìn)行繪制的結(jié)果，在上述方程式組4中使用作為rvt1d1/d2的任意選擇的常數(shù)值。虛線表示閾值。

圖3a及3b示出在3個(gè)檢測(cè)溫度(60℃、72℃及95℃)下對(duì)3個(gè)靶核酸序列[淋病奈瑟氏菌(ng)的基因組脫氧核糖核酸、沙眼衣原體(ct)的基因組脫氧核糖核酸及生殖器支原體(mg)的基因組脫氧核糖核酸]及它們的組合進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。通過探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法來產(chǎn)生與淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原體有關(guān)的信號(hào)，通過taqman探針方法來產(chǎn)生與生殖器支原體有關(guān)的信號(hào)。

圖3c示出基于圖3a的檢測(cè)結(jié)果獲得基準(zhǔn)值。檢測(cè)溫度之間的信號(hào)比率為基準(zhǔn)值的一例。

圖3d及3e示出對(duì)解聯(lián)立方程式5來得到的st1d1、st2d1及st3d1進(jìn)行繪制的結(jié)果。使用通過實(shí)驗(yàn)來獲得基準(zhǔn)值。虛線表示為了確認(rèn)所獲得的擴(kuò)增曲線的重要性而參照?qǐng)D3a中的淋病奈瑟氏菌單獨(dú)樣品、沙眼衣原體單獨(dú)樣品及生殖器支原體單獨(dú)樣品的結(jié)果來確定的閾值。

圖3f及3g示出對(duì)解聯(lián)立方程式6來得到的st1d2、st2d2及st3d2進(jìn)行繪制的結(jié)果。使用通過實(shí)驗(yàn)來獲得基準(zhǔn)值。虛線表示閾值。

圖3h及3i示出對(duì)解聯(lián)立方程式7來得到的st1d3、st2d3及st3d3進(jìn)行繪制的結(jié)果。使用通過實(shí)驗(yàn)來獲得基準(zhǔn)值。虛線表示閾值。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的最大的特征是在一個(gè)反應(yīng)容器中使用單一類型的標(biāo)志及單一類型的檢測(cè)器檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。在利用不同檢測(cè)溫度及用于解變數(shù)的數(shù)學(xué)方程式的本發(fā)明中，可在一個(gè)反應(yīng)容器中利用單一類型的標(biāo)志檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的特征選擇本發(fā)明的結(jié)構(gòu)，并成為用于檢測(cè)靶核酸序列的驚人的工藝。

在現(xiàn)有的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法中，為了在一個(gè)反應(yīng)容器中檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列而需要2種類型的熒光標(biāo)志或解鏈分析。

本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)容器中使用單一類型的熒光標(biāo)志來檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方案。

i.與2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)的分辨

在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，提供對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法，包括：

步驟(a)，與用于檢測(cè)第一靶核酸序列(t1)的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及用于檢測(cè)第二靶核酸序列(t2)的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)上述樣品，在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下檢測(cè)信號(hào)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)對(duì)各個(gè)靶核酸序列不被單一類型的檢測(cè)器(singletypeofdetector)分辨；

步驟(b)，提供包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)上述2個(gè)靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述2個(gè)方程式：

(i)：st1d1+st2d1＝sd1

(ii)：st1d2+st2d2＝sd2

在上述式中，(sd1)為在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)，(sd2)為在第二檢測(cè)溫度檢測(cè)的信號(hào)；(st1d1)為表示在第一檢測(cè)溫度下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st2d1)為表示在第一檢測(cè)溫度下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st1d2)為表示在第二檢測(cè)溫度下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st2d2)為表示在第二檢測(cè)溫度下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)；變數(shù)的總數(shù)為4個(gè)；

步驟(c)，提供分別包括選自由上述4個(gè)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st1d2)及(st1d2)組成的組中的至少一個(gè)變數(shù)的2個(gè)附加方程式；

步驟(d)，為了分辨分配在上述2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)，借助在步驟(b)及步驟(c)中所提供的4個(gè)方程式來得到對(duì)上述變數(shù)中的至少一個(gè)的解答(solution)。

根據(jù)使用擴(kuò)增曲線的現(xiàn)有的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，使用提供不被分辨的相同信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)來分辨多個(gè)靶核酸序列，從而無法進(jìn)行檢測(cè)，這是本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通常識(shí)。

本發(fā)明克服與本技術(shù)領(lǐng)域的普通常識(shí)相關(guān)的局限，帶來以大大得到改善的方式檢測(cè)靶核酸序列的意想不到的結(jié)果。

在本申請(qǐng)中，將本發(fā)明的方法作為對(duì)分別與樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法來表達(dá)，可選地，作為檢測(cè)樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的方法或者通過在2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)分配感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)來確定樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的存在的方法來表達(dá)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“感興趣的信號(hào)”是指借助本發(fā)明被分辨的信號(hào)。最終檢測(cè)出的信號(hào)可為多個(gè)信號(hào)之和。例如，在檢測(cè)溫度下最終檢測(cè)出的信號(hào)可包括(i)來自與第一靶核酸序列(t1)有關(guān)的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)及(ii)來自與第二靶核酸序列(t2)有關(guān)的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)。(i)信號(hào)及(ii)信號(hào)分別為借助本發(fā)明被分辨的感興趣的信號(hào)。例如，本發(fā)明的目的在于，從檢測(cè)出的信號(hào)分辨(i)信號(hào)和/或(ii)信號(hào)。感興趣的信號(hào)的這種分辨可使感興趣的信號(hào)分配到2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)。其結(jié)果，可通過感興趣的信號(hào)的分辨來確定靶核酸序列是否存在于樣品內(nèi)。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，由2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)不對(duì)各個(gè)靶核酸序列進(jìn)行分辨。有趣的是，在本發(fā)明中，在對(duì)由2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)進(jìn)行分辨來使用單一類型的檢測(cè)器的情況下，也可使感興趣的信號(hào)分配在上述2個(gè)靶核酸序列。

并且，在本發(fā)明中，可更加系統(tǒng)性、可信性、簡單的方式并使用數(shù)學(xué)方程式來分辨感興趣的信號(hào)。

以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。

步驟(a)：與信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)樣品以及信號(hào)檢測(cè)

與用于檢測(cè)第一靶核酸序列(t1)的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及用于檢測(cè)第二靶核酸序列(t2)的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)所要分析的樣品后，在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下檢測(cè)來自上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)對(duì)各個(gè)靶核酸序列不被單一類型的檢測(cè)器分辨。

本發(fā)明為了提供與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)而利用信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。借助相應(yīng)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)各個(gè)靶核酸序列。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)”是指在產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號(hào)的過程中所使用的任何物質(zhì)，例如，其包括寡核苷酸、標(biāo)志及酶?？蛇x地，在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)”是指利用用于產(chǎn)生信號(hào)的物質(zhì)的任何方法。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在可產(chǎn)生基于信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這種條件包括溶溫度、鹽濃度及溶液的ph。

例如，作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含與靶核酸序列特異性雜交的寡核苷酸(例如，探針及引物)；在與靶核酸序列雜交的探針或引物被切割而釋放片段的情況下，作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含與上述片段特異性雜交的捕捉寡核苷酸；在與上述捕捉寡核苷酸雜交的片段延伸而形成延伸鏈的情況下，作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含與上述延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸；作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含與上述捕捉寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸；以及作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含它們的組合。

即使信號(hào)產(chǎn)生原理相同，也可將包含不同序列的寡核苷酸的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)視為互不相同的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

標(biāo)志可與寡核苷酸相連接或者可以為自由形態(tài)。在延伸反應(yīng)期間標(biāo)志可插入于延伸產(chǎn)物。

例如，在信號(hào)產(chǎn)生中使用上述寡核苷酸的切割的情況下，酶包括5’-核酸酶、3’-核酸酶、尤其包括具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶、具有3’-核酸酶活性的核酸聚合酶或fen核酸酶。

在本發(fā)明中，可使用多種物質(zhì)以多種方式產(chǎn)生信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)中的至少一個(gè)為以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，與各個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，上述二聚體包含雙鏈靶核酸序列。

在本申請(qǐng)中所使用的與信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)相關(guān)的術(shù)語“以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)”是指以依賴于2個(gè)核酸分子的結(jié)合或解離的方式提供被檢測(cè)出的信號(hào)。上述表達(dá)包括根據(jù)以依賴于靶核酸序列存在的方式形成的二聚體(例如，包含具有標(biāo)志的檢測(cè)寡核苷酸及核酸序列)提供信號(hào)。并且，上述表達(dá)包括通過抑制二聚體(例如，具有標(biāo)志的檢測(cè)寡核苷酸及核酸序列)的雜交來提供信號(hào)，上述抑制隨著其他二聚體的形成而產(chǎn)生。

尤其，通過與靶核酸序列及上述靶核酸序列特異性雜交的檢測(cè)寡核苷酸之間的二聚體的形成產(chǎn)生上述信號(hào)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“檢測(cè)寡核苷酸”是參與產(chǎn)生被檢測(cè)的信號(hào)的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含參與產(chǎn)生實(shí)質(zhì)信號(hào)的寡核苷酸。例如，其他寡核苷酸(例如，包含與靶核酸序列或檢測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸)和檢測(cè)寡核苷酸的雜交或非雜交確定信號(hào)產(chǎn)生。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含至少一個(gè)標(biāo)志。

基于靶核酸序列及檢測(cè)寡核苷酸之間的二聚體形成的信號(hào)可通過包括蝎形方法(whitcombeetal,naturebiotechnology17:804-807(1999))、日出(或amplifluor)方法(nazarenkoetal,nucleicacidsresearch,25(12):2516-2521(1997)及美國專利第6117635號(hào))、lux方法(美國專利第7537886號(hào))、叩診槌(plexor)方法(sherrillcb,etal.,journaloftheamericanchemicalsociety,126:4550-45569(2004))、分子信標(biāo)方法(tyagietal,naturebiotechnologyv.14march1996)、hybeacon方法(frenchdjetal.,mol.cellprobes,15(6):363-374(2001))、相鄰的雜交探針方法(bernard,p.s.etal.,anal.biochem.,273:221(1999))及l(fā)na方法(美國專利第6977295號(hào))的多種方法產(chǎn)生。

尤其，通過以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體產(chǎn)生信號(hào)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“介導(dǎo)寡核苷酸”為介導(dǎo)生成不包含靶核酸序列的二聚體的寡核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸的切割本身不產(chǎn)生信號(hào)，在進(jìn)行介導(dǎo)寡核苷酸的雜交及切割之后，通過上述切割形成的片段參與用于產(chǎn)生信號(hào)的連續(xù)反應(yīng)。

根據(jù)一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸的雜交或切割本身不產(chǎn)生信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸以與靶核酸序列雜交且被切割的方式釋放片段，從而包含介導(dǎo)二聚體生成的寡核苷酸。尤其，上述片段在捕捉寡核苷酸中介導(dǎo)基于上述片段的延伸的二聚體的生成。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含與靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；以及(ii)5’-標(biāo)記部位，包含與靶核酸序列非-互補(bǔ)的核苷酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸的切割釋放片段，上述片段與捕捉寡核苷酸特異性雜交，并在上述捕捉寡核苷酸中延伸。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，與靶核酸序列雜交的介導(dǎo)寡核苷酸被切割而釋放片段，上述片段與捕捉寡核苷酸特異性雜交，上述片段以延伸的方式形成延伸鏈，這導(dǎo)致形成上述延伸鏈及捕捉寡核苷酸之間的延伸二聚體，從而提供表示靶核酸序列存在的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在使用包含與上述延伸鏈互補(bǔ)的雜交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情況下，上述第三寡核苷酸及延伸鏈的雜交通過形成其他類型的二聚體，來提供表示靶核酸序列存在的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在使用包含與捕捉寡核苷酸互補(bǔ)的雜交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情況下，第三寡核苷酸及上述捕捉寡核苷酸之間的二聚體形成受到上述延伸鏈及上述捕捉寡核苷酸之間的二聚體形成的抑制，從而提供表示靶核酸序列存在的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述片段、上述延伸鏈、上述捕捉寡核苷酸、上述第三寡核苷酸或它們的組合可起到檢測(cè)寡核苷酸的作用。

基于以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)可通過包括探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸(ptocleavageandextension)方法(wo2012/096523)、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交(ptocleavageandextension-dependentsignalingoligonucleotidehybridization)方法(wo2013/115442)及探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交(ptocleavageandextension-dependentnon-hybridization)方法(pct/kr2013/012312)的多種方法產(chǎn)生。

與在上述的文獻(xiàn)中公開的術(shù)語相關(guān)地，與寡核苷酸的相應(yīng)的例如下：介導(dǎo)寡核苷酸與探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸(pto)相應(yīng)，捕捉寡核苷酸與捕捉和模板化寡核苷酸(cto)相應(yīng)，第三寡核苷酸分別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸(so)或雜交寡核苷酸(ho)相應(yīng)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸、雜交寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸、延伸鏈或它們的組合可起到檢測(cè)寡核苷酸的作用。

以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)包含以由以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體抑制其他二聚體的形成的方式提供的信號(hào)(例如，探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交)。

例如，當(dāng)通過探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方式產(chǎn)生基于以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)時(shí)，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包含：上游寡核苷酸，包含與靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸；捕捉和模板化寡核苷酸；適合的標(biāo)志以及具有5’-核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶。探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含與靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；以及(ii)5’-標(biāo)記部位，包含與靶核酸序列非互補(bǔ)的核苷酸序列。捕捉和模板化寡核苷酸沿著3’→5’方向包含(i)捕捉部位，包含與上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位或5’-標(biāo)記部位的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列；以及(ii)模板化部位，包含與探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位及3’-靶向部位非互補(bǔ)的核苷酸序列。

基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法的產(chǎn)生信號(hào)的特定例包括如下步驟。

包括：步驟(a)，使靶核酸序列與上游引物及探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸雜交；步驟(b)，在用于切割上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的條件下，使步驟(a)的結(jié)果物與具有5’核酸酶活性的酶相接觸；上述上游寡核苷酸或其延伸鏈誘導(dǎo)基于具有5’核酸酶活性的酶的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的切割，上述切割釋放包含上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位或5’-標(biāo)記部位的一部分的片段；步驟(c)，使從上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸釋放的片段與捕捉和模板化寡核苷酸雜交；從上述捕捉和模板化寡核苷酸釋放的片段與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交；步驟(d)，利用上述步驟(c)的結(jié)果物及模板-依賴性核酸聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)；通過使與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交的片段延伸來形成延伸二聚體，上述延伸二聚體具有可通過(i)上述片段的序列和/或長度、(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或長度、(ⅲ)上述片段的序列和/或長度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或長度調(diào)節(jié)的tm值，上述延伸二聚體根據(jù)(i)與上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相連接的至少一個(gè)標(biāo)志、(ii)在延伸反應(yīng)期間插入于延伸二聚體內(nèi)的標(biāo)志、(ⅲ)在延伸反應(yīng)期間插入于延伸二聚體內(nèi)的標(biāo)志及與片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相連接的標(biāo)志或(ⅳ)插入標(biāo)志提供靶信號(hào)；以及步驟(e)，上述延伸二聚體在維持其雙鏈形態(tài)的預(yù)先確定的溫度下測(cè)定靶信號(hào)，由此檢測(cè)上述延伸二聚體，上述延伸二聚體的存在表示靶核酸序列的存在。在這種情況下，在上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反復(fù)循環(huán)之間還包括變性，來反復(fù)實(shí)施上述步驟(a)～步驟(e)的全部或一部分。

在語句“在反復(fù)循環(huán)之間變性”中，術(shù)語“變性”是指將雙鏈核酸分子解離成單鏈核酸分子。

在探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法的步驟(a)中，替代上游寡核苷酸可使用用于擴(kuò)增靶核酸序列的引物組。在這種情況下，在上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法中，在反復(fù)循環(huán)之間還包括變性，來反復(fù)上述步驟(a)～步驟(e)的全部或一部分。

在使與捕捉和模板化寡核苷酸雜交的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸片段延伸而形成延伸鏈后，探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法可分類為檢測(cè)上述延伸的過程。探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法的特征在于，使用延伸鏈及捕捉和模板化寡核苷酸之間的二聚體檢測(cè)延伸鏈的形成。

還存在檢測(cè)延伸鏈形成的其他接近法。例如，可利用與上述延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸，來檢測(cè)延伸鏈的形成(例如，探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交方法)。在這種方法中，信號(hào)可從(i)連接在與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸的標(biāo)志、(ii)連接在與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸的標(biāo)志及與探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸片段相連接的標(biāo)志、(iii)連接在與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸的標(biāo)志及在延伸反應(yīng)期間插入于延伸鏈的標(biāo)志或(iv)連接在與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸的標(biāo)志及嵌入染料提供?？蛇x地，信號(hào)可從(i)與延伸鏈相連接的標(biāo)志或(ii)嵌入染料提供。

可選地，通過檢測(cè)用于抑制與捕捉和模板化寡核苷酸及上述捕捉和模板化寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸之間的雜交的其他方法(例如，探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交方法)檢測(cè)延伸鏈形成。將這種抑制視為用于表示靶核酸序列的存在。信號(hào)可從(i)連接在可與捕捉和模板化寡核苷酸雜交的寡核苷酸的標(biāo)志、(ii)與捕捉和模板化寡核苷酸相連接的標(biāo)志、(iii)連接在可與捕捉和模板化寡核苷酸雜交的寡核苷酸的標(biāo)志及與捕捉和模板化寡核苷酸相連接的標(biāo)志或(iv)嵌入染料提供。

根據(jù)一實(shí)例，可與捕捉和模板化寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸具有與探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸片段重疊的序列。

根據(jù)一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含：可與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸(例如，探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交方法)及可與捕捉和模板化寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸(例如，探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交方法)。根據(jù)一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含在反應(yīng)期間生成的延伸鏈或捕捉和模板化寡核苷酸。

通常，基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法伴隨依賴于靶核酸序列的存在的延伸鏈的形成。在本申請(qǐng)中為了包括用于提供信號(hào)的多種方法使用術(shù)語“基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法”，上述多種方法包括通過探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的切割及延伸形成延伸鏈的步驟。

基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法產(chǎn)生信號(hào)的例包括如下的步驟，即，包括：步驟(a)，使上述靶核酸序列與上游引物及探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸雜交；步驟(b)，在用于上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的切割的條件下，使上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’核酸酶活性的酶與相接觸，上述上游寡核苷酸或其延伸鏈誘導(dǎo)基于具有5’核酸酶活性的酶的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的切割，上述切割釋放包含探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位或5’-標(biāo)記部位的一部分的片段；步驟(c)，使從上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸釋放的片段與捕捉和模板化寡核苷酸雜交，從上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸釋放的片段與捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交；步驟(d)，使用步驟(c)的結(jié)果物及模板-依賴性核酸聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交的片段被延伸，來形成延伸鏈；以及步驟(e)，通過檢測(cè)與延伸鏈的存在依賴性地產(chǎn)生的信號(hào)來檢測(cè)上述延伸鏈的形成。在步驟(a)中，替代上述上游寡核苷酸可使用用于擴(kuò)增靶核酸序列的引物組。在這種情況下，在上述基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反復(fù)循環(huán)之間還包括變性，來反復(fù)實(shí)施上述步驟(a)～步驟(e)的全部或一部分。

根據(jù)一實(shí)例，基于二聚體的形成產(chǎn)生的信號(hào)包括基于二聚體雜交(例如，二聚體本身的雜交或第三寡核苷酸的雜交)被誘導(dǎo)的信號(hào)或基于抑制因二聚體形成而引起的第三寡核苷酸的雜交而被誘導(dǎo)的信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，與靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)是基于以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成二聚體的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，與各個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)是基于以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成二聚體的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，在2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)中的至少一個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，與各個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

尤其，在使檢測(cè)寡核苷酸和靶核酸序列雜交后，基于檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生信號(hào)。

在使檢測(cè)寡核苷酸與靶核酸序列雜交后，基于上述檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)可通過包括taqman探針方法(美國專利第5210015號(hào)及美國專利第5538848號(hào))的多種方法產(chǎn)生。

在通過taqman探針方法產(chǎn)生信號(hào)的情況下，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包含用于擴(kuò)增靶核酸序列的引物組、具有適當(dāng)?shù)臉?biāo)志(例如，相互作用性雙重標(biāo)志)的taqman探針及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶。在靶擴(kuò)增期間，與靶核酸序列雜交的taqman探針被切割，并產(chǎn)生表示上述靶核酸序列存在的信號(hào)。

通過taqman探針方法產(chǎn)生信號(hào)的特定例包括如下的步驟，即，包括：步驟(a)，使引物組及具有適當(dāng)?shù)臉?biāo)志(例如，相互作用性雙重標(biāo)志)的taqman探針與靶核酸序列雜交；步驟(b)，使用上述步驟(a)的結(jié)果物及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶，來擴(kuò)增靶核酸序列，上述taqman探針被切割而釋放標(biāo)志；以及步驟(c)，從所釋放的上述標(biāo)志檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生。

尤其，信號(hào)以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式借助檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生。

根據(jù)一實(shí)例，與靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式借助檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，與各個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式借助檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在與靶核酸序列雜交的介導(dǎo)寡核苷酸被切割而釋放片段的情況下，上述片段與檢測(cè)寡核苷酸特異性雜交，上述片段誘導(dǎo)檢測(cè)寡核苷酸的切割。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在與靶核酸序列雜交的介導(dǎo)寡核苷酸被切割而釋放片段的情況下，上述片段被延伸而切割包含與捕捉寡核苷酸互補(bǔ)的雜交核苷酸序列的檢測(cè)寡核苷酸。

基于以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式的檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)可通過包括侵入物分析(美國專利第5691142號(hào))、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性切割(pcec，ptocleavageandextension-dependentcleavage)方法(wo第2012/134195號(hào))及在美國專利第7309573號(hào)中記載的方法等多種方法產(chǎn)生。尤其，在美國專利第7309573號(hào)中記載的方法可被視為使用基于切割的產(chǎn)生信號(hào)的基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法中的一種。在上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法中，檢測(cè)基于延伸鏈的形成與捕捉和模板化寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸的切割，從而可檢測(cè)上述延伸鏈的形成。在侵入物分析中，借助介導(dǎo)寡核苷酸的切割形成片段，并且以無片段的延伸的方式誘導(dǎo)連續(xù)的切割反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，檢測(cè)寡核苷酸的切割誘導(dǎo)信號(hào)變化或者釋放所要檢測(cè)的已標(biāo)志的片段。

在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)不僅基于檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生信號(hào)，而且基于二聚體的形成而產(chǎn)生信號(hào)的情況下，只要上述信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用于基于切割產(chǎn)生信號(hào)的過程中，就可被視為基于切割提供信號(hào)的信號(hào)發(fā)生機(jī)構(gòu)。

在基于檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生信號(hào)的情況下，可在任意溫度下檢測(cè)基于上述切割而被釋放的標(biāo)志。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例，與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)是基于檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及基于二聚體的形成的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的組合。

根據(jù)一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含至少一個(gè)標(biāo)志。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸可包含至少一個(gè)寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，當(dāng)檢測(cè)寡核苷酸包含多個(gè)寡核苷酸形成時(shí)，上述檢測(cè)寡核苷酸能夠以多種方式具有標(biāo)志。例如，多個(gè)寡核苷酸中的一個(gè)寡核苷酸可具有至少一個(gè)標(biāo)志、多個(gè)寡核苷酸均可具有至少一個(gè)標(biāo)志或者寡核苷酸的一個(gè)部位可具有至少一個(gè)標(biāo)志而其它部位能夠不具有標(biāo)志。

借助2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨。術(shù)語“不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)”是指因它們的相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的信號(hào)特性(例如，光學(xué)特性、釋放波長及電信號(hào))而信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器相互分辨。例如，針對(duì)2個(gè)靶核酸序列使用相同的標(biāo)志(例如，fam)且為了檢測(cè)從fam的釋放波長而使用單一類型的檢測(cè)器時(shí)，則無法以分辨的方式檢測(cè)信號(hào)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“單一類型的信號(hào)”是指提供相同或?qū)嵸|(zhì)相同的信號(hào)特性(例如，光學(xué)特性、釋放波長及電信號(hào))的信號(hào)。例如，fam及calfluor610提供不同類型的信號(hào)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“單一類型的檢測(cè)器”是指用于單一類型的信號(hào)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)。在包括用于多個(gè)不同類型的信號(hào)的多個(gè)通道(例如，光電二極管)的檢測(cè)器中，各個(gè)通道(例如，光電二極管)相當(dāng)于“單一類型的檢測(cè)器”。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包含相同的標(biāo)志，來自上述標(biāo)志的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨。

在本發(fā)明中，有用的標(biāo)志包括在本技術(shù)領(lǐng)域中公知的多種標(biāo)志。例如，在本發(fā)明中，有用的標(biāo)志包括單一標(biāo)志、相互作用性雙重標(biāo)志、嵌入染料及插入(incorporating)標(biāo)志。

例如，單一標(biāo)志包括熒光標(biāo)志、發(fā)光標(biāo)志、化學(xué)發(fā)光標(biāo)志、電化學(xué)標(biāo)志及金屬標(biāo)志。根據(jù)一實(shí)例，單一標(biāo)志根據(jù)是否存在于雙鏈或者是否存在于單鏈來提供不同的信號(hào)(例如，不同的信號(hào)強(qiáng)度)。根據(jù)一實(shí)例，單一標(biāo)志為熒光標(biāo)志。在本發(fā)明中所使用的單一熒光標(biāo)志的優(yōu)選種類及結(jié)合位點(diǎn)公開在美國專利號(hào)第7537886號(hào)及美國專利號(hào)第7348141號(hào)中，且其相關(guān)啟示事項(xiàng)全部包含在本申請(qǐng)中作為參照。例如，單一熒光標(biāo)志包含joe、fam、tamra、rox及基于熒光素的標(biāo)志。單一熒光標(biāo)志可通過多種方法與寡核苷酸相連接。例如，標(biāo)志可通過包含碳原子的隔區(qū)(例如，3-碳間隔區(qū)、6-碳間隔區(qū)或12-碳間隔區(qū))與探針相連接。

作為一個(gè)代表性的相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret，fluorescenceresonanceenergytransfer)標(biāo)志系統(tǒng)包含熒光報(bào)道分子(供體分子)及猝滅分子(受體分子)。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移中，能量供體可以為熒光性，能量受體可以為熒光性或非-熒光性。在相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)的再一形態(tài)中，能量供體為非-熒光性，例如，發(fā)色團(tuán)(chromophore)，能量受體為熒光性。在相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)的另一形態(tài)中，能量供體為發(fā)光性，例如為生物發(fā)光性、化學(xué)發(fā)光性或電化學(xué)反光性，受體為熒光性。相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)包含基于“接觸-介導(dǎo)猝滅(oncontact-mediatedquenching)”的雙重標(biāo)志(salvatoreetal.,nucleicacidsresearch,2002(30)no.21e122及johanssonetal.,j.am.chem.soc2002(124)pp6950-6956)。相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)包含基于至少2個(gè)分子(例如，染料)之間的相互作用誘導(dǎo)信號(hào)變化的任何標(biāo)志系統(tǒng)。

在本發(fā)明中，有用的報(bào)道分子及猝滅分子可包括在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中公知的任何分子。作為它們的例如下：cy2^tm(506)、yo-pro^tm-1(509)、yoyo^tm-1(509)、calcein(517)、fitc(518)、fluorx^tm(519)、alexa^tm(520)、rhodamine110(520)、oregongreen^tm500(522)、oregongreen^tm488(524)、ribogreen^tm(525)、rhodaminegreen^tm(527)、rhodamine123(529)、magnesiumgreen^tm(531)、calciumgreen^tm(533)、to-pro^tm-1(533)、toto1(533)、joe(548)、bodipy530/550(550)、dil(565)、bodipytmr(568)、bodipy558/568(568)、bodipy564/570(570)、cy3^tm(570)、alexa^tm546(570)、tritc(572)、magnesiumorange^tm(575)、phycoerythrinr&b(575)、rhodaminephalloidin(575)、calciumorange^tm(576)、pyroniny(580)、rhodamineb(580)、tamra(582)、rhodaminered^tm(590)、cy3.5^tm(596)、rox(608)、calciumcrimson^tm(615)、alexa^tm594(615)、texasred(615)、nilered(628)、yo-pro^tm-3(631)、yoyo^tm-3(631)、r-phycocyanin(642)、c-phycocyanin(648)、to-pro^tm-3(660)、toto3(660)、diddilc(5)(665)、cy5^tm(670)、thiadicarbocyanine(671)、cy5.5(694)、hex(556)、tet(536)、biosearchblue(447)、calfluorgold540(544)、calfluororange560(559)、calfluorred590(591)、calfluorred610(610)、calfluorred635(637)、fam(520)、fluorescein(520)、fluorescein-c3(520)、pulsar650(566)、quasar570(667)、quasar670(705)及quasar705(610)。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為納米單位的最大釋放波長。優(yōu)選地，報(bào)道分子-猝滅分子包含joe、fam、tamra、rox及基于熒光素的標(biāo)志。

在如下多種文獻(xiàn)中公開適合的熒光分子及適合的報(bào)道-猝滅對(duì)：pesceetal.，editors，fluorescencespectroscopy(marceldekker，newyork，1971)；whiteetal.，fluorescenceanalysis：apracticalapproach(marceldekker，newyork，1970)；berlman，handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules，2^ndedition(academicpress，newyork，1971)；griffiths，colorandconstitutionoforganicmolecules(academicpress，newyork，1976)；bishop，editor，indicators(pergamonpress，oxford，1972)；haugland，handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(molecularprobes，eugene，1992)；pringsheim，fluorescenceandphosphorescence(intersciencepublishers，newyork，1949)；haugland，r.p.，handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals，6^thedition(molecularprobes，eugene，oreg.，1996)美國專利第3996345號(hào)及第4351760號(hào)。

需要留意的是，在本發(fā)明中，可使用能夠?qū)Χ喾N范圍的波長或特定波長的熒光進(jìn)行猝滅的非-熒光猝滅分子(例如，黑猝滅分子或黑暗猝滅劑)。

在包含報(bào)道分子及猝滅分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，報(bào)道分子包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體，猝滅分子包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移的另一伙伴(受體)。例如，將熒光素染料作為報(bào)道分子使用，將羅丹明染料作為猝滅分子使用。

相互作用性雙重標(biāo)志可與二聚體中的一條鏈相連接。當(dāng)包含上述相互作用性雙重標(biāo)志的鏈維持單鏈狀態(tài)時(shí)，上述鏈通過形成發(fā)夾或無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)來誘導(dǎo)相互作用性雙重標(biāo)志之間的猝滅。當(dāng)上述鏈形成二聚體時(shí)，猝滅減少?？蛇x地，當(dāng)相互作用性雙重標(biāo)志與位于鄰近鏈的位置的核苷酸相連接時(shí)，產(chǎn)生相互作用性雙重標(biāo)志之間的猝滅。在上述鏈形成二聚體后被切割的情況下，猝滅減少。

各個(gè)相互作用性雙重標(biāo)志可分別與二聚體的兩條鏈相連接。上述二聚體的形成誘導(dǎo)猝滅，二聚體的變性不誘導(dǎo)猝滅。可選地，在兩條鏈中的一條鏈被切割的情況下，可不誘導(dǎo)猝滅。

在本發(fā)明中例示的有用的嵌入染料包含sybr^tmgreeni、po-pro^tm-1、bo-pro^tm-1、syto^tm43、syto^tm44、syto^tm45、sytox^tmblue、popo^tm-1、popo^tm-3、bobo^tm-1、bobo^tm-3、lo-pro^tm-1、jo-pro^tm-1、yo-pro^tm1、to-pro^tm1、syto^tm11、syto^tm13、syto^tm15、syto^tm16、syto^tm20、syto^tm23、toto^tm-3、yoyo^tm3、gelstar^tm及噻唑橙。嵌入染料特異性地插入于雙鏈核酸分子內(nèi)來產(chǎn)生信號(hào)

在能夠以在延伸期間插入標(biāo)志的方式產(chǎn)生信號(hào)的過程中使用插入標(biāo)志(例如，plexor方法，sherrillcb,etal.,journaloftheamericanchemicalsociety,126:4550-45569(2004))。并且，在基于以依賴于與靶核酸序列雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)產(chǎn)生過程中也可使用插入標(biāo)志。

通常，插入標(biāo)志可與核苷酸相結(jié)合。并且，還可使用具有非-天然堿基的核苷酸。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“非-天然堿基”是指如腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)及尿嘧啶(u)等的天然堿基的衍生物，它們可形成氫鍵堿基對(duì)。在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“非-天然堿基”作為母體化合物，包含具有與天然堿基不同的堿基對(duì)模式的堿基，例如，公開于美國專利第5432272號(hào)、美國專利第5965364號(hào)、美國專利第6001983號(hào)及美國專利第6037120號(hào)中。非-天然堿基之間的堿基對(duì)與天然堿基相同，具有2個(gè)或3個(gè)氫鍵。并且，非-天然堿基之間的堿基對(duì)還以特定方式形成。在非-天然堿基的特定例中，在堿基對(duì)組合中包含如下堿基：iso-c/iso-g、iso-dc/iso-dg、k/x、h/j及m/n(參照美國專利第7422850號(hào))。

在通過探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法產(chǎn)生信號(hào)的情況下，在進(jìn)行延伸反應(yīng)期間插入的上述核苷酸可具有第一非-天然堿基，捕捉和模板化寡核苷酸可具有核苷酸，上述核苷酸具有對(duì)上述第一非-天然堿基產(chǎn)生特異性結(jié)合親和性的第二非-天然堿基。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”是指用于檢測(cè)或定量的感興趣的核酸序列。靶核酸序列不僅包含單鏈序列，還包含雙鏈序列。靶核酸序列不僅包含起初存在于核酸試樣內(nèi)的序列，還包含在反應(yīng)中新生成的序列。

靶核酸序列可包含任意脫氧核糖核酸(基因組脫氧核糖核酸(gdna)及互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cdna))、核糖核酸分子及它們的雜化體(嵌合核酸)。上述序列可以為雙鏈或單鏈形態(tài)。在作為初始物質(zhì)的核酸為雙鏈的情況下，優(yōu)選地，將上述兩條鏈制備成單鏈或部分單鏈形態(tài)。作為用于鏈分離的公知的方法包含加熱、堿、甲酰胺、尿素及乙二醛處理、酶方法(如解旋酶作用)及結(jié)合蛋白質(zhì)，但并不局限于此。例如，鏈分離可在80℃～105℃的溫度范圍下進(jìn)行加熱來實(shí)現(xiàn)。用于實(shí)現(xiàn)這種處理的常規(guī)方法由文獻(xiàn)[josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001)]提供。

當(dāng)將信使核糖核酸(mrna)用作初始物質(zhì)時(shí)，在進(jìn)行退火步驟之前必需進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟，在文獻(xiàn)[josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001)；及noonan,k.f.etal.,nucleicacidsres.16:10366(1988)]中確認(rèn)其相關(guān)詳細(xì)內(nèi)容。為了實(shí)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄，可利用能夠與信使核糖核酸的聚腺苷酸尾雜交的寡核苷酸dt引物、隨機(jī)引物或靶特異性引物。

靶核酸序列包含任何天然原核細(xì)胞核酸、真核細(xì)胞核酸(例如，原生動(dòng)物和寄生蟲、真菌類、酵母、高等植物、低等動(dòng)物及包含哺乳動(dòng)物和人類的高等動(dòng)物)、病毒(例如，皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒、eb病毒、肝炎病毒以及脊髓灰質(zhì)炎病毒等)核酸或類病毒核酸。并且，核酸分子可以為通過重組生產(chǎn)的或可生產(chǎn)的任何核酸分子或化學(xué)合成或可化學(xué)合成的任何核酸分子。因此，可在自然中發(fā)現(xiàn)或無法發(fā)現(xiàn)核酸分子。靶核酸序列可包含已知或未知的序列。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“樣品”是指可根據(jù)本發(fā)明而利于評(píng)價(jià)的生物學(xué)樣品或來自任意其他介質(zhì)的任意細(xì)胞、組織或流體，其包含病毒、細(xì)菌、組織、細(xì)胞、血液、血清、血漿、淋巴、牛奶、小便、糞便、眼內(nèi)液、唾液、精液、腦提取物、脊髓液(scf)、闌尾、脾臟及扁桃組織提取物、羊水、腹水及非-生物學(xué)樣品(例如，食品、水及土壤)。并且，樣品包含從生物學(xué)供給源絕緣的自然核酸分子及合成核酸分子。

信號(hào)包括在信號(hào)檢測(cè)中的多種信號(hào)特征，例如信號(hào)強(qiáng)度(例如，rfu(相對(duì)熒光單位)值或進(jìn)行擴(kuò)增的情況下，特定循環(huán)、被選擇的循環(huán)或在端點(diǎn)中的rfu值)、信號(hào)變化形狀(或圖案)或ct值或?qū)ι鲜鎏卣鬟M(jìn)行數(shù)學(xué)處理來獲得的值。

根據(jù)一實(shí)例，與基準(zhǔn)值或樣品分析相關(guān)的術(shù)語“信號(hào)”不僅包含在檢測(cè)溫度下獲得的信號(hào)本身，而且包含通過對(duì)上述信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來提供的變形的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)獲得擴(kuò)增曲線的情況下，為了在各個(gè)檢測(cè)溫度下分辨信號(hào)值(或特征)及檢測(cè)靶核酸序列而可選擇并使用從擴(kuò)增曲線的多種信號(hào)值(或特征)(強(qiáng)度、ct值或擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù))。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可在伴隨核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過程中進(jìn)行步驟步驟(a)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，以無核酸擴(kuò)增的方式，在信號(hào)擴(kuò)增過程中進(jìn)行步驟(a)。

在本發(fā)明中，由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)可與靶擴(kuò)增一同進(jìn)行擴(kuò)增。可選地，在無靶擴(kuò)增的情況下，信號(hào)可被擴(kuò)增。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，信號(hào)產(chǎn)生與靶擴(kuò)增一同在包含信號(hào)擴(kuò)增的過程中實(shí)施。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)施靶擴(kuò)增。為了靶擴(kuò)增，在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中廣泛利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括靶序列的變性、靶序列和引物之間的退火(雜交)及引物延伸的循環(huán)(mullisetal.美國專利第4683195號(hào)、第4683202號(hào)及第4800159號(hào)；saikietal.,(1985)science230,1350-1354)?？赏ㄟ^在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的過程中適用上述的信號(hào)產(chǎn)生方法(例如，taqman方法及基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法)來擴(kuò)增信號(hào)。根據(jù)一實(shí)例，本發(fā)明通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法提供信號(hào)。根據(jù)一實(shí)例，靶核酸序列的擴(kuò)增通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr，參照wiedmannm,etal.,“l(fā)igasechainreaction(lcr)-overviewandapplications.”聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)methodsandapplications1994feb；3(4):s51-64)、缺口填補(bǔ)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(glcr，參照wo第90/01069號(hào)、ep第439182號(hào)及wo第93/00447號(hào))、q-β復(fù)制酶擴(kuò)增(q-beta，cahillp,etal.,clinchem.,37(9):1482-5(1991)，美國專利第5556751號(hào))、鏈置換擴(kuò)增(sda，參照gtwalkeretal.,nucleicacidsres.20(7):16911696(1992)，ep第497272號(hào))、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba，compton,j.nature350(6313):912(1991))，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma，參照hofmannwpetal.,jclinvirol.32(4):289-93(2005)；美國專利第5888779號(hào))或滾環(huán)擴(kuò)增(rca，參照hutchisonc.a.etal.,proc.natlacad.sci.usa.102:1733217336(2005))實(shí)施。

上述記載的擴(kuò)增方法可通過改變溫度或者重復(fù)未改變溫度的一系列反應(yīng)來擴(kuò)增靶序列。以“循環(huán)”表示包括重復(fù)一系列反應(yīng)的擴(kuò)增的單位。根據(jù)擴(kuò)增方法能夠以重復(fù)次數(shù)或時(shí)間表示循環(huán)的單位。

例如，可在擴(kuò)增的各循環(huán)、選擇的多個(gè)循環(huán)或反應(yīng)的端點(diǎn)中進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。根據(jù)一實(shí)例，在至少2個(gè)循環(huán)中檢測(cè)出信號(hào)的情況下，可在所有檢測(cè)溫度下或者在被選擇的一部分的檢測(cè)溫度下實(shí)施各個(gè)循環(huán)中的信號(hào)檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在奇數(shù)的循環(huán)中，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下進(jìn)行檢測(cè)，在偶數(shù)的循環(huán)中，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在不僅可產(chǎn)生基于信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)，而且可實(shí)現(xiàn)靶擴(kuò)增的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

借助包含用于擴(kuò)增的引物組及核酸聚合酶的靶擴(kuò)增機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)靶核酸序列的擴(kuò)增。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可使用具有核酸酶活性(例如，5’核酸酶活性或3’核酸酶活性)的核酸聚合酶。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可使用不具有核酸酶活性的核酸聚合酶。

本發(fā)明中，有用的核酸聚合酶為從各種細(xì)菌種得到的熱穩(wěn)定性脫氧核糖核酸聚合酶，上述脫氧核糖核酸聚合酶包含棲熱水生菌(thermusaquaticus(taq))、極端嗜熱菌(thermusthermophilus(tth))、絲狀棲熱菌(thermusfiliformis)、黃棲熱菌(thermisflavus)、超好熱性古細(xì)菌(thermocusliteralis)、典型嗜熱菌(thermusantranikianii)、卡德菲勒斯嗜熱菌(thermuscaldophilus)、切拉羅菲勒斯嗜熱菌(thermuschliarophilus)、黃棲熱菌(thermusflavus)、火地棲熱菌(thermusigniterrae)、嗜齒菌(thermuslacteus)、死亡嗜熱菌(thermusoshimai)、紅棲熱菌(thermusruber)、魯本斯棲熱菌(thermusrubens)、水生棲熱菌(thermusscotoductus)、西凡納斯熱袍(thermussilvanus)、棲熱菌種z05(thermusspeciesz05)、棲熱菌種sps17(thermusspeciessps17)、嗜熱菌(thermusthermophilus)、海棲熱袍菌(thermotogamaritima)、那不勒斯棲熱袍菌(thermotoganeapolitana)、非洲棲熱腔菌(thermosiphoafricanus)、嗜熱球菌(thermococuslitoralis)、巴羅西熱袍菌(thermococusbarossi)、嗜熱古細(xì)菌(thermococusgorgonarius)、海棲熱袍菌(thermotogamaritima)、那不勒斯棲熱袍菌(thermotoganeapolitana)、非洲棲熱腔菌(thermosiphoafricanus)、沃氏熱球菌(pyrococuswoesei)、掘越氏熱球菌(pyrococushorikoshii)、深海熱球菌(pyrococusabyssi)、隱蔽熱網(wǎng)菌(pyrodictiumocultum)、嗜火產(chǎn)液菌(aquifexpyrophilus)以及菌屬超嗜熱菌(aquifexaeolieus)。尤其，熱穩(wěn)定性脫氧核糖核酸聚合酶為taq聚合酶。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，通過非對(duì)稱性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)靶核酸序列的擴(kuò)增?？赏ㄟ^考慮下游寡核苷酸的切割或雜交來選擇引物的比率。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在無核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增工序中進(jìn)行步驟(a)和/或步驟(b)。

在通過包括寡核苷酸的切割的方法產(chǎn)生信號(hào)的情況下，信號(hào)能夠以無靶擴(kuò)增的方式被擴(kuò)增。例如，可通過cpt方法(duckp,etal.,biotechniques,9:142-148(1990))，侵入物分析(美國專利第6358691號(hào)及第6194149號(hào))，基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法(例如，探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交方法、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交方法及探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性切割方法)或cer方法(wo第2011/037306號(hào))將步驟(a)實(shí)施為無靶序列的擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增。

上述的信號(hào)擴(kuò)增方法可通過改變溫度或者重復(fù)未改變溫度的一系列反應(yīng)來擴(kuò)增靶序列。以“循環(huán)”表示包括重復(fù)一系列反應(yīng)的信號(hào)擴(kuò)增的單位。根據(jù)擴(kuò)增方法能夠以重復(fù)次數(shù)或時(shí)間表示循環(huán)的單位。

例如，可在擴(kuò)增的各循環(huán)、選擇的多個(gè)循環(huán)或反應(yīng)的端點(diǎn)中進(jìn)行信號(hào)的產(chǎn)生及檢測(cè)。

在與提供信號(hào)的2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同進(jìn)行培養(yǎng)(反應(yīng))樣品期間或之后，可通過使用如單一類型的檢測(cè)器等檢測(cè)器來檢測(cè)信號(hào)。

可通過使用考慮用于檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列的檢測(cè)溫度的任意類型的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)來實(shí)施本發(fā)明。當(dāng)存在靶核酸序列時(shí)，能夠以均在2個(gè)檢測(cè)溫度下或僅在2個(gè)檢測(cè)溫度中的一個(gè)檢測(cè)溫度下提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。在以僅在2個(gè)檢測(cè)溫度中的一個(gè)檢測(cè)溫度下提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的情況下，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在更低的溫度下提供信號(hào)為有利。

根據(jù)一實(shí)例，借助可在所有檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列中的各個(gè)靶核酸序列。

根據(jù)一實(shí)例，借助可在一個(gè)檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列中的第一靶核酸序列，借助可在2個(gè)檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列中的第二靶核酸序列。

根據(jù)一實(shí)例，考慮可由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的溫度范圍來預(yù)先確定檢測(cè)溫度。

在本發(fā)明中，利用存在能夠以依賴于信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的方式產(chǎn)生信號(hào)的特定溫度范圍。

例如，當(dāng)2個(gè)核酸分子之間進(jìn)行雜交(或結(jié)合)時(shí)，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)，當(dāng)它們之間進(jìn)行非-雜交(或解離)時(shí)，在不產(chǎn)生信號(hào)的情況下，雖然在可實(shí)現(xiàn)2個(gè)核酸分子之間的雜交的溫度下產(chǎn)生信號(hào)，但在2個(gè)核酸分子之間無法進(jìn)行雜交的溫度下不產(chǎn)生信號(hào)。如上所述，存在可產(chǎn)生信號(hào)(即，信號(hào)檢測(cè))的特定溫度范圍及不能夠產(chǎn)生信號(hào)的其他溫度范圍。上述溫度范圍受在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所使用的2個(gè)核酸分子的雜交物的tm值的影響。

在利用使用切割后具有標(biāo)志的被切割的片段的信號(hào)產(chǎn)生方法的情況下，在理論上，可在任何溫度(例如，30～99℃)下檢測(cè)信號(hào)。

檢測(cè)溫度選自可由信號(hào)發(fā)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的溫度范圍。

根據(jù)一實(shí)例，用于檢測(cè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可以為在2個(gè)檢測(cè)溫度下提供互不相同的信號(hào)(例如，信號(hào)強(qiáng)度)或不同信號(hào)變化圖案(例如，信號(hào)強(qiáng)度的變化程度)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，在利用以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)(例如，taqman探針方法)情況下，在基于檢測(cè)寡核苷酸和靶核酸序列的雜交的信號(hào)產(chǎn)生和/或來自染料的信號(hào)產(chǎn)生可受溫度的影響的方面上，來自信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)可隨著檢測(cè)溫度而不同。例如，利用熒光報(bào)道分子及猝滅分子標(biāo)志的探針可根據(jù)檢測(cè)溫度產(chǎn)生不同的信號(hào)，與相對(duì)較高檢測(cè)溫度相比，可在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生更高的信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，先制造與2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)后，再設(shè)定與2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的檢測(cè)溫度之后，進(jìn)行步驟(a)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，基于二聚體的tm值選擇檢測(cè)溫度。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，可通過調(diào)節(jié)二聚體的tm值來控制檢測(cè)溫度。

例如，在基于與靶核酸序列特異性雜交的檢測(cè)寡核苷酸(例如，lux探針、分子信標(biāo)探針、hybecon探針及相鄰的雜交探針)產(chǎn)生信號(hào)的情況下，通過調(diào)節(jié)寡核苷酸的二聚體的tm值，來在預(yù)先確定的溫度下成功地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。在使用蝎形引物的情況下，通過調(diào)節(jié)與延伸鏈雜交的部位的tm值，來在預(yù)先確定的溫度下成功地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。

在基于根據(jù)靶核酸序列的存在形成的二聚體來產(chǎn)生信號(hào)的情況下，通過調(diào)節(jié)二聚體的tm值，來在預(yù)先確定的溫度下成功地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。例如，在通過探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法產(chǎn)生信號(hào)的情況下，在捕捉和模板化寡核苷酸上通過調(diào)節(jié)通過探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸片段的延伸形成的延伸二聚體的tm值，來在預(yù)先確定的溫度下成功地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。

基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法具有可容易調(diào)節(jié)二聚體及通過上述二聚體對(duì)雜交起到影響的第三雜化體的tm值的優(yōu)點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，任意選擇檢測(cè)溫度。即，可選擇可檢測(cè)出借助檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生的信號(hào)的任一溫度。如上所述，在以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，可在多種溫度下檢測(cè)借助上述切割釋放的標(biāo)志。

能夠以均在2個(gè)檢測(cè)溫度下均提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)與2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。根據(jù)一實(shí)例，可選擇taqman探針方法、基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法或它們的組合作為在2個(gè)檢測(cè)溫度下均提供信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

可選地，能夠以均在2個(gè)檢測(cè)溫度下提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)與2個(gè)靶核酸序列中的一個(gè)有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，能夠以在一個(gè)檢測(cè)溫度下(尤其，在相對(duì)更低的溫度下)提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)與其他靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。根據(jù)一實(shí)例，以能夠均在2個(gè)檢測(cè)溫度下提供信號(hào)的方式選擇taqman探針方法、基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法，以能夠在一個(gè)檢測(cè)溫度下提供信號(hào)的方式選擇基于探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法。

在本發(fā)明中所使用的檢測(cè)器包括可檢測(cè)信號(hào)的任何機(jī)構(gòu)。例如，在使用熒光信號(hào)的情況下，可將適合于檢測(cè)熒光信號(hào)的光電二極管作為檢測(cè)器來使用。使用單一類型的檢測(cè)器的檢測(cè)意味著可檢測(cè)單一類型的信號(hào)的檢測(cè)器或者使用具有多個(gè)通道(即，光電二極管)的檢測(cè)器的各個(gè)通道(即，光電二極管)來進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)一實(shí)例，信號(hào)的產(chǎn)生包括從標(biāo)志“產(chǎn)生或消滅信號(hào)”以及“信號(hào)增加或減少”。

步驟(b)：包括表示感興趣的信號(hào)的變數(shù)的方程式的建立

提供包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)2個(gè)靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述2個(gè)方程式:

(i)：st1d1+st2d1＝sd1

(ii)：st1d2+st2d2＝sd2

在上述式中，(sd1)為在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)，(sd2)為在第二檢測(cè)溫度檢測(cè)的信號(hào)；(st1d1)為表示在第一檢測(cè)溫度下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st2d1)為表示在第一檢測(cè)溫度下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st1d2)為表示在第二檢測(cè)溫度下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st2d2)為表示在第二檢測(cè)溫度下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)；變數(shù)的總數(shù)為4個(gè)。

作為在第一檢測(cè)溫度(d1)下檢測(cè)出的信號(hào)的(sd1)由作為在第一檢測(cè)溫度(d1)下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的(st1d1)及作為在第一檢測(cè)溫度(d1)下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的(st2d1)組成。作為在第一檢測(cè)溫度(d2)下檢測(cè)出的信號(hào)的(sd2)由作為在第二檢測(cè)溫度(d2)下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的(st1d2)及作為在第一檢測(cè)溫度(d2)下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的(st2d2)組成。

(sd1)及(sd2)可為由檢測(cè)器測(cè)定的信號(hào)，即，可為常數(shù)值。(st1d1)，(st2d1)，(st1d2)及(st2d2)為將所獲得的未知變數(shù)。本發(fā)明涉及使用所測(cè)定的信號(hào)(sd1)及(sd2)來得到對(duì)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st1d2)及(st2d2)中的至少一個(gè)的解答的方法。

步驟(c)：附加方程式的建立

之后，提供分別包括選自由上述4個(gè)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st1d2)及(st1d2)組成的組中的至少一個(gè)變數(shù)的2個(gè)附加方程式。

建立2個(gè)方程式(i)及(ii)后，再建立2個(gè)附加方程式，由此，為了通過數(shù)學(xué)處理來得到對(duì)方程式(i)及(ii)中的變數(shù)中的至少一個(gè)(尤其，變數(shù)中的至少2個(gè)，更尤其，所有變數(shù))的解答，而提供共4個(gè)方程式。

例如，在使上述2個(gè)附加方程式具有與方程式(i)及(ii)相同的變數(shù)組的情況下(即，方程式(i)及(ii)轉(zhuǎn)換為聯(lián)立方程式)，可通過解上述聯(lián)立方程式(尤其，具有2個(gè)變數(shù)的線性聯(lián)立方程式)來得到對(duì)方程式(i)及(ii)中的變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。可選地，可通過與解上述聯(lián)立方程式的方法不同的方式來得到對(duì)方程式(i)及(ii)中的變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

根據(jù)一實(shí)例，上述2個(gè)附加方程式選自由下述方程式組成的組中：

(iii)：f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)，

(iv)：f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)，以及

(v)：st1d2＝任意選擇值

在上述式中，rvt1(d1d2)為表示在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)變化關(guān)系(relationshipofchange)的第一靶核酸序列(t1)的基準(zhǔn)值(rv)，rvt2(d1d2)為表示在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)變化關(guān)系的第二靶核酸序列(t2)的基準(zhǔn)值(rv)；f(st1d1，st1d2)表示st1d1及st1d2的函數(shù)；f(st2d1，st2d2)表示st2d1及st2d2的函數(shù)；

當(dāng)存在第一靶核酸序列時(shí)，也以使第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，可選擇方程式(v)中的st1d2＝任意選擇值。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在選擇方程式(v)的情況下，不選擇方程式(iii)作為附加方程。

前述的實(shí)例說明用于得到對(duì)方程式(i)及(ii)中的變數(shù)中的至少一個(gè)的解答的2個(gè)接近法。

第一接近法為使用方程式(iii)及(iv)作為2個(gè)附加方程式。

有趣的是，本發(fā)明人確認(rèn)，在一個(gè)反應(yīng)容器中，在表示預(yù)先確定靶核酸序列的存在的2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的情況下，以特定關(guān)系(圖案或者規(guī)則)存在信號(hào)變化。例如，針對(duì)靶核酸序列，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的信號(hào)變化呈特定關(guān)系(圖案或者規(guī)則)。例如，上述信號(hào)的強(qiáng)度可相同或?qū)嵸|(zhì)上相同，或者上述信號(hào)的強(qiáng)度雖然互不相同，但在2個(gè)檢測(cè)溫度下，可在特定范圍內(nèi)。

在本發(fā)明中，將上述發(fā)現(xiàn)適用于獲得基準(zhǔn)值并分辨與靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)的過程中。僅以使檢測(cè)溫度不同的方式檢測(cè)與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)(例如，無靶含量的變化或者無緩沖液條件的變化)，因此在2個(gè)檢測(cè)溫度之間的信號(hào)變化中存在特定關(guān)系(圖案或者規(guī)則)。根據(jù)一實(shí)例，在允許在2個(gè)檢測(cè)溫度之間的與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)變化的特定關(guān)系(圖案或者規(guī)則)的條件下實(shí)施本發(fā)明的方法。

靶核酸序列的“基準(zhǔn)值(rv)”表示在2個(gè)檢測(cè)溫度下借助用于檢測(cè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)變化的關(guān)系。

根據(jù)一實(shí)例，在使用rv值的情況下，在一個(gè)檢測(cè)溫度下的信號(hào)可表現(xiàn)在其他檢測(cè)溫度下的信號(hào)的方面。

在方程式(iii)及(iv)中，作為基準(zhǔn)值，rvt1(d1d2)及rvt2(d1d2)為預(yù)先確定的值。根據(jù)一實(shí)例，可通過使用與靶核酸序列相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來獲得基準(zhǔn)值。例如，與相應(yīng)的信號(hào)查收能你機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)與靶核酸序列相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后，在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)后，獲得在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化關(guān)系。信號(hào)變化關(guān)系可表示為在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異。

通過對(duì)在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下借助信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來獲得基準(zhǔn)值。這種數(shù)學(xué)處理為信號(hào)的函數(shù)。只要是為了獲得基準(zhǔn)值而使用的函數(shù)提供在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下借助信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)變化關(guān)系，上述函數(shù)包括任何函數(shù)。例如，函數(shù)可解析為信號(hào)的加法、乘法、減法及除法等數(shù)學(xué)處理。

在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下提供的信號(hào)的特征本身可使用于獲得在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化關(guān)系的過程中?？蛇x地，可通過對(duì)上述信號(hào)的特征進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來使在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)變形，并將上述信號(hào)特征使用于獲得在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化關(guān)系的過程中。

可選地，可使初期所獲得的基準(zhǔn)值變形，可作為基準(zhǔn)值來使用。

根據(jù)一實(shí)例，與基準(zhǔn)值相關(guān)的術(shù)語“信號(hào)”不僅包含在檢測(cè)溫度下獲得的信號(hào)本身，還包含通過對(duì)信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來提供的變形的信號(hào)。

如上所述，作為基準(zhǔn)值，rvt1(d1d2)及rvt2(d1d2)為預(yù)先確定的值，因此，rvt1(d1d2)及rvt2(d1d2)可起到(i)用于將方程式(i)及(ii)中的2個(gè)變數(shù)(st1d1)及(st1d2)轉(zhuǎn)換為選自上述2個(gè)變數(shù)中的一個(gè)變數(shù)的轉(zhuǎn)換子及(ii)用于將方程式(i)及(ii)中的2個(gè)變數(shù)(st2d1)及(st2d2)轉(zhuǎn)換為選自上述2個(gè)變數(shù)中的一個(gè)變數(shù)的轉(zhuǎn)換子作用。

根據(jù)一實(shí)例，方程式(iii)使用于將方程式(i)及(ii)中的2個(gè)變數(shù)(st1d1)及(st1d2)轉(zhuǎn)換為選自上述2個(gè)變數(shù)中的一個(gè)變數(shù)的過程中，方程式(iv)使用于將方程式(i)及(ii)中的2個(gè)變數(shù)(st2d1)及(st2d2)轉(zhuǎn)換為選自上述2個(gè)變數(shù)中的一個(gè)變數(shù)的過程中。

根據(jù)一實(shí)例，上述2個(gè)附加方程式中的一個(gè)選自方程式(iii)中，另一個(gè)選自方程式(iv)中。

能夠以多種方式獲得在本發(fā)明中所用的基準(zhǔn)值。例如，可將預(yù)測(cè)值作為基準(zhǔn)值來提供?？紤]靶序列、信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及檢測(cè)溫度，可預(yù)測(cè)表示在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化關(guān)系的基準(zhǔn)值?？蛇x地，可通過實(shí)施用于獲得基準(zhǔn)值的實(shí)驗(yàn)來將實(shí)驗(yàn)性值或?qū)嶋H性值作為基準(zhǔn)值來提供。

根據(jù)一實(shí)例，(i)通過如下步驟獲得rvt1(d1d2)：步驟(i-1)，與用于檢測(cè)第一靶核酸序列的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)第一靶核酸序列；步驟(i-2)，在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；步驟(i-3)，獲得在上述第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在上述第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異，(ii)通過如下步驟獲得rvt2(d1d2)：步驟(ii-1)，與用于檢測(cè)第二靶核酸序列的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)第二靶核酸序列；步驟(ii-2)，在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；步驟(ii-3)，獲得在上述第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在上述第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異，上述rvt1(d1d2)與rvt2(d1d2)不同。

在獲得基準(zhǔn)值中，術(shù)語“在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異”為在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化關(guān)系的一實(shí)例。

根據(jù)一實(shí)例，在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異包含對(duì)在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來獲得的差異。

根據(jù)一實(shí)例，在進(jìn)行數(shù)學(xué)處理的情況下，信號(hào)的特征為應(yīng)易于數(shù)學(xué)處理。在特定實(shí)例中，數(shù)學(xué)處理包括使用信號(hào)的計(jì)算(例如，加法、乘法、減法及除法)或者獲得來源于信號(hào)的其他值的數(shù)學(xué)處理。

在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)之間的差異可表現(xiàn)在多種方面。例如，可通過具有數(shù)值、信號(hào)的存在/不存在或信號(hào)特征的繪制表示上述差異。

可通過多種計(jì)算方法及它們的變形來進(jìn)行用于獲得差異的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理。

尤其，可通過計(jì)算在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)之間的比率來進(jìn)行用于獲得差異的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理。

例如，可將在第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的端點(diǎn)(end-point)對(duì)在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的端點(diǎn)強(qiáng)度的比率作為基準(zhǔn)值來使用。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，用于獲得信號(hào)之間的差異的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理相當(dāng)于計(jì)算在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，用于獲得信號(hào)之間的差異的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理相當(dāng)于計(jì)算在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率。

根據(jù)一實(shí)例，可通過計(jì)算在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的減法來獲得基準(zhǔn)值。

可利用多種方式進(jìn)行用于獲得差異的數(shù)學(xué)處理。可通過使用機(jī)器來進(jìn)行數(shù)學(xué)處理。例如，可借助檢測(cè)器或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置內(nèi)的處理器以數(shù)學(xué)方式處理信號(hào)。可選地，尤其，可根據(jù)預(yù)選確定的算法以手寫、數(shù)學(xué)方式處理信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，rvt1(d1d2)與rvt2(d1d2)不同。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，以使rvt1(d1d2)與rvt2(d1d2)不同的方式設(shè)計(jì)第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

在rv值互不相同的情況下，記述差異程度的定量性表述可隨著計(jì)算rv值的接近法而不同。

根據(jù)一實(shí)例，根據(jù)共同的計(jì)算方法處理用于獲得基準(zhǔn)值的信號(hào)來可提供用于比較的基準(zhǔn)值之后，使用用于比較的上述基準(zhǔn)值，來可獲得2個(gè)基準(zhǔn)值之間的差異程度。根據(jù)一實(shí)例，共同計(jì)算方法為2個(gè)信號(hào)的除法。

例如，為了通過本發(fā)明的方法來獲得在分析信號(hào)中所使用的基準(zhǔn)值而根據(jù)減法對(duì)2個(gè)信號(hào)進(jìn)行處理的情況下，為了獲取用于比較的基準(zhǔn)值而可根據(jù)除法對(duì)上述2個(gè)信號(hào)進(jìn)行處理。

根據(jù)一實(shí)例、rvt1(d1d2)比rvt2(d1d2)至少還大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍?？蛇x地，rvt2(d1d2)比rvt1(d1d2)至少還大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。

根據(jù)一實(shí)例，在為了確定第一基準(zhǔn)值是否與第二基準(zhǔn)值相同而進(jìn)行比較的情況下，根據(jù)除法計(jì)算上述基準(zhǔn)值。根據(jù)一實(shí)例，用于確定第一基準(zhǔn)值是否與第二基準(zhǔn)值相同的基準(zhǔn)值的計(jì)算方法可與用于檢測(cè)靶核酸序列的基準(zhǔn)值的計(jì)算方法相同或不同。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，用于基準(zhǔn)值的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可與用于檢測(cè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)相同。

根據(jù)一實(shí)例，用于獲得基準(zhǔn)值的培養(yǎng)條件與用于分析樣品的培養(yǎng)條件相同。

針對(duì)靶核酸序列，可在包括成分(例如，靶核酸序列、信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)、酶或三磷酸脫氧核苷酸(dntp))的量、緩沖液ph或反應(yīng)時(shí)間的多種反應(yīng)條件下獲得基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可在反應(yīng)結(jié)束時(shí)提供飽和信號(hào)，因此可在充分的反應(yīng)條件下獲得基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在計(jì)算基準(zhǔn)值獲得的信號(hào)之間的差異具有特定范圍，在上述特定范圍內(nèi)或者參照上述特定范圍來選擇基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可選擇上述特定范圍的最大值或最小值作為基準(zhǔn)值或者參照上述特定范圍的最大值或最小值來選擇基準(zhǔn)值。尤其，考慮到在多種條件下獲得的上述基準(zhǔn)值的標(biāo)準(zhǔn)變化、允許誤差范圍、特異度或敏感度，可使基準(zhǔn)值變形。

在“f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)或f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)”中，可通過用于計(jì)算rvt1(d1d2)或rvt2(d1d2)的數(shù)學(xué)表達(dá)來解析f(st1d1，st1d2)或f(st2d1，st2d2)。

根據(jù)一實(shí)例，f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)包括st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2(vi)或st1d2/st1d1＝rvt1d2/d1(vii)；f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)包括st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2(viii)或st2d2/st2d1＝rvt2d2/d1(ix)。

在使用在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下的信號(hào)之間的比率來獲得rv的情況下，可通過用于計(jì)算信號(hào)之間的比率的數(shù)學(xué)表達(dá)來解析f(st1d1，st1d2)或f(st2d1，st2d2)。在術(shù)語“rvt1(d1d2)”中，t1(d1d2)表示計(jì)算出的rv相應(yīng)于與通過計(jì)算在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下的信號(hào)之間的差異來獲得的第一靶核酸序列(t1)有關(guān)的基準(zhǔn)值。當(dāng)確定計(jì)算rv的方法時(shí)，可考慮上述計(jì)算方法來具體表達(dá)術(shù)語“t1(d1d2)”。

例如，術(shù)語“rvt1d1/d2”是指與通過計(jì)算在第一檢測(cè)溫度(d1)下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)在第二檢測(cè)溫度(d2)下檢測(cè)出的信號(hào)的比率來獲得的第一靶核酸序列(t1)有關(guān)的基準(zhǔn)值?？蛇x地，術(shù)語“rvt1d2/d1”是指與通過計(jì)算在第二檢測(cè)溫度(d2)下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)在第一檢測(cè)溫度(d1)下檢測(cè)出的信號(hào)的比率來獲得的第一靶核酸序列(t1)有關(guān)的基準(zhǔn)值。

根據(jù)一實(shí)例，通過如下步驟獲得rvt1d1/d2：步驟(i-1)，與用于檢測(cè)第一靶核酸序列的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)第一靶核酸序列；步驟(i-2)，在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；步驟(i-3)，之后，計(jì)算在上述第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)在上述第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率，在進(jìn)行步驟(i-1)及(i-2)之后，通過計(jì)算在上述第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)在上述第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率來獲得rvt1d2/d1，通過如下步驟獲得rvt2d1/d2：步驟(ii-1)，與用于檢測(cè)第二靶核酸序列的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)第二靶核酸序列；步驟(ii-2)，在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；步驟(ii-3)，之后，計(jì)算在上述第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)在上述第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率，在進(jìn)行步驟(ii-1)及(ii-2)之后，通過計(jì)算在上述第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)在上述第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率來獲得rvt2d2/d1。

根據(jù)一實(shí)例，用于獲得(st1d1)、(st1d2)、(st2d1)及(st2d2)的2個(gè)附加方程式包括下述方程式(vi)及(vii)中的一個(gè)及下述方程式(viii)及(ix)中的一個(gè)：

(vi)：st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

(vii)：st1d2/st1d1＝rvt1d2/d1

(viii)：st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

(ix)：st2d2/st2d1＝rvt2d2/d1。

根據(jù)一實(shí)例，在所選擇的2個(gè)檢測(cè)溫度下，可提供用于計(jì)算與特定靶核酸序列有關(guān)的rv的多個(gè)方程式(例如，在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下與第一靶核酸序列(t1)有關(guān)的方程式(vi)及(vii))。根據(jù)一實(shí)例，在此情況下，僅選擇多個(gè)方程式中的一個(gè)方程式作為附加方程式中的一個(gè)。

方程式(iii)及(iv)與式(i)及(ii)一同使用于得到對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答的過程中。如實(shí)施例1及圖1a-1d所例示，在f(st1d1，st1d2)為st1d1/st1d2且f(st2d1，st2d2)為st2d1/st2d2的情況下，用于得到對(duì)變數(shù)的解答的方程式組包括如下：

st1d1+st2d1＝sd1

st1d2+st2d2＝sd2

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

rvt1d1/d2及rvt2d1/d2為通過實(shí)驗(yàn)來預(yù)先確定的值，因此，可通過上述4個(gè)方程式來得到變數(shù)、(st1d1)、(st2d1)、(st1d2)及(st1d2)的解答。

可選地，可通過計(jì)算在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在第二檢測(cè)溫度檢測(cè)出的信號(hào)之間的減法來獲得基準(zhǔn)值。

在用于得到對(duì)方程式(i)及(ii)中的變數(shù)中的至少一個(gè)的解答的第二接近法中，作為2個(gè)附加方程式，使用方程式[(iii)及(v)]或[(iv)及(v)]。當(dāng)存在第一靶核酸序列時(shí)，也以使第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，可選擇方程式(v)中的st1d2＝任意選擇值。

在適用方程式(v)的情況下，可將任意選擇值作為st1d2來使用。根據(jù)一實(shí)例，在將零(0)作為st1d2來使用(st1d2＝0)的情況下，便于本發(fā)明的實(shí)施方式?？蛇x地，可將負(fù)常數(shù)或正常數(shù)作為st1d2來使用(st1d2＝負(fù)常數(shù)或正常數(shù))。

對(duì)除(st1d2)之外的變數(shù)的解答的數(shù)值可隨著在方程式(v)中所使用的常數(shù)值而不同。但是，可注意到對(duì)變數(shù)的解答的數(shù)值具有使用作為st1d2來選擇的常數(shù)的數(shù)值計(jì)算的值?？蛇x地，用于解變數(shù)的這種接近法可表示為對(duì)除(st1d2)之外的變數(shù)的解答的數(shù)值為通過使用作為為了提取信號(hào)而使用的st1d2的值被選擇的常數(shù)來獲得的結(jié)果。

因此，在任意常數(shù)適用于方程式(v)的情況下，也可在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)與各個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)進(jìn)行分辨，相反，計(jì)算出的變數(shù)隨著上述常數(shù)而不同。

尤其，為了獲得數(shù)據(jù)集而在多個(gè)循環(huán)檢測(cè)信號(hào)，在各個(gè)循環(huán)進(jìn)行信號(hào)分辨后，在將信號(hào)分辨結(jié)果對(duì)所有循環(huán)進(jìn)行繪制的情況下，絕對(duì)信號(hào)值可隨著方程式(v)中常數(shù)發(fā)生改變。但是，在所有循環(huán)中，產(chǎn)生或不產(chǎn)生信號(hào)變化(例如，信號(hào)變化圖案)的情況不發(fā)生改變，由此，可成功實(shí)現(xiàn)用于靶檢測(cè)的信號(hào)分辨。

根據(jù)一實(shí)例，能夠以所定義的方式使對(duì)通過使用方程式(v)來計(jì)算出的變數(shù)的解答數(shù)學(xué)變形。但在變形過程中，能夠以具有通過使用其他常數(shù)(例如，st1d2＝0)計(jì)算出的值的方式使對(duì)變數(shù)的解答變形。

當(dāng)確定感興趣的靶核酸序列的存在或不存在時(shí)，不考慮為了得到對(duì)變數(shù)的解答而使用的方程式(v)中的常數(shù)的數(shù)值。

在通過對(duì)將方程式(v)作為附加方程式來使用而計(jì)算出的變數(shù)的解答來確定感興趣的靶核酸序列的存在或不存在的情況下，可使用(i)對(duì)計(jì)算出的變數(shù)的解答本身或(ii)以所定義的方式數(shù)學(xué)變形的解答。并且，可考慮到方程式(v)中的常數(shù)的數(shù)值來建立用于計(jì)算出的解答或它們的數(shù)學(xué)變形的顯著性的閾值，由此，最終確定感興趣的靶核酸序列的存在或不存在。

根據(jù)一實(shí)例，在選擇方程式(v)的情況下，不選擇方程式(iii)，而選擇方程式(iv)。

本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可理解，在說明書及發(fā)明要求保護(hù)范圍下對(duì)第二接近法的說明包括選擇st1d1＝任意選擇值、st2d1＝任意選擇值或st2d2＝任意選擇值的實(shí)例。例如，當(dāng)存在第二靶核酸序列時(shí)，也以使第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，可選擇st2d2＝任意選擇值。在選擇方程式st2d2＝任意選擇值的情況下，不選擇方程式(iv)，而選擇方程式(iii)。但是，可要求多種實(shí)例，避免因重復(fù)說明而導(dǎo)致的不必要的說明書的復(fù)雜性并可包含在一實(shí)例(st1d2＝任意選擇值)的說明中。

術(shù)語“不產(chǎn)生信號(hào)”不僅包括“信號(hào)的不產(chǎn)生”，還包括背景信號(hào)等“無顯著性的信號(hào)產(chǎn)生”。

尤其，在為了獲得數(shù)據(jù)集而在多個(gè)循環(huán)檢測(cè)信號(hào)的情況下，術(shù)語“不產(chǎn)生信號(hào)”是指在循環(huán)之間無信號(hào)變化或無顯著性信號(hào)變化。

對(duì)為了獲得數(shù)據(jù)集而在多個(gè)循環(huán)檢測(cè)信號(hào)的情況沒有限制，可包括借助實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等擴(kuò)增反應(yīng)獲得信號(hào)擴(kuò)增曲線的情況。

根據(jù)一實(shí)例，用于獲得(st1d1)、(st1d2)、(st2d1)及(st2d2)的上述2個(gè)附加方程式包括下述方程式(viii)及(ix)中的一個(gè)及(ix)及下述方程式(v)：

(viii)：st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

(ix)：st2d2/st2d1＝rvt2d2/d1

(v)：st1d2＝任意選擇值。

如實(shí)施例2及圖2c-2d所例示，當(dāng)存在第一靶核酸序列時(shí)，也以使第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，對(duì)了得到對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答而可選擇f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)(iv)作為方程式(v)中的st1d2＝0及附加方程式。在f(st2d1，st2d2)為st2d1/st2d2的情況下，用于得到對(duì)變數(shù)的解答的方程式組包括如下：

st1d1+st2d1＝sd1

st1d2+st2d2＝sd2

st1d2＝0

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

rvt2d1/d2為預(yù)先確定的常數(shù)值，因此，可通過上述4個(gè)方程式來得到對(duì)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)及(st1d2)的解答。

將方程式(iii)及(iv)作為2個(gè)附加方程式來使用的第一接近法的特定實(shí)例，當(dāng)存在第一靶核酸序列時(shí)，也以使第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，可選擇rvt1(d1d2)作為任意選擇值。

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)存在第一靶核酸序列時(shí)，也以使第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，rvt1(d1d2)為任意選擇值。

如上所述，在第一靶核酸序列(t1)在第二檢測(cè)溫度(d2)下不產(chǎn)生信號(hào)的情況下，可將任意選擇值作為st1d2來使用，由此，rvt1(d1d2)可成為任意選擇值。

尤其，以使st1d2的解答(值)稱為在方程式中任何值或上述值左右(例如，“0”或“0”左右)，可選擇任意選擇值作為rvt1(d1d2)。

與“任何值或上述值左右”相關(guān)的術(shù)語“上述值左右”是指考慮為任何值的顯著水平內(nèi)的任意數(shù)。

尤其，在通過用于計(jì)算在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下的信號(hào)之間的比率的數(shù)學(xué)表達(dá)來解析f(st1d1，st1d2)的情況下，可選擇rvt1(d1d2)作為任意選擇值。

實(shí)際上，當(dāng)存在第一靶核酸序列時(shí)，也以使第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，通常產(chǎn)生具有非常弱的強(qiáng)度的信號(hào)(例如，背景信號(hào))。尤其，作為rvt1(d1d2)的任意選擇值可與利用實(shí)際上獲得的信號(hào)值來計(jì)算出的rvt1(d1d2)相同，或者可小于上述rvt1(d1d2)，或者可大于上述rvt1(d1d2)。

本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可理解，在說明書及發(fā)明要求保護(hù)范圍下對(duì)第一接近法的說明包括rvt1(d1d2)或rvt2(d1d2)為任意選擇值的實(shí)例。例如，當(dāng)存在第二靶核酸序列時(shí)，也以使第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，rvt2(d1d2)可為任意選擇值。但是，可要求多種實(shí)例，避免因重復(fù)說明而導(dǎo)致的不必要的說明書的過度復(fù)雜性并可包含在上述實(shí)例(作為任意選擇值的rvt1(d1d2))的說明中。

方程式(iii)及(iv)與方程式(i)及(ii)一同使用于得到對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答的過程中。如實(shí)施例2及圖2g-2h所例示，當(dāng)存在第一靶核酸序列時(shí)，也以使第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第二檢測(cè)溫度下實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，rvt1(d1d2)可為任意選擇值。在f(st1d1，st1d2)為st1d1/st1d2且f(st2d1，st2d2)為st2d1/st2d2的情況下，用于得到對(duì)變數(shù)的解答的方程式組包括如下：

st1d1+st2d1＝sd1

st1d2+st2d2＝sd2

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

rvt1d1/d2為任意選擇值，因此，可通過上述4個(gè)方程式來得到對(duì)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st1d2)及(st1d2)的解答。

有趣的是，本發(fā)明的方法可使由各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)量(例如，信號(hào)強(qiáng)度)定量化。如上所述，對(duì)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st1d2)及(st1d2)的解答可使由各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)量(例如，信號(hào)強(qiáng)度)定量化，這可適用于靶核酸序列的定量化。

步驟(d)：得到對(duì)變數(shù)的解答

最后，為了分辨分配在2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)，借助在步驟(b)及步驟(c)中所提供的上述4個(gè)方程式來得到對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

如上所述，在步驟(b)及(c)中所提供的方程式使用于為了分辨分配在2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)而得到對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答的過程中，

尤其，為了分辨分配在2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)(最尤其，所有)的感興趣的信號(hào)中的至少2個(gè)(更尤其，至少3個(gè)，最尤其，至少4個(gè))，使用在步驟(b)及步驟(c)中所提供的4個(gè)方程式來得到對(duì)變數(shù)中的至少2個(gè)(更尤其，至少3個(gè)，最尤其，至少4個(gè))的解答。

根據(jù)一實(shí)例，為了得到對(duì)上述2個(gè)變數(shù)的解答(值)而使用本發(fā)明的方法，上述2個(gè)變數(shù)中的一個(gè)選自與第一靶核酸序列有關(guān)的變數(shù)中，其他變數(shù)選自與第二靶核酸序列有關(guān)的變數(shù)中。

根據(jù)一實(shí)例，根據(jù)產(chǎn)生信號(hào)的接近法，為了分析所得到的對(duì)變數(shù)的解答(值)是否顯著而可利用閾值。

當(dāng)確定閾值時(shí)，可考慮陰性對(duì)照組、敏感度或所使用的標(biāo)志。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可由使用人員確定閾值，或者可自動(dòng)確定閾值。

根據(jù)一實(shí)例，僅使用第一靶核酸序列或者僅使用第二靶核酸序列并參照檢測(cè)出的信號(hào)來確定閾值。

根據(jù)一實(shí)例，以與基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的靶擴(kuò)增相關(guān)的實(shí)時(shí)方式實(shí)時(shí)方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，利用基準(zhǔn)值對(duì)在各個(gè)擴(kuò)增循環(huán)或一部分已選擇的循環(huán)中的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，針對(duì)循環(huán)繪制上述計(jì)算結(jié)果，并使用于分辨感興趣的信號(hào)(例如，確定靶核酸序列的存在)的過程中。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，2個(gè)靶核酸序列包含核苷酸變異，上述2個(gè)靶核酸序列中的一個(gè)包含一種類型的核苷酸變異，另一個(gè)包含另一類型的核苷酸變異。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“核苷酸變異”意味著在類似的連續(xù)的脫氧核糖核酸片段中特定位置的脫氧核糖核酸序列中的任意單一或多個(gè)核苷酸置換、缺失或插入。這種連續(xù)的脫氧核糖核酸片段包含一個(gè)基因或一個(gè)染色體的任意其他部位。這種核苷酸變異可以為突變或多態(tài)性等位基因變異。例如，在本發(fā)明中檢測(cè)出的核苷酸變異包括單核苷酸多態(tài)性(snp)、突變、缺失、插入、置換以及移位。例示的核苷酸變異的包括人類基因組內(nèi)的各種變異(例如，在亞甲基四氫葉酸還原酶(mthfr)基因中的變異)、與病原體的藥劑耐性相關(guān)的變異以及腫瘤形成誘發(fā)變異。在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語核苷酸變異包含核酸序列的特定位置的任意變異。即，術(shù)語核苷酸變異包含核酸序列的特定位置的野生型及其任意突變型。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在本發(fā)明中檢測(cè)出的核苷酸變異是單核苷酸多態(tài)性。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，通過使用與第一靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，來檢測(cè)由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子，通過使用與第二靶核酸序列有關(guān)的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，來檢測(cè)由第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子，通過使用上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)構(gòu)，來檢測(cè)由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的雜合子。

ii.與至少3個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)的分辨

在本發(fā)明的再一實(shí)施方式中，提供對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法，包括：

步驟(a)，與用于檢測(cè)n個(gè)靶核酸序列的n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)上述樣品，在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；借助相應(yīng)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)各個(gè)上述靶核酸序列；由上述n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)對(duì)各個(gè)靶核酸序列不被單一類型的檢測(cè)器分辨；n為2以上的整數(shù)

步驟(b)，提供分別包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述n個(gè)方程式：

在上述式中，(sd1)至(sdn)分別為在各個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)；(st1d1)至(stndn)分別為表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下由各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)；變數(shù)的總數(shù)為n²個(gè)；

步驟(c)，提供分別包括選自由變數(shù)(st1d1)至(stndn)組成的組中的至少一個(gè)變數(shù)的(n²-n)個(gè)附加方程式；以及

步驟(d)，為了分辨分配在上述n個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)，借助在步驟(b)及步驟(c)中所提供的n²個(gè)方程式來得到對(duì)上述變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

在本申請(qǐng)中，將本發(fā)明的方法作為對(duì)分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法來表達(dá)，作為檢測(cè)樣品內(nèi)至少一個(gè)靶核酸序列的方法或者通過在至少一個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)分配感興趣的信號(hào)來確定樣品內(nèi)至少一個(gè)靶核酸序列的存在的方法來表達(dá)。

在原則上上述第二實(shí)施方式基于上述的本發(fā)明的第一實(shí)施方式的技術(shù)性原理及特征，因此，為了避免導(dǎo)致本說明書的復(fù)雜性的過多的重復(fù)，省略它們之間的共同內(nèi)容。在為了說明第二實(shí)施方式，提起與第一實(shí)施方式有關(guān)的說明的情況下，需要留意第二實(shí)施方式與第一實(shí)施方式一部分不同。因此，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員需要理解與第一實(shí)施方式有關(guān)的一部分說明直接可適用于與第二實(shí)施方式有關(guān)的說明，其他說明可通過一些變形適用于與第二實(shí)施方式有關(guān)的說明。

以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。

步驟(a)：與樣品和信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的培養(yǎng)及信號(hào)檢測(cè)

首先，與用于檢測(cè)n個(gè)靶核酸序列的n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)待分析的樣品，然后在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)來源于信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)；各個(gè)靶核酸序列由相應(yīng)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)；由n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)不會(huì)被單一類型的檢測(cè)器分辨各靶核酸序列；n為2以上的整數(shù)。

在本發(fā)明中并不限定所檢測(cè)的靶核酸序列的數(shù)量，包括2、3、4、5、6、7、8、9及10個(gè)以上的靶核酸序列。

例如，當(dāng)靶核酸序列的數(shù)量為3個(gè)時(shí)，n為3，靶核酸序列可分別表現(xiàn)成t1、t2及t3。

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)靶核酸序列的數(shù)量為n個(gè)時(shí)，使用n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

當(dāng)靶核酸序列的數(shù)量為n個(gè)時(shí)，使用n個(gè)檢測(cè)溫度。例如，當(dāng)靶核酸序列的數(shù)量為3個(gè)時(shí)，n為3，使用3個(gè)檢測(cè)溫度。檢測(cè)溫度可分別表現(xiàn)成d1、d2及d3。

在本發(fā)明中，為了提供與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)而利用信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。各個(gè)靶核酸序列由相應(yīng)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)。例如，n個(gè)靶核酸序列中的第g靶核酸序列可由第g信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)，上述術(shù)語“g”為選自1至n的整數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述培養(yǎng)在由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的條件下進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述培養(yǎng)在包括n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的單一反應(yīng)容器中進(jìn)行。

用于本發(fā)明的第二實(shí)施方式的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可參照用于本發(fā)明的第一實(shí)施方式的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

在本發(fā)明中可使用多種物質(zhì)并以多種方式產(chǎn)生信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)中的至少一個(gè)為以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，與各個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

尤其，信號(hào)根據(jù)與靶核酸序列及上述靶核酸序列特異性雜交的檢測(cè)用寡核苷酸之間的二聚體形成而產(chǎn)生。

尤其，信號(hào)根據(jù)以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體而產(chǎn)生，上述每個(gè)寡核苷酸與靶核酸序列特異性雜交。

根據(jù)以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)可通過包括探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸(ptoce，ptocleavageandextension)的方法(wo第2012/096523號(hào))、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交(pce-sh，ptocleavageandextension-dependentsignalingoligonucleotidehybridization)方法(wo第2013/115442號(hào))及探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交(pce-nh，ptocleavageandextension-dependentnon-hybridization)方法(第pct/kr2013/012312號(hào))在內(nèi)的多種方法產(chǎn)生。

根據(jù)一實(shí)例，n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)中的至少一個(gè)為以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，與各個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

尤其，在實(shí)現(xiàn)檢測(cè)寡核苷酸和靶核酸序列的雜交后，根據(jù)檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生信號(hào)。在實(shí)現(xiàn)檢測(cè)寡核苷酸和靶核酸序列的雜交后根據(jù)檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)可通過taqman探針法(美國專利第5210015號(hào)及第5538848號(hào))在內(nèi)的多種方法產(chǎn)生。

尤其，信號(hào)以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式并根據(jù)檢測(cè)用寡核苷酸的切割產(chǎn)生，上述介導(dǎo)寡核苷酸與靶核酸序列實(shí)現(xiàn)特異性雜交。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸的切割釋放片段，上述片段在二聚體的形成或捕獲寡核苷酸上介導(dǎo)根據(jù)上述片段的延伸的檢測(cè)寡核苷酸的切割。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，與n個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為根據(jù)檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，與其他靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為根據(jù)二聚體的形成的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，各個(gè)靶核酸序列由可在所有檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)。

根據(jù)一實(shí)例，n個(gè)靶核酸序列中的第g靶核酸序列由可在最少“g”個(gè)檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)。例如，靶核酸序列中第3個(gè)靶核酸序列由可在3個(gè)以上的檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包括相同的標(biāo)志，來源于上述標(biāo)志的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，步驟(a)在伴隨核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過程中進(jìn)行。

在本發(fā)明中，由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)可與靶擴(kuò)增一同進(jìn)行擴(kuò)增。選擇性地，信號(hào)可在無靶擴(kuò)增的情況下進(jìn)行擴(kuò)增。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，信號(hào)的產(chǎn)生可與靶擴(kuò)增一同在包括信號(hào)擴(kuò)增的過程中進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，靶擴(kuò)增根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，培養(yǎng)不僅在由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的條件下進(jìn)行，還在可實(shí)現(xiàn)靶擴(kuò)增的條件下進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，步驟(a)在無核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過程中進(jìn)行。

當(dāng)根據(jù)包括寡核苷酸的切割的方法產(chǎn)生信號(hào)時(shí)，上述信號(hào)可在無靶擴(kuò)增的條件下進(jìn)行擴(kuò)增。

在與用于提供信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)(反應(yīng))樣品的過程或之后，上述信號(hào)使用檢測(cè)器來進(jìn)行檢測(cè)，例如使用單一類型檢測(cè)器來進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明，在單一類型檢測(cè)器的情況下也可決定2個(gè)靶核酸序列的存在或不存在。

在檢測(cè)溫度的觀點(diǎn)上，本發(fā)明可使用任一類型的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)來進(jìn)行。

信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可被設(shè)計(jì)成在n個(gè)檢測(cè)溫度中的所有或一部分的條件下提供信號(hào)。

尤其，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可被設(shè)計(jì)成在變更檢測(cè)溫度時(shí)提供不同的信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，考慮到可由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的溫度范圍，預(yù)先確定檢測(cè)溫度。

檢測(cè)溫度選自可由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的溫度范圍。

根據(jù)一實(shí)例，n個(gè)檢測(cè)溫度互不相同。

根據(jù)一實(shí)例，用于檢測(cè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可以為在n個(gè)檢測(cè)溫度分別提供互不相同的信號(hào)(例如，信號(hào)強(qiáng)度)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，在首先制備與2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)后，分配與2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的檢測(cè)溫度，然后進(jìn)行步驟(a)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，當(dāng)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式生成信號(hào)時(shí)，任意選擇檢測(cè)溫度。即，只要是可檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)寡核苷酸的切割而產(chǎn)生的信，則可使用任意溫度。如上所述地，當(dāng)信號(hào)以依賴于檢測(cè)用寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生時(shí)，根據(jù)切割釋放的標(biāo)志可在多種溫度下檢測(cè)。

使用于本發(fā)明的檢測(cè)器包括可檢測(cè)信號(hào)的任意機(jī)構(gòu)。例如，當(dāng)使用熒光信號(hào)時(shí)，可將適用于熒光信號(hào)的檢測(cè)的光電二極管利用成檢測(cè)器。使用單一類型的檢測(cè)器的檢測(cè)是指使用可檢測(cè)單一類型的信號(hào)的檢測(cè)器或者使用具有多個(gè)通道(即，光電二極管)的檢測(cè)器的各個(gè)通道(即，光電二極管)來進(jìn)行檢測(cè)。

步驟(b)：包括表示感興趣的信號(hào)的變數(shù)的方程式的制定

提供分別包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)上述靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述2個(gè)方程式：

在上述式中，(sd1)至(sdn)分別為在各個(gè)檢測(cè)溫度中檢測(cè)的信號(hào)；(st1d1)至(stndn)分別為表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下由各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)；變數(shù)的總數(shù)為n²個(gè)。

在上述數(shù)學(xué)方程式中，水平虛線“……”表示變數(shù)或多個(gè)變數(shù)，其數(shù)量依賴于n的數(shù)量。例如，當(dāng)n為3時(shí)，沒有由上述水平虛線表示的附加變數(shù)。當(dāng)n為4時(shí)，存在由上述水平虛線表示的(n-3)個(gè)附加變數(shù)。并且，垂直虛線“……”表示方程式或多個(gè)方程式，其數(shù)量依賴于n的數(shù)量。例如，當(dāng)n為3時(shí)，沒有由上述垂直虛線表示的附加方程式。當(dāng)n為4時(shí)，存在由上述垂直虛線表示的(n-3)個(gè)附加方程式。

當(dāng)n為2時(shí)，如下的提示方程式組中：

(1)：st1d1+st2d1＝sd1

(2):st1d2+st2d2＝sd2

作為在第一檢測(cè)溫度(d1)中檢測(cè)的信號(hào)的(sd1)由n個(gè)感興趣的信號(hào)形成，上述n個(gè)感興趣的信號(hào)在第一檢測(cè)溫度(d1)下由與n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生。即，作為在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)的(sd1)由作為感興趣的信號(hào)的(st1d1)至作為感興趣的信號(hào)的(stnd1)形成，上述(st1d1)在第一檢測(cè)溫度下由與第一靶核酸序列有關(guān)的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生，上述(stnd1)在第一檢測(cè)溫度下由與第n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的第n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生。

針對(duì)其他檢測(cè)溫度的方程式，可如上地解釋第一檢測(cè)溫度。

例如，作為在第n個(gè)檢測(cè)溫度(dn)向檢測(cè)的信號(hào)的(sdn)由在第n個(gè)檢測(cè)溫度(dn)下由與n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的n個(gè)感興趣的信號(hào)形成。作為在第n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)的(sdn)由作為感興趣的信號(hào)的(st1dn)至作為感興趣的信號(hào)的(stndn)形成，上述(st1dn)在第n個(gè)檢測(cè)溫度下由與第一靶核酸序列有關(guān)的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生，上述(stndn)在第n個(gè)檢測(cè)溫度下由與第n個(gè)靶核酸序列的第n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生。

(sd1)至(sdn)可以為由檢測(cè)器檢測(cè)出的信號(hào)，即，可以為常數(shù)值。(st1d1)至(stndn)為所要獲得的未知的變數(shù)。本發(fā)明涉及通過使用所檢測(cè)的信號(hào)(sd1)至(sdn)來獲得對(duì)變數(shù)(st1d1)至(stndn)中的至少一個(gè)的解答的方法。

在具體的例子中，樣品內(nèi)的n個(gè)靶核酸序列包含t1、t2及t3，當(dāng)n個(gè)檢測(cè)溫度包含60℃、72℃及95℃時(shí)，可提供分別包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述n個(gè)方程式：

st1d1+st2d1+st3d1＝sd1

st1d2+st2d2+st3d2＝sd2

st1d3+st2d3+st3d3＝sd3

步驟(c)：附加方程式的建立

然后，提供選自由變數(shù)(st1d1)至(stndn)組成的組中的最少一個(gè)變數(shù)的(n²-n)個(gè)附加方程式。

在方程式(1)至方程式(n)制定后，制定(n²-n)個(gè)附加方程式，上述附加方程式是為了借助數(shù)學(xué)處理來獲得對(duì)方程式(1)至方程式(n)中的變數(shù)中的至少一個(gè)(優(yōu)選為變數(shù)中的最少2個(gè)，更優(yōu)選為變數(shù)中的最少3個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為變數(shù)中的最少4個(gè)，最優(yōu)選為變數(shù)中的最少5個(gè))的解答而提供。

在數(shù)學(xué)方面，在步驟(b)及步驟(c)提供的n²個(gè)方程式可提供對(duì)變數(shù)中的至少一的解答。

例如，當(dāng)方程式(1)至方程式(n)可具有相同的變數(shù)組時(shí)(即，方程式(1)至方程式(n)變換成聯(lián)立方程式的情況)，附加方程式會(huì)解上述聯(lián)立方程式(尤其，具有n個(gè)變數(shù)的線性聯(lián)立方程式)，從而在方程式(1)至方程式(n)中可獲得對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。選擇性地，能夠以與上述聯(lián)立方程式的解法不同的方式獲得對(duì)方程式(1)至方程式(n)中的變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

根據(jù)一實(shí)例，(n²-n)個(gè)附加方程式選自由下述方程式組成的組中：

(x)：f(stjdα，stjdβ)＝rvtj(dαdβ)，及

(xi)：stjdk＝任意選擇值

tj中的j表示從1到第n個(gè)整數(shù)為止的所有整數(shù)；對(duì)于各個(gè)第j靶核酸序列，α及β一同表示選自1至n中的2個(gè)整數(shù)的組合；上述組合的數(shù)由nc2表示；對(duì)于各個(gè)第j靶核酸，k為選自1至n中的整數(shù)中的至少一個(gè)；rvtj(dαdβ)為反映在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度下借助第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)變化關(guān)系的第j靶核酸序列(tj)的基準(zhǔn)值(rv)；f(stjdα，stjdβ)表示stjdα及stjdβ的函數(shù)。

當(dāng)存在第j靶核酸序列時(shí)，也以使第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第k檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，能夠選擇方程式(xi)中的stjdk＝任意選擇值。

在將上述方程式(xi)作為附加方程式來選擇的情況下，其他附加方程式選自與第j靶核酸序列有關(guān)的α或β和與第j靶核酸序列有關(guān)的k不同的方程式(x)。

根據(jù)一實(shí)例，將零(0)作為stjdk(stjdk＝0)有利于本發(fā)明的實(shí)施方式。選擇性地，可將負(fù)常數(shù)或正常數(shù)使用成stjdk(stjdk＝負(fù)常數(shù)或stjdk＝正常數(shù))。

當(dāng)?shù)趈靶核酸序列(tj)存在時(shí)，stjdα及stjdβ分別示出在第α檢測(cè)溫度(dα)及第β檢測(cè)溫度(dβ)下由第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)。

為了將多個(gè)方程式作為單一普通方程式來說明而提供方程式(x)。

在數(shù)學(xué)方程式(x)中，tj中的j表示從1到第n個(gè)整數(shù)為止的所有整數(shù)，α及β一同表示選自1至n中的2個(gè)整數(shù)的組合。與α及β相關(guān)地，術(shù)語“組合”是指具有從一個(gè)集合(collection)選擇項(xiàng)目的方式的數(shù)學(xué)組合，選擇順序并不重要。α及β的組合是指n個(gè)檢測(cè)溫度中的2個(gè)組合。α及β的組合數(shù)由nc2表示。

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)靶核酸序列為n個(gè)時(shí)，方程式(x)可說明“nx[nc2]”個(gè)方程式。

例如，當(dāng)n為3時(shí)，j包含1、2及3，α及β的組合包含(1，2)、(1，3)及(2，3)。在此情況下，方程式(x)說明9個(gè)方程式。

例如，“f(stjdα，stjdβ)＝rvtj(dαdβ)”可包括下述內(nèi)容：

(i)當(dāng)j＝1時(shí)；

f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)，

f(st1d1，st1d3)＝rvt1(d1d3)，

f(st1d2，st1d3)＝rvt1(d2d3)，

(ii)當(dāng)j＝2時(shí)；

f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)，

f(st2d1，st2d3)＝rvt2(d1d3)，

f(st2d2，st2d3)＝rvt2(d2d3)，

(ii)當(dāng)j＝3時(shí)

f(st3d1，st3d2)＝rvt3(d1d2)，

f(st3d1，st3d3)＝rvt3(d1d3)，以及

f(st3d2，st3d3)＝rvt3(d2d3)。

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)從方程式(x)選擇(n²-n)個(gè)附加方程式時(shí)，這些(n-1)個(gè)方程式可選自與各個(gè)j有關(guān)的方程式組。

更優(yōu)選地，這種(n-1)個(gè)方程式的選擇用于提供具有n個(gè)變數(shù)的聯(lián)立方程式，以使相對(duì)各個(gè)j所選擇的(n-1)個(gè)方程式借助方程式(1)至方程式(n)來獲得對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

n為3，在分析檢測(cè)溫度d1中的信號(hào)的特定例中，相對(duì)各個(gè)j的2個(gè)方程式(即，n–1＝3–1＝2)選自3個(gè)可提供的方程式中。選自所記載的上述9個(gè)方程式地6個(gè)附加方程式如下：

f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)

f(st1d1，st1d3)＝rvt1(d1d3)

f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)

f(st2d1，st2d3)＝rvt2(d1d3)

f(st3d1，st3d2)＝rvt3(d1d2)

f(st3d1，st3d3)＝rvt3(d1d3)

尤其，(n²-n)個(gè)附加方程式包括選自由方程式(x)表示的方程式組中的方程式。

根據(jù)一實(shí)例，(n²-n)個(gè)附加方程式中的一部分可選自下屬方程式組中：

stjdk＝任意選擇值(xi)

當(dāng)存在第j靶核酸序列時(shí)，第j信號(hào)-提供機(jī)構(gòu)也不會(huì)在第k檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)，在此情況下，提供使stjdk具有任意選擇值的方程式。

根據(jù)一實(shí)例，可調(diào)節(jié)第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的特征，由此在多種檢測(cè)溫度下不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。

為了將多個(gè)方程式記述成單一普通方程式而提供方程式(xi)。

當(dāng)為了防止產(chǎn)生對(duì)各個(gè)n個(gè)靶核酸序列的信號(hào)而選擇檢測(cè)溫度時(shí)，提供在上述檢測(cè)溫度下使與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)具有任意選擇值的方程式。上述方程式可由方程式(xi)表示。

例如，靶核酸序列為n個(gè)(即，n＝3)，對(duì)第一靶核酸序列的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)被設(shè)計(jì)成在第二檢測(cè)溫度及第三檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)，對(duì)第二靶核酸序列的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)被設(shè)計(jì)成在第三檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)，在此情況下，方程式(xi)“stjdk＝任意選擇值”包括st1d2＝任意選擇值、st1d3＝任意選擇值及st2d3＝任意選擇值?？蛇x擇上述3個(gè)方程式中的全部或一部分。

根據(jù)一實(shí)例，附加方程式不僅包括選自由方程式(xi)表示的方程式組或多個(gè)方程式，還包括選自由方程式(x)表示式或多個(gè)方程式。

在上述的實(shí)例中說明用于獲得對(duì)方程式(1)至方程式(n)中的變數(shù)中的至少一個(gè)的解答的2個(gè)接近法。

在第一接近法中，作為(n²-n)個(gè)附加方程式而使用方程式(x)。

在方程式(x)中，作為基準(zhǔn)值，rvtj(dαdβ)為預(yù)先設(shè)置的值。

上述基準(zhǔn)值通過在2個(gè)檢測(cè)溫度下借助信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理來獲得。這種數(shù)學(xué)處理為信號(hào)的函數(shù)。只要是上述函數(shù)在2個(gè)檢測(cè)溫度下借助信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)來提供的信號(hào)變化關(guān)系，則為了獲得基準(zhǔn)值而使用的函數(shù)可包括任意函數(shù)。例如，上述函數(shù)可作為信號(hào)的加法、乘法、減法及除法等的數(shù)學(xué)處理提供。

如上所述地，作為基準(zhǔn)值的rvtj(dαdβ)為預(yù)先確定的值，因此rvtj(dαdβ)可起到在方程式(1)至方程式(n)中將變數(shù)(stjd1)至變數(shù)(stjdn)轉(zhuǎn)換成選自變數(shù)(stjd1)至變數(shù)(stjdn)中的一個(gè)變數(shù)的轉(zhuǎn)換者的作用。

根據(jù)一實(shí)例，包括第j靶核酸序列(tj)的基準(zhǔn)值(rv)的方程式(x)用于在方程式(1)至方程式(n)中將變數(shù)(stjd1)至變數(shù)(stjdn)轉(zhuǎn)換成選自變數(shù)(stjd1)至變數(shù)(stjdn)中的1個(gè)變數(shù)。

在本發(fā)明中使用的基準(zhǔn)值rvtj(dαdβ)可通過多種方式獲得。例如，基準(zhǔn)值可由預(yù)期值形成。考慮到靶序列、信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及檢測(cè)溫度，可預(yù)期表示檢測(cè)溫度中的信號(hào)變化關(guān)系的基準(zhǔn)值。選擇性地，可通過進(jìn)行獲得基準(zhǔn)值的實(shí)驗(yàn)來以實(shí)驗(yàn)值或?qū)嶋H值形成基準(zhǔn)值。

根據(jù)一實(shí)例，通過如下步驟獲得rvtj(dαdβ)：步驟(i-1)，與用于檢測(cè)第j靶核酸序列的第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)第j靶核酸序列；步驟(i-2)，在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；步驟(i-3)，之后，獲得在上述第α檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在上述第β檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異。

術(shù)語“在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度中檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異”為第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度中的信號(hào)變化關(guān)系地一實(shí)例。

根據(jù)一實(shí)例，在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度中檢測(cè)出的信號(hào)之間的壓抑包括通過對(duì)在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度中檢測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來獲得的差異。

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理時(shí)，信號(hào)的特征需要容易進(jìn)行數(shù)學(xué)處理。在特定實(shí)例中，數(shù)學(xué)處理包括使用信號(hào)的計(jì)算(例如，加法、乘法、減法及除法)或來源于信號(hào)的其他值。

在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度中檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異可由數(shù)值或具有信號(hào)特征的繪制來表示。

可通過多種計(jì)算方法及他們的變形來進(jìn)行用于獲取差異的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理。

尤其，用于獲得差異的信號(hào)地?cái)?shù)學(xué)處理可同構(gòu)計(jì)算第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度下的信號(hào)之間的比率來進(jìn)行。

例如，可將在第β檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的端點(diǎn)強(qiáng)度(end-pointintensity)與在第α檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的端點(diǎn)強(qiáng)度之間的比率作為基準(zhǔn)值使用。

用于獲得差異的數(shù)學(xué)處理可通過多種方式進(jìn)行。數(shù)學(xué)處理可通過使用設(shè)備來進(jìn)行。例如，可借助檢測(cè)器或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置內(nèi)的處理器以數(shù)學(xué)方式處理信號(hào)。選擇性地，尤其，可根據(jù)預(yù)先確定的算法對(duì)信號(hào)進(jìn)行手動(dòng)的數(shù)學(xué)處理。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在n個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)n個(gè)靶核酸序列的rv互不相同。

尤其，對(duì)使用相同的個(gè)檢測(cè)溫度之間的信號(hào)來計(jì)算的不同的靶核酸序列的基準(zhǔn)值互不相同。例如，當(dāng)存在3個(gè)靶核酸序列時(shí)，rvt1(dαdβ)、rvt2(dαdβ)及rvt3(dαdβ)可互不相同。根據(jù)一實(shí)例，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)用于對(duì)不同的靶核酸序列提供不同的基準(zhǔn)值。

當(dāng)rv值互不相同時(shí)，用于記述差異程度的定量表達(dá)可根據(jù)計(jì)算rv值的接近法而不同。

根據(jù)一實(shí)例，可根據(jù)共同的計(jì)算方法進(jìn)行處理來使用于獲得基準(zhǔn)值的信號(hào)提供用于進(jìn)行比較的基準(zhǔn)值，然后，使用用于進(jìn)行比較的上述基準(zhǔn)值來獲得2個(gè)基準(zhǔn)值之間的差異程度。根據(jù)一實(shí)例，共同的計(jì)算方法為2個(gè)信號(hào)的除法。

例如，根據(jù)本發(fā)明的方法，當(dāng)為了獲得在分析信號(hào)的過程中使用的基準(zhǔn)值而根據(jù)減法處理2個(gè)信號(hào)時(shí)，為了獲得用于進(jìn)行比較的基準(zhǔn)值，可根據(jù)除法處理上述2個(gè)信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，與其它基準(zhǔn)值相比，一個(gè)基準(zhǔn)值至少還大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。

根據(jù)一實(shí)例，在本發(fā)明中使用的基準(zhǔn)值中的一部分可相同。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，用于基準(zhǔn)值的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可與用于檢測(cè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)相同。

根據(jù)一實(shí)例，用于獲得基準(zhǔn)值的培養(yǎng)條件可與用于分析樣品的培養(yǎng)條件相同。

針對(duì)靶核酸序列，可在包括成分(例如，靶核酸序列、信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)、酶或三磷酸脫氧核苷酸(dntp))的量、緩沖液ph或反應(yīng)時(shí)間的多種反應(yīng)條件下獲得基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，基準(zhǔn)值可在完成反應(yīng)時(shí)提供飽和信號(hào)的充分的反應(yīng)條件下獲得。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在獲得基準(zhǔn)值時(shí)所獲得的信號(hào)之間的差異具有特定范圍，基準(zhǔn)值在上述特定范圍內(nèi)或者參照上述特定范圍來選擇。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可選擇上述特定范圍的最大值或最小值作為基準(zhǔn)值或者參照上述特定范圍的最大值或最小值來選擇基準(zhǔn)值。尤其，考慮到在多種條件下獲得的上述基準(zhǔn)值的標(biāo)準(zhǔn)變化、允許誤差范圍、特異度或敏感度，可變更基準(zhǔn)值。

在“f(stjdα，stjdβ)＝rvtj(dαdβ)”中，f(stjdα，stjdβ)可作為用于計(jì)算rvtj(dαdβ)的數(shù)學(xué)表達(dá)提供。

根據(jù)一實(shí)例，f(stjdα，stjdβ)＝rvtj(dαdβ)包括stjdα/stjdβ＝rvtjdα/dβ(xii)或stjdβ/stjdα＝rvtjdβ/dα(xiii)。

當(dāng)使用第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度下的信號(hào)之間的比率來獲得rv時(shí)，在“f(stjdα，stjdβ)＝rvtj(dαdβ)”中，f(stjdα，stjdβ)可作為用于計(jì)算stjdα及stjdβ之間的比率的數(shù)學(xué)表達(dá)提供。在術(shù)語“rvtj(dαdβ)”中，tj(dαdβ)表示計(jì)算出的rv與通過計(jì)算第α檢測(cè)溫度(dα)及第β檢測(cè)溫度(dβ)下的信號(hào)之間的差異來獲得的對(duì)第j靶核酸序列的基準(zhǔn)值相應(yīng)。

當(dāng)確定rv計(jì)算方法時(shí)，術(shù)語“tj(dαdβ)”可通過考慮上述計(jì)算方法來具體表達(dá)。例如，術(shù)語“rvtjdα/dβ”是指通過計(jì)算在第α檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)與在第β檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的比率來獲得的對(duì)第j靶核酸序列的基準(zhǔn)值。

根據(jù)一實(shí)例，通過如下步驟獲得rvtjdα/dβ：步驟(i-1)，與用于檢測(cè)第j靶核酸序列的第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)第j靶核酸序列；步驟(i-2)，在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；步驟(i-3)，之后，計(jì)算在上述第α檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)在上述第β檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率，在進(jìn)行步驟(i-1)及(i-2)之后，通過計(jì)算在上述第β檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)對(duì)在上述第α檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率來獲得rvtjdβ/dα。

根據(jù)一實(shí)例，n²-n個(gè)附加方程式選自下述方程式組中：

(xii)：stjdα/stjdβ＝rvtjdα/dβ；

(xiii)：stjdβ/stjdα＝rvtjdβ/dα。

在上述式中，在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度下與各個(gè)第j靶核酸有關(guān)的方程式選自上述方程式(xii)及方程式(xiii)中。尤其，在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度下與各個(gè)第j靶核酸有關(guān)的方程式選自方程式(xii)及方程式(xiii)中的一個(gè)。

與方程式(1)至方程式(n)一同選自由方程式(x)表示的方程式組的(多個(gè))附加方程式用于獲得對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

在具體例(n＝3)中，方程式(xii)或方程式(xiii)如下：

當(dāng)(i)j＝1時(shí)；

f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)可包括如下情況：

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2或st1d2/st1d1＝rvt1d2/d1；

f(st1d1，st1d3)＝rvt1(d1d3)可包括如下情況：

st1d1/st1d3＝rvt1d1/d3或st1d3/st1d1＝rvt1d3/d1；

f(st1d2，st1d3)＝rvt1(d2d3)可包括如下情況：

st1d2/st1d3＝rvt1d2/d3或st1d3/st1d2＝rvt1d3/d2。

當(dāng)(ii)j＝2時(shí)；

f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)可包括如下情況：

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2或st2d2/st2d1＝rvt2d2/d1；

f(st2d1，st2d3)＝rvt2(d1d3)可包括如下情況：

st2d1/st1d3＝rvt2d1/d3或st2d3/st2d1＝rvt2d3/d1；

f(st2d2，st2d3)＝rvt2(d2d3)可包括如下情況：

st2d2/st2d3＝rvt2d2/d3或st2d3/st2d2＝rvt2d3/d2。

當(dāng)(ii)j＝3時(shí)；

f(st3d1，st3d2)＝rvt3(d1d2)可包括如下情況：

st3d1/st3d2＝rvt3d1/d2或st3d2/st3d1＝rvt3d2/d1；

f(st3d1，st3d3)＝rvt3(d1d3)可包括如下情況：

st3d1/st3d3＝rvt3d1/d3或st3d3/st3d1＝rvt3d3/d1

f(st3d2，st3d3)＝rvt3(d2d3)可包括如下情況：

st3d2/st3d3＝rvt3d2/d3或st3d3/st3d2＝rvt3d3/d2。

根據(jù)一實(shí)例，為了在所選擇的2個(gè)檢測(cè)溫度下計(jì)算對(duì)特定靶核酸序列的rv，可提供多個(gè)方程式。根據(jù)一實(shí)例，在上述情況下，在多個(gè)方程式中選擇單一方程式。例如，當(dāng)j＝1(即，t1)且2個(gè)檢測(cè)溫度為60℃(d1)及72℃(d2)時(shí)，“f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)可包括st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2及st1d2/st1d1＝rvt1d2/d1。在上述2個(gè)特定方程式中，將單一方程式使用于對(duì)靶核酸序列(t1)的rv計(jì)算。

當(dāng)分析檢測(cè)溫度d1下的信號(hào)時(shí)，選自上述的方程式的6個(gè)附加方程式可以為如下：

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2(或st1d2/st1d1＝rvt1d2/d1)

st1d1/st1d3＝rvt1d1/d3(或st1d3/st1d1＝rvt1d3/d1)

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2(或st2d2/st2d1＝rvt2d2/d1)

st2d1/st2d3＝rvt2d1/d3(或st2d3/st2d1＝rvt2d3/d1)

st3d1/st3d2＝rvt3d1/d2(或st3d2/st3d1＝rvt3d2/d1)

st3d1/st3d3＝rvt3d1/d3(或st3d3/st3d1＝rvt3d3/d1)

最終，用于獲得對(duì)變數(shù)的解答的方程式組可包括如下的方程式：

st1d1+st2d1+st3d1＝sd1

st1d2+st2d2+st3d2＝sd2

st1d3+st2d3+st3d3＝sd3

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

st1d1/st1d3＝rvt1d1/d3

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

st2d1/st2d3＝rvt2d1/d3

st3d1/st3d2＝rvt3d1/d2

st3d1/st3d3＝rvt3d1/d3

rvt1d1/d2、rvt1d1/d3、rvt2d1/d2、rvt2d1/d3、rvt3d1/d2及rvt3d1/d3為實(shí)驗(yàn)性地預(yù)先確定的值，因此對(duì)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st3d1)、(st1d2)、(st2d2)、(st3d2)、(st1d3)、(st2d3)及(st3d3)的解答可根據(jù)上述9個(gè)方程式獲得。

用于獲得對(duì)方程式(1)至方程式(n)中的變數(shù)中的至少一個(gè)的解答的第二接近法作為(n²-n)個(gè)附加方程式而使用方程式(x)及方程式(xi)。當(dāng)存在第j靶核酸序列時(shí)，也以使第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在第k檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備的情況下，能夠選擇方程式(xi)中的stjdk＝任意選擇值。

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)作為附加方程式而選擇方程式(xi)時(shí)，其他附加方程式可選自使對(duì)第j靶核酸序列的α或β與對(duì)第j靶核酸序列的k不同的方程式(x)中。

即，作為附加方程式，當(dāng)最少一個(gè)方程式選自由方程式(xi)表示的方程式組時(shí)，從其他附加方程式排除由使對(duì)第j靶核酸序列的α或β與對(duì)第j靶核酸序列的k相同的方程式(x)表示的方程式組的一部分，并且其他附加方程式選自除所排除的上述一部分之外的方程式(x)中。

因此，在本文中使用的句子“當(dāng)作為附加方程式而選擇方程式(xi)時(shí)，其他附加方程式可選自使對(duì)第j靶核酸序列的α或β與對(duì)第j靶核酸序列的k不同的方程式(x)中”可記述成“當(dāng)作為附加方程式而選擇方程式(xi)時(shí)，其他附加方程式選自除了使對(duì)第j靶核酸序列的α或β與對(duì)第j靶核酸序列的k相同的方程式之外的方程式(x)中”。

在分析3個(gè)靶核酸序列(即，n＝3及j包括1、2及3)、當(dāng)t1存在時(shí)也以在72℃(d2)及95℃(d3)檢測(cè)溫度下實(shí)質(zhì)上不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)的方式制備對(duì)靶核酸序列(t1)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)、當(dāng)t2存在時(shí)也以在95℃檢測(cè)溫度(d3)下實(shí)質(zhì)上不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)的方式制備對(duì)靶核酸序列(t2)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的特定例(參照?qǐng)D3a)中，方程式(xi)可包括下述方程式：

st1d2＝0(j＝1及k＝2)，

st1d3＝0(j＝1及k＝3)，以及

st2d3＝0(j＝2及k＝3)。

另一方面，方程式(x)“f(stjdα，stjdβ)＝rvtj(dαdβ)”可包括如下：

當(dāng)(i)j＝1時(shí)；

f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)，

f(st1d1，st1d3)＝rvt1(d1d3)，

f(st1d2，st1d3)＝rvt1(d2d3)，

當(dāng)(ii)j＝2時(shí)；

f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)，

f(st2d1，st2d3)＝rvt2(d1d3)，

f(st2d2，st2d3)＝rvt2(d2d3)，

當(dāng)(ii)j＝3時(shí)；

f(st3d1，st3d2)＝rvt3(d1d2)，

f(st3d1，st3d3)＝rvt3(d1d3)，及

f(st3d2，st3d3)＝rvt3(d2d3)。

當(dāng)將“st2d3＝0(j＝2及k＝3)”作為附加方程式中的一個(gè)使用時(shí)，其他附加方程式可包括方程式(x)(j＝1)中的2個(gè)方程式，即，方程式(x)(j＝3)中的2個(gè)方程式及方程式(x)(j＝2)中的1個(gè)方程式。在特定實(shí)例中，在選擇這種方程式的過程中，排除對(duì)靶核酸序列(j＝2，即，t2)的α或β與對(duì)靶核酸序列(j＝2，即，t2)的k相同的方程式。即，排除“f(st2dα，st2dβ)＝rvt2(dαdβ)”中的包括d3檢測(cè)溫度的方程式。

當(dāng)分析檢測(cè)溫度60℃(d1)下的信號(hào)時(shí)，可如下的選擇包括含d1的變數(shù)的方程式：

st2d3＝0

f(st1d1，st1d2)＝rvt1(d1d2)

f(st1d1，st1d3)＝rvt1(d1d3)

f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)

f(st3d1，st3d2)＝rvt3(d1d2)

f(st3d1，st3d3)＝rvt3(d1d3)

代替所使用的“st2d3＝0(j＝2及k＝3)”，可將st1d2＝0(j＝1及k＝2)及st1d3＝0(j＝1及k＝3)使用成2個(gè)附加方程式。其他附加方程式可包括方程式(x)(j＝2)中的2個(gè)方程式及方程式(x)(j＝3)中的2個(gè)方程式。在特定實(shí)例中，針對(duì)這種方程式的選擇，排除使對(duì)靶核酸序列(j＝1，即，t1)的α或β與對(duì)靶核酸序列(j＝1，即，t1)的k(即，2或3)相同的方程式。即，從“f(st1dα，st1dβ)＝rvt1(dαdβ)”排出作為檢測(cè)溫度的而包括d2或d3的方程式。當(dāng)分析檢測(cè)溫度60℃(d1)下的信號(hào)時(shí)，可如下的選擇包括含d1的變數(shù)的方程式：

st1d2＝0

st1d3＝0

f(st2d1，st2d2)＝rvt2(d1d2)

f(st2d1，st2d3)＝rvt2(d1d3)

f(st3d1，st3d2)＝rvt3(d1d2)

f(st3d1，st3d3)＝rvt3(d1d3)

根據(jù)一實(shí)例，n²-n個(gè)附加方程式選自下述方程式組中：

(xii)：stjdα/stjdβ＝rvtjdα/dβ

(xiii)：stjdβ/stjdα＝rvtjdβ/dα

(xi)：stjdk＝任意選擇值

在上述式中，在第α檢測(cè)溫度及第β檢測(cè)溫度下與各個(gè)第j靶核酸有關(guān)的方程式選自上述方程式(xii)及方程式(xiii)。

當(dāng)上述方程式(xi)選自附加方程式時(shí)，其他附加方程式選自使與第j靶核酸序列有關(guān)的α或β與對(duì)第j靶核酸序列的k不同的方程式(xii)及方程式(xiii)。

作為具體例，在分析3個(gè)靶核酸序列(即，n＝3且j包括1、2及3)、當(dāng)t1存在時(shí)也以在72℃(d2)及95℃(d3)的檢測(cè)溫度下實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備與靶核酸序列(t1)有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)、當(dāng)t2存在時(shí)也以在95℃的檢測(cè)溫度(d3)下實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備與靶核酸序列(t2)有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的特定例(參照?qǐng)D3a)中，存在可利用于獲得對(duì)變數(shù)的解答的多種方程式組。

在將“st2d3＝0(j＝2及k＝3)”使用成1個(gè)附加方程式的情況下，獲得對(duì)變數(shù)的解答的方程式組中的一個(gè)可包括下述方程式：

st1d1+st2d1+st3d1＝sd1

st1d2+st2d2+st3d2＝sd2

st1d3+st2d3+st3d3＝sd3

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

st1d1/st1d3＝rvt1d1/d3

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

st2d3＝0

st3d1/st3d2＝rvt3d1/d2

st3d1/st3d3＝rvt3d1/d3

rvt1d1/d2、rvt1d1/d3、rvt2d1/d2、rvt3d1/d2及rvt3d1/d3為實(shí)驗(yàn)性或任意性地確定的常數(shù)，因此對(duì)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st3d1)、(st1d2)、(st2d2)、(st3d2)、(st1d3)、(st3d3)的解答可根據(jù)上述9個(gè)方程式獲得。

代替“st2d3＝0(j＝2及k＝3)”的使用，可將st1d2＝0(j＝1及k＝2)及st1d3＝0(j＝1及k＝3)使用成2個(gè)附加方程式。用于獲得對(duì)變數(shù)的解答的方程式組中的一個(gè)可包括下屬方程式：

st1d1+st2d1+st3d1＝sd1

st1d2+st2d2+st3d2＝sd2

st1d3+st2d3+st3d3＝sd3

st1d2＝0

st1d3＝0

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

st2d1/st2d3＝rvt2d1/d3

st3d1/st3d2＝rvt3d1/d2

st3d1/st3d3＝rvt3d1/d3

rvt2d1/d2、rvt2d1/d3、rvt3d1/d2及rvt3d1/d3為實(shí)驗(yàn)性或任意性地確定的常數(shù)，因此對(duì)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st3d1)、(st2d2)、(st3d2)、(st2d3)、(st3d3)的解答可根據(jù)上述9個(gè)方程式獲得。

根據(jù)一實(shí)例，即使在第j靶核酸序列存在的情況下也以在第k檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，也不會(huì)將方程式“stjdk＝任意選擇值”使用成附加方程式。在此情況下，α或β與k相同的rvtj(dαdβ)可以為經(jīng)實(shí)驗(yàn)獲得的值。

根據(jù)一實(shí)例，在第j靶核酸序列存在的情況下也以在第k檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，在此情況下，α或β與k相同的rvtj(dαdβ)為任意選擇值。

尤其，在方程式(x)中，當(dāng)借助用于計(jì)算第α檢測(cè)溫度(dα)及第β檢測(cè)溫度(dβ)下的信號(hào)之間的比率的數(shù)學(xué)表達(dá)來提供f(stjdα，stjdβ)時(shí)，，rvtj(dαdβ)可作為任意選擇值選擇。

尤其，作為rvtj(dαdβ)，任意選擇值在方程式組的解答過程中能夠以使stjdk的解答成為任意值或其周圍值(例如，“0”或“0”周圍)的方式選擇。

根據(jù)一實(shí)例，作為rvtj(dαdβ)，任意選擇值可與實(shí)際上利用所獲得的信號(hào)值來計(jì)算的rvtj(dαdβ)相同或者小于上述rvtj(dαdβ)。

實(shí)際上，即使在第j靶核酸序列存在的情況下也以在第k檢測(cè)溫度下不產(chǎn)生信號(hào)的方式制備第j信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，通常也會(huì)產(chǎn)生具有非常弱的強(qiáng)度的信號(hào)(例如，背景信號(hào))。因此，可經(jīng)實(shí)驗(yàn)獲得α或β與k相同的rvtj(dαdβ)。

本發(fā)明的方法可實(shí)現(xiàn)由各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)量(例如，信號(hào)強(qiáng)度)的定量。如上所述地，對(duì)變數(shù)(st1d1)至變數(shù)(stndn)的解答可實(shí)現(xiàn)由各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)量(例如，信號(hào)強(qiáng)度)的定量，這可適用于靶核酸序列的定量。

步驟(d)：獲得對(duì)變數(shù)的解答

最終，為了分辨分配在n個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)，而借助在步驟(b)及步驟(c)中提供的n²個(gè)方程式獲得對(duì)上述變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

如上所述地，在步驟(b)及步驟(c)提供的n²個(gè)方程式為了分辨分配在n個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)而使用，由此可決定對(duì)n個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的存在與否。

尤其，為了分辨分配在靶核酸序列中的最少1個(gè)(例如，最少2個(gè)、最少3個(gè)、最少4個(gè)、最少5個(gè)、最少6個(gè)、最少7個(gè)、最少8個(gè)、最少9個(gè)及最少10個(gè)或最少n個(gè))的感興趣的信號(hào)中的最少1個(gè)(例如，最少2個(gè)、最少3個(gè)、最少4個(gè)、最少5個(gè)、最少6個(gè)、最少9個(gè)、最少16個(gè)、最少25個(gè)或最少n²個(gè))而使用步驟(b)及步驟(c)中提供的n²個(gè)方程式來獲得對(duì)變數(shù)中的最少一個(gè)(例如，最少2個(gè)、最少3個(gè)、最少4個(gè)、最少5個(gè)、最少6個(gè)、最少9個(gè)、最少16個(gè)、最少25個(gè)或最少n²個(gè))的解答。

根據(jù)一實(shí)例，本方法為了獲得對(duì)分別選自與各靶核酸序列有關(guān)的變數(shù)組的n個(gè)變數(shù)的解答(值)而使用。

根據(jù)一實(shí)例，根據(jù)產(chǎn)生信號(hào)的方式，為了確認(rèn)針對(duì)變數(shù)而獲得的解答是否顯著而利用閾值。陰性對(duì)照組、敏感度及所使用的標(biāo)志可用于確定閾值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，閾值可由使用人員或者自動(dòng)確定。

根據(jù)一實(shí)例，閾值在檢測(cè)溫度中僅使用靶核酸序列中的一個(gè)并參照所檢測(cè)的信號(hào)來決定。

根據(jù)一實(shí)例，閾值對(duì)各個(gè)靶核酸序列或各個(gè)檢測(cè)溫度可特定地使用。

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)以與根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的靶擴(kuò)增相關(guān)的實(shí)時(shí)方式產(chǎn)生信號(hào)時(shí)，利用基準(zhǔn)值對(duì)各個(gè)擴(kuò)增循環(huán)或部分選擇的循環(huán)中的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，計(jì)算結(jié)果使用于對(duì)循環(huán)進(jìn)行繪制且分辨感興趣的信號(hào)(例如，決定靶核酸序列的存在與否)。

根據(jù)一實(shí)例，為了確定感興趣的信號(hào)的顯著性，閾值適用于繪制結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，靶核酸序列包括變異。

在本文中使用的術(shù)語“核苷酸變異”是指向序列類似的連續(xù)的脫氧核糖核酸(dna)片段中取代、缺失或插入特定位置的脫氧核糖核酸序列中的任意單一或多個(gè)核苷酸。這種連續(xù)的脫氧核糖核酸片段包括一個(gè)基因或一個(gè)染色體的任一其它部位。這種核苷酸變異可以是突變或多態(tài)性等位基因的變異。例如，在本發(fā)明中檢測(cè)的核苷酸變異包括單核苷酸多態(tài)性(snp)、突變、缺失、插入、取代及易位。所例示的核苷酸變異包括人類基因組內(nèi)的多種變異(例如，亞甲基四氫葉酸還原酶(mthfr)基因中的變異)、與病原體的耐藥性相關(guān)的變異及腫瘤形成誘發(fā)突變。在本文中使用的術(shù)語核苷酸變異包括核酸序列的特定位置中的任一變異。即，術(shù)語核苷酸變異包括核酸序列的特定位置中的野生型及其任意的突變型。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在本發(fā)明中檢測(cè)的核苷酸變異為單核苷酸多態(tài)性(snp)。

iii.用于分辨對(duì)靶核酸序列的感興趣的信號(hào)的試劑盒

在本發(fā)明的還有一實(shí)施方式中提供如下的試劑盒，用于對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨，上述試劑盒包括：(a)2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，用于對(duì)用于檢測(cè)上述第一靶核酸序列(t1)的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及用于檢測(cè)第二靶核酸序列(t2)的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的上述2個(gè)靶核酸序列進(jìn)行檢測(cè)；及(b)說明書，記載標(biāo)題為“對(duì)2個(gè)靶核酸序列感興趣的信號(hào)的分辨”的實(shí)施方式i的本發(fā)明的方法。

在本發(fā)明的附加實(shí)施方式提供如下的試劑盒，用于對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨，上述試劑盒包括：(a)n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，用于檢測(cè)上述n個(gè)靶核酸序列；及(b)說明書，記載標(biāo)題為“對(duì)至少3個(gè)靶核酸序列感興趣的信號(hào)的分辨”的實(shí)施方式ii的本方法。

本發(fā)明的試劑盒為了進(jìn)行本發(fā)明的方法而制備，為了去除導(dǎo)致本發(fā)明復(fù)雜的過度的重復(fù)，省略了本發(fā)明的試劑盒與方法之間的共同的說明。

上述的本發(fā)明的所有試劑盒可為選擇性地包括進(jìn)行緩沖液、脫氧核糖核酸聚合酶輔因子及脫氧核苷酸-5-三磷酸等的靶擴(kuò)增反應(yīng)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng))所需的試劑。選擇性地，試劑盒還可以包括多種多核苷酸分子、逆轉(zhuǎn)錄酶、多種緩沖液、試劑以及用于抑制脫氧核糖核酸聚合酶活性的抗體。并且，試劑盒可包括進(jìn)行陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組所需的試劑。在特定反應(yīng)中使用的試劑的最佳量可由熟知本公開事項(xiàng)的優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)人員容易地確定。試劑盒的組成成分可存在于單獨(dú)容器或者多個(gè)結(jié)構(gòu)要素可存在于一個(gè)容器內(nèi)。

用于記載或進(jìn)行本發(fā)明的方法的說明書可記載在適合的存儲(chǔ)介質(zhì)。例如，說明書可印刷在紙及塑料等的基板上。在再一實(shí)例中，說明書能夠以存在于只讀儲(chǔ)存器(cd-rom)及軟盤等的適合的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)的電子存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件方式存在。在另一實(shí)例中，可在試劑盒內(nèi)不包括實(shí)質(zhì)的說明書，只是提供從遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)源通過互聯(lián)網(wǎng)獲得說明書的機(jī)構(gòu)。上述實(shí)例中的一例是包含可瀏覽說明書的網(wǎng)址和/或可下載說明書的網(wǎng)址的試劑盒。

iv.用于分辨對(duì)與靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)的存儲(chǔ)介質(zhì)及裝置

在以下記述的存儲(chǔ)介質(zhì)、裝置及計(jì)算機(jī)程序用于在計(jì)算機(jī)中實(shí)施本發(fā)明，為了避免導(dǎo)致本說明書的復(fù)雜性的過多的重復(fù)，省略它們之間的共同內(nèi)容。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中提供如下的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法，上述對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法包括下述步驟：

步驟(a)，接收在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下檢測(cè)出的信號(hào)；借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)上述樣品內(nèi)第一靶核酸序列(t1)，借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)第二靶核酸序列(t2)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨；

步驟(b)，提供分別包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)上述2個(gè)靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述2個(gè)方程式：

(i)：st1d1+st2d1＝sd1

(ii)：st1d2+st2d2＝sd2

在上述式中，(sd1)為在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)，(sd2)為在第二檢測(cè)溫度檢測(cè)的信號(hào)；(st1d1)為表示在第一檢測(cè)溫度下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st2d1)為表示在第一檢測(cè)溫度下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st1d2)為表示在第二檢測(cè)溫度下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st2d2)為表示在第二檢測(cè)溫度下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)；變數(shù)的總數(shù)為4個(gè)；

步驟(c)，提供分別包括選自由上述4個(gè)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st1d2)及(st1d2)組成的組中的至少一個(gè)變數(shù)的2個(gè)附加方程式；以及

步驟(d)，為了分辨分配在上述2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)，借助在步驟(b)及步驟(c)中所提供的4個(gè)方程式來得到對(duì)上述變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)不僅包含方程式(i)及方程式(ii)，還包含附加方程式。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，作為第一靶核酸序列(t1)的基準(zhǔn)值(rv)的rvt1(d1d2)和/或作為第二靶核酸序列(t2)的基準(zhǔn)值(rv)的rvt2(d1d2)存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包含指令，上述指令不僅用于提供方程式(i)及方程式(ii)，還用于提供附加方程式。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包含在進(jìn)行上述方法的過程中用于輸入rvt1(d1d2)和/或rvt2(d1d2)的指令。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)還包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行用于獲得rvt1(d1d2)和/或rvt2(d1d2)的方法。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方式提供如下的計(jì)算機(jī)程序，即，運(yùn)行用于執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法的處理器且儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，上述計(jì)算機(jī)程序的特征在于，上述對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法包括下述步驟：

步驟(a)，接收在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下檢測(cè)出的信號(hào)；借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)上述樣品內(nèi)第一靶核酸序列(t1)，借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)第二靶核酸序列(t2)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨；

步驟(b)，提供分別包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)上述2個(gè)靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述2個(gè)方程式：

(i)：st1d1+st2d1＝sd1

(ii)：st1d2+st2d2＝sd2

在上述式中，(sd1)為在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)，(sd2)為在第二檢測(cè)溫度檢測(cè)的信號(hào)；(st1d1)為表示在第一檢測(cè)溫度下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st2d1)為表示在第一檢測(cè)溫度下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st1d2)為表示在第二檢測(cè)溫度下由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，(st2d2)為表示在第二檢測(cè)溫度下由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)；變數(shù)的總數(shù)為4個(gè)；

步驟(c)，提供分別包括選自由上述4個(gè)變數(shù)(st1d1)、(st2d1)、(st1d2)及(st1d2)組成的組中的至少一個(gè)變數(shù)的2個(gè)附加方程式；以及

步驟(d)，為了分辨分配在上述2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)，借助在步驟(b)及步驟(c)中所提供的4個(gè)方程式來得到對(duì)上述變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序不僅包含方程式(i)及方程式(ii)，還包含附加方程式。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序包含rvt1(d1d2)和/或rvt2(d1d2)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序不僅包含方程式(i)及方程式(ii)，還包含附加方程式。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序包含在進(jìn)行本方法的過程中用于輸入rvt1(d1d2)和/或rvt2(d1d2)的指令。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序還包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行用于獲得rvt1(d1d2)和/或rvt2(d1d2)的方法。

當(dāng)由上述處理器進(jìn)行時(shí)，會(huì)運(yùn)行上述程序指令，并使處理器進(jìn)行上述的本發(fā)明的方法。程序指令可包含用于接收在第一檢測(cè)溫度(d1)及第二檢測(cè)溫度(d2)下檢測(cè)的信號(hào)的指令，并且可包含如下的指令，即，通過使用從用于分辨分配在2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)的步驟(b)及步驟(c)提供的4個(gè)方程式來獲得對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

上述的本發(fā)明的方法由處理器實(shí)現(xiàn)，例如，由設(shè)置于獨(dú)立型計(jì)算機(jī)(stand-alonecomputer)、網(wǎng)絡(luò)連接電腦(networkattachedcomputer)或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其等的數(shù)據(jù)采集裝置(dataacquisitiondevice)的處理器實(shí)現(xiàn)。

計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)的類型包括刻錄光盤(cd-r)、只讀儲(chǔ)存器(cd-rom)、數(shù)字多功能光盤(dvd)、閃存存儲(chǔ)器、軟盤、硬盤驅(qū)動(dòng)器、便攜式硬盤、通用串行總線(usb)、磁帶、迷你光碟(minidisc)、非易失性存儲(chǔ)卡、電可擦只讀存儲(chǔ)器(eeprom)、光盤(cd)、光存儲(chǔ)介質(zhì)、隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(ram)、只讀存儲(chǔ)器(rom)、系統(tǒng)存儲(chǔ)器及web服務(wù)器等多種存儲(chǔ)介質(zhì)。

與信號(hào)相關(guān)的數(shù)據(jù)(例如，強(qiáng)度、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)及檢測(cè)溫度)可通過幾個(gè)設(shè)備來接收。例如，數(shù)據(jù)可借助位于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)數(shù)據(jù)收集裝置的處理器收集。在進(jìn)行收集期間可實(shí)時(shí)提供數(shù)據(jù)或者可儲(chǔ)存于存儲(chǔ)器單元或緩沖區(qū)，在完成實(shí)驗(yàn)后可在處理器提供數(shù)據(jù)。類似地，通過與上述收集裝置的網(wǎng)絡(luò)連接(例如，局域網(wǎng)(lan)，虛擬專用網(wǎng)絡(luò)(vpn)、互聯(lián)網(wǎng)及內(nèi)聯(lián)網(wǎng))或直接連接(例如，通用串行總線、其它直接有線連接或無線連接)向獨(dú)立計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等額外的系統(tǒng)提供上述數(shù)據(jù)集或者可向光盤、數(shù)字多功能光盤、軟盤、便攜式硬盤或獨(dú)立計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等便攜式介質(zhì)提供上述數(shù)據(jù)集。類似地，可通過與筆記本電腦或臺(tái)式計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等客戶端的網(wǎng)絡(luò)連接(例如，局域網(wǎng)、虛擬專用網(wǎng)絡(luò)、互聯(lián)網(wǎng)，內(nèi)聯(lián)網(wǎng)及無線通信網(wǎng)絡(luò))向服務(wù)器系統(tǒng)提供上述數(shù)據(jù)集。在接收或收集上述數(shù)據(jù)后，進(jìn)行上述數(shù)據(jù)分析步驟，并通過使用從用于分辨分配在2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)的步驟(b)及步驟(c)提供的4個(gè)方程式來獲得對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。例如，處理器通過處理所接收的數(shù)據(jù)來獲得在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)之間的差異。用于實(shí)現(xiàn)運(yùn)行本發(fā)明的處理器的指示可包含在邏輯系統(tǒng)。雖然可向便攜式硬盤、通用串行總線、軟盤、光盤及數(shù)字多功能光盤等的任何軟件存儲(chǔ)介質(zhì)提供上述指示，但是可進(jìn)行下載且可存儲(chǔ)于存儲(chǔ)器模塊(例如，硬盤驅(qū)動(dòng)器、本地或附著隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、只讀存儲(chǔ)器等其他存儲(chǔ)器)。用于運(yùn)行本發(fā)明的計(jì)算機(jī)代碼可運(yùn)行為如c、c++、java、visualbasic、vbscript、javascript、perl及xml等多種代碼語言。并且，多種語言及協(xié)議可利用于基于本發(fā)明的數(shù)據(jù)和命令的外部及內(nèi)部存儲(chǔ)和傳送。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中提供用于對(duì)作為分別與樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列(t1)及第二靶核酸序列(t2)的2個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的裝置，其特征在于，包括：(a)計(jì)算機(jī)處理器；以及(b)計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，與上述計(jì)算機(jī)處理器耦合。

根據(jù)一實(shí)例，上述裝置還包括：反應(yīng)容器，用于收容樣品及信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)；溫度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，用于調(diào)節(jié)上述反應(yīng)容器的溫度；和/或單一類型的檢測(cè)器，在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，計(jì)算機(jī)處理器不僅可使單一類型的檢測(cè)器在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)，還可獲得對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。上述處理器能夠以使一個(gè)處理器進(jìn)行2中動(dòng)作的方式制造：與2個(gè)檢測(cè)溫度下的檢測(cè)及解答的計(jì)算相關(guān)的指令。選擇性地，處理器單元能夠使2個(gè)處理器分別進(jìn)行2中動(dòng)作的方式制造。

上述裝置的第一個(gè)必要特征為具有可使上述裝置在2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)的處理器。根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)信號(hào)與靶核酸序列的擴(kuò)增一同產(chǎn)生時(shí)，上述裝置包括可在每次擴(kuò)增循環(huán)中在上述2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)的處理器。

上述裝置的第二個(gè)必要特征為具有通過處理上述2個(gè)檢測(cè)溫度下的信號(hào)來獲得對(duì)變數(shù)的解答的處理器。根據(jù)一實(shí)例，對(duì)變數(shù)的解答可由經(jīng)過數(shù)學(xué)處理的數(shù)值表示。

根據(jù)一實(shí)例，上述處理器可通過在用于檢測(cè)靶核酸序列的現(xiàn)有的裝置(例如，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置)安裝軟件來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)一實(shí)例，上述裝置包括可在2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)且可對(duì)2個(gè)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)處理的處理器。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中提供如下的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，即，包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法，上述對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法包括下述步驟：

步驟(a)，接收在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)；借助相應(yīng)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)各個(gè)上述靶核酸序列；由上述n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)對(duì)各個(gè)靶核酸序列不被單一類型的檢測(cè)器分辨；n為2以上的整數(shù)；

步驟(b)，提供分別包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述n個(gè)方程式：

在上述式中，(sd1)至(sdn)分別為在各個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)；(st1d1)至(stndn)分別為表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下由各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)；變數(shù)的總數(shù)為n²個(gè)；

步驟(c)，提供分別包括選自由變數(shù)(st1d1)至(stndn)組成的組中的至少一個(gè)變數(shù)的(n²-n)個(gè)附加方程式；以及

步驟(d)，為了分辨分配在上述n個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)，借助在步驟(b)及步驟(c)中所提供的n²個(gè)方程式來得到對(duì)上述變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)不僅存儲(chǔ)方程式(1)至方程式(n)，還存儲(chǔ)附加方程式。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，作為基準(zhǔn)值的rvtj(dαdβ)存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包含如下的指令，即，上述指令不僅提供方程式(1)至方程式(n)，還提供附加方程式。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包含在進(jìn)行本方法的過程中輸入rvtj(dαdβ)的指令。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)還包含用于實(shí)現(xiàn)處理器的指令，上述處理器用于進(jìn)行獲得rvtj(dαdβ)的方法。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中提供如下的計(jì)算機(jī)程序，即，運(yùn)行用于執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法的處理器且儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，上述執(zhí)行對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的方法包括：

步驟(a)，接收在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)；借助相應(yīng)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)各個(gè)上述靶核酸序列；由上述n個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)對(duì)各個(gè)靶核酸序列不被單一類型的檢測(cè)器(singletypeofdetector)分辨；n為2以上的整數(shù)；

步驟(b)，提供分別包括表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下對(duì)靶核酸序列產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)的下述n個(gè)方程式：

在上述式中，(sd1)至(sdn)分別為在各個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)；(st1d1)至(stndn)分別為表示在各個(gè)檢測(cè)溫度下由各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的感興趣的信號(hào)的變數(shù)；變數(shù)的總數(shù)為n²個(gè)；

步驟(c)，提供分別包括選自由變數(shù)(st1d1)至(stndn)組成的組中的至少一個(gè)變數(shù)的(n²-n)個(gè)附加方程式；以及

步驟(d)，為了分辨分配在上述n個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)，借助在步驟(b)及步驟(c)中所提供的n²個(gè)方程式來得到對(duì)上述變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序不僅包含方程式(1)至方程式(n)，還包含附加方程式。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序包含rvtj(dαdβ)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序包含如下的指令，上述指令不僅提供方程式(1)至方程式(n)，還提供附加方程式。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序包含在進(jìn)行本方法的過程中輸入rvtj(dαdβ)的指令。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序還包含用于實(shí)現(xiàn)用于進(jìn)行獲得rvtj(dαdβ)的方法的處理器的指令。

當(dāng)由上述處理器實(shí)現(xiàn)時(shí)，使上述程序指令運(yùn)行，并使處理器進(jìn)行上述的本發(fā)明的方法。程序指令可包括接收在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)的指令以及為了分辨分配在n個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)的感興趣的信號(hào)中的至少一個(gè)而獲得對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答的指令。

在本發(fā)明的又一施方式中提供用于對(duì)作為分別與樣品內(nèi)n個(gè)靶核酸序列有關(guān)的感興趣的信號(hào)且不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)進(jìn)行分辨的裝置，上述裝置包括：(a)計(jì)算機(jī)處理器；以及(b)上述的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，與上述計(jì)算機(jī)處理器耦合。

根據(jù)一實(shí)例，上述裝置還包括：反應(yīng)容器，用于收容樣品及信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)；溫度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)和/或單一類型的檢測(cè)器，上述溫度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)用于調(diào)節(jié)上述反應(yīng)容器的溫度，上述檢測(cè)器n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，計(jì)算機(jī)處理器不僅可使單一類型的檢測(cè)器在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)，還可獲得對(duì)變數(shù)中的至少一個(gè)的解答。上述處理器能夠以使一個(gè)處理器進(jìn)行2中動(dòng)作的方式制造：與n個(gè)檢測(cè)溫度下的檢測(cè)及解答的計(jì)算相關(guān)的指令。選擇性地，處理器單元能夠以使2個(gè)處理器分別進(jìn)行2中動(dòng)作的方式制造

上述裝置的第一個(gè)必要特征為具有可使上述裝置在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)的處理器。根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)信號(hào)與靶核酸序列的擴(kuò)增一同產(chǎn)生時(shí)，上述裝置包括可對(duì)應(yīng)每次擴(kuò)增循環(huán)在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)的處理器。

上述裝置的第二個(gè)必要特征為具有通過處理n個(gè)檢測(cè)溫度下的信號(hào)來獲得對(duì)變數(shù)的解答的處理器。根據(jù)一實(shí)例，對(duì)變數(shù)的解答可由經(jīng)過數(shù)學(xué)處理的數(shù)值表示。

根據(jù)一實(shí)例，上述處理器可通過在用于檢測(cè)靶核酸序列的現(xiàn)有的裝置(例如，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)裝置)安裝軟件來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)一實(shí)例，上述裝置包括可在n個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)且可對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)處理的處理器。

如下的總結(jié)本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)：

(a)在利用不同檢測(cè)溫度的本發(fā)明中，在一個(gè)反應(yīng)容器中僅用單一類型的標(biāo)志，也能夠以現(xiàn)有的實(shí)時(shí)方式檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。在現(xiàn)有技術(shù)中，在完成靶擴(kuò)增后，通過解鏈分析檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。與此不同地，由于本發(fā)明在靶擴(kuò)增后無需解鏈分析，從而大大縮短分析時(shí)間。

(b)本發(fā)明可通過使用數(shù)學(xué)方程式來獲得在檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的總信號(hào)中所包含的單獨(dú)的信號(hào)值(即，變數(shù))?；诜匠淌浇夥ǖ谋景l(fā)明能夠以系統(tǒng)化的方式獲得單獨(dú)的信號(hào)值，因此能夠以更準(zhǔn)確且便利的方式提供分析結(jié)果。

(c)本發(fā)明在為了靶核酸序列的檢測(cè)而選擇信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的方面非常自由。尤其，本發(fā)明可使用(i)相對(duì)各個(gè)靶核酸序列而在所有檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，(ii)相對(duì)靶核酸序列的一部分在所有檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及相對(duì)靶核酸序列的一部分而在部分檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，以及(iii)相對(duì)不同的靶核酸序列而具有不同的信號(hào)產(chǎn)生溫度范圍的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

(d)本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)在2個(gè)檢測(cè)溫度之間存在由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)變化的特定的關(guān)系(方式或規(guī)則)的發(fā)現(xiàn)。尤其，本發(fā)明為了檢測(cè)靶核酸序列而引入被稱為“表示信號(hào)變化的上述關(guān)系(方式或規(guī)則)的基準(zhǔn)值”的新概念。本發(fā)明使用包含基準(zhǔn)值的方程式。上述基準(zhǔn)值的利用能夠以更邏輯的方式提供個(gè)別信號(hào)，并且能夠以更便利的方式提供附加方程式。

通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的說明。這些實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，在所附的發(fā)明要求保護(hù)范圍中所公開的本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例，這對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。

實(shí)施例

實(shí)施例1：包括不同溫度下的號(hào)檢測(cè)的taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的實(shí)施及借助方程式解答的2個(gè)靶檢測(cè)

本發(fā)明者通過使用包括不同溫度下的信號(hào)檢測(cè)的taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及單一檢測(cè)通道來調(diào)查在1個(gè)反應(yīng)容器中是否能夠檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列。列具有變數(shù)的方程式，上述變數(shù)用于表示在2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的感興趣的信號(hào)，并解開上述方程式來分辨感興趣的信號(hào)，由此確定多個(gè)靶核酸序列的存在或不存在。

為了上游引物和下游引物的延伸及taqman探針的切割，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脫氧核糖核酸聚合酶。淋球菌(neisseriagonorrhoeae(ng))的基因組脫氧核糖核酸及沙眼衣原體(chlamydiatrachomatis(ct))的基因組脫氧核糖核酸用作靶核酸序列。準(zhǔn)備4種類型的樣品(淋球菌、沙眼衣原體、淋球菌+沙眼衣原體及無靶的對(duì)照組)并進(jìn)行了分析。

為了淋球菌及沙眼衣原體檢測(cè)而使用taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在靶核酸存在的情況下，taqman探針被切割，并放出標(biāo)志的片段。可通過從標(biāo)志的片段測(cè)定信號(hào)，來獲取擴(kuò)增曲線。

與淋球菌有關(guān)的taqman探針在其的5’-末端由熒光報(bào)道分子(quasar670)標(biāo)志以及在其的3’-末端由猝滅分子標(biāo)志(序列：3)，與沙眼衣原體有關(guān)的taqman探針在其的5’-末端由熒光報(bào)道分子(quasar670)標(biāo)志以及內(nèi)部部分由猝滅分子(bhq-2)標(biāo)志(序列：6)。

作為信號(hào)檢測(cè)溫度而選擇“60℃”及“72℃”。

通過使用表示在60℃及72℃的檢測(cè)溫度下借助淋球菌及沙眼衣原體提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)、淋球菌及沙眼衣原體的基準(zhǔn)值(rv)及在2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)來列方程式。

<方程式組1>

st1d1+st2d1＝sd1

st1d2+st2d2＝sd2

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

st1d1表示在60℃的檢測(cè)溫度下借助淋球菌而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t1表示淋球菌，d1表示60℃的檢測(cè)溫度；

st2d1表示在60℃的檢測(cè)溫度下借助沙眼衣原體而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t2表示沙眼衣原體，d1表示60℃的檢測(cè)溫度；

st1d2表示在72℃的檢測(cè)溫度下借助淋球菌而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t1表示淋球菌，d2表示72℃的檢測(cè)溫度；

st2d2表示至72℃的檢測(cè)溫度下借助沙眼衣原體而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t2表示沙眼衣原體，d2表示72℃的檢測(cè)溫度；

sd1為常數(shù)，在60℃的溫度下檢測(cè)信號(hào)，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得；

sd2為常數(shù)，在72℃的溫度下檢測(cè)信號(hào)，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得；

rvt1d1/d2為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算60℃的溫度下的rfu÷72℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu為對(duì)單獨(dú)含有淋球菌的樣品的檢測(cè)。t1表示淋球菌，d1及d2分別表示60℃及72℃的檢測(cè)溫度；及

rvt2d1/d2為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算60℃的溫度下的rfu÷72℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu為對(duì)單獨(dú)含有沙眼衣原體的樣品的檢測(cè)。t2表示沙眼衣原體，d1及d2分別表示60℃及72℃的檢測(cè)溫度。

用于解開上述方程式組的接近法如下：在重新制定具有針對(duì)各個(gè)靶核酸序列選擇的2個(gè)變數(shù)的線性聯(lián)立方程式后，獲得對(duì)上述2個(gè)變數(shù)的解答。例如，可制定下述4個(gè)線性聯(lián)立方程式：

聯(lián)立方程式1

st1d1+st2d1＝sd1

1/rvt1d1/d2×st1d1+1/rvt2d1/d2×st2d1＝sd2

聯(lián)立方程式2

rvt1d1/d2×st1d2+rvt2d1/d2×st2d2＝sd1

st1d2+st2d2＝sd2

聯(lián)立方程式3

st1d1+rvt2d1/d2×st2d2＝sd1

1/rvt1d1/d2×st1d1+st2d2＝sd2

聯(lián)立方程式4

rvt1d1/d2×st1d2+st2d1＝sd1

st1d2+1/rvt2d1/d2×st2d1＝sd2

然后，選擇上述4個(gè)線性聯(lián)立方程式中的一個(gè)。在各循環(huán)中獲得相應(yīng)的對(duì)變數(shù)的解答后，對(duì)其進(jìn)行繪制。繪制結(jié)果可被視為由相應(yīng)的變數(shù)表示的靶序列的擴(kuò)增曲線。最后，確定靶序列的存在或不存在。

在本實(shí)施例中，使用線性聯(lián)立方程式1、2。

在本實(shí)施例中使用的上游引物、下游引物及探針的序列如下：

ng-f5’-tacgcctgctactttcacgctiiiiigtaatcagatg-3’(序列：1)

ng-r5’-caatggatcggtatcactcgciiiiicgagcaagaac-3’(序列：2)

ng-p5’-[quasar670]tgcccctcattggcgtgtttcg[bhq-2]-3’(序列：3)

ct-f15’-tccgaatggataaagcgtgaciiiiiatgaactcac-3’(序列：4)

ct-r15’-aacaatgaatcctgagcaaaggiiiiicgttagagtc-3’(序列：5)

ct-p5’-[quasar670]cattgtaaaga[t(bhq-2)]atggtctgcttcgaccg[c3spacer]-3’(序列：6)

(i：脫氧肌苷)

利用包含靶核酸序列(1pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸，10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸或1pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶擴(kuò)增的上游引物(序列1)及10pmole的下游引物(序列2)、1.5pmole的taqman探針(序列3)、5pmole的用于沙眼衣原體的靶擴(kuò)增的上游引物(序列4)，10pmole的下游引物(序列5)、3pmole的taqman探針(序列6)以及5μl的4×主混合液(最終，200μm的三磷酸脫氧核苷酸(dntps)、2mm的mgcl2及2u的taq脫氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最終體積進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在50℃的溫度下在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(cfx96，伯樂公司(bio-rad))中將含有上述反應(yīng)混合物的管放入5分鐘，在95℃的溫度下變性15分鐘，并且以在95℃的溫度下30秒鐘、在60℃的溫度下60秒鐘、在72℃的溫度下30秒鐘的方式反復(fù)實(shí)施50次。在每個(gè)循環(huán)的60℃及72℃的溫度下進(jìn)行了信號(hào)的檢測(cè)。

如圖1a所示，當(dāng)淋球菌、沙眼衣原體或淋球菌+沙眼衣原體存在時(shí)，在60℃及72℃溫度下均檢測(cè)出了信號(hào)。當(dāng)靶核酸不存在時(shí)，未檢測(cè)出信號(hào)。通過使用淋球菌獨(dú)立樣品或沙眼衣原體獨(dú)立樣品的信號(hào)來計(jì)算了與各個(gè)靶序列有關(guān)的基準(zhǔn)值。如圖1b所示，與淋球菌及沙眼衣原體靶有關(guān)的基準(zhǔn)值分別為1.8及5.8。

圖1c示出了通過解開聯(lián)立方程式1來獲得的繪制結(jié)果。對(duì)st1d1的繪制結(jié)果可被視為60℃的溫度下的淋球菌的擴(kuò)增曲線，對(duì)st2d1的繪制結(jié)果可被制備60℃的溫度下的沙眼衣原體的擴(kuò)增曲線。為了確認(rèn)所獲得的擴(kuò)增曲線的顯著性，而參照淋球菌樣品及沙眼衣原體樣品的結(jié)果來選擇適合的閾值。如圖1c所示地，60℃的溫度下的淋球菌或沙眼衣原體的擴(kuò)增曲線可保濕各樣品被的靶核酸序列的存在或不存在。

圖1d示出如下的內(nèi)容，即，可通過解開聯(lián)立方程式2來獲得72℃的溫度下的淋球菌或沙眼衣原體的擴(kuò)增曲線，由此，確認(rèn)各樣品內(nèi)的靶核酸序列的存在或不存在。

上述結(jié)果證實(shí)，可列包含變數(shù)、基準(zhǔn)值及在各檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)的方程式，并通過解開上述方程式的方式來從在各檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)提取或分辨對(duì)各靶序列的感興趣的信號(hào)。

因此，可使用包括相同溫度下的信號(hào)檢測(cè)的taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及單一檢測(cè)通道來在一個(gè)反應(yīng)容器中檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列，由此可知，本發(fā)明的方程式解答方式能夠以更便利且具有更可信性的方式確定靶序列的存在與否。

實(shí)施例2：包括相同溫度下的信號(hào)檢測(cè)的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的執(zhí)行及借助方程式解答的2個(gè)靶檢測(cè)

本發(fā)明者通過使用包括相同溫度下的信號(hào)檢測(cè)地探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及單一檢測(cè)通道來調(diào)查在1個(gè)反應(yīng)容器中是否能夠檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列。列具有變數(shù)的方程式，上述變數(shù)用于表示在2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的感興趣的信號(hào)，并解開上述方程式來分辨感興趣的信號(hào)，由此確定多個(gè)靶核酸序列的存在或不存在。

為了上游引物和下游引物的延伸、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的切割及探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脫氧核糖核酸聚合酶。將淋球菌的基因組脫氧核糖核酸及沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸用作靶核酸序列。準(zhǔn)備4種類型的樣品(淋球菌、沙眼衣原體、淋球菌+沙眼衣原體及無模板的對(duì)照組)并進(jìn)行了分析。

通過使用探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來檢測(cè)了沙眼衣原體及淋球菌。在靶存在的情況下，探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸被切割，并生成探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸片段。上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸，而形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚體(二聚的捕捉和模板化寡核苷酸)。延伸二聚體的形成提供信號(hào)，并通過在延伸二聚體形成溫度下測(cè)定信號(hào)，來可獲取擴(kuò)增曲線。

作為信號(hào)檢測(cè)溫度而選擇“60℃”及“72℃”。

在本實(shí)施例中以在60℃及72℃的溫度下形成上述二聚體并提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)對(duì)沙眼衣原體的上述延伸二聚體的序列及長度。另一方面，對(duì)淋球菌的上述延伸二聚體的序列及長度被設(shè)計(jì)成如下，即，雖然在60℃的溫度下形成二聚體并提供信號(hào)，但在72℃的溫度下不形成二聚體，而使被解離從而無法提供信號(hào)。在72℃的檢測(cè)溫度下，產(chǎn)生對(duì)上述沙眼衣原體的信號(hào)，并被檢測(cè)出。在60℃的檢測(cè)溫度下，不僅產(chǎn)生對(duì)上述沙眼衣原體的信號(hào)，還產(chǎn)生對(duì)上述淋球菌的信號(hào)，并被檢測(cè)出。

為了上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的延伸，它們的3’-末端被碳間隔區(qū)阻斷。上述cto的5’-末端被猝滅分子(bhq-2)標(biāo)志以及其模板部位被熒光報(bào)道分子(calfluorred610)標(biāo)志(序列8及序列12)。

<方程式組2>

st1d1+st2d1＝sd1

st1d2+st2d2＝sd2

st1d2＝0

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

st1d1、st2d1、st1d2、st2d2、sd1、sd2及rvt2d1/d2與方程式組1中的定義相同。

在方程式組2中，代替淋球菌的基準(zhǔn)值rvt1d1/d2而使用方程式st1d2＝0。針對(duì)淋球菌的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)被制備成在存在淋球菌時(shí)在72℃的檢測(cè)溫度(d2)下也不會(huì)實(shí)質(zhì)性地產(chǎn)生信號(hào)，因此在本實(shí)施例中可選擇方程式st1d2＝0。

在各個(gè)循環(huán)中獲得對(duì)變數(shù)的相應(yīng)的解答后，對(duì)其進(jìn)行繪制。

<方程式組3>

st1d1+st2d1＝sd1

st1d2+st2d2＝sd2

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

st1d1、st2d1、st1d2、st2d2、sd1、sd2、rvt1d1/d2及rvt2d1/d2與方程式組1中的定義相同。

在本實(shí)施例中，針對(duì)淋球菌的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)被制備成在存淋球菌時(shí)在72℃的檢測(cè)溫度(d2)下也不會(huì)實(shí)質(zhì)性地產(chǎn)生信號(hào)。但是，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中通常檢測(cè)出的72℃的檢測(cè)溫度(d2)下的非常微弱的信號(hào)(例如，背景信號(hào))也可使用在實(shí)際提供rvt2d1/d2的方面。

如解聯(lián)立方程式1，能夠以相同的方式并使用聯(lián)立方程式1及聯(lián)立方程式2來獲得解答。在各個(gè)循環(huán)中獲得對(duì)變數(shù)的相同的解答后，對(duì)其進(jìn)行繪制。

<方程式組4>

st1d1+st2d1＝sd1

st1d2+st2d2＝sd2

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

st1d1、st2d1、st1d2、st2d2、sd1、sd2及rvt2d1/d2與方程式組1中的定義相同。

在方程式組4中，rvt1d1/d2為任意選擇常數(shù)值(arbitrary-selectedconstantvalue)。在本實(shí)施例中，針對(duì)淋球菌的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)被制備成在存在淋球菌時(shí)在72℃的檢測(cè)溫度(d2)下也不會(huì)實(shí)質(zhì)性地產(chǎn)生信號(hào)，因此代替經(jīng)實(shí)驗(yàn)所獲得的值，可使用針對(duì)rvt2d1/d2的任意選擇值。在此情況下，針對(duì)rvt2d1/d2的任意選擇值為10⁸，其更大于在方程式組3中經(jīng)實(shí)驗(yàn)所獲得的值。

如解聯(lián)立方程式1，能夠以相同的方式并使用聯(lián)立方程式1及聯(lián)立方程式2來獲得解答。在各個(gè)循環(huán)中獲得對(duì)變數(shù)的相應(yīng)的解答后，對(duì)其進(jìn)行繪制。

在本實(shí)施例中使用的上游引物、下游引物、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下：

ng-f5’-tacgcctgctactttcacgctiiiiigtaatcagatg-3’(序列：1)

ng-r5’-caatggatcggtatcactcgciiiiicgagcaagaac-3’(序列：2)

ng-pto5’-gtacgcgatacgggcccctcattggcgtgtttcg[c3spacer]-3’(序列：7)

ng-cto5’-[bhq-2]tttttttttttttttttttg[t(calfluorred610)]actgcccgtatcgcgtac[c3spacer]-3’(序列：8)

ct-f25’-gagttttaaaatgggaaattctggtiiiiitttgtataac-3’(序列：9)

ct-r25’-ccaattgtaatagaagcattggttgiiiiittattggaga-3’(序列：10)

ct-pto5’-gattacgcgaccgcatcagaagctgtcattttggctgcg[c3spacer]-3’(序列：11)

ct-cto5’-[bhq-2]gcgctggataccctggacga[t(calfluorred610)]atgtgcggtcgcgtaatc[c3spacer]-3’(序列：12)

(i：脫氧肌苷)

(下劃線文字表示探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位)

利用包含靶核酸序列(10pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸或10pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶擴(kuò)增的上游引物(序列1)及5pmole的下游引物(序列2)、3pmole的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸(序列7)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列8)，5pmole的用于沙眼衣原體的靶擴(kuò)增的上游引物(序列9)、5pmole的下游引物(序列10)、3pmole的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸(序列11)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列12)以及10μl的2×主混合液(最終，200μm的三磷酸脫氧核苷酸、2mm的mgcl2及2u的taq脫氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最終體積進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在50℃的溫度下在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(cfx96，伯樂公司(bio-rad))中將含有上述反應(yīng)混合物的管放入5分鐘后，在95℃的溫度下變性15分鐘，并在95℃的溫度下進(jìn)行30秒、在60℃的溫度下進(jìn)行60秒、在72℃的溫度下進(jìn)行30秒的過程循環(huán)反復(fù)50次。信號(hào)的檢測(cè)在每次循環(huán)均在60℃及72℃的溫度下進(jìn)行。

如圖2a所示，當(dāng)淋球菌、沙眼衣原體或淋球菌+沙眼衣原體存在時(shí)，在60℃的溫度下檢測(cè)信號(hào)。當(dāng)沙眼衣原體單獨(dú)存在時(shí)，在60℃及72℃的溫度下均檢測(cè)出信號(hào)。當(dāng)淋球菌單獨(dú)存在時(shí)，在60℃的溫度下檢測(cè)出信號(hào)，但在72℃的溫度下未檢測(cè)出。當(dāng)靶核酸序列不存在時(shí)，未檢測(cè)出信號(hào)。各個(gè)靶的基準(zhǔn)值使用淋球菌樣品或沙眼衣原體樣品的信號(hào)來計(jì)算，并示出在圖2b。如圖2b所示，針對(duì)淋球菌及沙眼衣原體的基準(zhǔn)值分別為36.7及1.2。

圖2c-圖2h示出通過解開方程式組2、3及4來獲得的繪制結(jié)果。針對(duì)st1d1、st2d1、st1d2及st2d2的繪制結(jié)果可分別被視為60℃的溫度下的淋球菌的擴(kuò)增曲線、60℃的溫度下的沙眼衣原體的擴(kuò)增曲線、72℃的溫度下的淋球菌的擴(kuò)增曲線以及72℃的溫度下的沙眼衣原體的擴(kuò)增曲線。為了確認(rèn)所獲得的擴(kuò)增曲線的顯著性，參照淋球菌樣品及沙眼衣原體樣品的結(jié)果來選擇適合的閾值。

如圖2c、圖2e及圖2g所示地，60℃的溫度下的淋球菌或沙眼衣原體的擴(kuò)增曲線可確認(rèn)各樣品內(nèi)的靶核酸序列的存在或不存在。

上述結(jié)果證實(shí)，可列包含變數(shù)、基準(zhǔn)值及在各檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)的方程式，并通過解開上述方程式的方式來從在各檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)提取或分辨對(duì)各靶序列的感興趣的信號(hào)。

因此，可使用包括相同溫度下的信號(hào)檢測(cè)的taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及單一檢測(cè)通道來在一個(gè)反應(yīng)容器中檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列，由此可知，本發(fā)明的方程式解答方式能夠以更便利且具有更可信性的方式確定靶序列的存在與否。

實(shí)施例3：包括相同溫度下的信號(hào)檢測(cè)地taqman/探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的執(zhí)行及借助解答方程式的3個(gè)靶檢測(cè)

本發(fā)明者通過使用包括不同溫度下的信號(hào)檢測(cè)地taqman/探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及單一檢測(cè)通道來調(diào)差在一個(gè)反應(yīng)容器中是否能夠檢測(cè)3個(gè)靶核酸序列。列具有變數(shù)的方程式，上述變數(shù)用于表示在3個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的感興趣的信號(hào)，并解開上述方程式來分辨感興趣的信號(hào)，由此確定多個(gè)靶核酸序列的存在或不存在。

為了上游引物和下游引物的延伸、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的切割及探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脫氧核糖核酸聚合酶。將淋球菌(neisseriagonorrhoeae(ng))的基因組脫氧核糖核酸、沙眼衣原體的(chlamydiatrachomatis(ct))基因組脫氧核糖核酸及生殖支原體(mycoplasmagenitalium(mg))的基因組脫氧核糖核酸作為靶核酸序列使用。準(zhǔn)備分別包括淋球菌、沙眼衣原體、生殖支原體、淋球菌及沙眼衣原體的混合物；淋球菌及生殖支原體的混合物；沙眼衣原體及生殖支原體的混合物；淋球菌、沙眼衣原體及生殖支原體的混合物及不存在模板的對(duì)照組的8個(gè)反應(yīng)管。

為了檢測(cè)生殖支原體，而使用taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。為了檢測(cè)沙眼衣原體及淋球菌，而使用探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

作為信號(hào)檢測(cè)溫度而選擇“60℃”、“72℃”及“95℃”。

在本實(shí)施例中，以在60℃及72℃的溫度下提供信號(hào)且在95℃的溫度下不提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)針對(duì)沙眼衣原體的上述延伸二聚體的序列及長度。另一方面，以在60℃的溫度下提供信號(hào)且在72℃及95℃的溫度下不提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)針對(duì)淋球菌的上述延伸二聚體的序列及長度。在95℃的檢測(cè)溫度下，產(chǎn)生并檢測(cè)出針對(duì)上述生殖支原體的信號(hào)。在72℃的檢測(cè)溫度下，不僅產(chǎn)生并檢測(cè)出針對(duì)上述生殖支原體的信號(hào)，還產(chǎn)生并檢測(cè)出針對(duì)上述沙眼衣原體的信號(hào)。并且，在60℃的檢測(cè)溫度下，不僅產(chǎn)生并檢測(cè)出針對(duì)上述生殖支原體及沙眼衣原體的信號(hào)，還產(chǎn)生并檢測(cè)出針對(duì)上述淋球菌的信號(hào)。

taqman探針的5’-末端被熒光報(bào)道分子(calfluorred610)標(biāo)記以及其3’-末端被猝滅分子(bhq-2)標(biāo)記(序列：15)。為了上述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的延伸，它們的3’-末端被碳間隔區(qū)阻斷。上述cto被猝滅分子(bhq-2)標(biāo)記以及其模板部位被熒光報(bào)道分子(calfluorred610)標(biāo)記(序列：8及12)。

在本實(shí)施例中，利用來源于各靶的基準(zhǔn)值及3個(gè)檢測(cè)溫度(95℃，72℃及60℃)的信號(hào)的繪制方法來提供表示各靶核酸序列的存在和不存在的擴(kuò)增曲線。將聯(lián)立方程式作為繪制方法使用，并適用于從各檢測(cè)溫度中提取靶信號(hào)的方面。用于獲得針對(duì)各靶核酸序列的擴(kuò)增曲線的基準(zhǔn)值的計(jì)算及聯(lián)立方程式如下：

<方程式組5>

st1d1+st2d1+st3d1＝sd1

st1d2+st2d2+st3d2＝sd2

st1d3+st2d3+st3d3＝sd3

st1d1/st1d2＝rvt1d1/d2

st1d1/st1d3＝rvt1d1/d3

st1d2/st1d3＝rvt1d2/d3

st2d1/st2d2＝rvt2d1/d2

st2d1/st2d3＝rvt2d1/d3

st2d2/st2d3＝rvt2d2/d3

st3d1/st3d2＝rvt3d1/d2

st3d1/st3d3＝rvt3d1/d3

st3d2/st3d3＝rvt3d2/d3

st1d1為表示在60℃的檢測(cè)溫度下借助淋球菌而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t1表示淋球菌，d1表示60℃的檢測(cè)溫度；

st2d1為表示在60℃的檢測(cè)溫度下借助沙眼衣原體而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t2表示沙眼衣原體，d1表示60℃的檢測(cè)溫度；

st3d1為表示在60℃的檢測(cè)溫度下借助生殖支原體而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t3表示生殖支原體，d1表示60℃的檢測(cè)溫度；

st1d2為表示在72℃的檢測(cè)溫度下借助淋球菌而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t1表示淋球菌，d2表示72℃的檢測(cè)溫度；

st2d2為表示在72℃的檢測(cè)溫度下借助沙眼衣原體而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t2表示沙眼衣原體，d2表示72℃的檢測(cè)溫度；

st3d2為表示在72℃的檢測(cè)溫度下借助生殖支原體而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t3表示生殖支原體，d2表示72℃的檢測(cè)溫度；

st1d3為表示在95℃的檢測(cè)溫度下借助淋球菌而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t1表示淋球菌，d3表示95℃的檢測(cè)溫度；

st2d3為在95℃的檢測(cè)溫度下借助沙眼衣原體而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t2表示沙眼衣原體，d3表示95℃的檢測(cè)溫度；

st3d3表示在95℃的檢測(cè)溫度下借助生殖支原體而提供的感興趣的信號(hào)的變數(shù)，t3表示生殖支原體，d3表示95℃的檢測(cè)溫度；

sd1為常數(shù)，在60℃的溫度下下檢測(cè)信號(hào)，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得；

sd2為常數(shù)，在72℃的溫度下下檢測(cè)信號(hào)，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得；

sd3為常數(shù)，在95℃的溫度下下檢測(cè)信號(hào)，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得；

rvt1d1/d2為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算60℃的溫度下的rfu÷72℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有淋球菌的樣品中檢測(cè)。t1表示淋球菌，d1及d2分別表示60℃及72℃的檢測(cè)溫度；

rvt1d1/d3為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算60℃的溫度下的rfu÷95℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有淋球菌的樣品中檢測(cè)。t1表示淋球菌，d1及d3分別表示60℃及95℃的檢測(cè)溫度；

rvt1d2/d3為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算72℃的溫度下的rfu÷95℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有淋球菌的樣品中檢測(cè)。t1表示淋球菌，d2及d3分別表示72℃及95℃的檢測(cè)溫度；

rvt2d1/d2為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算60℃的溫度下的rfu÷72℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有淋球菌的樣品中檢測(cè)。t1表示淋球菌，d1及d2分別表示60℃及72℃的檢測(cè)溫度；。

rvt2d1/d3為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算60℃的溫度下的rfu÷95℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有沙眼衣原體的樣品中檢測(cè)。t2表示沙眼衣原體，d1及d3分別表示60℃及95℃的檢測(cè)溫度；

rvt2d2/d3為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算72℃的溫度下的rfu÷95℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有沙眼衣原體的樣品中檢測(cè)。t2表示沙眼衣原體，d2及d3分別表示72℃及95℃的檢測(cè)溫度；

rvt3d1/d2為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算60℃的溫度下的rfu÷72℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有生殖支原體的樣品中檢測(cè)。t3表示生殖支原體，d1及d2分別表示60℃及72℃的檢測(cè)溫度；

rvt3d1/d3為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算60℃的溫度下的rfu÷95℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有生殖支原體的樣品中檢測(cè)。t3表示生殖支原體，d1及d3分別表示60℃及95℃的檢測(cè)溫度；及

rvt3d2/d3為常數(shù)，在端點(diǎn)計(jì)算72℃的溫度下的rfu÷95℃中的rfu，由此以實(shí)驗(yàn)的方式獲得，rfu從單獨(dú)含有生殖支原體的樣品中檢測(cè)。t3表示生殖支原體，d2及d3分別表示72℃及95℃的檢測(cè)溫度。

用于解開上述方程組的接近法如下：在重新制定具有針對(duì)各個(gè)靶核酸序列選擇的3個(gè)變數(shù)的線性聯(lián)立方程式后，獲得對(duì)上述3個(gè)變數(shù)的解答。例如，在方程式組5中使用9個(gè)聯(lián)立方程式中的適合的6個(gè)方程式來指定下述3個(gè)線性聯(lián)立方程式：

聯(lián)立方程式5

st1d1+st2d1+st3d1＝sd1

1/rvt1d1/d2×st1d1+1/rvt2d1/d2×st2d1+1/rvt3d1/d2×st3d1＝sd2

1/rvt1d1/d3×st1d1+1/rvt2d1/d3×st2d1+1/rvt3d1/d3×st3d1＝sd3

聯(lián)立方程式6

rvt1d1/d2×st1d2+rvt2d1/d2×st2d2+rvt3d1/d2×st3d2＝sd1

st1d2+st2d2+st3d2＝sd2

1/rvt1d2/d3×st1d2+1/rvt2d2/d3×st2d2+1/rvt3d2/d3×st3d2＝sd3

聯(lián)立方程式7

rvt1d1/d3×st1d3+rvt2d1/d3×st2d3+rvt3d1/d3×st3d3＝sd1

rvt1d2/d3×st1d3+rvt2d2/d3×st2d3+rvt3d2/d3×st3d3＝sd2

st1d3+st2d3+st3d3＝sd3

然后，在各個(gè)循環(huán)中獲得相應(yīng)的對(duì)變數(shù)的解答后，對(duì)其進(jìn)行繪制。繪制結(jié)果可被視為由相應(yīng)的變數(shù)表示的靶序列的擴(kuò)增曲線。最后，確定靶序列的存在或不存在。

在本實(shí)施例中，針對(duì)淋球菌的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)被制備成在存在淋球菌時(shí)在72℃及95℃的檢測(cè)溫度下也不會(huì)實(shí)質(zhì)性地產(chǎn)生信號(hào)，針對(duì)沙眼衣原體的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)被制備成在存在沙眼衣原體時(shí)在95℃的檢測(cè)溫度下也不會(huì)實(shí)質(zhì)性地產(chǎn)生信號(hào)。因此，可代替方程式組5而使用其他方程式組。

作為方程式組5的第一變形例，代替包含針對(duì)淋球菌的基準(zhǔn)值中的rvt1d1/d2、rvt1d1/d3或rvt1d2/d3的方程式而使用方程式st1d2＝0及st1d3＝0，代替包含針對(duì)沙眼衣原體的基準(zhǔn)值中的rvt2d1/d3或rvt2d2/d3的方程式而使用方程式st2d3＝0。

作為第二變形例，可代替經(jīng)實(shí)驗(yàn)所獲得的值而使用針對(duì)rvt1d1/d2、rvt1d1/d3、rvt1d2/d3、rvt2d1/d3及rvt2d2/d3的任意選擇值。

第一變形例及第二變形例的組合也可使用于本方法。

在本實(shí)施例中使用的上游引物、下游引物、探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸以及捕捉和模板化寡核苷酸及taqman探針的序列如下：

ng-f5’-tacgcctgctactttcacgctiiiiigtaatcagatg-3’(序列：1)

ng-r5’-caatggatcggtatcactcgciiiiicgagcaagaac-3’(序列：2)

ng-pto5’-gtacgcgatacgggcccctcattggcgtgtttcg[c3spacer]-3’(序列：7)

ng-cto5’-[bhq-2]tttttttttttttttttttg[t(calfluorred610)]actgcccgtatcgcgtac[c3spacer]-3’(序列：8)

ct-f25’-gagttttaaaatgggaaattctggtiiiiitttgtataac-3’(序列：9)

ct-r25’-ccaattgtaatagaagcattggttgiiiiittattggaga-3’(序列：10)

ct-pto5’-gattacgcgaccgcatcagaagctgtcattttggctgcg[c3spacer]-3’(序列：11)

ct-cto5’-[bhq-2]gcgctggataccctggacga[t(calfluorred610)]atgtgcggtcgcgtaatc[c3spacer]-3’(序列：12)

mg-f5’-aaaacccacggaaatgatgagaiiiiiattggttctac-3’(序列：13)

mg-r5’-ctcgttaatttacctattccattttgiiiiictgataaaag-3’(序列：14)

mg-p5’-[calfluorred610]gagttctttcaagaacagcaagaggtgt[bhq-2]-3’(序列：15)

(i：脫氧肌苷)

(下劃線文字表示探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位)

靶核酸序列(利用包含靶核酸序列(10pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸、10pg的生殖支原體的基因組脫氧核糖核酸、10pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸的混合物、10pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸及10pg的生殖支原體的基因組脫氧核糖核酸的混合物、10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸及10pg的生殖支原體的基因組脫氧核糖核酸的混合物或者分別為10pg的淋球菌、沙眼衣原體及生殖支原體的基因組脫氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶擴(kuò)增的上游引物(序列1)及5pmole的下游引物(序列2)、3pmole的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸(序列7)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列8)、5pmole的用于沙眼衣原體的靶擴(kuò)增的上游引物(序列9)、5pmole的下游引物(序列10)、3pmole的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸(序列11)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列12)以及10μl的2×主混合液(最終，200μm的三磷酸脫氧核苷酸、2mm的mgcl2及2u的taq脫氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最終體積進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在50℃的溫度下在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(cfx96，伯樂公司(bio-rad))中將含有上述反應(yīng)混合物的管放入5分鐘后，在95℃的溫度下變性15分鐘，并在95℃的溫度下進(jìn)行30秒、在60℃的溫度下進(jìn)行60秒、在72℃的溫度下進(jìn)行30秒的過程循環(huán)反復(fù)50次。信號(hào)的檢測(cè)在每次循環(huán)均在60℃、72℃及95℃的溫度下進(jìn)行。

如圖3a及圖3b所示地，當(dāng)存在淋球菌、沙眼衣原體、生殖支原體及混合靶時(shí)，在60℃的溫度下檢測(cè)信號(hào)。當(dāng)沙眼衣原體單獨(dú)存在時(shí)，在60℃及72℃的溫度下均檢測(cè)出信號(hào)，但在95℃的溫度下未檢測(cè)出信號(hào)。當(dāng)淋球菌單獨(dú)存在時(shí)，在60℃的溫度下檢測(cè)出信號(hào)，但在95℃及72℃的溫度下未檢測(cè)出信號(hào)。當(dāng)靶核酸序列不存在時(shí)，未檢測(cè)出信號(hào)。各靶的基準(zhǔn)值使用淋球菌單獨(dú)樣品、沙眼衣原體單獨(dú)樣品或生殖支原體單獨(dú)樣品的信號(hào)來計(jì)算，并示出在圖3c。

針對(duì)st1d1、st2d1、st3d1、st2d1、st2d2、st2d3、st3d1、st3d2及st3d3的繪制結(jié)果可分別被視為60℃的溫度下的淋球菌的擴(kuò)增曲線、60℃的溫度下的沙眼衣原體地?cái)U(kuò)增曲線、60℃的溫度下的生殖支原體的擴(kuò)增曲線、72℃的溫度下的淋球菌的擴(kuò)增曲線、72℃的溫度下的沙眼衣原體地?cái)U(kuò)增曲線、72℃的溫度下的生殖支原體的擴(kuò)增曲線、95℃的溫度下的淋球菌的擴(kuò)增曲線、95℃的溫度下的沙眼衣原體的擴(kuò)增曲線及95℃的溫度下的生殖支原體的擴(kuò)增曲線。為了確認(rèn)所獲得的擴(kuò)增曲線的顯著性，參照淋球菌單獨(dú)樣品、沙眼衣原體單獨(dú)樣品及生殖支原體單獨(dú)樣品的結(jié)果來選擇適合的閾值。

如圖3d及圖3e所示地，60℃的溫度下的淋球菌、沙眼衣原體或生殖支原體的擴(kuò)增曲線可確認(rèn)各樣品內(nèi)的靶核酸序列的存在或不存在。

上述結(jié)果證實(shí)，可列包含變數(shù)、基準(zhǔn)值及在各檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)的方程式，并通過解開上述方程式的方式來從在各檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)提取或分辨對(duì)各靶序列的感興趣的信號(hào)。

因此，可使用包括不同溫度下的信號(hào)檢測(cè)的taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及單一檢測(cè)通道來在一個(gè)反應(yīng)容器中檢測(cè)3個(gè)靶核酸序列，由此可知，本發(fā)明的方程式解答方式能夠以更便利且具有更可信性的方式確定3個(gè)靶序列的存在與否。

詳細(xì)記述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，可進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的原理的變形及修改，這對(duì)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的，本發(fā)明的范圍可根據(jù)所附的發(fā)明要求保護(hù)范圍和其的等同技術(shù)方案定義。

?序列表

<110>seegene,inc.

<120>與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)的分辨

<130>pp150136

<150>us62/089723

<151>2014-12-09

<150>us62/154319

<151>2015-04-29

<160>15

<170>kopatentin2.0

<210>1

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ng-f

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(26)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>1

tacgcctgctactttcacgctnnnnngtaatcagatg37

<210>2

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ng-r

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(26)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>2

caatggatcggtatcactcgcnnnnncgagcaagaac37

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ng-p

<400>3

tgcccctcattggcgtgtttcg22

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ct-f1

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(26)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>4

tccgaatggataaagcgtgacnnnnnatgaactcac36

<210>5

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ct-r1

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(27)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>5

aacaatgaatcctgagcaaaggnnnnncgttagagtc37

<210>6

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ct-p

<400>6

cattgtaaagatatggtctgcttcgaccg29

<210>7

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ng-pto

<400>7

gtacgcgatacgggcccctcattggcgtgtttcg34

<210>8

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ng-cto

<400>8

tttttttttttttttttttgtactgcccgtatcgcgtac39

<210>9

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ct-f2

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(30)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>9

gagttttaaaatgggaaattctggtnnnnntttgtataac40

<210>10

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ct-r2

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(30)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>10

ccaattgtaatagaagcattggttgnnnnnttattggaga40

<210>11

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ct-pto

<400>11

gattacgcgaccgcatcagaagctgtcattttggctgcg39

<210>12

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ct-cto

<400>12

gcgctggataccctggacgatatgtgcggtcgcgtaatc39

<210>13

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mg-f

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(27)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>13

aaaacccacggaaatgatgagannnnnattggttctac38

<210>14

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mg-r

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(31)

<400>14

ctcgttaatttacctattccattttgnnnnnctgataaaag41

<210>15

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mg-p

<400>15

gagttctttcaagaacagcaagaggtgt28