本發(fā)明涉及氨基酸檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種食品中游離氨基酸含量的測定方法。

背景技術(shù)：

氨基酸是既含氨基(-nh2)又含羧基(-cooh)的有機(jī)化合物的統(tǒng)稱，是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的基本單位，也是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，不僅具有營養(yǎng)保健價(jià)值，還具有特殊的生理調(diào)節(jié)功效，被認(rèn)為是世界保健食品第三代產(chǎn)品。在食品工業(yè)中，氨基酸除用于食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑外，還廣泛用于調(diào)味、增香、消除異臭、防腐保鮮等方面，是食品品質(zhì)鑒定中一個(gè)重要的理化指標(biāo)。各種食品中都含有游離氨基酸，在食物的加工過程中，可以與肽、核苷酸、有機(jī)酸、糖、無機(jī)離子等形成相應(yīng)的呈味活性物質(zhì)，決定了每一種食物獨(dú)有的風(fēng)味特征。

目前，食品或飲料中游離氨基酸含量測定方法主要采用電位滴定法、茚三酮比色法、消旋光法、氨基酸分析儀法、色譜法(液相、氣相)等。其中，反相高效液相色譜法準(zhǔn)確度最高，應(yīng)用最廣，但該方法最主要的缺點(diǎn)是分析時(shí)間長、分離度差、有機(jī)溶劑用量大。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種超臨界流體色譜法測定食品中游離氨基酸含量的方法，所述的測定方法能在16min內(nèi)快速分離并分別定量檢測出食品中十七種氨基酸的含量，具有檢測速度快、有機(jī)溶劑用量少、分離度高、靈敏度高、再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種食品中游離氨基酸含量的測定方法，包括以下步驟：

對質(zhì)量為m的待檢測物預(yù)處理，得到體積為v的檢測液；

將所述檢測液進(jìn)行柱前衍生化，得到衍生化的檢測液；

采用超臨界流體色譜儀檢測所述衍生化的檢測液中氨基酸的含量，得到檢測液所含的氨基酸的質(zhì)量濃度；

所述超臨界流體色譜儀的檢測條件為：色譜柱的直徑為3.0mm、柱長為100mm、填料粒徑為1.7μm，填料為高密度二醇；流動相為超臨界二氧化碳和含有甲酸銨的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇與乙腈的體積比為1：0.9-1.1，甲酸銨在所述甲醇乙腈溶液中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.18％-0.22％；采用梯度洗脫，超臨界二氧化碳在不同時(shí)間段的體積百分比為：0-0.2min為100％-95％，0.2-5.0min為90％-70％，5.0-10.5min為80％-60％，10.5-16.0min為90％-70％，16.0-17.0min為95％-100％；

分析時(shí)間：3.5-16.0min；柱溫：40-60℃；備壓：1500-3000psi；進(jìn)樣量：0.2-10μl；流速：1.0-3.0ml/min；檢測波長為280nm；

通過以下公式分別計(jì)算得到所述待檢測物中氨基酸的含量：(質(zhì)量濃度*v)/m。

本發(fā)明提供的測定方法，先將食品中的氨基酸提取出來，然后在超臨界流體色譜儀中采用特定的洗脫條件，將十七種氨基酸分別選擇性地分配，進(jìn)而分離開，并定量檢測出其濃度。最后代入公式(質(zhì)量濃度*v)/m，計(jì)算出食品中十七種氨基酸的含量。整個(gè)超臨界流體色譜的檢測過程不會超過16min，溶劑用量極少，并且譜圖顯示完全可以將十七種氨基酸同時(shí)分離開，并定量檢測出含量，具有檢測速度快、有機(jī)溶劑用量少、分離度高、靈敏度高、再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

進(jìn)一步地，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸、脯氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、精氨酸、蘇氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸。即本發(fā)明提供的測定方法可以檢測這些氨基酸中的任一種或多種。

上述測定方法適用于測定各種類型的食品，例如，植物組織、水果(火龍果、蘋果、草莓等)和果酒(菠蘿果酒等)。進(jìn)一步地，所述待檢測物包括植物組織、水果、果酒、果汁、飲料、固體飲料(如速溶茶等)、食品添加劑等。

進(jìn)一步地，若待檢測物為液體，則所述預(yù)處理為直接取樣；

若待檢測物為植物組織，所述預(yù)處理為：將待檢測物粉碎，等體積比加入鹽酸，充分混合后離心，上清液即為所述檢測液；

若待檢測物為固體飲料、食品添加劑，所述預(yù)處理為：取待檢測物，加入鹽酸，使待檢測物在鹽酸中的濃度為0.8-1.5g/l，混合后離心得到上清液為所述檢測液；如可以為0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l等等。

所述鹽酸溶液的濃度為0.2±0.02mol/l。

加入鹽酸溶液可以避免檢測成分被氧化，可以在幾乎零氧化率的條件下將食品中的氨基酸充分提取出來，提取率可以達(dá)到90％以上，該預(yù)處理方法對十七種氨基酸的提取率高，損失少。

進(jìn)一步地，所述衍生化為：依次加入ph為9.0±0.2的1±0.02mol/l硼酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、甲醇、檢測液、乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯，混合后超聲處理10-20min，然后在60-80℃下水浴1.0h以上，去除過量的衍生化試劑；

其中，硼酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、甲醇、檢測液和乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯的體積比為25：24：24-26：1。

衍生化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)物之間的配比對反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量及反應(yīng)速度具有至關(guān)重要的影響，采用上述配比的衍生化體系產(chǎn)量高，且反應(yīng)速度快。

水浴衍生化1h以后，反應(yīng)基本達(dá)到飽和，如果再延長反應(yīng)時(shí)間，提取率會提高，但相應(yīng)的成本會急劇增加。水浴的時(shí)間可以為1h、1.5h、2h、3h等等。

優(yōu)選地，硼酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、甲醇、檢測液和乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯的體積比為25：24：25：1。

進(jìn)一步地，去除過量的衍生化試劑后還過濾，所述過濾采用0.22μm尼龍膜進(jìn)行。通過過濾進(jìn)一步去除雜質(zhì)，為檢測的穩(wěn)定進(jìn)行提供良好的基礎(chǔ)。

優(yōu)選地，所述進(jìn)樣體積為0.2-3.0μl。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)，該進(jìn)樣體積可以保證峰面積在比較合理的范圍，從而保證在儀器的檢測范圍內(nèi)。

優(yōu)選地，所述備壓為1800psi?，F(xiàn)該范圍的備壓，可以提高氨基酸的柱效，此時(shí)分離效果最佳，峰型分離度好。

優(yōu)選地，所述流速為2ml/min。該條件下分離效果更佳，靈敏度更高。

優(yōu)選地，所述超臨界流體色譜儀檢測時(shí)，波長補(bǔ)償范圍為330-430nm。該條件可以降低基線噪音干擾，得到的峰型對稱性好、選擇性強(qiáng)、干擾少。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明提供的測定方法能在16min內(nèi)快速分離并分別定量檢測出食品中十七種氨基酸的含量，具有檢測速度快、采樣量少、有機(jī)溶劑用量少、分離度高、靈敏度高、再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

(2)本發(fā)明選用在待檢測物中添加一定濃度的鹽酸溶液，能快速將食品中的氨基酸分離出來，提高了食品中游離氨基酸的檢測效率。

(3)本發(fā)明還選擇特定的衍生化體系以及步驟，反應(yīng)速度快，衍生化效果好。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中標(biāo)準(zhǔn)品中測定的各氨基酸的色譜圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中火龍果樣品中氨基酸的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

一種超臨界流體色譜法測定食品中游離氨基酸含量的方法：

一、制備衍生化的檢測液

取火龍果，去皮之后稱量4g(m)打漿，按照1：1的質(zhì)量體積比加入鹽酸溶液(0.2mol/l)，在振蕩器上震蕩10s，使其完全混合，離心取上清液，得到檢測液；

取5ml具塞試管，向試管中依次加入500μlph為9.0的1mol/l硼酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、480μl甲醇、500μl檢測液和20μl乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯，超聲處理15min，然后所得溶液在70℃下水浴1h，去除過量的衍生化試劑，然后過0.22μm尼龍膜，得到的濾液用于超臨界流體色譜儀檢測。

二、超臨界流體色譜儀測定標(biāo)準(zhǔn)曲線：

稱取甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，纈氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，絲氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，蘇氨酸(thr)，組氨酸(his)，異亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，賴氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)十七種氨基酸標(biāo)品各6mg放于5ml離心管中，加入4ml鹽酸溶液(0.2mol/l)，在振蕩器上震蕩10s，使其完全混合，得到1.5mg/ml的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)儲備液；

取單標(biāo)儲備液各1.0ml于10ml棕色容量瓶中，0.2mol/l的鹽酸溶液稀釋至刻度，即得氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)儲備液。

分別取混標(biāo)儲備液，用0.2mol/l的鹽酸溶液稀釋為濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、1.5mg/ml梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按樣品處理步驟進(jìn)行柱前衍生化，經(jīng)0.22μm尼龍膜過濾后，取適量采用超臨界流體色譜儀進(jìn)行檢測，檢測條件如下，以峰面積-濃度作圖，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程；

檢測條件：

色譜柱的直徑為3.0mm、柱長為100mm、填料粒徑為1.7μm，填料為高密度二醇；流動相為超臨界二氧化碳和含有甲酸銨的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇與乙腈的體積比為1：1，甲酸銨在所述甲醇乙腈溶液中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.20％；采用梯度洗脫，其中，超臨界二氧化碳在不同時(shí)間段的體積百分比為：0-0.2min為98％，0.2-5.0min為80％，5.0-10.5min為70％，10.5-16.0min為80％，16.0-17.0min為98％；分析時(shí)間：16min；柱溫：50℃；備壓：1800psi；進(jìn)樣量：1μl；流速：2.0ml/min；檢測波長為280nm，波長補(bǔ)償為400nm。

三、超臨界流體色譜儀測定樣品：

采用與第二步相同的檢測條件檢測步驟一制得的檢測液，得到十七種氨基酸的峰值，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出濃度，再通過公式(質(zhì)量濃度*v)/m計(jì)算中食品中的氨基酸含量。

十七種氨基酸異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示，各氨基酸的譜圖如圖1所示。

表1十七種氨基酸異構(gòu)體對照品的線性回歸方程及相關(guān)參數(shù)

注：x：氨基酸的濃度(μg/ml)；y：氨基酸積分峰面積；*檢出限：信噪比(s/n)為3；**定量限：信噪比(s/n)為10。

從圖1可以看出，得到的17種氨基酸分離效果佳，峰型好。從表1可以看出，得到的線性回歸方程的r²均在0.9990以上，線性穩(wěn)定，誤差小。

火龍果樣品中氨基酸色譜圖如圖2所示；根據(jù)線性回歸方程計(jì)算得到火龍果樣品中氨基酸含量，如表2所示。同時(shí)，在對火龍果樣品檢測時(shí)，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定檢測方法的重現(xiàn)性；另外，采用上述方法，3天后進(jìn)行相同操作進(jìn)樣，測定檢測方法的再現(xiàn)性，結(jié)果如表2所示。

表2火龍果樣品中氨基酸含量

從圖2可以看出，得到的17種氨基酸分離效果佳，峰型好。從表2可以看出，火龍果樣品中所含含有的各種氨基酸的含量，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19％-2.07％，具有良好的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性。

加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取已知氨基酸含量的火龍果樣品4ml(共24份)，分別加入甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，纈氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，絲氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，蘇氨酸(thr)，組氨酸(his)，異亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，賴氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)的單標(biāo)儲備液(濃度為0.1mg/ml，體積分別為12.5、25.0、125.0μl)至每份火龍果樣品。按樣品處理步驟及檢測條件下進(jìn)樣2次。

回收率結(jié)果如表3所示，從表3可以看出，這十七種氨基酸的平均回收率范圍在91.2％-98.2％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.7％-3.2％。

表3回收率試驗(yàn)

從表3可以看出，各氨基酸的平均回收率范圍在85％以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3％-4.9％。

實(shí)施例2

一種超臨界流體色譜法測定草莓果汁中游離氨基酸含量的方法，步驟如下：

一、制備衍生化的檢測液

取5ml具塞試管，向試管中依次加入500μlph為8.8的0.98mol/l硼酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、480μl甲醇、480μl(v)草莓果汁，同時(shí)，采用萬分之一天平快速稱量在草莓果汁加入前后試管的重量，兩者相減得到加入的草莓果汁的重量(m)；

然后立即加入20μl乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯，超聲處理10min，然后所得溶液在60℃下水浴1h，去除過量的衍生化試劑，然后過0.22μm尼龍膜，得到的濾液用于超臨界流體色譜儀檢測。

二、超臨界流體色譜儀測定標(biāo)準(zhǔn)曲線：

稱取甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，纈氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，絲氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，蘇氨酸(thr)，組氨酸(his)，異亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，賴氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)十七種氨基酸標(biāo)品各6mg放于5ml離心管中，加入4ml鹽酸溶液(0.1mol/l)，在振蕩器上震蕩10s，使其完全混合，得到1.5mg/ml的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)儲備液；

取單標(biāo)儲備液各1.0ml于10ml棕色容量瓶中，0.2mol/l的鹽酸溶液稀釋至刻度，即得氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)儲備液。

分別取混標(biāo)儲備液，用0.2mol/l的鹽酸溶液稀釋為濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、1.5mg/ml梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按樣品處理步驟進(jìn)行柱前衍生化，經(jīng)0.22μm尼龍膜過濾后，取適量采用超臨界流體色譜儀進(jìn)行檢測，檢測條件如下，色譜圖同實(shí)施例1的圖1基本一致，以峰面積-濃度作圖，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程；

檢測條件：

色譜柱的直徑為3.0mm、柱長為100mm、填料粒徑為1.7μm，填料為高密度二醇；流動相為超臨界二氧化碳和含有甲酸銨的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇與乙腈的體積比為1：0.9，甲酸銨在所述甲醇乙腈溶液中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.18％；采用梯度洗脫，其中，超臨界二氧化碳在不同時(shí)間段的體積百分比為：0-0.2min為100％，0.2-5.0min為90％，5.0-10.5min為80％，10.5-16.0min為90％，16.0-17.0min為95％；分析時(shí)間：3.5min；柱溫：60℃；備壓：1500psi；進(jìn)樣量：0.2μl；流速：1.0ml/min；檢測波長為280nm，波長補(bǔ)償為330nm。

三、超臨界流體色譜儀測定樣品：

采用與第二步相同的檢測條件檢測步驟一制得的檢測液，得到十七種氨基酸的峰值，色譜圖與實(shí)施例1的圖2基本一致，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出質(zhì)量濃度，再通過公式(質(zhì)量濃度*v)/m計(jì)算中食品中的氨基酸含量。

另外，測定重現(xiàn)性、再現(xiàn)性以及加樣回收率，結(jié)果與實(shí)施例1基本一致。

實(shí)施例3

一種超臨界流體色譜法測定食品中游離氨基酸含量的方法，步驟如下：

一、制備衍生化的檢測液

取質(zhì)量為2g(m)的菠菜葉粉碎打漿，加入等體積的鹽酸溶液(0.12mol/l)，在振蕩器上震蕩10s，使其完全混合，然后離心取上清，得到檢測液v；

取5ml具塞試管，向試管中依次順序加入500μlph為9.2的1.02mol/l硼酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、480μl甲醇、520μl檢測液和20μl乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯，超聲處理20min，然后所得溶液在80℃下水浴1h，去除過量的衍生化試劑，然后過0.22μm尼龍膜，得到的濾液用于超臨界流體色譜儀檢測。

二、超臨界流體色譜儀測定標(biāo)準(zhǔn)曲線：

稱取甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，纈氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，絲氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，蘇氨酸(thr)，組氨酸(his)，異亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，賴氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)十七種氨基酸標(biāo)品各6mg放于5ml離心管中，加入4ml鹽酸溶液(0.22mol/l)，在振蕩器上震蕩10s，使其完全混合，得到1.5mg/ml的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)儲備液；

取單標(biāo)儲備液各1.0ml于10ml棕色容量瓶中，0.22mol/l的鹽酸溶液稀釋至刻度，即得氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)儲備液。

分別取混標(biāo)儲備液，用0.22mol/l的鹽酸溶液稀釋為濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、1.5mg/ml梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按樣品處理步驟進(jìn)行柱前衍生化，經(jīng)0.22μm尼龍膜過濾后，取適量采用超臨界流體色譜儀進(jìn)行檢測，檢測條件如下，色譜圖同實(shí)施例1的圖1基本一致，以峰面積-濃度作圖，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程；

檢測條件：

色譜柱的直徑為3.0mm、柱長為100mm、填料粒徑為1.7μm，填料為高密度二醇；流動相為超臨界二氧化碳和含有甲酸銨的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇與乙腈的體積比為1：1.1，甲酸銨在所述甲醇乙腈溶液中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.22％；采用梯度洗脫，其中，超臨界二氧化碳在不同時(shí)間段的體積百分比為：0-0.2min為95％，0.2-5.0min為70％，5.0-10.5min為60％，10.5-16.0min為90％，16.0-17.0min為95％；分析時(shí)間：10min；柱溫：40℃；備壓：3000psi；進(jìn)樣量：10μl；流速：3.0ml/min；檢測波長為280nm，波長補(bǔ)償為430nm。

三、超臨界流體色譜儀測定樣品：

采用與第二步相同的檢測條件檢測步驟一制得的檢測液，得到十七種氨基酸的峰值，色譜圖與實(shí)施例1的圖2基本一致，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出質(zhì)量濃度，再通過公式(質(zhì)量濃度*v)/m計(jì)算中食品中的氨基酸含量。

另外，測定重現(xiàn)性、再現(xiàn)性以及加樣回收率，結(jié)果與實(shí)施例1基本一致。

實(shí)施例4

一種超臨界流體色譜法測定葡萄酒中游離氨基酸含量的方法，步驟如下：

一、制備衍生化的檢測液

取5ml具塞試管，向試管中依次加入500μlph為9.0的1mol/l硼酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、480μl甲醇、500μl葡萄酒(v)，同時(shí)，采用萬分之一天平快速稱量在草莓果汁加入前后試管的重量，兩者相減得到加入的草莓果汁的重量(m)；

然后立即加入20μl乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯，超聲處理15min，然后所得溶液在70℃下水浴1h，去除過量的衍生化試劑，然后過0.22μm尼龍膜，得到的濾液用于超臨界流體色譜儀檢測。

二、超臨界流體色譜儀測定標(biāo)準(zhǔn)曲線：

稱取甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，纈氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，絲氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，蘇氨酸(thr)，組氨酸(his)，異亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，賴氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)十七種氨基酸標(biāo)品各6mg放于5ml離心管中，加入4ml鹽酸溶液(0.18mol/l)，在振蕩器上震蕩10s，使其完全混合，得到1.5mg/ml的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)儲備液；

取單標(biāo)儲備液各1.0ml于10ml棕色容量瓶中，0.18mol/l的鹽酸溶液稀釋至刻度，即得氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)儲備液。

分別取混標(biāo)儲備液，用0.18mol/l的鹽酸溶液稀釋為濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、1.5mg/ml梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按樣品處理步驟進(jìn)行柱前衍生化，經(jīng)0.22μm尼龍膜過濾后，取適量采用超臨界流體色譜儀進(jìn)行檢測，檢測條件如下，色譜圖同實(shí)施例1的圖1基本一致，以峰面積-濃度作圖，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程；

檢測條件：

色譜柱的直徑為3.0mm、柱長為100mm、填料粒徑為1.7μm，填料為高密度二醇；流動相為超臨界二氧化碳和含有甲酸銨的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇與乙腈的體積比為1：1，甲酸銨在所述甲醇乙腈溶液中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.2％；采用梯度洗脫，其中，超臨界二氧化碳在不同時(shí)間段的體積百分比為：0-0.2min為98％，0.2-5.0min為80％，5.0-10.5min為70％，10.5-16.0min為80％，16.0-17.0min為98％；分析時(shí)間：16min；柱溫：50℃；備壓：1800psi；進(jìn)樣量：3μl；流速：2.0ml/min；檢測波長為280nm，波長補(bǔ)償范圍為380nm。

三、超臨界流體色譜儀測定樣品：

采用與第二步相同的檢測條件檢測步驟一制得的檢測液，得到十七種氨基酸的峰值，色譜圖與實(shí)施例1的圖2基本一致，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出質(zhì)量濃度，再通過公式(質(zhì)量濃度*v)/m計(jì)算中食品中的氨基酸含量。

另外，測定重現(xiàn)性、再現(xiàn)性以及加樣回收率，結(jié)果與實(shí)施例1基本一致。

本發(fā)明提供的食品中游離氨基酸含量的測定方法，整個(gè)超臨界流體色譜的檢測過程不會超過16min，溶劑用量極少，并且譜圖顯示完全可以將十七種氨基酸異構(gòu)體同時(shí)分離開，并定量檢測出含量，具有檢測速度快、有機(jī)溶劑用量少、分離度高、靈敏度高、再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。