本發(fā)明涉及有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病的新型喹啉衍生物的鑒定，以及喹啉衍生物對(duì)炎性疾病的新型治療用途。

本發(fā)明還涉及與這種炎性疾病有關(guān)的生物標(biāo)志物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

炎癥是免疫系統(tǒng)對(duì)組織損傷和感染的保護(hù)性應(yīng)答。但是，在一些情況下，炎性應(yīng)答可以損傷肌體。在急性期，炎癥表征為疼痛、發(fā)熱、發(fā)紅、腫脹和功能喪失。存在多種影響全世界成千上萬(wàn)的人的炎性狀況。

事實(shí)上，炎性疾病包括多種狀況，包括與自身免疫疾病有關(guān)的炎性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的炎性疾病、關(guān)節(jié)炎疾病、炎性消化道疾病和炎性皮膚。其中，炎性腸病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化是特別受到關(guān)注的。

炎性腸病(ibd)是一種復(fù)雜的多因素疾病(andcerar,2012)。其通常是指潰瘍性結(jié)腸炎(uc)和crohn疾病(cd)，它們?yōu)樯婕澳c的炎癥的2種慢性狀況。ibd在發(fā)達(dá)國(guó)家是普通的，在北歐地區(qū)，多至每200位個(gè)體有1位受到這些疾病的影響?；加衖bd的患者展現(xiàn)出對(duì)于醫(yī)生而言的多種臨床挑戰(zhàn)問(wèn)題。dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎與不同促炎細(xì)胞因子(包括tnfalpha和ifngamma)的上調(diào)節(jié)有關(guān)。近來(lái)，已經(jīng)顯示，在患有活性u(píng)c的小兒患者中，mir-124受到特異性的下調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子3(stat3)的轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子表達(dá)、以及其下游靶物(其中有促炎細(xì)胞因子)的轉(zhuǎn)錄激活的水平升高(koukosetal.；gastroenterology；145(4):842-52:2013)。然而，盡管近來(lái)取得了進(jìn)展，但是仍需要具有快速起效以及用于增強(qiáng)的保持長(zhǎng)效緩解的能力的安全的、良好耐受的治療。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)是最常見(jiàn)的自身免疫疾病，并且患病率為全世界人口的大約0.3至1％，而且通常與活動(dòng)力降低、社會(huì)依賴(lài)性增加和工作障礙有關(guān)。ra是影響關(guān)節(jié)內(nèi)膜組織(被稱(chēng)為滑膜)的系統(tǒng)性炎性疾病。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織表征為成纖維樣滑膜細(xì)胞(fls)在內(nèi)膜襯里層中過(guò)度增殖，以及內(nèi)襯下巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞和b細(xì)胞、以及其他促進(jìn)骨和軟骨的炎癥和損壞的炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。促炎細(xì)胞因子(特別是腫瘤壞死因子alpha(tnfα)、白細(xì)胞介素-1(il-1)和-6(il-6)，其主要由滑液巨噬細(xì)胞產(chǎn)生)的關(guān)節(jié)內(nèi)和系統(tǒng)性表達(dá)例如通過(guò)有助于rafls的過(guò)度增殖而在ra的發(fā)病機(jī)理中起重要作用。通常使用稱(chēng)為緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥品(dmard)的一組小分子藥品來(lái)治療ra患者。dmard以某種方式抑制肌體的過(guò)于活躍的免疫和/或炎性系統(tǒng)，由此減緩疾病的進(jìn)程。對(duì)dmard不產(chǎn)生應(yīng)答的ra患者使用諸如腫瘤壞死因子(tnf)拮抗劑之類(lèi)的生物試劑來(lái)治療。然而，即使tnf拮抗劑有效地用于大約三分之二的患者中，但是應(yīng)答患者通常在5年內(nèi)變成無(wú)應(yīng)答的。因此，需要備選治療方法。值得注意的是，在ra成為慢性之前的早期階段，針對(duì)ra患者設(shè)計(jì)的新型治療方法受到特別關(guān)注。

多發(fā)性硬化(ms)是一種自身免疫性炎性疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病，其破壞髓磷脂、少突細(xì)胞和軸突。ms表征為多病灶炎癥以及巨噬細(xì)胞和致腦炎t細(xì)胞在中樞神經(jīng)細(xì)胞中的浸潤(rùn)。在整個(gè)中樞神經(jīng)細(xì)胞中都可以發(fā)現(xiàn)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且其參與cns炎性應(yīng)答的發(fā)作和進(jìn)展。當(dāng)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被激活時(shí)，其通過(guò)產(chǎn)生神經(jīng)毒素、炎性細(xì)胞(炎性蛋白質(zhì)-10、巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)-2、c-c趨化因子配體19、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2)和產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞而高度破壞cns的功能。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞指導(dǎo)這樣的炎性應(yīng)答，其可以導(dǎo)致腦和脊髓被對(duì)抗外來(lái)入侵者的免疫細(xì)胞以及破壞髓磷脂蛋白質(zhì)的t細(xì)胞浸潤(rùn)。在炎癥過(guò)程中，在cns中出現(xiàn)外周巨噬細(xì)胞，并且這些細(xì)胞具有高度激活的表現(xiàn)型，高效地刺激致腦炎t細(xì)胞的擴(kuò)張，并且認(rèn)為這些細(xì)胞有助于神經(jīng)元組織的破壞。

microrna(mirna)作為最廣泛的非編碼組是一類(lèi)大約22nt非編碼rna，其通過(guò)與靶mrna轉(zhuǎn)錄物的非翻譯區(qū)(utr)結(jié)合而抑制基因的表達(dá)(laietal.,naturegenetics,vol.30,no.4,pp.363–364,2002；barteletal.,cell,vol.136,no.2,pp.215–233,2009)。mirna基因代表已知的真核基因組的大約1-2％。預(yù)測(cè)表明每個(gè)mirna可以靶向超過(guò)200個(gè)轉(zhuǎn)錄物，并且單一的mrna可以受到多個(gè)mirna的調(diào)節(jié)(lindow,dnacellbiol.,vol.26(5),p.339-351,2007)。mirna由內(nèi)源發(fā)夾形轉(zhuǎn)錄物形成，并且通過(guò)與靶mrna的堿基配對(duì)而起作用，根據(jù)堿基配對(duì)的程度，導(dǎo)致mrna的切割或翻譯的阻抑。兩種加工事件導(dǎo)致成熟mirna形成：首先，新生的mirna轉(zhuǎn)錄物(pri-mirna)被加工成70個(gè)核苷酸前體(pre-mirna)，其由核輸出，并在細(xì)胞質(zhì)中切割從而生成短的(長(zhǎng)度為大約22個(gè)核苷酸)成熟的mirna(lee,emboj.,vol.21,p；4663-4670,2002)。mirna可以位于基因間或基因內(nèi)。當(dāng)位于基因間時(shí)，它們的表達(dá)與其他mirna相配合作為一簇(altuviaetal.,nucleicacidsresearch,vol.33,no.8,pp.2697–2706,2005,ozsolaketal.,genesanddevelopment,vol.22,no.22,pp.3172–3183,2008)。當(dāng)位于基因內(nèi)時(shí)，即，定位于編碼蛋白質(zhì)的基因中(幾乎在內(nèi)含子中排除)，它們通常由與它們宿主基因相同的鏈來(lái)表達(dá)(liuetal.,cellresearch,vol.18,no.10,pp.985–996,2008,kimetal.,embojournal,vol.26,no.3,pp.775–783,2007)并且處于相關(guān)的水平(baskervilleetal.,rna,vol.11,no.3,pp.241–247,2005)。

目前已經(jīng)顯示一種mirna(即，mir-124)的過(guò)表達(dá)會(huì)使炎性巨噬細(xì)胞失活，并將它們轉(zhuǎn)化成小膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。據(jù)信mir-124通過(guò)靶向cebpα(負(fù)責(zé)用于髓系細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子)而抑制巨噬細(xì)胞的激活。靜脈注射包含mir-124的脂質(zhì)體可以顯著地抑制臨床eae癥狀，并抑制致腦炎t細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞形成cns。

事實(shí)上，ponomarev等人(“microrna-124promotesmicrogliaquiescenceandsuppresseseaebydeactivatingmacrophagesviathec/ebp-α-pu.1pathway”；naturemedicine(2011)；17:1:64-71)表明mir-124作為小膠質(zhì)細(xì)胞靜息的重要調(diào)節(jié)因子并且作為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活的調(diào)控因子而起作用?；趯?shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis(eae))模型，本研究表明mir-124的表達(dá)模式在患有eae的小鼠中受到調(diào)控(根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型而受到上調(diào)或下調(diào))。

wo2010/151755還教導(dǎo)施用mir-124用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)炎性疾病。

sun等人(“microrna-124mediatesthecholinergicanti-inflammatoryactionthroughinhibitingtheproductionofpro-inflammatorycytokines”；cellresearch(2013)；23:1270-1283)還教導(dǎo)mir-124可以通過(guò)靶向stat3和tace而介導(dǎo)類(lèi)膽堿能的抗炎作用。

另一方面，已經(jīng)鑒定新型化合物，在本發(fā)明中還稱(chēng)為“喹啉衍生物”，但是用于不同的適應(yīng)癥。

參照如下，喹啉是下式所示的雜環(huán)芳香族有機(jī)化合物：

因此，“喹啉衍生物”包括取代的喹啉，例如單取代的或多取代的喹啉。

wo2010/143170教導(dǎo)了用于治療與過(guò)早衰老有關(guān)的狀況的化合物的用途。

wo2010/143169和wo2012/080953教導(dǎo)了用于治療aids的化合物的用途。

wo2010/143168教導(dǎo)了用于治療一系列癌癥的化合物的用途。已經(jīng)顯示這些化合物能夠糾正備選剪接的缺陷。

發(fā)明概述

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，下文中式(i)所定義的化合物可以用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

因此，本發(fā)明涉及下文定義的式(i)所示的化合物，用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

具體而言，本發(fā)明涉及下文定義的式(i)所示的化合物，用于治療和/或預(yù)防炎癥和/或可以與所述的炎性疾病一起發(fā)生的炎癥。

本發(fā)明還涉及至少一種mirna(所述的至少一種mirna為mir-124)作為生物標(biāo)志物用于篩選喹啉衍生物以及具體而言的式(i)所示的化合物的體外或離體的用途，其中推定所述的喹啉衍生物以及具體而言的式(i)所示的化合物有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及如下文定義的式(id)或(ie)所示的化合物。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含式(id)或(ie)的至少一種化合物的藥物組合物。

本發(fā)明還涉及在以下列表中選擇的化合物：

-(8)8-氯代-5-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(9)8-氯代-n⁴-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n²-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2,4-二胺

-(10)8-氯代-n-甲基-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(11)8-氯代-n⁴-(2-嗎啉乙基)-n²-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2,4-二胺

-(13)4,8-二氯-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(14)8-氯代-n-(3-嗎啉丙基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(15)8-氯代-6-(2-嗎啉乙氧基)-n-(3-嗎啉丙基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(16)8-氯代-5-(2-嗎啉乙氧基)-n-(3-嗎啉丙基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(17)8-氯代-6-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(18)8-氯代-6-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(19)8-氯代-6-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(20)8-氯代-n-(3-氟代-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(21)n-(5-溴代-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)-8-氯代喹啉-2-胺

-(22)n²-(8-氯代喹啉-2-基)-n⁵-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)-4-(三氟甲基)吡啶-2,5-二胺

-(28)8-氯代-n-甲基-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(29)8-氯代-5-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(30)8-氯代-n-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(31)8-氯代-n-(2-嗎啉乙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(32)8-氯代-n-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(33)8-氯代-n-(4-嗎啉丁基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(34)8-氯代-n⁴-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n²-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2,4-二胺

-(35)4,8-二氯-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(36)8-氯代-5-(2-嗎啉乙氧基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(37)n¹-(4,8-二氯代喹啉-2-基)-4-(三氟甲氧基)苯-1,2-二胺

-(38)4,8-二氯-n-(2-嗎啉乙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(39)8-氯代-6-(2-嗎啉乙氧基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(40)8-氯代-n²-(2-嗎啉乙基)-n⁴-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n²-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2,4-二胺

-(41)8-氯代-n-(2-嗎啉乙基)-n-(2-硝基-4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(42)n¹-(8-氯代喹啉-2-基)-n¹-(2-嗎啉乙基)-4-(三氟甲氧基)苯-1,2-二胺

-(43)8-氯代-5-(2-嗎啉乙氧基)-n-(2-嗎啉乙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(44)n¹-(8-氯代-5-(2-嗎啉乙氧基)喹啉-2-基)-4-(三氟甲氧基)苯-1,2-二胺

-(46)8-氯代-2-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)喹啉

-(47)4-(2-((8-氯代-2-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)喹啉-6-基)氧基)乙基)嗎啉

-(48)8-氯代-2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)喹啉

-(49)4-(2-((8-氯代-2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)喹啉-6-基)氧基)乙基)嗎啉

-(50)4-(2-((8-氯代-2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)喹啉-5-基)氧基)乙基)嗎啉

-(51)磷酸單-[8-氯代-2-(4-三氟甲基-吡啶-2-基氨基)-喹啉-6-基]酯

-(52)磷酸單-[2-(8-氯代-喹啉-2-基氨基)-5-三氟甲氧基-苯基]酯

-(53)磷酸單-[8-氯代-2-(4-三氟甲氧基-苯基氨基)-喹啉-6-基]酯

-以及它們的藥物可接受的鹽，以及更具體地選自上文定義的化合物(8)，(9)；(10)；(11)；(30)；(46)；(47)；(48)；(49)和(50)或它們的一種可藥用的鹽。

本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含式(id)或(ie)所示的至少一種化合物，或者上文定義的化合物(8)、(9)、(10)、(11)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)、(34)、(35)、(36)、(37)、(38)、(39)、(40)、(41)、(42)、(43)、(44)、(46)、(47)、(48)、(49)、(50)、(51)、(52)和(53)中的一種，更具體地化合物(8)、(9)、(10)、(11)、(30)、(46)、(47)、(48)、(49)和(50)中的一種。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于增加真核細(xì)胞中mir-124的表達(dá)的體外或離體方法，其至少包括以下步驟：

a)提供真核細(xì)胞；

b)使所述的細(xì)胞與喹啉衍生物，并且特別是式(i)所示的化合物接觸。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及篩選衍生化合物，并且特別是式(i)所示的化合物的體外或離體方法，其中推定所述的衍生化合物，并且特別是式(i)所示的化合物有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病，所述的方法至少包括以下步驟：

a)提供真核細(xì)胞；

b)使所述的細(xì)胞與式(i)所示的化合物接觸；

c)測(cè)量所述的細(xì)胞中mir-124的表達(dá)；以及

d)當(dāng)在步驟c)中測(cè)量的mir-124的表達(dá)水平相對(duì)于參照值升高時(shí)，選擇所述的候選物，推定所述的候選物有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：葡聚糖硫酸鈉(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型1——在下文定義的喹啉衍生物化合物(24)存在下，在dss-小鼠模型上，在一段時(shí)間(天)內(nèi)體重減輕的百分率的變化。體重減輕的百分率(％)在y-軸上示出。在第3天至第10天(x-軸)進(jìn)行dss處理。在第3天至第29天進(jìn)行使用處于甲基纖維素(mc)中的喹啉衍生物、或者僅使用mc的填喂法。

圖2：葡聚糖硫酸鈉(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型2——在下文定義的喹啉衍生物化合物(24)存在下，在第二輪dss后，在dss-小鼠模型上，在一段時(shí)間(天)內(nèi)體重減輕的百分率的變化。體重減輕的百分率(％)在y-軸上示出。從第12天開(kāi)始，在5天(x-軸)內(nèi)進(jìn)行dss處理。在第3天至第29天進(jìn)行使用處于甲基纖維素(mc)中的喹啉衍生物、或者僅使用mc的填喂法。

圖3：葡聚糖硫酸鈉(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型——在第二次dss處理(5天)的2-3天除去結(jié)腸，并測(cè)量結(jié)腸尺寸(cm)的變化。(ns)表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。使用mann-whitney檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，星號(hào)表示顯著性差異(p<0.5)，2個(gè)星號(hào)表示極顯著性差異(p<0.05)。

圖4：葡聚糖硫酸鈉(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型——在第二次dss處理的第3天除去結(jié)腸，并針對(duì)損傷數(shù)進(jìn)行分析。在顯微鏡下觀(guān)察損傷并測(cè)量。

圖5：葡聚糖硫酸鈉(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型——在第二次dss處理的第3天除去結(jié)腸，并測(cè)定損傷面積(mm²)。

圖6：膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型——在平均10個(gè)個(gè)體的組群中，在一段時(shí)間內(nèi)(周)關(guān)節(jié)腫脹的變化(mm)。關(guān)節(jié)腫脹(mm)在y-軸上示出。在12周內(nèi)評(píng)估未處理組與處理組之間的變化。

發(fā)明詳述

需要鑒定用于治療和/或預(yù)防炎性疾病的新型化合物。

還需要用于評(píng)估候選藥品(例如喹啉衍生物)對(duì)炎性疾病的活性的新型生物標(biāo)志物。

本發(fā)明的目的是滿(mǎn)足這些需要。

喹啉衍生物

根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明的主題涉及式(i)所示的化合物或其任意一種藥物可接受的鹽在治療和/或預(yù)防炎性疾病中的用途：

其中：

z為c或n；

v為c或n；

是指芳香族環(huán)，其中v為c或n，并且當(dāng)v為n時(shí)，v在z的鄰位、間位或?qū)ξ?，即，分別形成吡啶、噠嗪、嘧啶或吡嗪基團(tuán)；

r獨(dú)立地表示氫原子，鹵素原子或選自以下的基團(tuán)：–cn基團(tuán)、羥基基團(tuán)、–coor1基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷氧基基團(tuán)、(c3-c6)環(huán)烷基基團(tuán)、-no2基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)、(c1-c4)烷氧基基團(tuán)、苯氧基基團(tuán)、-nr1-so2-nr1r2基團(tuán)、-nr1-so2-r1基團(tuán)、-nr1-c(＝o)-r1基團(tuán)、-nr1-c(＝o)-nr1r2基團(tuán)、-so2-nr1r2基團(tuán)、-so3h基團(tuán)、-o-so2-or3基團(tuán)、-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)、-o-ch2-coor3基團(tuán)和(c1-c3)烷基基團(tuán),所述的烷基可任選地被羥基基團(tuán)單取代；

q為n或o，前提條件是當(dāng)q為o時(shí)，r”不存在；

r1和r2獨(dú)立地為氫原子或(c1-c3)烷基基團(tuán)；

r3和r4獨(dú)立地表示氫原子、li⁺、na⁺、k⁺、n⁺(ra)4或芐基基團(tuán)；

n為1、2或3；

n’為1、2或3；

r’獨(dú)立地表示氫原子或選自以下的基團(tuán)：(c1-c3)烷基基團(tuán)、鹵素原子、羥基基團(tuán)、-coor1基團(tuán)、-no2基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)、嗎啉基或嗎啉基團(tuán)、n-甲基哌嗪基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c4)烷氧基基團(tuán)、-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)和-cn基團(tuán)，并且可以進(jìn)一步為選自以下的基團(tuán)：

a為共價(jià)鍵、氧原子或nh；

b為共價(jià)鍵或nh；

m為1、2、3、4或5；

p為1、2或3；

ra和rb獨(dú)立地表示氫原子、(c1-c5)烷基基團(tuán)或(c3-c6)環(huán)烷基基團(tuán)；

ra和rb與它們所連接的氮原子可以一起進(jìn)一步形成飽和的5-或6-元雜環(huán)，所述5-或6-元雜環(huán)可任選地進(jìn)一步包含選自n、o和s的雜原子，所述的雜環(huán)可任選地被一個(gè)或多個(gè)ra取代，前提條件是當(dāng)r’為基團(tuán)(iia)或(iiia)時(shí)，只有其他的r’基團(tuán)不同于所述的基團(tuán)(iia)或(iiia)，n’可以為2或3；

r”為氫原子、(c1-c4)烷基基團(tuán)，或者為上文定義的基團(tuán)(iia)。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，q為n。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，n為1或2。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，n’為1或2。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，r”為氫原子、(c1-c4)烷基基團(tuán)或基團(tuán)其中m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，r獨(dú)立地表示氫原子、甲基基團(tuán)、甲氧基基團(tuán)、三氟甲基基團(tuán)、三氟甲氧基基團(tuán)、氨基基團(tuán)、鹵素原子和-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)，并且更具體為氟原子或氯原子、三氟甲氧基基團(tuán)和氨基基團(tuán)。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，r’獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子并且更具體為氟原子或氯原子、氨基基團(tuán)、甲基基團(tuán)、-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)或基團(tuán)其中a為o或nh；m為2或3；并且x1為o、ch2或n-ch3，前提條件是當(dāng)r’為所述的基團(tuán)時(shí),n’為1或2，并且當(dāng)n’為2時(shí)，其他r’基團(tuán)不同于所述的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’備選地獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子并且更具體地為氟原子或氯原子、甲基基團(tuán)或基團(tuán)其中a為o或nh，m為2，并且x1為o、ch2或n-ch3，前提條件是當(dāng)r’為所述的基團(tuán)時(shí)，n’為1或2，并且當(dāng)n’為2時(shí)，其他的r’基團(tuán)不同于所述的基團(tuán)。

所有上文和下文所述的具體的實(shí)施方案當(dāng)然可以結(jié)合在一起，并且形成本發(fā)明的一部分。

式(i)所示的化合物包括下文定義的式(ia)、(ib)、(ic)、(id)和(ie)所示的化合物。

根據(jù)具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的另一個(gè)主題是式(ia)所示的化合物在治療和/或預(yù)防炎性疾病中的用途：

其中r、r’、r”、n和n’如上文定義；

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n為1或2。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n’為1或2。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子，或者選自羥基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷氧基基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)、(c1-c4)烷氧基基團(tuán)和(c1-c3)烷基基團(tuán)的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子，或者選自(c1-c3)烷基基團(tuán)、羥基基團(tuán)、-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)或基團(tuán)的基團(tuán)，其中a為o或nh，m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，前提條件是當(dāng)r’為所述的基團(tuán)時(shí)，n’為1或2，并且當(dāng)n’為2時(shí)，其他的r’基團(tuán)不同于所述的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r”為氫原子、(c1-c4)烷基基團(tuán)或基團(tuán)其中m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，而且優(yōu)選地，r”為氫原子或甲基基團(tuán)。

根據(jù)具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的另一個(gè)主題是式(ib)所示的化合物在治療和/或預(yù)防炎性疾病中的用途：

其中r、r’、r”、n和n’如上文定義。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n為1或2。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n’為1、2或3。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子，或者選自羥基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷氧基基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)、(c1-c4)烷氧基基團(tuán)、-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)和(c1-c3)烷基基團(tuán)的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子，或者選自(c1-c3)烷基基團(tuán)、羥基基團(tuán)、-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)或基團(tuán)的基團(tuán)，其中a為o或nh，m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，前提條件是當(dāng)r’為所述的基團(tuán)時(shí)，n’為1或2，并且當(dāng)n’為2時(shí)，其他的r’基團(tuán)不同于所述的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’備選地獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子，或者選自(c1-c3)烷基基團(tuán)、羥基基團(tuán)或-nr1r2基團(tuán)的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r”為氫原子、(c1-c4)烷基基團(tuán)或基團(tuán)其中m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，而且優(yōu)選地r”為氫原子或甲基基團(tuán)。

根據(jù)具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的另一個(gè)主題是式(ic)所示的化合物在治療和/或預(yù)防炎性疾病中的用途：

其中r、r’、r”、n和n’如上文定義。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n為1。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n’為1。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子，或者選自羥基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷氧基基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)、(c1-c4)烷氧基基團(tuán)和(c1-c3)烷基基團(tuán)的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r備選地獨(dú)立地表示氫原子或鹵素原子。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子或者選自(c1-c3)烷基基團(tuán)、羥基基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)或基團(tuán)的基團(tuán)，其中a為o或nh，m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，前提條件是當(dāng)r’為所述的基團(tuán)時(shí)，n’為1或2，并且當(dāng)n’為2時(shí)，其他的r’基團(tuán)不同于所述的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’備選地獨(dú)立地表示氫原子或鹵素原子。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r”為氫原子、(c1-c4)烷基基團(tuán)或基團(tuán)其中m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，而且優(yōu)選地r”為氫原子或甲基基團(tuán)。

根據(jù)具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的另一個(gè)主題是式(id)所示的化合物在治療和/或預(yù)防炎性疾病中的用途：

其中r、r’、n和n’如上文定義。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n為1。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n’為1。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子，或者選自羥基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷氧基基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)、(c1-c4)烷氧基基團(tuán)和(c1-c3)烷基基團(tuán)的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r備選地獨(dú)立地表示氫原子、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷氧基基團(tuán)或鹵素原子。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子或者選自(c1-c3)烷基基團(tuán)、羥基基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)或基團(tuán)的基團(tuán)，其中a為o或nh，m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，前提條件是當(dāng)r’為所述的基團(tuán)時(shí)，n’為1或2，并且當(dāng)n’為2時(shí)，其他的r’基團(tuán)不同于所述的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’備選地獨(dú)立地表示氫原子或鹵素原子。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r”為氫原子、(c1-c4)烷基基團(tuán)或基團(tuán)其中m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，而且優(yōu)選地r”為氫原子或甲基基團(tuán)。

根據(jù)具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的另一個(gè)主題是式(ie)所示的化合物在治療和/或預(yù)防炎性疾病中的用途：

其中r、r’、n和n’如上文定義。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n為1。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，n’為1。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子，或者選自羥基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷氧基基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)、(c1-c4)烷氧基基團(tuán)和(c1-c3)烷基基團(tuán)的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r備選地獨(dú)立地表示氫原子、(c1-c3)氟代烷基基團(tuán)、(c1-c3)氟代烷氧基基團(tuán)或鹵素原子。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子或者選自(c1-c3)烷基基團(tuán)、羥基基團(tuán)、-nr1r2基團(tuán)或基團(tuán)的基團(tuán)，其中a為o或nh，m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，前提條件是當(dāng)r’為所述的基團(tuán)時(shí)，n’為1或2，并且當(dāng)n’為2時(shí)，其他的r’基團(tuán)不同于所述的基團(tuán)。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r’備選地獨(dú)立地表示氫原子或鹵素原子。

根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，r”為氫原子、(c1-c4)烷基基團(tuán)或基團(tuán)其中m為2或3，并且x1為o、ch2或n-ch3，而且優(yōu)選地r”為氫原子或甲基基團(tuán)。

根據(jù)另一個(gè)具體的實(shí)施方案，上文定義的所述的化合物(id)和(ie)也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，式(i)所示的一些化合物是新型的，構(gòu)成了本發(fā)明的一部分，并且選自以下(并具有下文表1中發(fā)現(xiàn)的數(shù)字)：

-(8)8-氯代-5-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(9)8-氯代-n⁴-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n²-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2,4-二胺

-(10)8-氯代-n-甲基-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(11)8-氯代-n⁴-(2-嗎啉乙基)-n²-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2,4-二胺

-(13)4,8-二氯-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(14)8-氯代-n-(3-嗎啉丙基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(15)8-氯代-6-(2-嗎啉乙氧基)-n-(3-嗎啉丙基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(16)8-氯代-5-(2-嗎啉乙氧基)-n-(3-嗎啉丙基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(17)8-氯代-6-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(18)8-氯代-6-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(19)8-氯代-6-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)-n-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(20)8-氯代-n-(3-氟代-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2-胺

-(21)n-(5-溴代-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)-8-氯代喹啉-2-胺

-(22)n²-(8-氯代喹啉-2-基)-n⁵-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)-4-(三氟甲基)吡啶-2,5-二胺

-(28)8-氯代-n-甲基-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(29)8-氯代-5-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(30)8-氯代-n-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(31)8-氯代-n-(2-嗎啉乙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(32)8-氯代-n-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(33)8-氯代-n-(4-嗎啉丁基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(34)8-氯代-n⁴-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n²-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2,4-二胺

-(35)4,8-二氯-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(36)8-氯代-5-(2-嗎啉乙氧基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(37)n¹-(4,8-二氯代喹啉-2-基)-4-(三氟甲氧基)苯-1,2-二胺

-(38)4,8-二氯-n-(2-嗎啉乙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(39)8-氯代-6-(2-嗎啉乙氧基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(40)8-氯代-n²-(2-嗎啉乙基)-n⁴-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n²-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2,4-二胺

-(41)8-氯代-n-(2-嗎啉乙基)-n-(2-硝基-4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(42)n¹-(8-氯代喹啉-2-基)-n¹-(2-嗎啉乙基)-4-(三氟甲氧基)苯-1,2-二胺

-(43)8-氯代-5-(2-嗎啉乙氧基)-n-(2-嗎啉乙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺

-(44)n¹-(8-氯代-5-(2-嗎啉乙氧基)喹啉-2-基)-4-(三氟甲氧基)苯-1,2-二胺

-(46)8-氯代-2-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)喹啉

-(47)4-(2-((8-氯代-2-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)喹啉-6-基)氧基)乙基)嗎啉

-(48)8-氯代-2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)喹啉

-(49)4-(2-((8-氯代-2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)喹啉-6-基)氧基)乙基)嗎啉

-(50)4-(2-((8-氯代-2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)喹啉-5-基)氧基)乙基)嗎啉

-(51)磷酸單-[8-氯代-2-(4-三氟甲基-吡啶-2-基氨基)-喹啉-6-基]酯

-(52)磷酸單-[2-(8-氯代-喹啉-2-基氨基)-5-三氟甲氧基-苯基]酯

-(53)磷酸單-[8-氯代-2-(4-三氟甲氧基-苯基氨基)-喹啉-6-基]酯

-以及它們可藥用的鹽。

就本發(fā)明的目的而言，式(i)所示的化合物包括式(ia)、(ib)、(ic)、(id)和(ie)所示的化合物的任意一種，以及它們的組合。式(i)所示的化合物包括表1中定義的化合物(1)至(53)，以及它們的組合。

本發(fā)明的化合物可以以游離堿基的形式存在，或者與藥物可接受的酸形成加成鹽。

式(i)所示的化合物的合適的生理學(xué)可接受的酸加成鹽包括氫溴酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、三氟醋酸鹽、抗壞血酸鹽、鹽酸鹽、酒石酸鹽、三氟甲基磺酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲磺酸鹽、甲酸鹽、醋酸鹽和延胡索酸鹽。

式(i)所示的化合物和/或其鹽可以形成溶劑化物或水合物，并且本發(fā)明包括所有這些溶劑化物和水合物。

術(shù)語(yǔ)“水合物”和“溶劑化物”簡(jiǎn)單地是指根據(jù)本發(fā)明的化合物(i)可以為水合物或溶劑化物形式，即，與一種或多種水或溶劑分子組合或結(jié)合。這僅是此類(lèi)化合物的化學(xué)特征，其可以適用于所有此類(lèi)型的有機(jī)化合物。

式(i)所示的化合物可以包括一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子。因此，它們可以以對(duì)映異構(gòu)體形式或非對(duì)映異構(gòu)體形式存在。這些對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體和它們的混合物(包括外消旋混合物)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)：

-“鹵素”理解為是指氯、氟、溴或碘，并且具體是指氯、氟或溴；

-“(c1-c5)烷基”如本文所用，分別是指c1-c5的正、仲或叔的飽和烴。實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、丁基、戊基；

-“(c3-c6)環(huán)烷基”如本文所用，分別是指環(huán)狀飽和烴。實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基。

-“(c1-c4)烷氧基”如本文所用，分別是指o-(c1-c4)烷基部分，其中烷基如上文定義。實(shí)例包括但不限于甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、丁氧基；

-“氟代烷基基團(tuán)”和“氟代烷氧基基團(tuán)”分別是指上文定義的烷基基團(tuán)和烷氧基基團(tuán)，所述的基團(tuán)被至少一個(gè)氟原子取代。實(shí)例為全氟代烷基基團(tuán)，例如三氟甲基或全氟丙基。

-“飽和的5-或6-元雜環(huán)”如本文所用，分別是指包含至少一個(gè)雜原子的飽和環(huán)。實(shí)例包括但不限于嗎啉、哌嗪、硫代嗎啉、哌啶、吡咯烷；

-“患者”可以擴(kuò)展為人類(lèi)或哺乳動(dòng)物，例如貓或狗。

適用于本發(fā)明的式(i)所示的化合物可以如wo2010/143170、wo2010/143169、wo2012/080953和wo2010/143168，和/或下文進(jìn)一步描述的那樣制備。

更具體而言，可以根據(jù)wo2012/080953中所述的合成途徑來(lái)制備式(i)所示的化合物，其中r’表示選自上文定義的以下基團(tuán)：更具體而言，當(dāng)a為o時(shí)。

當(dāng)a為n時(shí)，可以實(shí)施以下合成途徑。式(vii)所示的喹啉衍生物在另外的交聯(lián)反應(yīng)之前，可以作為構(gòu)件合成。

為了獲得式(vii)所示的化合物，可以實(shí)施以下反應(yīng)順序，如以下方案1所示。

方案1

式(ii)所示的化合物可以放置于吡啶中，其中r’不同于h，并且如上文所定義，而且可以具體為氯原子，然后將式(iii)所示的化合物以相對(duì)于式(ii)所示的化合物為1至2的摩爾比(例如1.5)加入。將反應(yīng)混合物在110℃至150℃的溫度(例如130℃)攪拌8小時(shí)至18小時(shí)，例如14小時(shí)。在冷卻至室溫時(shí)，可以將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并使用諸如二氯甲烷之類(lèi)的有機(jī)溶劑稀釋所得的殘余物。然后，可以使用無(wú)機(jī)堿(例如na2co3)的飽和水性溶液洗滌有機(jī)相，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮，從而得到式(iv)所示的化合物。

式(iv)所示的化合物可以放置于thf/水混合物中，然后將將氫氧化鈉以相對(duì)于式(iv)所示的化合物為1至1.5的摩爾比(例如1.2)加入，并將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)至18小時(shí)，例如14小時(shí)。然后可以加入濃鹽酸，直至達(dá)到ph2，并使用諸如醋酸乙酯之類(lèi)的有機(jī)溶劑萃取所得的溶液。之后，將有機(jī)相在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮，從而得到式(v)所示的化合物。

式(v)所示的化合物可以放置于多磷酸中，以相對(duì)于式(v)所示的化合物為5至15的摩爾比(例如10)加入，并將反應(yīng)混合物在110至150℃的溫度(例如130℃)攪拌8小時(shí)至18小時(shí)，例如14小時(shí)。在冷卻至室溫時(shí)，可以緩慢加入摩爾濃度為1至5m(例如2m)的氫氧化鈉的水性溶液?？梢赃^(guò)濾所得的沉淀物，使用水漂洗并在減壓下在干燥器中干燥，從而得到式(vi)所示的化合物。

式(vi)所示的化合物可以放置于pocl3中，以相對(duì)于式(vi)所示的化合物為5至15的摩爾比(例如10)加入，并將反應(yīng)混合物在80至120℃的溫度(例如100℃)下攪拌1小時(shí)至5小時(shí)，例如2小時(shí)。在冷卻至室溫時(shí)，可以緩慢加入水?？梢赃^(guò)濾所得的沉淀物，使用水漂洗并在減壓下在干燥器中干燥，從而得到式(vii)所示的化合物。

如wo2010/143170、wo2010/143169、wo2012/080953和wo2010/143168中，和/或下文進(jìn)一步描述的那樣，式(vii)所述的中間體化合物可以通過(guò)使其與苯胺衍生物、氨基吡啶衍生物、嘧啶衍生物、羥基吡啶衍生物、苯酚衍生物或羥基嘧啶衍生物交聯(lián)而形成式(i)所示的化合物。

此后，式(vii)所示的中間體化合物的位置4處的氯可以被胺取代，從而形成帶有式(iia)所示的基團(tuán)(并且a＝nh)的喹啉衍生物。

當(dāng)q＝n并且r”不同于h時(shí)，可以使用方案2和3所示的以下途徑。

為了獲得式(ix)所示的化合物，如下文方案2中所示，可以實(shí)施以下反應(yīng)。

方案2

在aklhal(其中alk表示(c1-c4)烷基基團(tuán)，而hal表示鹵素原子，相對(duì)于式(viii)所示的化合物的摩爾比為1至2，例如1.1)存在并且在無(wú)機(jī)堿(例如叔丁醇鉀，相對(duì)于式(viii)所示的化合物的摩爾比為1至2，例如1.1)存在下，式(viii)所示的化合物(其中z、v、n、n’、r和r’如上文定義)可以放置于無(wú)水極性溶劑(例如無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺)中。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)至24小時(shí)，例如16小時(shí)。反應(yīng)混合物可以在水和有機(jī)溶劑(例如醋酸乙酯)之間進(jìn)行分配。然后，合并有機(jī)相，使用生理鹽水的飽和水性溶液洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮，從而得到式(ix)所示的化合物。

為了獲得式(xii)所示的化合物，可以實(shí)施以下反應(yīng)，如下文方案3所示。

方案3

在nah(摩爾比為2至5，例如3)存在下，式(x)所示的化合物(其中z、v、n、n’、r和r’如上文定義)可以放置于無(wú)水極性溶劑(例如無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺)中，并且反應(yīng)混合物可以在室溫下攪拌10分鐘至50分鐘，例如30分鐘。在ki(相對(duì)于式(x)所示的化合物的摩爾比為1至2，例如1)存在并且在有機(jī)堿(例如et3n，相對(duì)于式(x)所示的化合物的摩爾比為1至2，例如1)存在下，式(xi)所示的化合物(其中m、b、ra和rb如上文定義)可以相對(duì)于式(x)所示的化合物的摩爾比為1至2，例如1放置于無(wú)水極性溶劑(例如無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺)中，并且反應(yīng)混合物可以在室溫在氣體的惰性氣氛(例如氬氣)中攪拌10分鐘至50分鐘，例如30分鐘。然后，可以將活化的化合物(x)加入至化合物(xi)中，并將所得的反應(yīng)混合物在70℃至110℃的溫度(例如90℃)攪拌2小時(shí)至10小時(shí)，例如4小時(shí)。在冷卻至室溫時(shí)，可以將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并且可以使用諸如醋酸乙酯之類(lèi)的有機(jī)溶劑洗脫所得的殘余物。然后，可以使用生理鹽水的飽和水性溶液洗滌有機(jī)相，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮，從而得到式(xii)所示的化合物。

當(dāng)帶有式(iia)所示的氨基基團(tuán)的取代時(shí)(其中a為nh)，則可以實(shí)施以下途徑，如方案4所示。

方案4

式(xiii)所示的化合物(其中z、v、n’、r和r’如上文定義，并且x為鹵素原子，例如br)可以放置于極性溶劑混合物中，例如二噁烷/n,n-二甲基甲酰胺的混合物。然后，在非親核性有機(jī)堿(例如叔丁醇鈉或叔丁醇鉀)以相對(duì)于式(xiii)所示的化合物的總量2至5的摩爾比(例如3)存在下，在二膦(例如xantphos(4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧雜蒽)或x-phos(2-雙環(huán)己基膦基-2’,4’,6’-三異丙基二苯基))以相對(duì)于式(xiii)所示的化合物的總量為5mol％至40mol％存在下，以及在催化劑(例如pd(oac)2或pd2(dba)3)以相對(duì)于式(xiii)所示的化合物的總量為2mol％至15mol％的量存在下，將式(xiv)所示的化合物(其中b、ra和rb如上文定義)以相對(duì)于式(xiii)所示的化合物為1至2的摩爾比(例如1.5)加入?？梢詫⒎磻?yīng)混合物在微波反應(yīng)器中在90℃至150℃(例如120℃)的溫度加熱30分鐘至100分鐘，例如70分鐘?？梢允狗磻?yīng)混合物在減壓下濃縮，并且可以使用諸如醋酸乙酯之類(lèi)的有機(jī)溶劑稀釋殘余物。可以使用水洗滌有機(jī)相，傾析，在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，并在加壓下濃縮，從而得到式(xv)所示的化合物。

可以根據(jù)以下方案5來(lái)制備上文定義的通式(id)所示的化合物。

方案5

在諸如cs2co3之類(lèi)的無(wú)機(jī)堿(摩爾比為2至5，例如3)存在下以及在cui(摩爾比為1至2，例如1)存在下，式(xvi)所示的化合物(其中n’和r’如上文定義，并且x為鹵素原子，例如cl)可以放置于諸如n,n-二甲基甲酰胺之類(lèi)的極性溶劑中。然后，可以將式(xvii)所示的化合物(其中r、v和n如上文定義)以相對(duì)于式(xvi)所示的化合物為1至2的摩爾比(例如1)加入。可以將反應(yīng)混合物在130℃至170℃(例如在150℃)的溫度在微波反應(yīng)器中加熱30分鐘至100分鐘，例如50分鐘。在冷卻至室溫時(shí)，可以將水加入至反應(yīng)混合物中，未溶解的固體可以通過(guò)硅藻土過(guò)濾，并且可以使用諸如醋酸乙酯之類(lèi)的有機(jī)溶劑萃取所得的濾液。然后，可以使用水和生理鹽水的飽和水性溶液洗滌有機(jī)相，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮，從而得到式(id)所示的化合物。

可以根據(jù)以下方案6來(lái)制備上文定義的通式(ie)所示的化合物。

方案6

在諸如cs2co3之類(lèi)的無(wú)機(jī)堿(摩爾比為2至5，例如3)存在下以及在cui(摩爾比為1至2，例如1)存在下，式(xvi)所示的化合物(其中n’和r’如上文定義，并且x為鹵素原子，例如cl)可以放置于諸如n,n-二甲基甲酰胺之類(lèi)的極性溶劑中。然后，可以將式(xix)所示的化合物(其中r、v和n如上文定義)以相對(duì)于式(xvi)所示的化合物為1至2的摩爾比(例如1)加入?？梢詫⒎磻?yīng)混合物在130℃至170℃(例如在150℃)的溫度在微波反應(yīng)器中加熱30分鐘至100分鐘，例如50分鐘。在冷卻至室溫時(shí)，可以將水加入至反應(yīng)混合物中，將未溶解的固體可以通過(guò)硅藻土過(guò)濾，并且可以使用諸如醋酸乙酯之類(lèi)的有機(jī)溶劑萃取所得的濾液。然后，可以使用水和生理鹽水的飽和水性溶液洗滌有機(jī)相，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮，從而得到式(ie)所示的化合物。

更具體而言，可以由式(xx)所示的化合物(r’基團(tuán)為oh基團(tuán))開(kāi)始，通過(guò)以下途徑來(lái)制備式(i)所示的化合物，其中r’表示-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)：

方案7

在相對(duì)于式(xx)所示的化合物的摩爾比為1的二乙基磷酰氯存在下，并且在相對(duì)于式(xx)所示的化合物的摩爾比為1至2(例如1.2)的諸如三乙基胺之類(lèi)的有機(jī)堿存在下，在氣體的惰性氣氛(例如氬氣)在0℃時(shí)，(xx)所示的化合物(其中z、v、n、n’、r和r’如上文定義)可以放置于諸如無(wú)水二氯甲烷之類(lèi)的無(wú)水氯烷烴溶劑中?？梢詫⒎磻?yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)至24小時(shí)的時(shí)間，例如14小時(shí)。然后，可以使反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并且所得的殘余物在摩爾濃度為1至2m(例如1m)的鹽酸水性溶液和諸如醋酸乙酯之類(lèi)的有機(jī)溶劑之間進(jìn)行分配。然后，可以合并有機(jī)相，使用諸如na2co3之類(lèi)的無(wú)機(jī)堿的飽和水性溶液洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮，從而得到式(xxi)所示的化合物。

在相對(duì)于式(xxi)所示的化合物的摩爾比為1至5(例如4)的三甲基溴硅烷存在下，可以將式(xxi)所示的化合物放置于諸如乙腈之類(lèi)的極性非質(zhì)子溶劑中?？梢詫⒎磻?yīng)混合物在在50℃至70℃(例如在60℃)的溫度在微波輻射下攪拌15小時(shí)至60分鐘，例如30分鐘。在冷卻至室溫下，可以緩慢加入meoh/水(95/5)混合物?？梢詫⑺玫某恋砦镞^(guò)濾，使用水漂洗，并在減壓下在干燥器中干燥，從而得到式(xxii)所示的化合物。

可以由式(i)所示的化合物(r基團(tuán)為oh基團(tuán))開(kāi)始，采用相同的過(guò)程來(lái)獲得式(i)所示的化合物，其中r表示-o-p(＝o)-(or3)(or4)基團(tuán)。

炎性疾病

因此，本發(fā)明還涉及用于治療和/或預(yù)防炎性疾病的式(ia)、(ib)、(ic)、(id)和(ie)所示的化合物。

令人吃驚地，本發(fā)明人能夠顯示，基于2種體內(nèi)小鼠模型，式(i)所示的化合物使得與炎性疾病(例如炎性腸病(ibd)和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra))有關(guān)的病征顯著改善。

在2種所建立的用于2種炎性疾病(炎性腸病(ibd)和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra))的小鼠模型中，目前已經(jīng)評(píng)估了式(i)所示的化合物的炎癥調(diào)控能力。葡聚糖硫酸鈉(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型用于研究炎性腸病(參見(jiàn)&cerar；“dextransodiumsulphatecolitismousemodel:trapsandtricks”；journalofbiomedicineandbiotechnology(2012)；718617)。膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型已經(jīng)用于研究類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，如brand等人(“collagen-inducedarthritis”；natureprotocols；(2007)；2(5):1269-75)中所示。

事實(shí)上，本發(fā)明人顯示了在(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型上，施用屬于式(i)的化合物可以在體內(nèi)使得結(jié)腸的長(zhǎng)度得到改善，并且使淋巴器官(例如派伊爾淋巴集結(jié)(peyer’spatche))的改變減少。本發(fā)明人進(jìn)一步顯示了基于膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型，施用式(i)所示的化合物可以使得腫脹顯著減輕以及炎癥病征降級(jí)。

根據(jù)本發(fā)明，《炎癥》表征為疼痛、發(fā)熱、發(fā)紅和腫脹，并且可以由感染、刺激或損失而導(dǎo)致。

因此，《炎性疾病》是指由過(guò)度的或失調(diào)的炎癥引起的一組疾病和/或紊亂。

根據(jù)本發(fā)明，《治療和/或預(yù)防炎性疾病》可以是指對(duì)炎性疾病或者指炎癥本身(其在個(gè)體中可以與所述的炎性疾病一起發(fā)生)的治療和/或預(yù)防。

因此，炎性疾病的治療和/或預(yù)防還包括此類(lèi)炎癥的治療和/或預(yù)防。

根據(jù)本發(fā)明，《治療和/或預(yù)防》炎性疾病包括治療所述的炎性疾病，降低所述的炎性疾病發(fā)展的可能性，或者延遲所述的炎性疾病的發(fā)生。

根據(jù)本發(fā)明，“個(gè)體”可以指人類(lèi)或非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選指人類(lèi)。

以非限定性的方式，炎性疾病包括：與自身免疫疾病有關(guān)的炎性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)炎性疾病、關(guān)節(jié)炎性疾病、炎性消化道疾病、炎性皮膚及與上皮細(xì)胞有關(guān)的其他炎性疾病(例如支氣管炎)、與癌癥有關(guān)的炎癥(例如結(jié)腸癌)、與刺激有關(guān)的炎癥以及與損傷有關(guān)的炎癥。

因此、炎性疾病可以選自以下列表：與自身免疫疾病有關(guān)的炎性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)炎性疾病、關(guān)節(jié)炎性疾病、炎性消化道疾病、炎性皮膚及與上皮細(xì)胞有關(guān)的其他炎性疾病(例如支氣管炎)、與癌癥有關(guān)的炎癥、與刺激有關(guān)的炎癥以及與損傷有關(guān)的炎癥。

具體而言，炎性疾病選自以下列表：炎性腸病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、帕金斯病、骨關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑癬、皮炎、sjogren綜合征、支氣管炎、哮喘和與結(jié)腸癌有關(guān)的炎癥。

更具體而言，炎性疾病選自以下列表：炎性腸病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化、骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑癬、sjogren綜合征、支氣管炎和與結(jié)腸癌有關(guān)的炎癥。

更具體而言，炎性疾病選自以下列表：炎性腸病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化、骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎和銀屑癬。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的炎性疾病包括：炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化。

甚至更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的炎性疾病包括：炎性腸病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化。

炎性疾病還可以涵蓋阿爾茨海默病、帕金斯病、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化和皮炎。

關(guān)于皮炎，可以引述濕疹。

就上述觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防炎性疾病的式(i)所示的化合物，其中所述的疾病涵蓋所述的炎癥，以及與炎性疾病有關(guān)的炎癥。

因此，本發(fā)明還涉及用于治療和/或預(yù)防炎性疾病的式(i)所示的化合物的用途，其中所述的疾病涵蓋所述的炎癥，以及與炎性疾病有關(guān)的炎癥。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明的主題涉及單獨(dú)或組合用作藥物的化合物(ie)、(id)、(8)、(9)、(10)、(11)、(44)、(46)、(47)、(48)、(49)、(50)、(51)、(52)、(53)或其藥物可接受的鹽。

根據(jù)另一個(gè)目的，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含單獨(dú)的或組合的化合物(ie)、(id)、(8)、(9)、(10)、(11)、(44)、(46)、(47)、(48)、(49)、(50)、(51)、(52)、(53)或其藥物可接受的鹽。

本發(fā)明還涉及用于制備組合物(例如藥物)的式(i)所示的化合物的用途，所述組合物用于治療和/或預(yù)防炎癥，其中所述的炎癥涵蓋所述的炎癥，以及與炎性疾病有關(guān)的炎癥。

本發(fā)明還涉及用于治療和/或預(yù)防炎性疾病的方法，其中所述的炎性疾病包括所述的炎癥，以及與所述的炎性疾病有關(guān)的炎癥，并且所述的方法包括將式(i)所示的化合物施用有需要的患者的步驟。

mirna-124

microrna(mirna)為小的單鏈非編碼rna，其在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中起作用，使得它們的同源靶信使rna的表達(dá)或者mrna的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的翻譯減少。成熟mirna的長(zhǎng)度通常為大約19-23個(gè)核苷酸。mirna抑制它們的靶蛋白質(zhì)生產(chǎn)的這種能力得以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活性，例如細(xì)胞命運(yùn)決定、凋亡、分化和瘤形成。

mir-124最初在小鼠中克隆。人類(lèi)mir-124前體(或mirn-124或mirna-124或microrna124)由胚胎干細(xì)胞克隆。目前為止，已經(jīng)鑒定9種單倍型的mir-124前體(guoetal.,plosone,2009,4(11):e7944)，其中3種以人類(lèi)hsa-mir-124-1、hsa-mir-124-2和hsa-mir-124-3形式存在(分別為seqidno:1,seqidno:2和seqidno:3)。

mir-124microrna前體為小的非編碼rna分子。成熟的～21核苷酸microrna是由發(fā)夾前體序列通過(guò)dicer酶加工得到的。mir-124-3p的成熟序列為seqidno:4，mir-124-5p的成熟序列為seqidno:5。

根據(jù)本發(fā)明，測(cè)量mir-124的表達(dá)水平涵蓋測(cè)量前體或成熟mir-124的表達(dá)水平。

本發(fā)明還涉及用于增加生物樣品中mir-124的表達(dá)的式(i)所示的化合物。

因此，根據(jù)另一個(gè)所述的目的，本發(fā)明涉及用于增加真核細(xì)胞中mir-124的表達(dá)的體外或離體方法，該方法至少包括以下步驟：

a)提供真核細(xì)胞；

b)使所述的細(xì)胞與衍生的化合物，特別是式(i)所示的化合物接觸。

篩選候選化合物的方法

用于成功開(kāi)發(fā)給定藥品或疫苗的一個(gè)重要因素是高效且快速地評(píng)估其效力的可能性。因此，重要的是具有用于評(píng)估藥品或疫苗的效力所依賴(lài)的合適的工具，例如特異性的生物標(biāo)志物。

令人吃驚的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在炎癥過(guò)程中，mir-124起到重要的作用。事實(shí)上，本發(fā)明人已經(jīng)顯示，式(i)所示的化合物能夠調(diào)控mir-124的表達(dá)。具體而言，本發(fā)明人已經(jīng)顯示本發(fā)明的化合物能夠上調(diào)節(jié)(增加多至100倍)mir-124在由供者得到的外周血單核細(xì)胞(pbmc)上的表達(dá)(通過(guò)ficoll^tm梯度離心分離)。

由于本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)建立式(i)所示的化合物能夠調(diào)控mir-124的表達(dá)，所以本發(fā)明還涉及用于篩選喹啉衍生物，特別是式(i)所示的化合物的體外或離體方法，其中所述的化合物推定為有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

因此，根據(jù)另一個(gè)目的，本發(fā)明涉及至少一種mirna作為用于篩選喹啉衍生物，特別是式(i)所示的化合物的生物標(biāo)志物的體外或離體用途，其中所述的至少一種mirna為mir-124，并且所述的化合物推定為有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

因此，本發(fā)明還涉及用于篩選喹啉衍生物，特別是式(i)所示的化合物的體外或離體方法，其中推定所述的化合物有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病，所述的方法至少包括以下步驟：

a)提供真核細(xì)胞；

b)使所述的細(xì)胞與式(i)所示的化合物接觸；

c)測(cè)量在所述的細(xì)胞中mir-124的表達(dá)；以及

d)當(dāng)在步驟c)中測(cè)量的mir-124的表達(dá)水平相對(duì)于參照值受到調(diào)控時(shí)，選擇所述的候選物，推定所述的候選物有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)水平的“調(diào)控”包括表達(dá)水平的上調(diào)和下調(diào)。就本發(fā)明的意義而言，mir-124的表達(dá)水平的“調(diào)控”優(yōu)選地是指上調(diào)。

具體而言，本發(fā)明涉及用于篩選喹啉衍生物，特別是式(i)所示的化合物的體外或離體方法，其中推定所述的化合物有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病，所述的方法至少包括以下步驟：

a)提供真核細(xì)胞；

b)使所述的細(xì)胞與式(i)所示的化合物接觸；

c)測(cè)量mir-124在所述的細(xì)胞中的表達(dá)；以及

d)當(dāng)在步驟c)中測(cè)量的mir-124的表達(dá)水平相對(duì)于參照值增加時(shí)，選擇所述的候選物，推定所述的候選物有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，由得自生物樣品的真核細(xì)胞測(cè)量mir-124的存在或表達(dá)水平，并將其與對(duì)照參照值比較。

具體而言，適用于本發(fā)明的“生物樣品”可以為生物流體，例如血液、血漿或血清、唾液、細(xì)胞間液或尿樣；細(xì)胞樣品，例如細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、干細(xì)胞系或包含外周血單核細(xì)胞(pbmc)的樣品；組織活檢，例如口腔組織、胃腸道組織、皮膚、口腔黏膜組織或得自臨床試驗(yàn)的多種樣品。所述的樣品可以是樣品粗品，或者可以在儲(chǔ)存、處理或測(cè)量之前純化成各種程度。

具體而言，適用于本發(fā)明的生物樣品為外周血單核細(xì)胞(pbmc)或包含pbmc的樣品。因此，本發(fā)明的生物樣品可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)由外周全血處理得到，例如密度梯度離心，更具體地為ficoll^tm梯度。

pbmc樣品(特別是使用ficoll^tm梯度處理的樣品)容易包含淋巴細(xì)胞(t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞)、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。在人類(lèi)中，這些群體的發(fā)生率在個(gè)體中不同。

因此，以非限定性的方式，真核細(xì)胞包括上文定義的任意一種類(lèi)型的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞(t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞)、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。

在實(shí)施本發(fā)明之前，實(shí)施收集用于本發(fā)明的用途和方法的生物樣品的步驟，并且所述的步驟并非根據(jù)本發(fā)明的用途或方法的步驟。

可以在任何所需的間隔過(guò)程中取得用于mirna評(píng)估的樣品。例如可以每小時(shí)、每天2次、每天、每周、每個(gè)月、每隔一個(gè)月、每年等取得樣品。所述的樣品可以立即檢驗(yàn)，或者可以?xún)?chǔ)存用于后期檢驗(yàn)。

所述的樣品可以在檢驗(yàn)前進(jìn)行純化。在一些實(shí)施方案中，在檢驗(yàn)之前，可以由剩余的細(xì)胞內(nèi)容物分離mir-124。此外，如果需要，可以由樣品中剩余的mrna分離mir-124分子。例如在檢驗(yàn)之前，可以基于尺寸差異，由mrna分離mir-124。

用于與檢驗(yàn)的生物樣品中所測(cè)量的mir-124的表達(dá)水平進(jìn)行比較的對(duì)照參照值從對(duì)照樣品獲得。

對(duì)照樣品可以取自多種來(lái)源。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照樣品取自治療之前的或疾病存在之前的患者(例如歸檔的血液樣品)。在其他的實(shí)施方案中，對(duì)照樣品取自一組正常的未生病的人群的成員。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物上實(shí)施細(xì)胞測(cè)試，例如未經(jīng)測(cè)試化合物處理的或者已經(jīng)使用參照化合物(例如dmso、甲基纖維素(mc)或水)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，為了測(cè)定或監(jiān)測(cè)患者中的炎性疾病，對(duì)照參照值可以得自在已知未患有所述的狀況的個(gè)體或一組個(gè)體上獲得的分離的生物樣品。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，為了測(cè)定或監(jiān)測(cè)對(duì)患者中炎性疾病的治療效力，對(duì)照參照值可以得自個(gè)體或一組個(gè)體的分離的生物樣品，其中已知所述的個(gè)體或一組個(gè)體未患有所述的狀況，和/或未接受其效力有待測(cè)定或監(jiān)測(cè)的治療。備選地，對(duì)照參照值可以得自從患者得到的分離的生物樣品，其中所述的患者患有炎性疾病，并且接受其效力有待測(cè)定或監(jiān)測(cè)的治療，所述的分離的生物樣品得自施用治療前的患者。

技術(shù)人員可以利用多種方法來(lái)測(cè)量mir-124生物標(biāo)志物的存在或表達(dá)水平。

例如核酸測(cè)試或陣列可以用于評(píng)估樣品中mir-124的存在和/或表達(dá)水平。

mir-124的序列可以用于制備相應(yīng)的核苷酸，其作為在不同核酸測(cè)試中使用的互補(bǔ)探針或引物用于檢測(cè)樣品中mir-124生物標(biāo)志物的表達(dá)或存在情況，例如但不限于northern印跡和基于pcr的方法(例如實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-pcr或qrt-pcr)。諸如qrt-pcr之類(lèi)的方法可以用于精確定量樣品中mirna的量。

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的每一種工藝來(lái)獲得根據(jù)本發(fā)明的正義和反義探針或引物，具體而言為在sambrook等人(molecularcloning:laboratorymanual,3^rded.,2001,coldspringharbour,n.y.)中所述的那些。

與rna或dna的檢測(cè)和定量有關(guān)的方法是本領(lǐng)域公知的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以指例如wang等人(1989,procnatlacadsciusa,vol.86:917-921),wong等人(2005,biotechniques,vol.39(1):75-85),nolan等人(2006,natprotoc,vol.1(3):1559-1582),klinck等人(2008,cancerresearch,vol.68:657-663)，或者還有由bustin公開(kāi)的一般綜述(2000,journalofmolecularendocrinology,vol.25:169-193)。

適用于測(cè)量mir-124的存在或表達(dá)水平的分離的核酸探針為能夠與mir-124特異性雜交的核酸探針，例如前體或成熟mir-124。

此類(lèi)核酸探針可以包含18至30個(gè)核苷酸，特別是20至27個(gè)，優(yōu)選為20至25個(gè)，優(yōu)選為20、22或25個(gè)，并且更優(yōu)選為大約25個(gè)核苷酸。如之前所示，可以根據(jù)本領(lǐng)域任何已知的方法來(lái)制備此類(lèi)核酸探針。

本領(lǐng)域公知多種方法和公式用于預(yù)測(cè)對(duì)于給定探針和給定靶物的最佳雜交溫度。

因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)一組探針、給定的靶物序列以及特定的雜交條件而容易地計(jì)算最佳的雜交溫度。

有利地，所述的探針的最佳雜交溫度為40℃至60℃，并且更具體為45℃至55℃，并且優(yōu)選為大約48℃。

關(guān)于用于本發(fā)明的核酸探針與本發(fā)明的生物標(biāo)志物雜交的緩沖劑的實(shí)例，可以提及包含100mmmes、1m[na+]、20mmedta、0.01％tween-20的緩沖劑作為雜交緩沖劑，包含6xsspe、0.01％tween-20的緩沖劑作為非嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南礈炀彌_劑，以及包含100mmmes、0.1m[na+]、0.01％tween-20的緩沖劑作為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南礈炀彌_劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于核酸檢測(cè)和定量的方法可以為基于熒光染料的方法，其中通過(guò)測(cè)量與所述的核酸結(jié)合的諸如染料之類(lèi)的配基的熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)估核酸的濃度。熒光染料是本領(lǐng)域公知的。

備選地，可以使用分光光度測(cè)量法來(lái)定量所述的核酸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于核酸檢測(cè)和定量的方法可以為基于雜交的方法。所述的基于雜交的方法可以包括pcr和定量-pcr(qrt-pcr或q-pcr)技術(shù)，或者基于逆轉(zhuǎn)錄酶/聚合酶的技術(shù)。有利地，所述的方法可以包括或進(jìn)一步與測(cè)序步驟結(jié)合。

這些方法可以包括：(i)細(xì)胞mrna的提取步驟；(ii)使用逆轉(zhuǎn)錄酶將mrna逆轉(zhuǎn)錄成dna的步驟；以及(iii)由之前的步驟獲得的dna進(jìn)行dna擴(kuò)增的步驟。通常，由相同的樣品開(kāi)始，擴(kuò)增以下核酸：(a)在靶mrna的逆轉(zhuǎn)錄步驟之后獲得的dna；以及(b)在mrna逆轉(zhuǎn)錄之后獲得的dna或多種dna，其中所述的mrna是構(gòu)成性地并持續(xù)性地被細(xì)胞表達(dá)(《持家基因》)，例如由基因mrpl19、pum1和gadph編碼的rna。

擴(kuò)增的dna可以在通過(guò)電泳分離以及對(duì)dna條帶的測(cè)量后進(jìn)行定量。與靶mrna有關(guān)的結(jié)果可以表示為與《持家》基因編碼的mrna相比的相對(duì)單位。在一些實(shí)施方案中，在瓊脂糖凝膠電泳后實(shí)施擴(kuò)增的dna的分離步驟，接著使用溴化乙錠對(duì)dna條帶進(jìn)行著色，然后使用密度計(jì)量法對(duì)這些遷移條帶中所包含的dna進(jìn)行定量。在其他的實(shí)施方案中，可以使用微通道裝置，其中通過(guò)毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增的dna，然后使用激光束對(duì)發(fā)射的信號(hào)進(jìn)行定量。此類(lèi)裝置可以為裝置，例如得自《gx》系列，使用caliperlifesciences(hopkinton,ma,usa)公司的商標(biāo)。

通過(guò)qrt-pcr獲得的定量結(jié)果有時(shí)候可以比定量數(shù)據(jù)具有更多的信息，并且可以簡(jiǎn)化測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量管理。因此，在一些實(shí)施方案中，基于qrt-pcr的測(cè)試可以用于在細(xì)胞基測(cè)試過(guò)程中測(cè)量mirna的水平。qrt-pcr方法還可以用于監(jiān)測(cè)患者治療。市售可得的方法為基于qrt-pcr的方法(例如taqmanrarray^tm)。

任何合適的測(cè)試平臺(tái)可以用于測(cè)定樣品中mirna的表達(dá)或存在。例如測(cè)試可以為dipstick、薄膜、芯片、盤(pán)、測(cè)試條、過(guò)濾器、微球、載玻片、多孔板或光學(xué)纖維形式。測(cè)試系統(tǒng)可以具有固體支持物，在該支持物上附著有對(duì)應(yīng)于mirna的寡核苷酸。固體支持物可以包括例如塑料、硅、金屬、樹(shù)脂、玻璃、薄膜、顆粒、沉淀物、凝膠、聚合物、片、球、多糖、毛細(xì)管、膜板或載玻片。測(cè)試成分可以制備或包裝在一起作為用于檢測(cè)mirna的試劑盒。

在一些實(shí)施方案中，可以制備或購(gòu)買(mǎi)用于檢驗(yàn)生物樣品中喹啉衍生物或藥品候選物活性的寡核苷酸陣列。陣列通常包含固體支持物以及與該支持物接觸的至少一種寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸對(duì)應(yīng)于mir-124生物標(biāo)志物的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，mir-124生物標(biāo)志物的一部分包含至少5、10、15、20或更多的堿基。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可以結(jié)合其他的mirna(也用作生物標(biāo)志物)來(lái)測(cè)試mir-124的存在或表達(dá)。在此類(lèi)實(shí)施方案中，陣列可以用于評(píng)估樣品中多種mirna的表達(dá)或存在情況，包括mirna-124。一般而言，所述的方法包括以下步驟：a)在足以發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，將所述的樣品與包含探針組的陣列接觸；以及b)檢查所述的陣列，以檢測(cè)任何可檢測(cè)的標(biāo)記的存在情況，由此評(píng)價(jià)樣品中各自靶mirna的量。表達(dá)陣列的使用可以獲得給定樣品的mirna表達(dá)圖譜。

制備測(cè)試的方法或測(cè)試mirna的陣列是本領(lǐng)域公開(kāi)的，并且無(wú)需在本文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。

核酸陣列可以用于檢測(cè)生物樣品中mirna的存在情況或差異性表達(dá)。多核苷酸陣列(例如dna或rna陣列)通常包含在支持物上以預(yù)定構(gòu)造排布的通常不同序列多核苷酸(“捕獲劑”)的區(qū)域。所述的陣列是“可尋址的”，因?yàn)檫@些區(qū)域(通常稱(chēng)為“陣列特征”)在陣列支持物上具有不同的預(yù)定位置(“地址”)。在陣列上在特定的預(yù)定位置(即，“地址”)的區(qū)域(即，陣列的“特征”或“點(diǎn)”)將檢測(cè)特定的mirna靶物。多核苷酸陣列通常是通過(guò)將事先獲得的多核苷酸以位點(diǎn)特異性的方式沉積在支持物上或者通過(guò)在支持物上位點(diǎn)特異性地原位合成多核苷酸而在平面支持物上制造得到?？梢酝ㄟ^(guò)沉積(例如通過(guò)基于接觸或噴射的方法或光刻法)前體單元(例如核苷酸或氨基酸單體)或預(yù)合成的捕獲劑來(lái)制造用于檢測(cè)mirna表達(dá)的陣列。在將多核苷酸捕獲劑沉積到支持物上之后，通常對(duì)支持物進(jìn)行處理(例如洗滌和封閉)，并儲(chǔ)存，然后使用。

用于檢測(cè)mirna表達(dá)的陣列具有至少2種、3種、4種或5種不同的對(duì)象探針。但是，在某些實(shí)施方案中，對(duì)象陣列可以包含探針組，該探針組具有可以檢測(cè)相應(yīng)數(shù)量的mirna的至少10種、至少20種、至少50種、至少100種、至少200種、至少500種、至少1000種或更多的探針。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象陣列可以包含用于檢測(cè)有機(jī)體的所鑒定的mirna的至少一部分或全部的探針，或者可以包含得自多種有機(jī)體的直系同源探針。

在促進(jìn)樣品中mirna與陣列上存在的一種或多種捕獲劑發(fā)生特異性結(jié)合以展示所觀(guān)察的結(jié)合圖案的條件下，可以將核酸陣列與包含mirna分析物的樣品或標(biāo)記的樣品接觸。在詢(xún)問(wèn)陣列時(shí)可以檢測(cè)這種結(jié)合圖案。例如可以使用合適的標(biāo)記(例如熒光化合物)來(lái)標(biāo)記樣品中的靶mirna，然后在陣列暴露于樣品后，可以精確地觀(guān)察(例如通過(guò)觀(guān)察熒光圖案)陣列上的標(biāo)記。所觀(guān)察的結(jié)合圖案可以指示樣品的一種或多種mirna成分的存在情況和/或濃度。

可以使用本領(lǐng)域公知的方法來(lái)實(shí)施對(duì)mirna的標(biāo)記，例如使用dna連接酶、末端轉(zhuǎn)移酶或通過(guò)標(biāo)記rna主鏈等。在一些實(shí)施方案中，mirna可以使用熒光標(biāo)記來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。示例性的熒光染料包括但不限于氧雜蒽染料、熒光素染料、羅丹明染料、異硫氰酸熒光素(fitc)、6羧基熒光素(fam)、6羧基-2l,4l,7',4,7-六氯熒光素(hex)、6羧基4',5'二氯2',7'二甲氧基熒光素(joe或j)、n,n,n',n'四甲基6羧基羅丹明(tamra或t)、6羧基x羅丹明(rox或r)、5羧基羅丹明6g(r6g5或g5)、6羧基羅丹明6g(r6g6或g6)、和羅丹明110；青色素染料，例如cy3、cy5和cy7染料；alexa染料，例如alexa-fluor-555；香豆素、二乙基氨基香豆素、傘形酮；苯甲亞胺染料，例如hoechst33258；菲啶染料，例如texasred；溴乙非啶染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料、bodipy染料、喹啉染料、pyrene、熒光素均三嗪、rl10、eosin、joe、r6g、四甲基羅丹明、lissamine、rox、naptho熒光素等。

在一些實(shí)施方案中，可以制備用于評(píng)估免疫調(diào)控活性的核苷酸陣列，或者從例如affymetrix購(gòu)買(mǎi)。所述的陣列可以包含固體支持物和多種與支持物接觸的寡核苷酸。該寡核苷酸可以存在于固體支持物上特定的可尋址的位置處；每個(gè)寡核苷酸對(duì)應(yīng)于mirna序列的至少一部分，所述的mirna序列在細(xì)胞或患者中使用喹啉衍生物或藥品候選物進(jìn)行處理時(shí)可差異性地表達(dá)。mirna序列包含至少一個(gè)mir-124序列。

當(dāng)陣列用于評(píng)估m(xù)irna時(shí)，典型的方法可以包括以下步驟：1)獲得包含表面結(jié)合的對(duì)象探針的陣列；2)在足以提供特異性結(jié)合的條件下，使mirna群體與表面結(jié)合的探針雜交；3)雜交后洗滌，從而除去雜交中未結(jié)合的核酸；以及4)檢測(cè)雜交的mirna。在這些步驟的各步驟中使用的試劑以及它們的使用條件可以根據(jù)特定的應(yīng)用而改變。

可以在合適的雜交條件下實(shí)施雜交，其可以根據(jù)需要在嚴(yán)謹(jǐn)性方面改變。典型的條件為足以在互補(bǔ)的結(jié)合成員之間(即，在表面結(jié)合的對(duì)象探針與樣品中互補(bǔ)的mirna之間)在陣列表面上產(chǎn)生探針/靶物復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，可以采用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。通常在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下實(shí)施雜交。本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)(例如在足以提供樣品中的靶mirna與陣列上的探針特異性地結(jié)合的條件下)用于使樣品與核酸陣列雜交。合適的條件的選擇(包括溫度、鹽濃度、多核苷酸濃度、雜交時(shí)間、洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)性等)取決于試驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括樣品來(lái)源、捕獲劑的特性、所預(yù)計(jì)的互補(bǔ)性程度等，并且對(duì)于本領(lǐng)域那些普通技術(shù)人員而言，可以通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)來(lái)確定。通常，就核酸雜交而言，“嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交”和“嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交洗滌條件”通常是序列依賴(lài)性的，并且在不同的試驗(yàn)條件下不同?？梢越?jīng)過(guò)大約12至大約24小時(shí)進(jìn)行雜交。洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)性可以影響mirna序列與互補(bǔ)的捕獲劑特異性雜交的程度。那些普通技術(shù)人員容易地認(rèn)識(shí)到備選地但是相當(dāng)?shù)碾s交和洗滌條件可以用于提供相似的嚴(yán)謹(jǐn)性條件。

如所示，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用theaffymetrixgenechipmirnaarray2.0并根據(jù)操作說(shuō)明所述的方案實(shí)施mirna表達(dá)圖譜試驗(yàn)。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以使用thehybridization,wash,andstainkit(affymetrixref.#900720)實(shí)施所述的雜交。有利地，通過(guò)根據(jù)制造商提供的方案實(shí)施所述的雜交。

在mirna雜交過(guò)程之后，通常洗滌陣列表面結(jié)合的多核苷酸，從而除去未結(jié)合的核酸?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的洗滌方案來(lái)進(jìn)行洗滌，其中洗滌條件通常是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模缟衔乃?。例如使用affymetrix公司出售的洗滌緩沖劑(ref.#900721和#900722)來(lái)實(shí)施洗滌步驟。然后，使用讀取陣列的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)檢測(cè)靶mirna與探針的雜交。例如通過(guò)照明陣列并讀取在陣列的各個(gè)特征處所得熒光的位置和強(qiáng)度以檢測(cè)mirna/探針結(jié)合復(fù)合物，可以完成讀取所得的雜交的陣列。

相對(duì)于對(duì)照參照(例如得自健康供者的對(duì)照參照值)調(diào)控mir-124的存在情況或表達(dá)水平可以指示炎性疾病。具體而言，相對(duì)于對(duì)照參照值(即，得自健康供者的對(duì)照參照值)，所述的mirna的存在減少或抑制或者表達(dá)水平降低可以指示炎性疾病。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的用途可以包括獲得或測(cè)量進(jìn)入到分離的生物樣品中的mir-124的表達(dá)水平，以及將所述的測(cè)量的表達(dá)水平與對(duì)照參照值比較。觀(guān)察相對(duì)于所述對(duì)照參照值的所述測(cè)量水平的調(diào)控可以指示炎性疾病，或所述的炎性疾病的治療。

在藥品候選物存在下，相對(duì)于對(duì)照參照值(即，未通過(guò)所述的藥品候選物，例如喹啉衍生物的治療)，mir-124的表達(dá)水平增加或上調(diào)指示藥品候選物推定有效地用于治療和/或預(yù)防炎性疾病。

因此，當(dāng)?shù)米詷悠返膍ir-124在生物樣品中與對(duì)照參照值相比為“增加的”或“上調(diào)的”時(shí)，這種增加可以為比較的對(duì)照參照值(即，未通過(guò)喹啉衍生物的治療)的大約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、100％、200％、300％、500％、1,000％、5,000％或更高。

具體而言，mir-124的測(cè)量表達(dá)水平相對(duì)于所述的對(duì)照參照值可以為至少2倍、優(yōu)選為至少4倍、優(yōu)選為至少6倍、優(yōu)選為至少8倍、更優(yōu)選為至少10倍。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，mir-124的測(cè)量表達(dá)水平相對(duì)于所述的對(duì)照參照值可以為至少100倍。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可以實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的用途或方法，以用于優(yōu)化患者的劑量方案。對(duì)給定的喹啉衍生物(具體而言為式(i)所示的化合物)，患者可以產(chǎn)生不同的應(yīng)答，這取決于多種因素諸如年齡、健康、遺傳背景、存在的其他并發(fā)癥、疾病進(jìn)程以及共同施用的其他藥品。有用的是使用mir-124生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估和優(yōu)化患者中喹啉衍生物的劑量方案，例如劑量用量和/或劑量時(shí)間表。就此而言，mir-124基生物標(biāo)志物還可以用于跟蹤和調(diào)節(jié)隨時(shí)間發(fā)展的內(nèi)個(gè)體患者的治療有效性。生物標(biāo)志物可以用于匯集患者治療中作出決定所需的信息，從而根據(jù)需要增加或降低試劑的劑量。例如可以使用基于mir-124的生物標(biāo)志物來(lái)檢驗(yàn)接受喹啉衍生物的患者，從而查看劑量是否將是有效的，或者是否需要實(shí)施更進(jìn)攻性的治療計(jì)劃。可以根據(jù)mir-124生物標(biāo)志物的測(cè)量來(lái)調(diào)節(jié)施用的藥品的量、施用的定時(shí)、施用的頻率、施用的持續(xù)時(shí)間。

在個(gè)體治療方案過(guò)程中或者在臨床試驗(yàn)過(guò)程中，mir-124生物標(biāo)志物還可以用于跟蹤患者的順應(yīng)性?？梢栽谒O(shè)定的間隔時(shí)跟蹤患者的順應(yīng)性，以確保試驗(yàn)中所包含的患者能夠根據(jù)指導(dǎo)服藥。此外，可以使用mir-124生物標(biāo)志物來(lái)檢驗(yàn)接受喹啉衍生物的患者，從而測(cè)定患者是否順應(yīng)治療計(jì)劃的劑量方案。與未治療的對(duì)照樣品的表達(dá)水平相比，增多的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平指示對(duì)所述的方案的順應(yīng)性。

因此，在不脫離本發(fā)明的范圍下，對(duì)照參照值可以得自衍生自以下的真核細(xì)胞：得自健康供者和/或事先未使用給定候選藥品(例如給定的喹啉衍生物)進(jìn)行治療的供者的生物樣品。

本發(fā)明的生物標(biāo)志物可以實(shí)施用于評(píng)估和跟蹤?quán)苌锏男Я?，具體而言為式(i)所示的化合物。因此，可以測(cè)量進(jìn)入分離的生物樣品中的mir-124的存在情況或表達(dá)水平，其中所述的生物樣品得自事先使用喹啉衍生物，例如式(i)所示的化合物治療的患者。

接著，將測(cè)量的進(jìn)入分離的生物樣品中的mir-124的存在情況或表達(dá)水平與對(duì)照參照值比較。

當(dāng)觀(guān)察到相對(duì)于對(duì)照參照值，測(cè)量的mir-124的表達(dá)水平增高時(shí)，則該測(cè)量指示喹啉衍生物，具體而言為式(i)所示的化合物的活性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)觀(guān)察到相對(duì)于對(duì)照參照值，mir-124的測(cè)量的表達(dá)水平增高時(shí)，則該測(cè)量可以指示患者對(duì)使用所述的喹啉衍生物，具體而言為式(i)所示的化合物的治療產(chǎn)生應(yīng)答。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)觀(guān)察到相對(duì)于對(duì)照參照值，測(cè)量的水平增高時(shí)，則該測(cè)量指示使用所述的喹啉衍生物，具體而言為式(i)所示的化合物的治療的有效性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)觀(guān)察到相對(duì)于對(duì)照參照值，mir-124的測(cè)量的表達(dá)水平增高時(shí)，則該測(cè)量指示所述的喹啉衍生物，具體而言為式(i)所示的化合物作為用于預(yù)防和/或治療炎性疾病的治療試劑的治療效力。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)觀(guān)察到相對(duì)于對(duì)照參照值，mir-124的測(cè)量的表達(dá)水平增高時(shí)，如果所述的對(duì)照參照值是由生物樣品(衍生自使用另一個(gè)劑量方案治療的患者)測(cè)量的，則所述的測(cè)量指示所述的喹啉衍生物，具體而言為式(i)所示的化合物的特定的劑量方案作為用于預(yù)防和/或治療炎性疾病的治療試劑的治療效力。

式(i)所示的一些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和光譜數(shù)據(jù)分別由下表i和表ii中示出(參見(jiàn)實(shí)施例)。

表i

本文提供的實(shí)施例僅是示例性的，并且本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員僅僅使用常規(guī)的試驗(yàn)，便認(rèn)識(shí)到或者能夠弄清特定化合物、材料和過(guò)程的大量等價(jià)物。認(rèn)為所有這些等價(jià)物均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且涵蓋在所附的權(quán)利要求書(shū)內(nèi)。

實(shí)施例

實(shí)施例1：8-氯代-n⁴-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n²-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹啉-2,4-二胺；化合物(9)

將鄰氯苯胺(5.3ml,50mmoles,1eq.)放置于吡啶(8ml)中。然后加入二乙基丙二酸酯(11.4ml,75mmoles,1.5eq.)，并將反應(yīng)混合物在130℃攪拌14小時(shí)。在冷卻至室溫時(shí)，將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并使用二氯甲烷稀釋所得的殘余物。然后，使用na2co3的飽和水性溶液洗滌有機(jī)相，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而提供乙基2-[(2-氯苯基)氨基甲?；鵠醋酸酯(2.7g,22％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ9.74(brs,1h),8.38(dd,j＝8.1,1.5hz,1h),7.40(dd,j＝8.1,1.5hz,1h),7.28(td,j＝8.1,1.5hz,1h),7.07(td,j＝8.1,1.5hz,1h),4.30(q,j＝7.1hz,2h),3.54(s,2h),1.34(t,j＝7.1hz,3h)。

將乙基2-[(2-氯苯基)氨基甲?；鵠醋酸酯(2.4g,9.93mmoles,1eq.)放置于thf(9.9ml)/水(3.8ml)混合物中。然后加入氫氧化鈉(477mg,11.92mmoles,1.2eq.)，并將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌14小時(shí)。然后，加入濃鹽酸，直至達(dá)到ph2，并使用醋酸乙酯萃取所得的溶液。然后，將有機(jī)相在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮，從而得到2-[(2-氯苯基)氨基甲?；鵠醋酸(2g,94％)。

¹hnmr(300mhz,meod)δ7.98(dd,j＝8.1,1.5hz,1h),7.45(dd,j＝8.1,1.5hz,1h),7.30(td,j＝8.1,1.5hz,1h),7.16(td,j＝8.1,1.5hz,1h),3.54(s,2h)。

將2-[(2-氯苯基)氨基甲?；鵠醋酸(3.7g,17.32mmoles,1eq.)在多磷酸(17g,173.2mmoles,10eq.)中形成的反應(yīng)混合物在130℃攪拌14小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，然后緩慢加入2m的氫氧化鈉水性溶液。將所得的沉淀物過(guò)濾，使用水漂洗，在干燥器中在減壓下干燥，從而得到8-氯代喹啉-2,4-二醇(3g,89％)。

¹hnmr(300mhz,dmso)δ11.66(brs,1h),10.40(brs,1h),7.78(d,j＝7.8hz,1h),7.66(d,j＝7.8hz,1h),7.17(t,j＝7.8hz,1h),5.81(s,1h)。

ms(esi)[m-h]^-＝194.1

將8-氯代喹啉-2,4-二醇(1.5g,7.67mmoles,1eq.)在pocl3(7.1ml,76.7mmoles,10eq.)中形成的反應(yīng)混合物在100℃攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，然后緩慢加入水。將所得的沉淀物過(guò)濾，使用水漂洗，在干燥器中在減壓下干燥，從而得到2,4,8-三氯代喹啉(1.6g,90％)。

¹hnmr(300mhz,dmso)δ8.21(d,j＝8.4hz,1h),8.14(d,j＝8.4hz,1h),8.11(s,1h),7.78(t,j＝8.4hz,1h)。

將2,4,8-三氯代喹啉(1g,4.30mmoles,1eq.)、2-氨基-4-三氟甲基吡啶(768mg,4.73mmoles,1.1eq.)、pd(oac)2(19mg,0.09mmol,2mol％)、xantphos(50mg,0.09mmol,2mol％)和cs2co3(3.9g,12.04mmoles,2.8eq.)在t-buoh(17.2ml)中形成的反應(yīng)混合物在90℃加熱2天。在冷卻至室溫時(shí)，將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并使用醋酸乙酯稀釋所得的殘余物。然后將有機(jī)相用水洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而得到(4,8-二氯-喹啉-2-基)-(4-三氟甲基-吡啶-2-基)-胺(13)(588mg,38％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ9.40(s,1h),8.46(d,j＝5.4hz,1h),8.06(dd,j＝8.1,1.5hz,1h),7.86(dd,j＝8.1,1.5hz,1h),7.81(s,1h),7.40(t,j＝8.1hz,1h),7.25(s,1h),7.22(d,j＝5.4hz,1h)。

ms(esi)[m+h]⁺＝358.1

將(4,8-二氯-喹啉-2-基)-(4-三氟甲基-吡啶-2-基)-胺(200mg,0.54mmole,1eq.)、3-(哌啶-1-基)丙-1-胺(94μl,0.59mmole,1.1eq.)、cui(10mg,0.05mmol,0.1eq)、l-脯氨酸(9mg,0.11mmole,0.2eq.)、碳酸鉀(148mg,1.01mmole,2eq.)在dmso(1.4ml)中形成的反應(yīng)混合物在90℃在氬氣的惰性氣氛中攪拌24小時(shí)。然后，反應(yīng)混合物在醋酸乙酯和水之間進(jìn)行分配。在傾析時(shí)，使用二氯甲烷進(jìn)一步萃取水相。合并有機(jī)相，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而得到8-氯代-n⁴-(3-哌啶-1-基-丙基)-n²-(4-三氟甲基-吡啶-2-基)-喹啉-2,4-二胺(9)(48mg,7％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ9.55(s,1h),8.40(d,j＝4.8hz,1h),7.85(s,1h),7.77(d,j＝7.8hz,1h),7.72(d,j＝7.8hz,1h),7.62(s,1h),7.18(t,j＝7.8hz,1h),7.10(d,j＝4.8hz,1h),5.88(s,1h),3.41–3.31(m,2h),2.59(t,j＝5.4hz,2h),2.57–2.43(m,4h),2.01–1.92(m,2h),1.79–1.70(m,4h),1.65–1.54(m,2h)。

¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ154.9,154.0,152.3,148.5,144.2,132.2,129.7,121.7,119.7,118.4,112.4,109.8,88.0,59.6,55.1,44.9,26.1,24.4,23.4。

ms(esi)[m+h]⁺＝464.2

實(shí)施例2：2-n-(8-氯代喹啉-2-基)-5-n-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]-4-(三氟甲基)吡啶-2,5-二胺；化合物(22)

將2,8-二氯代喹啉(198mg,1.0mmol,1eq.)、5-溴代-4-(三氟甲基)吡啶-2-胺(241mg,1.0mmol,1eq.)、pd(oac)2(4.5mg,0.02mmol,2mol％)、xantphos(11.6mg,0.02mmol,2mol％)和cs2co3(782mg,2.4mmoles,2.4eq.)在t-buoh(4ml)中形成的反應(yīng)混合物在微波反應(yīng)器中在120℃加熱70分鐘。在冷卻至室溫時(shí)，將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并使用醋酸乙酯稀釋所得的殘余物。然后，將有機(jī)相用水洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而得到n-[5-溴代-4-(三氟甲基)吡啶-2-基]-8-氯代喹啉-2-胺(21)(300mg,75％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ9.71(s,1h),8.51(s,1h),8.06(d,j＝9.0hz,1h),7.81(m,2h),7.65(d,j＝7.8hz,1h),7.33(t,j＝7.8hz,1h),7.00(d,j＝9.0hz,1h)。

ms(esi)[m+h]⁺＝403.7

將n-[5-溴代-4-(三氟甲基)吡啶-2-基]-8-氯代喹啉-2-胺(101mg,0.250mmol,1eq.)、3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙-1-胺(64μl,0.375mmol,1.5eq.)、pd2(dba)3(28mg,0.030mmol,12mol％)、xantphos(43.4mg,0.075mmol,30mol％)和叔丁醇鈉(72mg,0.75mmol,3eq.)在二噁烷(1ml)/dmf(0.1ml)混合物中形成的反應(yīng)混合物在微波反應(yīng)器中在120℃加熱70分鐘。在冷卻至室溫時(shí)，將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并使用醋酸乙酯稀釋所得的殘余物。然后，將有機(jī)相用水洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而得到2-n-(8-氯代喹啉-2-基)-5-n-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]-4-(三氟甲基)吡啶-2,5-二胺(22)(52mg,43％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ9.39(s,1h),7.97–7.86(m,2h),7.82(brs,1h),7.73(d,j＝7.5hz,1h),7.56(d,j＝7.5hz,1h),7.23(t,j＝7.5hz,1h),6.94(d,j＝9.0hz,2h),3.34–3.22(m,2h),2.80–2.44(m,10h),2.37(s,3h),1.87(t,j＝6.0hz,2h)。

ms(esi)[m+h]⁺＝479.0

實(shí)施例3：8-氯代-n-甲基-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺；化合物(28)

如wo2010/143169的實(shí)施例5中所述來(lái)合成8-氯代-n-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺，即，化合物(24)。

將8-氯代-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺(24)(340mg,1.0mmole,1eq.)、叔丁醇鉀(124mg,1.1mmole,1.1eq.)和碘代甲烷(69μl,1.1mmole,1.1eq.)在dmf(2ml)中形成的反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后，反應(yīng)混合物在醋酸乙酯和水之間進(jìn)行分配。合并有機(jī)相，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而得到8-氯代-n-甲基-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺(28)(247mg,70％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.69(d,j＝9.0hz,2h),7.49(d,j＝7.8hz,1h),7.36–7.25(m,4h),7.14(t,j＝7.8hz,1h),6.75(d,j＝9.0hz,1h),3.69(s,3h)。

ms(esi)[m+h]⁺＝353.1

實(shí)施例4：8-氯代-n-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺；化合物(30)

如wo2010/143169的實(shí)施例5中所述來(lái)合成8-氯代-n-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺，即，化合物(24)。

將8-氯代-n-[4-(三氟甲氧基)苯基]喹啉-2-胺(24)(500mg,1.47mmole,1eq.)和nah(177mg,4.43mmoles,3eq.)在無(wú)水dmf(2ml)中形成的反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。將1-(3-氯丙基)哌啶氫氯化物(292mg,1.47mmole,1eq.)、ki(245mg,1.47mmole,1eq.)和et3n(205μl,1.47mmole,1eq.)在無(wú)水dmf(5ml)中形成的反應(yīng)混合物在氬氣的惰性氣氛下在室溫?cái)嚢?0分鐘。然后，將活化的喹啉加入至哌啶鏈中，并將所得的反應(yīng)混合物在90℃攪拌4小時(shí)。接著，將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并使用醋酸乙酯稀釋所得的殘余物。將有機(jī)相用生理鹽水的飽和水性溶液洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而得到8-氯代-n-(3-(哌啶-1-基)丙基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)喹啉-2-胺(30)(472mg,69％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.73–7.63(m,2h),7.48(d,j＝7.9hz,1h),7.39–7.26(m,4h),7.13(t,j＝7.9hz,1h),6.67(d,j＝9.1hz,1h),4.26–4.14(m,2h),2.52–2.33(m,6h),2.11–1.97(m,2h),1.64–1.52(m,4h),1.45(s,2h)。

¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ156.5,147.3,144.1,143.5,137.1,130.8,129.7,129.1,126.4,124.7,122.7,122.4,118.9(t,j＝222hz),112.5,56.9,54.5,49.6,25.6,24.6,24.3。

ms(esi)[m+h]⁺＝464.4

實(shí)施例5：8-氯代-2-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)喹啉；化合物(46)

將2,8-二氯代喹啉(79mg,0.4mmol,1eq.)、2-羥基-4-(三氟甲基)吡啶(65mg,0.4mmol,1eq.)、cui(76mg,0.4mmol,1eq.)和cs2co3(391mg,1.2mmol,3eq.)在dmf(6ml)中形成的反應(yīng)混合物在微波反應(yīng)器中在150℃加熱50分鐘。在冷卻至室溫時(shí)，向反應(yīng)混合物中加入水。通過(guò)硅藻土過(guò)濾未溶解的固體，并使用醋酸乙酯萃取所得的濾液2次。將有機(jī)相用水和生理鹽水的飽和水性溶液洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而得到8-氯代-2-{[4-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}喹啉(46)(68mg,52％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.40(d,j＝7.2hz,1h),8.34(d,j＝8.8hz,1h),8.18(d,j＝8.8hz,1h),7.90(d,j＝7.2hz,1h),7.85(d,j＝7.9hz,1h),7.56(t,j＝7.9hz,1h),6.98(s,1h),6.53(d,j＝7.9hz,1h)。

¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ161.6,151.2,143.4,142.3,138.7,138.2,137.4,133.4,130.6,129.1,127.6,126.7,120.2,119.7,102.3。

ms(esi)[m+h]⁺＝325.1

實(shí)施例6：8-氯代-2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)喹啉；化合物(48)

將2,8-二氯代喹啉(2x79mg,2x0.4mmol,1eq.)、4-(三氟甲氧基)苯酚(2x52μl,2x0.4mmol,1eq.)、cui(2x76mg,2x0.4mmol,1eq.)和cs2co3(2x391mg,2x1.2mmol,3eq.)在dmf(2x6ml)中形成的反應(yīng)混合物在微波反應(yīng)器中在150℃加熱50分鐘。在冷卻至室溫時(shí)，向反應(yīng)混合物中加入水。通過(guò)硅藻土過(guò)濾未溶解的固體，并使用醋酸乙酯萃取所得的濾液2次。將有機(jī)相用水和生理鹽水的飽和水性溶液洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。通過(guò)柱層析在硅膠上純化所得的殘余物，從而得到8-氯代-2-[4-(三氟甲氧基)苯氧基]喹啉48(212mg,78％)。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.12(d,j＝8.8hz,1h),7.73(d,j＝8.1hz,1h),7.66(d,j＝8.1hz,1h),7.46(d,j＝9.1hz,2h),7.38–7.22(m,3h),7.12(d,j＝8.8hz,1h)。

¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ161.5,151.9,145.9,142.7,140.5,132.0,130.3,127.0,126.4,125.1,122.8,122.2,119.0(t,j＝255hz),113.6。

ms(esi)[m+h]⁺＝340.1

通過(guò)nmr光譜證明本發(fā)明的其他化合物的結(jié)構(gòu)。

表ii

藥理學(xué)數(shù)據(jù)

本發(fā)明的化合物為藥理學(xué)檢驗(yàn)的主題，已經(jīng)證明它們?cè)谥委?，特別是預(yù)防炎性疾病中作為活性物質(zhì)的相關(guān)性。

實(shí)施例7：在炎性腸病的體內(nèi)模型中喹啉衍生物對(duì)mir-124表達(dá)的調(diào)控

a.材料與方法

離體研究

采用ficoll^tm梯度提取pbmc

就所述的目的而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方案，通過(guò)在ficoll^tm梯度上離心來(lái)分離健康供者的外周血單核細(xì)胞(pbmc)。

簡(jiǎn)言之，將60-70ml白細(xì)胞層(buffy-coat)倒入175cm²燒瓶中，并使用pbs將體積調(diào)節(jié)至300ml，從而得到大約5倍稀釋的白細(xì)胞層。然后，在環(huán)境溫度，將38ml稀釋的白細(xì)胞層加入50mlfalcon^tm管(包含12mlficoll^tm(histopack-1077))中。在環(huán)境溫度，將制備物在515rcf離心30分鐘。使用移液管由falcon^tm管回收淋巴細(xì)胞環(huán)，然后在環(huán)境溫度，使用pbs通過(guò)在290rcf離心10分鐘對(duì)所述的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，直至上清液變澄清。

然后，在37℃將細(xì)胞再次懸浮于rpmiglutamax培養(yǎng)基(lifetechnologiesref61870-010)中，使密度達(dá)到1,5x10⁶細(xì)胞/ml，其中所述的培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％胎牛血清(fcs)(thermofischerrefsv30160.03)并且未活化。將細(xì)胞在37℃在5％co2溫育48小時(shí)。

使用篩選的分子處理細(xì)胞

使用6孔板進(jìn)行篩選。向各孔中加入篩選的分子，其中所述的各孔包含3.10⁶細(xì)胞/4ml的rpmi，其中補(bǔ)充有10％胎牛血清和40u/mlil-2(peprotechref200-02)。將100％dmso(4μl)加入至孔中，并且檢驗(yàn)為陰性對(duì)照。

如本發(fā)明下文所述設(shè)定各個(gè)檢驗(yàn)條件，并且相應(yīng)地調(diào)節(jié)孔中最終相應(yīng)的體積：

1)100％dmso中的喹啉衍生物(5μm并且最終體積為4μl)；

2)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥品：馬拉韋羅、依法韋侖、達(dá)蘆那韋、azt(所有藥品均為10μm，并且最終體積為4μl)。

將各孔在37℃在5％co2溫育3天。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方案更換培養(yǎng)基(第3天)。簡(jiǎn)言之，將平板在290rcf離心5分鐘，并除去3ml上清液。然后，加入補(bǔ)充有10％胎牛血清和40u/mlil-2的3mlrpmi，并且將5mm篩選的分子在100％dmso中形成的3μl原液或3μl100％dmso作為陰性對(duì)照。

mirna的提取(第6天)

使用15mlfalcon^tm管回收細(xì)胞，在290rcf離心5分鐘，然后在10mlpbs中洗滌，并在290rcf再離心5分鐘。然后將細(xì)胞再次懸浮于1mlpbs中，并計(jì)數(shù)。

回收6x10⁶個(gè)細(xì)胞，并在290rcf離心5分鐘。將細(xì)胞團(tuán)在300μl得自themachereynagelmirna提取試劑盒(machereynagelref740971)的ml裂解緩沖劑中裂解，并進(jìn)一步儲(chǔ)存在-20℃。

向各樣品中加入5μl的2x10⁸拷貝/μl加標(biāo)對(duì)照(ce_mir-39得自seqidn°6的參照號(hào)219610)。采用得自machereynagelmirna提取試劑盒的方案進(jìn)行mirna提取，其中rna的洗脫體積為50μl，mirna的洗脫體積為30μl，并進(jìn)一步儲(chǔ)存在-20℃。

mirna的逆轉(zhuǎn)錄(第6天)

使用得自的themiscriptrtii逆轉(zhuǎn)錄(rt)試劑盒，使用miscripthispec緩沖劑對(duì)12μlmirna實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄步驟，并進(jìn)一步儲(chǔ)存在-20℃。

mirna的定量pcr(第6天)

使用themiscriptgreenpcr試劑盒和miscriptprimerassays，根據(jù)制造商的方案實(shí)施定量pcr步驟。

用于384孔板的miscript反應(yīng)混合物的組成：

根據(jù)制造商的方案，在380rochereal-timepcr系統(tǒng)上在384孔板中以一式三份來(lái)重復(fù)所述的反應(yīng)。還根據(jù)制造商的方案設(shè)定循環(huán)條件：

qpcr的相對(duì)定量是本領(lǐng)域已知的，并且在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。

相對(duì)定量

使用miscriptprimerassays(hs_mir-124a,hs_mir-26a和hs_mir-191，或者–參照號(hào)ms00006622,ms00029239和ms00003682)，對(duì)于mir-124qpcr(hs_mir-124a)稀釋至在h2o中的1/10^th，或者對(duì)于參照/管家基因qpcr(hs_mir-26a和hs_mir-191)稀釋至1/100^th。

使用得自mir-124的一式三份的交點(diǎn)(cp)值的平均值以及mir-26a和mir-191的一式三份的平均值，在未經(jīng)過(guò)效率校正(2^-△△cp)的情況下，使用相對(duì)定量模型進(jìn)行分析。

b.結(jié)果

在式(i)所示的不同化合物存在下，評(píng)價(jià)一組供者(對(duì)于各種化合物，檢驗(yàn)1至7名供者)。

使用上文所述的方案，采用不同的供者(1至7)，通過(guò)相對(duì)定量來(lái)評(píng)估m(xù)ir-124表達(dá)的平均倍數(shù)變化(與dmso相比)，并呈現(xiàn)于下表iii中：

表iii

因此，試驗(yàn)證據(jù)表明與未處理的pbmc上建立的參照值相比，上文提及的式(i)所示的喹啉衍生物上調(diào)pbmc中mir-124的表達(dá)水平。

相反，在由4名供者得到的pbmc中，已知的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥品(馬拉韋羅、依法韋侖、達(dá)蘆那韋或azt)對(duì)mir-124的過(guò)表達(dá)均不具有任何顯著的作用。

實(shí)施例8：喹啉衍生物對(duì)(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的作用

a.材料與方法

小鼠模型

dss模型

常用的炎性腸病的小鼠模型為葡聚糖硫酸鈉(dss-)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型。急性dss-結(jié)腸炎的典型組織學(xué)改變?yōu)檎车鞍缀谋M、上皮變性和粘膜屏障被逐漸破壞，這導(dǎo)致炎癥和結(jié)腸炎。

在9天內(nèi)，使3組6周齡的c57bl/6小鼠(每組8只)接受飲用水中的dss施用(2.5％)(圖1-2)。每天測(cè)量體重減輕和水消耗。通過(guò)測(cè)量各裝置中飲用水的體積減少來(lái)測(cè)定水消耗。使用單獨(dú)的200ul0.5mc(dss+mc組)，或者與40mg/kg化合物24一起(dss+mc+24組)通過(guò)填喂法處理小鼠。在對(duì)照小鼠減輕多至它們體重的20％的時(shí)間點(diǎn)時(shí)(dss)，停止使用dss處理，并替代為飲用水。其他處理持續(xù)21天。

3組16周齡的c57bl/6小鼠(每組7只)接受處于飲用水中的2.5％dss(圖3)。使用單獨(dú)的200ul0.5mc(dss+mc組)，或者與40mg/kg化合物24一起(dss+mc+24組)通過(guò)填喂法處理小鼠。使用dss處理小鼠6天，并且在對(duì)照小鼠減輕多至它們體重的15％的時(shí)間點(diǎn)時(shí)(dss)，對(duì)所有小鼠實(shí)施安樂(lè)死，并取得結(jié)腸用于進(jìn)一步的分析。

使用尺來(lái)測(cè)量結(jié)腸，并根據(jù)theswissroll方案(whittemetal.；“murinecolitismodelingusingdextransulfatesodium(dss)”,jvisexp2010(35)1652)制備完整的結(jié)腸(使用福爾馬林固定并包埋于石蠟中)以用于組織學(xué)分析。將4μm切片脫蠟，并使用蘇木精和伊紅染色，對(duì)于損傷尺寸和其他改變進(jìn)行分析(圖4-6)。我們比較在dss周期中未處理的小鼠，以及使用懸浮于甲基纖維素中的喹啉衍生物或僅使用甲基纖維素(mc)處理的小鼠。使用mann-whitney檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，星號(hào)指示顯著性差異(p<0.5)，兩個(gè)星號(hào)指示極顯著性差異(p<0.05)。

b.結(jié)果

使用喹啉衍生物化合物(24)建立所提出的結(jié)果，對(duì)于所述的化合物，呈現(xiàn)以下結(jié)構(gòu)用于參考：

在使用喹啉衍生物對(duì)施用dss的小鼠處理5天后，表觀(guān)體重減輕平均低于1％，與此相反，mc或未處理的小鼠顯示體重減輕為10％至20％(圖1和2)。

值得注意的是，我們注意到藥品處理的小鼠的水消耗更高，反映了喹啉衍生物的控制疾病的作用。在二次施用dss的過(guò)程中，喹啉衍生物處理在小鼠中還顯著地控制體重減輕，指示小鼠并非是無(wú)應(yīng)答的，并且喹啉衍生物適用于重復(fù)施用。在一個(gè)周期的dss之后，在喹啉衍生物處理的小鼠中結(jié)腸的長(zhǎng)度(6.4cm+/-0.6cm)明顯比僅mc處理的小鼠(5.9cm+/-0.8cm)和未處理的小鼠(5.8cm+/-0.8cm)的結(jié)腸更大(圖3)。這種差異在接受2周期的dss的小鼠中甚至更突出。喹啉衍生物處理的小鼠中結(jié)腸的長(zhǎng)度(5.7cm+/-0.9cm)明顯比僅mc處理的小鼠(4.3cm+/-0.5cm)和未處理的小鼠(4.4cm+/-0.4cm)的結(jié)腸更大(圖3)。不同組群的小鼠發(fā)展成相當(dāng)數(shù)量的損傷(圖4)，但是損傷面積的平均尺寸顯著地低于喹啉衍生物處理的小鼠，即，2.1mm²與8.4mm²(僅mc處理的小鼠)(圖5)。這種差異在暴露于2個(gè)dss周期的小鼠中得以維持(3.8mm²與12.2mm²)。

最后，我們觀(guān)察到在2個(gè)dss周期后，淋巴器官(例如派伊爾淋巴集結(jié))的改變減少，表明喹啉衍生物的處理調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

實(shí)施例9：喹啉衍生物對(duì)膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的作用

a.材料與方法

小鼠模型

膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型：

使用ii型牛膠原蛋白通過(guò)皮內(nèi)免疫多組9至10周齡的dba/1小鼠，其中所述的ii型牛膠原蛋白以1:1的比例使用弗氏佐劑乳化。在初次免疫后21天攻擊小鼠，并且每?jī)商焱ㄟ^(guò)監(jiān)測(cè)各后爪踝關(guān)節(jié)的厚度來(lái)評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)型外觀(guān)。后爪踝關(guān)節(jié)的厚度是使用表盤(pán)卡尺(0-至10-mm)使用厚度計(jì)測(cè)量的。在2周內(nèi)，每天使用懸浮于甲基纖維素中的喹啉衍生物候選物或者僅使用甲基纖維素(mc)處理小鼠，然后監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展。使用mann-whitney檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，星號(hào)指示顯著性差異(p<0.5)。

b.結(jié)果

10只使用測(cè)試的喹啉衍生物化合物(24)處理的小鼠中僅1只小鼠顯示炎癥病征(相比之下，10只mc處理的小鼠中的8只小鼠發(fā)展出疾病)。與僅使用mc處理的小鼠相比，使用喹啉衍生物處理的小鼠顯示明顯減小的腫脹(1.9mm對(duì)比大約2.2mm)(圖6)。

因此，對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的化合物實(shí)施的測(cè)試結(jié)果顯示所述的化合物可以用于治療和/或預(yù)防上文進(jìn)一步描述的炎性疾病。

就此而言，可以對(duì)患有炎性疾病的個(gè)體施用有效量的所述的化合物。

因此，可以在藥物組合物中實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的化合物，其中所述的藥物組合物可以包含有效量的所述的化合物、以及一種或多種藥物賦形劑。

根據(jù)劑型和所需的施用方式來(lái)選擇上文提及的賦形劑。

在該內(nèi)容中，它們可以以一定的劑量(其能夠每天施用0.1至1000mg的活性物質(zhì))與合適的賦形劑聯(lián)合存在于任何適用于腸內(nèi)或腸胃外施用的藥物形式中，例如以片劑或包衣片劑、硬明膠、軟膠囊和其他膠囊、栓劑或飲劑(例如懸劑、糖漿)、或者可注射的溶液或懸劑的形式。

可以采用任何給藥途徑。例如可以通過(guò)口服、腸胃外、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、直腸、舌下、粘膜、鼻內(nèi)或其他手段施用式(i)所示的化合物。此外，式(i)所示的化合物可以以藥物組合物和/或單位劑型的形式施用。

具體而言，本發(fā)明的藥物組合物可以口服和/或腸胃外施用。

合適的劑型包括但不限于膠囊、片劑(包括速溶和緩釋片劑)、粉末、糖漿、口服懸劑和用于腸胃外施用的溶液。

所述的藥物組合物還可以包含另一種本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的抗炎試劑，以及根據(jù)本發(fā)明的化合物。

序列表

<110>abivax

universitedemontpellier

centrenationaldelarecherchescientifique(cnrs)

institutcurie

<120>用于治療炎性疾病的喹啉衍生物

<130>pr72917

<150>ep14306164.6

<151>2014-07-17

<160>6

<170>bissap1.3

<210>1

<211>85

<212>rna

<213>智人

<400>1

aggccucucucuccguguucacagcggaccuugauuuaaauguccauacaauuaaggcac60

gcggugaaugccaagaauggggcug85

<210>2

<211>109

<212>rna

<213>智人

<400>2

aucaagauuagaggcucugcucuccguguucacagcggaccuugauuuaaugucauacaa60

uuaaggcacgcggugaaugccaagagcggagccuacggcugcacuugaa109

<210>3

<211>87

<212>rna

<213>智人

<400>3

ugagggccccucugcguguucacagcggaccuugauuuaaugucuauacaauuaaggcac60

gcggugaaugccaagagaggcgccucc87

<210>4

<211>20

<212>rna

<213>智人

<400>4

uaaggcacgcggugaaugcc20

<210>5

<211>22

<212>rna

<213>智人

<400>5

cguguucacagcggaccuugau22

<210>6

<211>22

<212>rna

<213>秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)

<400>6

ucaccggguguaaaucagcuug22