專利名稱：用于治療炎性疾病的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于防止、預(yù)防和治療諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性疾病的方法和藥物組合物，所述藥物組合物包含蛋白質(zhì)膽鹽激活脂肪酶(BSSL)的拮抗劑。本發(fā)明還涉及包含 BSSL拮抗劑的藥物組合物以及它們在用于防止、預(yù)防和治療諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性疾病的方法中的用途。
背景技術(shù)：
炎件疾病-類風(fēng)濕件關(guān)節(jié)炎炎癥是人體對損傷或感染、過敏或化學(xué)刺激的反應(yīng)，其可導(dǎo)致各種炎癥性疾病或病癥，例如與過敏相關(guān)的炎癥、與氧化一氮的產(chǎn)生相關(guān)的炎癥、與皮膚、腹部、外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼或淚腺、耳、鼻、口、肺、心臟、肝臟、胰腺、甲狀腺、脂肪組織、腎臟、關(guān)節(jié)或血管相關(guān)的炎癥或者與感染、外傷或自身免疫相關(guān)的炎癥。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是慢性、炎性、全身性自身免疫疾病，其影響約的西方社會總?cè)丝?Gabriel 2001)。該疾病過程導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨的進(jìn)行性損傷。這一損傷由免疫應(yīng)答和非抗原特異性固有炎性過程引起。該疾病的特征是單關(guān)節(jié)或多關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)發(fā)炎并且嗜中性粒細(xì)胞大量聚積在滑膜液和組織中?；ひ褐械氖戎行粤＜?xì)胞通過釋放蛋白酶和產(chǎn)生氧化劑引起軟骨損傷，抑制嗜中性粒細(xì)胞浸潤入發(fā)炎的關(guān)節(jié)是防止該疾病進(jìn)展的方法正變得越來越明顯(Hallett 2008)。目前對RA的治療包括用于疼痛治療的非甾體抗炎藥 (NSAID)、緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物(DMARD)和靶向特異的促炎性細(xì)胞因子或各種細(xì)胞類型的細(xì)胞表面受體的生物制劑。但是仍然需要炎性疾病特別是慢性炎性疾病的替代藥物治療。因此需要鑒定出參與炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和過程的新的獨(dú)特的靶點(diǎn)，其可用作研發(fā)用于治療、預(yù)防或防止炎性疾病的創(chuàng)新性治療藥物的基礎(chǔ)。膽鹽激活脂肪酶膽鹽激活脂肪酶(BSSL)還被稱作羧基酯脂肪酶(CEL)或膽鹽依賴性脂肪酶 (BSDL)，在至今為止所研究的所有物種中其為在外分泌胰腺中表達(dá)并且被分泌進(jìn)入腸腔的裂解脂肪的酶。在包括人類在內(nèi)的一些物種中，BSSL還可由泌乳的乳腺表達(dá)并且與乳汁一起分泌。BSSL具有寬泛的底物特異性，其具有水解多種不同的底物的能力，例如膽固醇酯、三?；?、二?；蛦熙；视汀⒅苄跃S生素酯、磷脂、半乳糖脂以及神經(jīng)酰胺(Hui和 Howies 2002)。最初認(rèn)為BSSL的生理學(xué)功能限于小腸中和水解食物中的脂肪(Hemell等人，1997)。胰液中高度富含BSSL(多達(dá)總蛋白含量的5% )和BSSL水解多種脂質(zhì)的能力使研究人員提出了 BSSL在脂質(zhì)消化和吸收中的多種功能。BSSL在膽固醇酯的吸收中具有關(guān)鍵作用O^ait等人，2002)，這一點(diǎn)在缺乏BSSL (CEL基因)的小鼠中得到驗(yàn)證(Howies等人，1996)。盡管認(rèn)為這是其在成人中的主要功能，但是它很可能還有助于新生兒中甘油三酯的消化和吸收(Lindquist和Hernell 2010)。已發(fā)現(xiàn)BSSL以較低的但是明顯的水平存在于健康個體的血清中(Blacliberg等人，198 并且目前的研究已表明BSSL參與脂蛋白代謝和動脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)(Hui和 Howies 2002)。BSSL的潛在功能以及甚至是循環(huán)BSSL水平升高是否是動脈粥樣硬化的風(fēng)險因素或可防止動脈粥樣硬化這一問題仍不清楚。最初報(bào)道了測定為膽固醇酯酶活性的 BSSL與血清中的總脂蛋白和低密度脂蛋白(LDL)-膽固醇水平之間的令人驚異的顯著的正相關(guān)性(Hui和Howies 2002)。接著證明了 BSSL與動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的平滑肌細(xì)胞 (SMC)相關(guān)并且在體外誘導(dǎo)血管SMS增殖(Auge等人2003)。一項(xiàng)使用轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明BSSL的巨噬細(xì)胞表達(dá)具有促動脈粥樣硬化性，有利于膽固醇酯積累和泡沫細(xì)胞形成 (Kodvawala等人，2005)。由這些研究判斷，BSSL可能為動脈粥樣硬化的風(fēng)險因素。另一方面，BSSL降低氧化的LDL中的溶血磷脂膽堿的含量，由此減少氧化的LDL在巨噬細(xì)胞中的積累(Hui和Howies 2002)，并且已表明其通過與清道夫受體BI途徑的直接或間接相互作用在高密度脂蛋白膽固醇酯的肝臟選擇性攝取和代謝中起到生理學(xué)作用(Camarota等人， 2004)，這表明血清中的BSSL可防止動脈粥樣硬化。BSSL 蛋白人BSSL蛋白(由CEL基因編碼)是722個氨基酸的單鏈糖蛋白(Nilsson等人，1990)。該酶被合成為具有20個氨基酸的信號肽的742個氨基酸的前體。已推測出調(diào)節(jié)酶的活性的兩個膽鹽結(jié)合位點(diǎn)和蛋白酶抗性(Hui 1996)以及鞘脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD) (Aubert-Jousset 等人，2004)。通過示意圖可將該酶分成兩部分i)與乙酰膽堿酯酶和一些其它的酯酶具有顯著同源性的N-端結(jié)構(gòu)域。在該部分中存在已提出的催化三分子(Serl94(包含于GESAG基序中)、Asp320和His435)和N-糖基化位點(diǎn)Asnl87、肝素結(jié)合位點(diǎn)(推測位于1-100位)以及兩個鏈內(nèi)二硫鍵(Cys64-Cys80 和Cys 246-Cys257) 0已發(fā)現(xiàn)所述肝素結(jié)合能力位于由氨基酸1_445組成的分子部分中 (Spilburg等人，1995)并且所述肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域事實(shí)上可能是由含不同序列組成的三維結(jié)構(gòu)。BSSL的肝素結(jié)合性質(zhì)被認(rèn)為對于與細(xì)胞膜例如腸細(xì)胞膜的相互作用非常重要(Fait 2002)。ii)具有數(shù)量不同的包含相似的但是不相同的重復(fù)序列(11個氨基酸)的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)的C-端部分(由外顯子11編碼)。人類中最常見的形式包含16個重復(fù)序列， 但是個體和等位基因之間的重復(fù)數(shù)量存在差異(Lindquist等人，200 。重復(fù)序列之后為 11個氨基酸的額外的尾區(qū)(該尾區(qū)長于對應(yīng)的大鼠和小鼠酶)。所述重復(fù)序列富含脯氨酸，每一個重復(fù)單位內(nèi)存在天冬氨酸并且一些重復(fù)單位內(nèi)存在谷氨酸，這些使得該區(qū)具有強(qiáng)酸性并且導(dǎo)致該蛋白質(zhì)具有低等電點(diǎn)。據(jù)報(bào)道富含脯氨酸的重復(fù)序列的數(shù)量在物種之間變化很大，通常小鼠和牛中為3個，大鼠中為4個，人類中為16個，大猩猩中為39個(Hui 和Howies 2002 ；Madeyski等人1999)。這一重復(fù)單位的數(shù)量的多樣性可解釋所觀察到的物種之間該蛋白質(zhì)的大小差異；小鼠BSSL是74kDa蛋白質(zhì)，而在重復(fù)區(qū)被廣泛糖基化的人 BSSL具有120-140kDa的表觀分子量；所述重復(fù)序列攜帶了該蛋白質(zhì)的大部分的15-35%碳水化合物。重復(fù)序列的數(shù)量和糖基化的差異均可解釋變化的表觀分子量(Lindquist等人 2002)。已通過分析人乳汁BSSL的分離的C-端部分(氨基酸528-72 證明人乳汁BSSL 的16個重復(fù)序列中可能僅有10個是0-糖基化的(Wang等人，1995)。已表明所述重復(fù)序列在保護(hù)BSSL免受蛋白水解性降解方面具有功能性作用并且CN 102458464 A說明書3/25
它們的0-糖基化對于該酶的分泌是重要的(Brimeau等人，1997)。C_端區(qū)的寡糖包含Lewis χ和Lewis b以及較少的Lewis抗原結(jié)構(gòu)。由于那些與血型相關(guān)的抗原決定簇，BSSL的C-端區(qū)可在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用中具有粘附功能，如其抗菌作用所例證(Naarding等人，2006 ； Ruvoen-Clouet等人，2006)。另一方面，所述重復(fù)區(qū)對于催化活性、膽鹽活化和肝素結(jié)合具有較低的重要性(Hui 1996)。還表明C-尾區(qū)通過結(jié)合腸內(nèi)皮細(xì)胞表面的凝集素樣受體(LOX-I)是重要的結(jié)構(gòu)部分(Fayard等人，2003)。肝素結(jié)合位點(diǎn)形成了其它結(jié)合部分，并且這些結(jié)合位點(diǎn)對于 BSSL在不同的細(xì)胞環(huán)境和細(xì)胞階段中的作用機(jī)制具有關(guān)鍵作用。血管BSSL通過比較BSSL VNTR基因型和血清脂質(zhì)表型發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列的數(shù)量和血清膽固醇水平之間具有相關(guān)性(Bengtsson-Ellmark等人，2004)。盡管所述重復(fù)序列多態(tài)性僅是脂質(zhì)水平的遺傳標(biāo)記，但是它還可能在測定血漿脂質(zhì)組成中具有功能性作用。BSSL存在于人類血漿和主動脈組織中表明了 BSSL在脂質(zhì)代謝中的更寬泛的作用。人們已廣泛研究了循環(huán)BSSL的來源。已證明人類巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞可合成并且分泌該酶(Hui和Howies 2002)。相反，在另一項(xiàng)研究中，動脈粥樣硬化損傷內(nèi)的BSSL與平滑肌細(xì)胞(SMC)相關(guān)但是與活化的巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞不相關(guān)(Auge等人，200 。在另一項(xiàng)研究中，認(rèn)為注射入大鼠腸袢中的BSSL被腸細(xì)胞內(nèi)化，轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞并且釋放進(jìn)入血液循環(huán)(Brimeau等人，200；3)?；谶@些數(shù)據(jù)，已提出循環(huán)BSSL來源于胰腺。但是，還證明了進(jìn)食乳汁后BSSL血清水平不會增加，并且盡管在新生兒中乳汁是BSSL的主要來源而配方奶粉中不含BSSL，但是BSSL血清水平在母乳喂養(yǎng)和配方奶粉喂養(yǎng)的人類嬰兒之間無差異。已報(bào)道了 BSSL與人血漿中的含載脂蛋白B的脂蛋白的相關(guān)性(Brimeau等人， 2003)，這與BSSL存在于人類主動脈并且具有修飾低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白 (HDL)的組成以及通過降低它們的溶血磷脂膽堿(IysoPC)含量降低氧化的LDL(oxLDL)的致動脈粥樣化作用的能力這些觀察結(jié)果一起表明了 BSSL在動脈粥樣硬化形成中充當(dāng)保護(hù)性因子的潛在的新作用。LysoPC是oxLDL中的主要磷脂組分并且通過如下過程生成與PC 分子的sn-2位點(diǎn)酯化的多不飽和脂肪酸氧化和片段化，然后由LDL-相關(guān)磷脂酶A2 (PLA2) 和BSSL水解變短的脂肪酰殘基。盡管IysoPC僅組成非-oxLDL中總PC的，但是LDL 的氧化修飾可將這一比例提高至40-50%。LysoPC可充當(dāng)單核細(xì)胞的化學(xué)引誘物，誘導(dǎo)單核細(xì)胞粘附至血管內(nèi)皮細(xì)胞并且促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，這最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。由于BSSL 對IysoPC的作用，已證明BSSL可與膽固醇和氧化的脂蛋白相互作用從而調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的進(jìn)展(Hui 和 Howies 2002)。但是，BSSL存在于并積累于動脈粥樣硬化損傷內(nèi)這一事實(shí)以及單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(或具有巨噬細(xì)胞表型的SMC)表達(dá)并分泌BSSL這一事實(shí)表明這些細(xì)胞可能是積累的BSSL的來源。已表明巨噬細(xì)胞中BSSL的病理生理學(xué)作用的機(jī)制是BSSL作為神經(jīng)酰胺酶降低神經(jīng)酰胺和溶血磷脂膽堿水平的功能(Hui和Howies 2002)，這導(dǎo)致響應(yīng)于致動脈粥樣硬化脂蛋白的膽固醇酯積累增加從而在體內(nèi)引起動脈粥樣硬化損傷大小增加。這與 Kodvawala等人Q005)的研究一致，他們通過使用體內(nèi)模型證明了在apoE缺陷小鼠中巨噬細(xì)胞中的BSSL表達(dá)促進(jìn)響應(yīng)經(jīng)修飾的LDL的膽固醇酯合成和積累并且增加動脈粥樣硬化損傷。
動脈粥樣硬化的滯留-應(yīng)答假說包括內(nèi)皮損傷、脂蛋白氧化以及巨噬細(xì)胞和VSMC(血管平滑肌細(xì)胞)增殖在內(nèi)的與動脈粥樣硬化形成早期相關(guān)的許多過程不足以單獨(dú)導(dǎo)致?lián)p傷形成。滯留-應(yīng)答假說指明致動脈粥樣硬化脂蛋白的內(nèi)皮下滯留是所有這些事實(shí)上是對脂質(zhì)積累的正常生理反應(yīng)的過程的誘發(fā)因素。盡管LDL早期滯留的主要決定因素可能是內(nèi)皮下間隙內(nèi)的蛋白聚糖組成，但是一旦損傷開始形成BSSL可通過充當(dāng)內(nèi)皮下蛋白聚糖和脂蛋白之間的分子橋輔助并且增強(qiáng)滯留(W0 2005/095986)。與胞外基質(zhì)組分結(jié)合的BSSL可充當(dāng)LDL滯留中的橋連分子，如脂蛋白脂肪酶(LPL)所表明(Pentikainen等人，2002)。血小板中的BSSL最近發(fā)現(xiàn)BSSL保存于血小板中并且在血小板活化后釋放(Panicot-Dubois等人， 2007)。而且，已證明BSSL可誘導(dǎo)血小板中的鈣動員(mobilization)并且增強(qiáng)凝血酶介導(dǎo)的血小板聚集和擴(kuò)散。在小鼠血栓病模型(激光誘導(dǎo)的損傷)中，BSSL在體內(nèi)積累于血管壁損傷位點(diǎn)的動脈血栓中。當(dāng)CXC趨化因子受體4(CXCR4)被拮抗時，BSSL的積累受到抑制并且減小了血栓大小。與野生型小鼠相比，BSSL敲除小鼠(BSSL-KO)的尾靜脈出血次數(shù)增加。這些數(shù)據(jù)表明BSSL通過與血小板上的CXCR4相互作用調(diào)節(jié)血栓形成。CXCR4屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)基因家族，CXCR4活化后通過數(shù)種不同的途徑誘導(dǎo)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；例如CXCR4與趨化因子配體SDF-I的結(jié)合活化G蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并且誘導(dǎo)細(xì)胞趨化反應(yīng)(Clemetson等人，2000)。還已知CXCR4與HIV-I相互作用并且充當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞的輔助受體。HIV-I與CXCR4的結(jié)合是由存在于HIV-I gpl20上的被稱作 V3環(huán)的結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。BSSL蛋白質(zhì)包含與gpl20的V3環(huán)結(jié)構(gòu)相關(guān)的區(qū)域。已提出這一被稱作V3樣環(huán)結(jié)構(gòu)域(氨基酸361-393)的區(qū)域(Aubert-Jousset等人，2004)介導(dǎo)BSSL與血小板上的CXCR4的結(jié)合?？偠灾?，對于血漿和主動脈組織中的BSSL的來源和功能存在令人困惑的和相
互矛盾的結(jié)果。EP 1840573報(bào)導(dǎo)了胰島素自身抗體陽性或陰性的NOD(非肥胖型糖尿病)小鼠之間基因表達(dá)模式的差異。鑒定出125個差異表達(dá)的基因，其中之一是編碼BSSL的CEL基因。鑒定出這些差異表達(dá)的基因可用于自身免疫疾病例如I型糖尿病的前炎癥狀態(tài)的早期診斷。還表明所述差異表達(dá)的基因是治療具有前炎癥階段的自身免疫疾病的靶點(diǎn)。本領(lǐng)域公知特定疾病的形成導(dǎo)致多種基因表達(dá)發(fā)生改變，如EP1840573所證明。但是，并不認(rèn)為所有此類差異表達(dá)的基因是所述疾病形成的原因。相反，對致病基因(如果存在的話)的鑒定需要更復(fù)雜的研究。盡管EP 1840573鑒定出BSSL是炎性疾病的潛在標(biāo)記，但是其未能鑒定出BSSL是炎性疾病形成的原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于如下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)BSSL在炎性過程中具有作用以及抑制或消除 BSSL在動物模型中防止慢性關(guān)節(jié)炎的形成。
本發(fā)明基于BSSL缺陷小鼠免于諸如膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的炎性疾病這一實(shí)證。因此人BSSL的拮抗劑對于炎性疾病的防止、預(yù)防和/或治療具有潛在用途。適合的BSSL拮抗劑是降低BSSL的活性、量和/或表達(dá)的物質(zhì)?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選的 BSSL拮抗劑是特異結(jié)合人BSSL的抗體和抗體片段，以及包含與編碼人BSSL的多聚核苷酸序列互補(bǔ)的序列的RNAi和反義多聚核苷酸。根據(jù)本發(fā)明使用的最優(yōu)選的BSSL拮抗劑是單克隆BSSL抗體。因此，本發(fā)明的一方面提供防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的方法，其包括向需要此類治療的個體給藥藥學(xué)有效量的特異結(jié)合人BSSL的抗體或抗體片段。本發(fā)明的另一方面提供用于防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的藥物組合物，其包含特異結(jié)合人BSSL的抗體或抗體片段以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的另一方面提供特異結(jié)合人BSSL的抗體或抗體片段在制備用于防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的藥物組合物中的用途。本發(fā)明的另一方面提供防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的方法，其包括向需要此類治療的個體給藥藥學(xué)有效量的包含與編碼人BSSL的多聚核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的一部分互補(bǔ)的序列的RNAi分子或反義多聚核苷酸。本發(fā)明的另一方面提供用于防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的藥物組合物，其包括包含與編碼人BSSL的多聚核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的一部分互補(bǔ)的序列的RNAi分子或反義多聚核苷酸和藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的另一方面提供包含與編碼人BSSL的多聚核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的一部分互補(bǔ)的序列的RNAi分子或反義多聚核苷酸在制備用于防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的藥物組合物中的用途。


圖1檢測人類肝臟中的BSSL mRNA用BSSL特異性寡聚核苷酸引物將一式兩份分離自四名個體的肝切片(biopsies) 的總RNA逆轉(zhuǎn)錄并且擴(kuò)增。用1.8%瓊脂糖凝膠電泳分離(resolve)PCR產(chǎn)物并且用溴化乙錠染色。從所有樣品中擴(kuò)增預(yù)期大小(327nt)的PCR產(chǎn)物；患者1(泳道1和2)；患者2(泳道3和4)；患者3(泳道5和6)；患者4(泳道7和8)。將從分離自人類乳汁的RNA合成的 cDNA 用作陽性對照(泳道 9)。將 0' GeneRuler 50-bp DNA 梯度(Fermentas，Ontario, Canada)用作分子量標(biāo)記(泳道10)。圖2.蛋白質(zhì)印跡法用SDS-PAGE(10% )分離來自兩份人類肝臟樣品(患者3和患者4)的親和純化的蛋白質(zhì)提取物，轉(zhuǎn)移至PVDF膜并且用多克隆抗-人BSSL抗體檢測。患者3，泳道1 ；患者 4，泳道2 ；來自人類乳汁(泳道幻和人類胰腺(泳道4)的蛋白質(zhì)提取物；以及純化自人類乳汁的BSSL(泳道5)用作陽性對照。圖3.組織學(xué)、油紅0染餼以及人類肝臟切片中的BSSL定位用蘇木精和伊紅仏，0)、油紅0 ，幻對獲自兩名患者[患者I(A-C)；患者4(D_F)] 的肝組織切片(8-μ m冷凍切片)進(jìn)行染色，并且用多克隆抗-BSSL抗體(C，F(xiàn))進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。
S 4.對BSSL和免,瘡細(xì)胞j示iff講行雙重免,瘡熒光染盧,在人類肝臟中，BSSL與表達(dá)⑶15的細(xì)胞而非表達(dá)⑶68的細(xì)胞共定位。使用兔多克隆抗-BSSL抗體和小鼠單克隆抗⑶-68或抗-⑶15抗體對獲自兩名患者[患者1 (分圖 4A)和患者4(分圖4B)]的肝切片進(jìn)行雙重免疫熒光染色。當(dāng)一起使用抗-BSSL和抗-⑶15 抗體時兩個分圖中的融合(merge，合并)照片中均出現(xiàn)了被視為這些黑色和白色圖像中的亮染色的黃色，表明存在共定位圖5. BSSL定位于循環(huán)CD15-陽件粒件白細(xì)胞從健康志愿者的血液收獲人類白細(xì)胞，進(jìn)行透性化處理并且用兔多克隆抗-BSSL(A)抗體和小鼠單克隆抗_CD15(B)抗體進(jìn)行雙重免疫熒光染色。用DAPI (C)對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。融合圖片(D)中出現(xiàn)被視為該黑色和白色圖片中的亮染色的黃色，表明存在共定位。圖6.循環(huán)粒件白細(xì)胞中的BSSL的亞細(xì)胞定位從健康志愿者的血液收獲人類白細(xì)胞并且用兔多克隆抗-BSSL抗體和小鼠單克隆抗-CD15抗體進(jìn)行雙重免疫熒光染色。為了區(qū)分胞外和胞內(nèi)定位，在加入抗體之前對細(xì)胞進(jìn)行(上分圖)或不進(jìn)行(下分圖)透性化處理。上分圖中的融合圖片(picture，照片) 中出現(xiàn)了被視為這些黑色和白色圖片中的亮染色的黃色，表明存在共定位。圖7.蛋白質(zhì)印跡分析用通過SDS-PAGE (10% )分離來自人類單核血細(xì)胞(泳道1和2)或多核粒性白細(xì)胞 (泳道3- 的親和純化的蛋白質(zhì)提取物，轉(zhuǎn)移至PVDF膜并且用多克隆抗-人BSSL抗體檢測。將來自人類乳汁(泳道6)和人類胰腺(泳道7)的蛋白質(zhì)提取物用作陽性對照。圖8.檢測人血細(xì)胞中的BSSL mRNA用BSSL-特異性寡聚核苷酸引物將分離自兩名健康個體的單核血細(xì)胞和多核粒性白細(xì)胞的總RNA逆轉(zhuǎn)錄并且擴(kuò)增。用1.8%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物并且用溴化乙錠染色。從所有樣品中擴(kuò)增預(yù)期大小(327nt)的PCR產(chǎn)物；單核血細(xì)胞(泳道1和2)；多核粒性白細(xì)胞(泳道3和4)。陰性對照(省去來自cDNA合成反應(yīng)的RT)顯示于泳道5_8。 將0' GeneRuler 50-bp DNA梯度(Fermentas)用作分子量標(biāo)記(泳道9)。圖9.人動脈粥樣硬化斑塊中的BSSL的免疫定位在福爾馬林固定的、石蠟包埋的獲自動脈粥樣硬化頸動脈的組織切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究，使用兔多克隆BSSL-肽(氨基酸328-341)抗體(A)和(C)或兔免疫前血清 (B)和(D)作為陰性對照。用Mayer蘇木精進(jìn)行復(fù)染。該圖顯示了兩名患者的數(shù)據(jù)(A、B是來自患者1的切片；C、D是來自患者2的切片)。圖10. CIA小鼠模型中的平均關(guān)節(jié)炎評分通過每周評分2-3次跟蹤觀察關(guān)節(jié)炎57天。與野生型(wt)對照相比BSSL缺陷小鼠具有顯著較低的疾病評分。性別之間的疾病易感性存在很大差異。僅有很少的雌性小鼠患關(guān)節(jié)炎并且那些患病小鼠的評分很低。㈧所有小鼠；(B)雄性；(C)雌性。圖11. CIA小鼠模型中的發(fā)病率和嚴(yán)重度BSSL缺陷小鼠與它們的wt同胞(littermate，同窩出生者)相比患關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率下降并且嚴(yán)重度還更低。發(fā)病率表示為所有小鼠(A)的百分?jǐn)?shù)，嚴(yán)重度表示為僅患病小鼠(B)的平均關(guān)節(jié)炎評分。
a 12. CIA小鼠It型中杭-CII杭體的血清濃度第30天(分圖A)和第57天(分圖B)采集的血清中的抗膠原蛋白II (抗-CII 抗體)濃度的分析表明BSSL缺陷(黑柱)小鼠和BSSL wt小鼠(白柱)之間的應(yīng)答就IgG 同種型(由圖中的總IgG表示)和IgM而言均無差異。圖13. CIA小鼠樽型中的軟骨降解第57天通過ELISA測量血清中作為軟骨降解標(biāo)記的軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)的濃度。BSSL缺陷小鼠(黑柱)中的COMP水平顯著低于wt雄性對照(白柱)。在雌性中無差異。S 14. CIA小鼠的平均關(guān)節(jié)炎i平分、關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重度和發(fā)病率通過每周評分2-3次跟蹤觀察關(guān)節(jié)炎48天。與BSSL wt小鼠(A)和(C)相比，BSSL 缺陷小鼠表現(xiàn)出顯著更低的疾病評分，這還反映于更低的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率(B)。與BSSL wt小鼠相比，BSSL雜合子(雜合的)小鼠的發(fā)病傾向更低，但是不如純合子(純合的)BSSL缺陷小鼠有抗性。(A)和(B)所有小鼠；(C)僅患病小鼠。*表示ρ < 0. 05，**表示ρ < 0. 01。圖15. CIA小鼠樽型中的軟骨降解第48天通過ELISA測量血清中作為軟骨降解標(biāo)記的COMP的濃度。BSSL缺陷小鼠(黑柱)中的COMP水平顯著低于BSSL wt對照(白柱)。相對于BSSL缺陷小鼠和BSSL wt小鼠中的濃度，BSSL雜合子小鼠(陰影線柱)中的COMP血清濃度在它們中間。*表示ρ < 0. 05。
_9] 圖16.血漿中的抗-II型膠原蛋白應(yīng)答(IgG)將第33天和第48天的抗-CII抗體水平的分析表示為相對于合并血清的標(biāo)準(zhǔn)品的相對值。任何BSSL基因型之間的IgG應(yīng)答無顯著差異。圖17.與對照相比抗-BSSL灃射后的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重度注射了 lmg/kg或5mg/kg抗-BSSL的大鼠表現(xiàn)出顯著降低的疾病嚴(yán)重度。*表示口<0.05，#表示？<0.01。所有組的發(fā)病率為100%。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)BSSL在炎性疾病中具有作用并且抑制或消除BSSL可在動物模型中防止慢性關(guān)節(jié)炎的形成。已證明BSSL蛋白存在于炎性細(xì)胞和發(fā)炎的組織中。與野生型對照相比BSSL缺陷小鼠(BSSL-KO)患膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的疾病嚴(yán)重度顯著降低并且發(fā)病率更低。注射抗-BSSL抗體顯著降低了大鼠中姥鮫烷(pristane，降植烷)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的疾病嚴(yán)重度。本發(fā)明提供用于防止和/或治療炎性疾病的BSSL拮抗劑。優(yōu)選地，所述BSSL拮抗劑可為特異結(jié)合人類BSSL的抗體或抗體片段，或者是包含與編碼人BSSL的多聚核苷酸序列的一部分互補(bǔ)的序列的RNAi分子或反義多聚核苷酸。炎性疾病可根據(jù)本發(fā)明預(yù)防和/或治療的炎性疾病選自但不限于呼吸道的炎性疾病，包括哮喘，包括間歇性和持續(xù)性以及所有嚴(yán)重度的支氣管哮喘、過敏性哮喘、內(nèi)源性哮喘、外源性哮喘、運(yùn)動誘導(dǎo)的哮喘、藥物誘導(dǎo)的(包括阿司匹林和NSAID誘導(dǎo)的)哮喘和塵螨誘導(dǎo)的哮喘，以及氣道高反應(yīng)性的其它誘因引起的哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；支氣管炎，包括傳染性和嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎；肺氣腫；支氣管擴(kuò)張；囊性纖維化；結(jié)節(jié)病；農(nóng)民肺和相關(guān)疾??；過敏性肺炎；肺纖維化，包括隱原性纖維化肺泡炎、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、在抗腫瘤治療中并發(fā)的纖維化以及慢性感染，包括肺結(jié)核和曲霉病以及其它真菌感染；肺移植的并發(fā)癥；肺脈管系統(tǒng)的脈管炎和血栓形成性疾病以及肺高壓；鎮(zhèn)咳活性包括治療與氣道的炎性和分泌性病癥相關(guān)的慢性咳嗽以及醫(yī)源性咳嗽；急性和慢性鼻炎，包括藥物性鼻炎和血管舒縮性鼻炎；常年性和季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎，包括神經(jīng)性鼻炎(枯草熱)；鼻息肉??；急性病毒感染，包括普通感冒以及由呼吸道合胞病毒、流感病毒、冠狀病毒(包括SARQ和腺病毒引起的感染；骨和關(guān)節(jié)的炎性疾病，包括原發(fā)性和繼發(fā)性的骨關(guān)節(jié)炎/骨關(guān)節(jié)病，例如先天性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良、頸部和腰部脊椎炎以及腰背部和頸部疼痛；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和斯蒂爾 (Still)??；血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病，包括強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和未分化脊柱關(guān)節(jié)??；膿毒性關(guān)節(jié)炎和其它感染相關(guān)的關(guān)節(jié)病以及骨疾病例如肺結(jié)核，包括波特氏(Potts)病和Poncet綜合癥；急性和慢性結(jié)晶性滑膜炎，包括尿酸鹽痛風(fēng)、磷酸鈣貯積病和磷灰石相關(guān)的腱、粘液囊和滑膜炎癥；白賽(Behcet)??；原發(fā)性和繼發(fā)性干燥關(guān)節(jié)炎 (Sjogren)綜合癥；全身性硬化癥和局限性硬皮??；系統(tǒng)性紅斑狼瘡、混合性結(jié)締組織病以及未分化結(jié)締組織病；炎性肌病，包括皮肌炎和多肌炎；風(fēng)濕性多肌痛；幼年型關(guān)節(jié)炎，包括任何關(guān)節(jié)分布的特發(fā)性炎性關(guān)節(jié)炎和相關(guān)綜合癥，風(fēng)濕熱及其全身并發(fā)癥；脈管炎，包括巨細(xì)胞動脈炎、多發(fā)性大動脈炎(Takayasu動脈炎)、Churg-MrauSS綜合癥、結(jié)節(jié)性多動脈炎、微小多動脈炎以及與病毒感染、過敏反應(yīng)、冷球蛋白和副蛋白相關(guān)的脈管炎；腰背部疼痛；家族性地中海熱、穆-韋二氏(Muckle-We 11 s)綜合癥以及家族愛爾蘭發(fā)燒(Familial Hibernian Fever)、菊池氏(Kikuchi)病、藥物誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)痛、肌腱炎以及肌病；與結(jié)締組織重構(gòu)或由損傷(例如運(yùn)動損傷)引起的肌肉骨骼疾病或包括如下疾病在內(nèi)的疾病相關(guān)的炎性疾病關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或結(jié)晶性關(guān)節(jié)病)、其它關(guān)節(jié)病(例如椎間盤退變或顳下頌關(guān)節(jié)退變)、骨重建病(例如骨質(zhì)疏松、 Paget病或骨壞死)、多軟骨炎、硬皮病、混合性結(jié)締組織病、脊椎關(guān)節(jié)病或牙周病(例如牙周炎)；炎性心血管疾病，包括累及冠狀血管和外周血液循環(huán)的動脈粥樣硬化；心囊炎； 心肌炎、炎性和自身免疫性心肌病，包括心肌結(jié)節(jié)?。蝗毖栽俟嘧p傷；心內(nèi)膜炎；心瓣炎和主動脈炎，包括傳染性主動脈炎(例如梅毒性主動脈炎)；血管炎；近端和外周靜脈疾病，包括靜脈炎和包括深靜脈血栓病和靜脈曲張并發(fā)癥在內(nèi)的血栓??；皮膚的炎性疾病，包括銀屑病、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎或其它濕疹性皮膚病，以及延遲型過敏反應(yīng)；植物性和光照性皮炎；脂溢性皮炎、皰疹樣皮炎、扁平苔癬、硬化萎縮性苔癬、壞疽性膿皮癥、皮膚結(jié)節(jié)病、盤狀紅斑狼瘡、天皰瘡、類天皰瘡、大皰性表皮松解癥、 風(fēng)疹、血管性水腫、血管炎、中毒性紅斑、皮膚嗜酸性白細(xì)胞增多癥、斑禿、男性-模型斑禿、 Sweet綜合癥、Weber-Christian綜合癥、多形性紅斑；傳染性和非傳染性的蜂窩織炎；脂膜炎；皮膚淋巴細(xì)胞瘤、非黑素瘤皮膚癌以及其它增生異常性損傷；藥物誘導(dǎo)的疾病，包括固定型藥疹；眼睛的炎性疾病，包括眼瞼炎；結(jié)膜炎，包括常年性和春季過敏性結(jié)膜炎；虹彩炎；前葡萄膜炎和后葡萄膜炎；脈絡(luò)膜炎；自身免疫；累及視網(wǎng)膜的退行性或炎性疾??；目艮炎，包括交感性眼炎；結(jié)節(jié)?。桓腥?，包括病毒、真菌和細(xì)菌感染；胃腸道的炎性疾病，包括舌炎、齒肉炎、牙周炎；食道炎，包括胃食管返流?。皇人峒?xì)胞性胃腸炎、肥大細(xì)胞增生病、腹部疾病、克羅恩(Crohn)病、結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、直腸炎、肛門搔癢、腸易激癥、腸易激綜合征，腹部炎性疾病，包括肝炎，包括自身免疫性、酒精性和病毒性肝炎；肝臟纖維化和硬化；膽囊炎；急性和慢性胰腺炎；生殖泌尿道炎性疾病，包括腎炎，包括間質(zhì)性腎炎和腎小球腎炎；腎病綜合征；膀胱炎，包括急性和慢性(間質(zhì)性)膀胱炎以及洪納(Hurmer)潰瘍；急性和慢性尿道炎、前列腺炎、附睪炎、卵巢炎和輸卵管炎；外陰陰道炎；佩洛尼氏(Peyronie)??；勃起機(jī)能障礙 (男性和女性)；在例如腎臟、心臟、肝臟、肺、骨髓、皮膚或角膜移植后或輸血后的急性和慢性異體移植物排斥；或慢性移植物抗宿主病；炎性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括阿茲海默氏病和其它癡呆癥，包括克-雅二氏 (Creutzfeldt-Jakob)病和新類型庫賈氏病(New varaintCreutzfeldt-Jakob病)；淀粉樣變性；多發(fā)性硬化癥和其它脫髓鞘綜合癥；腦動脈硬化和脈管炎；顳動脈炎；重癥肌無力； 急性和慢性疼痛(急性、間歇性或持續(xù)性，不論是中樞神經(jīng)還是外周神經(jīng)起源)，包括內(nèi)臟痛、頭痛、偏頭疼、三叉神經(jīng)痛、非典型面痛、關(guān)節(jié)和骨疼痛、癌癥或腫瘤侵襲引起的疼痛、神經(jīng)性疼痛綜合癥，包括糖尿病性、皰疹后以及HIV相關(guān)的神經(jīng)?。簧窠?jīng)系統(tǒng)結(jié)節(jié)?。粣盒?、傳染性或自身免疫過程的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥；以及其它自身免疫和過敏性疾病，包括橋本甲狀腺炎(Hashimoto甲狀腺炎)、格雷夫斯(Graves)病、阿狄森(Addison)病、糖尿病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、嗜酸細(xì)胞性筋膜炎、高免疫球蛋白E綜合癥、抗磷脂綜合癥；具有炎性或免疫學(xué)組分的其它病癥；包括獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDQ、麻瘋病、塞扎里(Sezary)綜合癥以及瘤外綜合征。優(yōu)選地，可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行預(yù)防和/或治療的炎性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。^^本文中提及的術(shù)語“抗體或抗體片段”包括完整的抗體和被稱作其“抗原結(jié)合部分”或單鏈的任何抗原結(jié)合片段?！翱贵w”指包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白或其抗原結(jié)合部分。每一條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文中縮寫和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈的恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域^^丄^和口組成。每一條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為VD 和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域Q組成。Vh和\區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為被稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高度可變區(qū)和其間散布的被稱作框架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域。各乂11 和\由三個⑶R和四個FR組成，從氨基端到羧基端以如下順序排列FRl、OTRl、FR2、raR2、 FR3、⑶R3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。本文使用的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”指保留了特異結(jié)合抗原Gf^BBSSL)的能力的一個或多個抗體片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段實(shí)現(xiàn)。屬于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”范圍內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和ChI結(jié)構(gòu)域組成的一價片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fab'片段，其基本是具有一部分鉸鏈區(qū)的Fab ； (iv)由V1^P ChI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(ν)由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(vi)由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb 片段(Ward等人，1989) ； (vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)；以及(viii)納米抗體，其為包含一個可變結(jié)構(gòu)域和兩個恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。另外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域\和Vh 是由不同的基因編碼，但是可使用重組技術(shù)通過合成接頭將它們連接，所述接頭能夠?qū)⑺鼈冎苽涑善渲械腬和配對形成一價分子的單一蛋白質(zhì)鏈(稱作單鏈Fv(SCFV)；參見， Bird等人，(1988))。此類單鏈抗體也預(yù)期包含于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并且以篩選完整抗體的相同的方式篩選所述片段。本文使用的“分離的抗體”旨在表示基本不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，特異結(jié)合BSSL的分離的抗體基本不含特異結(jié)合BSSL之外的抗原的抗體)。但是特異結(jié)合BSSL的分離的抗體對其它抗原例如來自其它物種的BSSL分子具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體基本不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指具有單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。本文使用的術(shù)語“人抗體”預(yù)期包括可變區(qū)內(nèi)的、框架區(qū)和CDR區(qū)均來自人種系免疫球蛋白序列的抗體。另外，如果所述抗體包含恒定區(qū)，則所述恒定區(qū)也來自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸序列(例如，通過體外隨機(jī)突變或定點(diǎn)突變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。但是，本文使用的術(shù)語“人抗體”預(yù)期不包括其中來自另一哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列被移植到人框架序列上的抗體。術(shù)語“人單克隆抗體”指表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中的框架區(qū)和 ⑶R區(qū)均來自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一實(shí)施方案中，通過包含與永生化細(xì)胞融合的獲自轉(zhuǎn)基因非人類動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞的雜交瘤制備所述人單克隆抗體，所述轉(zhuǎn)基因非人類動物具有包含與人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。本文使用的術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)分離自具有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物(例如小鼠)或從其制備的雜交瘤(下文進(jìn)一步描述)的抗體，(b)分離自經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞例如轉(zhuǎn)染瘤的抗體，(c)分離自重組、組合人抗體文庫的抗體，以及(d)通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其它方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此類重組人抗體具有其中的框架和⑶R區(qū)來自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，可對此類重組人抗體進(jìn)行體外突變(或者，當(dāng)使用具有人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時在體內(nèi)進(jìn)行體細(xì)胞突變)并且因此所述重組抗體的Vh和\區(qū)的氨基酸序列盡管來自人種系Vh和\序列并且與之相關(guān)，卻不是天然存在于體內(nèi)的人抗體種系庫的序列。如本文所使用，“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如，IgM或 IgGl)。短語“抗體識別抗原”和“特異于抗原的抗體”在本文中可與術(shù)語“特異結(jié)合抗原的抗體”替換使用。術(shù)語“人抗體衍生物”指人抗體的任何修飾形式，例如抗體與另一物質(zhì)或抗體的結(jié)合物。術(shù)語“人源化抗體”旨在表示其中來自另一哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR 序列被移植到人框架序列上的抗體?？稍谒鋈丝蚣苄蛄袃?nèi)進(jìn)行另外的框架區(qū)修飾。術(shù)語“嵌合抗體”旨在表示其中的可變區(qū)序列來自一個物種并且恒定區(qū)序列來自另一物種的抗體，例如其中的可變區(qū)序列來自小鼠抗體并且恒定區(qū)序列來自人抗體的抗體。如本文所使用，“特異結(jié)合人BSSL”的抗體旨在表示以Ix 1(ΓΜ或更小，更優(yōu)選切 10、或更小，更優(yōu)選3x 10- 或更小、更優(yōu)選Ix 10、或更小、甚至更優(yōu)選切IOl或更小的Kd結(jié)合人BSSL的抗體。本文使用的術(shù)語“基本上不結(jié)合”蛋白質(zhì)或細(xì)胞表示不結(jié)合或者不以高親和力結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞，即以Ix IO-fiM或更大、更優(yōu)選Ix ΙΟ—Μ或更大、更優(yōu)選 Ix 10_4 M或更大、更優(yōu)選Ix IO3M或更大、甚至更優(yōu)選Ix 10_%或更大的Kd結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞。本文使用的術(shù)語〃 Kass。?！啊盎颉?Ka"旨在表示特定的抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而本文使用的術(shù)語"Kdis“或"Kd"旨在表示特定的抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使用的術(shù)語"K/旨在表示解離常數(shù)，其獲自&與1的比(即Kd/Ka)并且表示為摩爾濃度(M)?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已確立的方法測定抗體的Kd值。測定抗體Kd的優(yōu)選方法是使用表面等離子共振，優(yōu)選使用諸如Biaeore 系統(tǒng)的生物傳感系統(tǒng)本文使用的術(shù)語對IgG抗體的“高親和力”指對目標(biāo)抗原具有Ix IO-7M或更小、更優(yōu)選切或更小、甚至更優(yōu)選Ix 10、或更小，甚至更優(yōu)選切IOl或更小并且甚至更優(yōu)選Ix 10- 或更小的Kd的抗體。但是對其它抗體同種型的“高親和力”結(jié)合可不同。例如，對IgM同種型的“高親和力”結(jié)合指具有KTfiM或更小、更優(yōu)選10_7M或更小、甚至更優(yōu)選 10_8M或更小的Kd的抗體。如本文所使用，術(shù)語“個體”包括任何人類或非人類動物。術(shù)語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物或非哺乳動物，例如非人靈長類動物、綿羊、犬、貓、馬、牛、雞、 兩棲動物、爬行動物等。抗-BSSL抗體可根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的特征是所述抗體的特定的功能特征或性質(zhì)。例如，所述抗體特異結(jié)合人BSSL。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合包含存在于人BSSL序列(SEQ ID NO 2)中的氨基酸序列的表位。最優(yōu)選所述抗體結(jié)合存在于對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸1-722的氨基酸序列中的表位，甚至更優(yōu)選所述抗體結(jié)合存在于BSSL的N端部分的表位，即存在于對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸1-500的氨基酸序列中的表位。優(yōu)選的，所述抗體以高親和力例如1x10_7M或更小的Kd結(jié)合人BSSL。根據(jù)本發(fā)明使用的抗-BSSL抗體優(yōu)選表現(xiàn)出一種或多種以下特征⑴以Ix IO-7M或更小的Kd結(jié)合人BSSL ；(ii)阻斷BSSL與表達(dá)CXCR4的細(xì)胞的結(jié)合；(iii)阻斷BSSL增強(qiáng)的血小板聚集；(iv)阻斷BSSL與復(fù)合物CXCR4/SDF-1的結(jié)合；
(ν)阻斷SDF-I誘導(dǎo)的白細(xì)胞遷移。優(yōu)選地，所述抗體以切10- 或更小的Kd結(jié)合人BSSL，&h 10. 或更小的Kd結(jié)合人BSSL，Wh 10- 或更小的Kd結(jié)合人BSSL，以虹1()- 或更小的Kd結(jié)合人BSSL，以3x 10_9或更小的Kd結(jié)合人BSSL,以2x 10_9或更小的Kd結(jié)合人BSSL,或者以Ix 1(Γ9Μ或更小的Kd結(jié)合人BSSL。所述抗體優(yōu)選結(jié)合存在于人BSSL但是不存在于其它蛋白質(zhì)中的表位。所述抗體通常結(jié)合人BSSL但是不與其它蛋白質(zhì)結(jié)合，或者以低親和力例如以Ix KTfiM的Kd或者更優(yōu)選以Ix 10_5M或更大的KD，更優(yōu)選以Ix 10_4 M或更大，更優(yōu)選Ix IO3M或更大，甚至更優(yōu)選Ix 10- 或更大的Kd與其它蛋白質(zhì)結(jié)合。評價所述抗體對人BSSL的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)測定法為本領(lǐng)域已知，包括例如 ELISA，蛋白質(zhì)印跡法、RIA和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。還可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定法例如通過Biacore 系統(tǒng)分析測定抗體的結(jié)合動力學(xué)(例如，結(jié)合親和力)。制備單克降抗體可通過包括常規(guī)的單克隆抗體方法例如Kohler和Milstein (1975)的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)在內(nèi)的各種技術(shù)制備根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體(HlAb)。盡管優(yōu)選體細(xì)胞雜交操作，但是在理論上可應(yīng)用其它制備單克隆抗體的技術(shù)，例如病毒轉(zhuǎn)染或癌基因轉(zhuǎn)染B淋巴細(xì)胞。制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中制備雜交瘤是被廣泛確立的操作。免疫方案以及用于融合的被免疫的脾細(xì)胞的分離技術(shù)為本領(lǐng)域公知。融合伴侶(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合操作是已知的?？苫谌缟纤鲋苽涞姆侨藛慰寺】贵w的序列制備根據(jù)本發(fā)明使用的嵌合或人源化抗體?？蓮母信d趣的非人雜交瘤獲得編碼重鏈和輕鏈的DNA并且使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行工程化使其包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為了生成嵌合抗體，可使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠的可變區(qū)與人的恒定區(qū)連接(參見，例如US 4，816，567)。為了生成人源化抗體，可使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠CDR區(qū)插入人的框架中(參見，例如US 5，225，539)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是人單克隆抗體?？墒褂脭y帶部分人免疫系統(tǒng)而非鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠生成此類抗BSSL的人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文中分別被稱作HuMAb小鼠@和KM小鼠 的小鼠，并且在本文中統(tǒng)稱為“人Ig小鼠”。HuMAb小鼠 (Medarex ,lnC·)包含編碼未重排的人重鏈(μ和γ)和κ 輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微衛(wèi)星基因座，還具有使內(nèi)源性μ和K基因座失活的靶向突變(參見，例如，Lonberg等人1994)。因此，所述小鼠表現(xiàn)出鼠IgM或κ的表達(dá)減少，并且在免疫后，所引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因發(fā)生類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變從而生成高親和力的人IgGK單克隆抗體(Lonberg和Huszar 1995)。還可參見US 5, 545,806, US5, 770，429、US 5，545，807、WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884、WO 99/45962 和 WO 01/14424。在另一實(shí)施方案中，可使用在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠制備根據(jù)本發(fā)明使用的人抗體。該小鼠在本文中被稱作“KM小鼠 ”，如WO 02/43478中詳述。另外，在本領(lǐng)域中可獲得表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代的轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)并且可用于制備根據(jù)本發(fā)明使用的抗-BSSL抗體。例如，可使用被稱作XenomouSe(AbgeniX，Inc.) 的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)；此類小鼠記載于例如US 5,939, 598, US 6,075, 181、US 6, 114, 598, US 6，150584和US 6，162,963。另外，在本領(lǐng)域中可獲得表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代的轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)并且可用于制備抗-BSSL抗體。例如，可使用被稱作“TC小鼠”的攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠；此類小鼠記載于Tomizuka等人Q000)。另外，本領(lǐng)域已記載了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(Kuroiwa等人2002)并且可用于制備抗-BSSL 抗體。還可使用用于篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示法制備根據(jù)本發(fā)明使用的人單克隆抗體。用于分離人抗體的此類噬菌體展示法是本領(lǐng)域確立的。參見例如US 5，223，409、US 5，403，484、US 5，571，698、US5, 427，908、US 5，580，717、US 5，969，108、US 6，172，197, US 5, 885, 793, US 6, 521, 404, US 6, 544, 731, US 6, 555, 313, US 6，582，915 和 US 6，593，081。還可使用SCID小鼠制備人單克隆抗體，所述SCID小鼠中重建了人免疫細(xì)胞從而在免疫后產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。此類小鼠記載于例如US5，476，996和US 5，698，767。RNAi可根據(jù)本發(fā)明使用的RNAi分子包含與選自以下的多聚核苷酸序列的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列a)序列 SEQ ID NO :1，b)與SEQ ID NO 1具有至少80%、優(yōu)選至少90%例如至少95%的序列一致性的 SEQ ID NO 1變異體，和/或c)與序列a)和b)互補(bǔ)的序列。此類RNAi分子是潛在的BSSL拮抗劑。MX可根據(jù)本發(fā)明使用的反義多聚核苷酸序列包含與選自以下的多聚核苷酸序列的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列a)序列 SEQ ID NO :1，b)與SEQ ID NO 1具有至少80%、優(yōu)選至少90%例如至少95%的序列一致性的 SEQ ID NO 1變異體，和/或c)與序列a)和b)互補(bǔ)的序列。此類反義多聚核苷酸序列分子是潛在的BSSL拮抗劑。 兩個核酸序列之間的序列一致性百分?jǐn)?shù)是所述序列中核苷酸相同的位點(diǎn)的數(shù)量， 將需要引入以用于兩條序列的最佳比對的空位的數(shù)量和每一個空位的長度考慮在內(nèi)。
如下測定兩條多聚核苷酸序列之間的一致性百分?jǐn)?shù)。首先，使用包含BLASTN版本 2. 0. 14 和 BLASTP 版本 2. 0. 14 的獨(dú)立版本 BLASTZ 的 BLAST 2 Sequences (B12seq)程序比較多聚核苷酸序列和例如EQ IDNO 1。該獨(dú)立版本的BLASTZ可獲自U. S. Government ‘ s National Centerfor Biotechnology Information, N tit http://www. ncbi. nlm. nih. gov?？稍贐LASTZ附加的幫助文件中找到解釋如何使用Blkeq程序的說明。Blkeq使用BLASTN算法進(jìn)行兩條多聚核苷酸序列之間的比較。為了比較兩條多聚核苷酸序列，將 B12seq的選項(xiàng)設(shè)置如下將_i設(shè)置成包含預(yù)比較的第一條多聚核苷酸序列的文件(例如， C:\seql.txt)；將_j設(shè)置為包含預(yù)比較的第二條多聚核苷酸序列的文件(例如，C:\seq2. txt)；將-ρ設(shè)置為blastn;將-ο設(shè)置為任何期望的文件名(例如C: \output. txt)；所有其它選項(xiàng)均保留默認(rèn)設(shè)置。例如，可使用以下指令生成包含兩條多聚核苷酸序列之間的比較的輸出文件C: \B12seq_i c:\seql.txt_j c:\seq2.txt_p blastn-oc \output. txt。如果所比較的兩個序列具有序列相似性，則所命名的輸出文件將顯示出為比對序列的那些相似區(qū)域。如果所比較的兩個序列不具有序列相似性，則所命名的輸出文件不會顯示出比對序列。一旦開始比對，則會通過對兩條序列中存在相同核苷酸殘的位置的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)來測定匹配數(shù)量。通過用匹配數(shù)量除以已鑒定的序列中列出的序列長度然后用所述數(shù)值乘以100 來測定一致性百分?jǐn)?shù)。例如，如果比較長度為120個核苷酸的多聚核苷酸序列和SEQ ID NO 1中列出的序列，如上文所述比對后所述序列共有匹配數(shù)為114的序列，則該序列與SEQ ID NO 1中列出的序列具有95% (即114+120*100 = 95)的一致性百分?jǐn)?shù)。BSSL簡而言之，BSSL可分離自適合的組織例如乳汁。或者可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法通過分離編碼BSSL的DNA制備重組BSSL。可使用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)例如文庫篩選和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方便地從可商購的RNA、cDNA文庫、基因組DNA或基因組DNA文庫分離編碼BSSL的DNA。這些技術(shù)詳細(xì)記載于Molecular Cloning-ALaboratory Manual,第2版，Sambrook,Fritsch&Maniatis, Cold SpringHarbor Press。能夠以登錄號Ρ198!35 (CEL HUMAN) (SEQ ID NO :2)從SwissProt 數(shù)據(jù)庫獲得人BSSL的氨基酸序列，以及例如以登錄號)(54457 (SEQ ID NO 1)從EMBL數(shù)據(jù)庫獲得cDNA序列。然后將所得到的編碼BSSL的cDNA克隆入可商購的哺乳動物表達(dá)載體，例如 pcDNA3 (Invitrogen)、pMClneo (Stratagene)、pXTl (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、 EB0-pSV2-neo(ATCC 37593)、pBPV-1 (8-2) (ATCC37110)、pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pRSVneo(ATCC 37198)、pSV2_dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)、1ZD35(ATCC 37565)、pLXIN、pSIR (Clontech)禾口 PlRES-EGFP(Clontech)。使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染技術(shù)將所得表達(dá)載體引入容易獲得的培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞系中，例如L細(xì)胞L-M (TK-) (ATCC CCL 1. 3)、L細(xì)胞L-M (ATCC CCL1. 2)、 THP-I(ATCC TIB 202)、HEK 293(ATCC CRL 1573)、Raji(ATCC CCL86)、CV-1(ATCC CCL 70)、 C0S-1(ATCC CRL 1650)、C0S_7 (ATCC CRL1651)、CH0_K1 (ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、 NIH/3T3(ATCC CRL1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS_C_1(ATCC CCL26) 禾口 MRC-5(ATCC CCL 171)。分離表達(dá)CEL的CH0、HEK293、HeLa以及克隆衍生物。將這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系用于制備重組CEL?；蛘撸瑢⒕幋aBSSL的cDNA克隆入適用于在微生物中表達(dá)的容易獲得的表達(dá)載體，例如細(xì)菌表達(dá)載體例如 pET(Invitrogen)、pDEST(Invitrogen)、pLEX(Invitrogen)、 pCAL (Stratagene)；用于在酵母中表達(dá)的酵母表表達(dá)載體pYES Qnvitrogen)、 pESC (Stratagene)以及用于在畢赤酵母中表達(dá)的pPICZ Gnvitrogen)。使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染技術(shù)將所得表達(dá)載體引入容易獲得的微生物株系中，例如大腸桿菌菌株JMlOl (Stratagene)和 JMl 10 (Stratagene)。從不同的組織和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系純化BSSL的方法是本領(lǐng)域公知的(Lombardo等人， 1978 ；Blackberg 和 Hernell 1981 ；Wang 和 Johnson 1983 ；Hansson 等人，1993)。制劑和給藥可以標(biāo)準(zhǔn)方式例如通過口服、局部、腸胃外、含服、鼻腔或直腸給藥或通過吸入給藥為預(yù)治療的病癥給藥根據(jù)本發(fā)明使用的抗體和抗體片段、RNAi分子和反義多聚核苷酸。 為實(shí)現(xiàn)這些目的，可通過本領(lǐng)域已知的方法將抗體和抗體片段、RNAi分子和反義多聚核苷酸配制成如下形式片劑、膠囊劑、水性或油性溶液劑、懸浮劑、乳劑、霜劑、軟膏劑、凝膠劑、 鼻噴霧劑、栓劑、用于吸入的微細(xì)的散劑或氣霧劑以及用于腸胃外使用(包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或輸注)的無菌的水性或油性溶液劑或懸浮劑或無菌乳劑。還可在組合治療中即與其它藥物組合給藥本發(fā)明的藥物組合物。例如，所述組合治療可包括與至少一種其它抗炎劑或免疫抑制劑組合的抗-BSSL抗體。如本文所使用，“藥學(xué)可接受的載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑以及吸收延遲劑等。優(yōu)選地，所述載體適合用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮給藥(例如通過注射或輸注)。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)可接受的鹽?！八帉W(xué)可接受的鹽”指保留了母體化合物的期望生物學(xué)活性并且不會產(chǎn)生任何不利的毒理學(xué)作用的鹽(參見，例如 Berge等人1977)。此類鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒的無機(jī)酸的那些，例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸等，以及衍生自無毒的有機(jī)酸的那些，例如脂肪族一元和二元羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等。堿加成鹽包括衍生自堿土金屬的那些，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等，以及衍生自無毒的有機(jī)胺的那些，例如N，N' -二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙胺、乙二胺、普魯卡因等。本發(fā)明的藥物組合物還包含藥學(xué)可接受的抗氧化劑。藥學(xué)可接受的抗氧劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；( 油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酯、丁羥基茴香醚(BHA)、丁羥基甲苯 (BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物中的適合的水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及它們的適合的混合物、植物油例如橄欖油以及注射用有機(jī)酯例如油酸乙酯。例如通過使用包衣材料例如卵磷脂，通過在分散體的情況中維持所要求的粒徑以及通過使用表面活性劑可維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。這些組合物還可包含輔劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過滅菌操作和通過加入各種抗菌劑和抗真菌劑例如尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸等可確保防止微生物的存在。還可能需要將等滲劑例如糖、氯化鈉等加入所述組合物中。另外，通過加入延遲吸收的物質(zhì)例如單硬脂酸鉛和明膠可形成吸收延長的可注射的藥物形式。藥學(xué)可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用于臨時制備無菌注射用溶液劑或分散體的無菌粉末。此類介質(zhì)和試劑對于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。
調(diào)節(jié)劑量以提供最佳的期望反應(yīng)(例如治療反應(yīng))。例如，可給藥單次推注、可在一段時間內(nèi)給藥數(shù)個分次劑量或者可如治療情況的緊迫性所示成比例地減少或增加劑量。 將腸胃外組合物配制成單位劑量形式以便于給藥和實(shí)現(xiàn)劑量均一性是特別有利的。本文使用的劑量單位形式指適合用作用于預(yù)治療個體的單一劑量的物理分離單位；每一個單位包含與所需的藥物載體聯(lián)合的經(jīng)計(jì)算可產(chǎn)生期望治療作用的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明單位計(jì)量形式的規(guī)格取決于并依賴于以下因素(a)活性化合物的特性和預(yù)實(shí)現(xiàn)的具體療效，和(b)配制此類化合物用于治療個體中的過敏的技術(shù)中的固有局限性。對于抗體給藥，以宿主體重計(jì)，劑量范圍為約0.0001-100mg/kg并且更通常為 0. 01-5mg/kgo例如，齊[J量可為0. 3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或 10mg/kg體重或者在l-10mg/kg的范圍內(nèi)。示例性治療方案需要每周給藥一次、每兩周給藥一次、每三周給藥一次、每四周、每月給藥一次、每三個月給藥一次或者每三個月-六個月給藥一次。本發(fā)明抗-BSSL抗體的優(yōu)選的劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下給藥的lmg/kg體重或:3mg/kg體重，或者使用以下給藥方案之一給予抗體(i)每四周六個劑量，然后每三個月六個劑量；(ii)每三周給藥一次；(iii):3mg/kg體重給藥一次，然后每三周lmg/kg體重。實(shí)施例^MM 1. BSSL出現(xiàn)在肝_中并H龍肝脂肪奪+牛的狀與粒件白細(xì)胞共定位檢驗(yàn)肝臟是循環(huán)BSSL的來源這一假說個體和樣品獲取在癌癥的選擇性腹部手術(shù)中從四名患者獲得人肝臟切片。從距離腫瘤位點(diǎn)大于一厘米的肝臟組織取切片?；颊?是接受結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移手術(shù)的62歲男性；患者2是接受直腸癌肝轉(zhuǎn)移手術(shù)的73歲女性；患者3是接受結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的60歲女性，患者4是接受膽管細(xì)胞癌手術(shù)的63歲女性。所有患者均接受全身麻醉。根據(jù)生產(chǎn)商的使用指南使用Polymorphpi^pTM(Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway)從來自健康志愿者的全血樣品分離多形核粒性白細(xì)胞和單核細(xì)胞。試驗(yàn)方案得到瑞典^iea大學(xué)醫(yī)學(xué)會倫理委員會(Ethics Committee ofthe Medical Faculty of Umea University, Sweden)的批準(zhǔn)。獲得了所有參與者的知情同意書。RNA分離、cDNA合成、RT-PCR擴(kuò)增和測序?qū)⑺占挠糜赗NA分離的新鮮肝臟標(biāo)本立即浸入TRIzoI試劑(Invitrogen， Carlsbad, CA, USA)中并且根據(jù)使用說明分離總RNA。將分離的人血細(xì)胞(多形核粒性白細(xì)胞和單核細(xì)胞)重懸于RNAlater溶液(Ambion，Austin, TX, USA)并且于8°C溫育過夜。使細(xì)胞沉淀，重懸于TRIzol，并且根據(jù)使用說明分離總RNA。使用NanoDrop NDlOO (NanoDropTechnologies, Wilmington, DE, USA)用分光光度法定量 RNA 產(chǎn)率，通過溴化乙錠染色在1 %瓊脂糖凝膠上分離的核糖體RNA條帶評價RNA的完整性。將RNA樣品保存于-70°C直至使用。使用隨機(jī)六聚體和iTaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑在100 μ 1的體積(AppliedBiosystems， Foster City, CA, USA)中從 IygS RNA 生成 cDNA。根據(jù)生產(chǎn)商的建議使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(AppliedBiosystems)進(jìn)行 PCR。在20 μ 1的總體積內(nèi)擴(kuò)增一微升的cDNA。引物序列如下正向引物(BSSL10) 5' -TCCCGGGACCTGCCCGTTAT-5‘ (SEQ IDNO :3)；反向引物(BSSL 11)5' -CTGCAGAGAGACGCTGGCAC -3' (SEQ IDNO :4)。PCR 條件如下:95°C 5min，然后 94°C 45s, 60°C lmin，72°C lmin，共 40 個循環(huán)，最后72°C延伸8min。如果存在目標(biāo)序列，預(yù)期PCR反應(yīng)可產(chǎn)生包含BSSL外顯子4 和5的327-bp產(chǎn)物。根據(jù)生產(chǎn)商的建議使用 Big Dye Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)對PCR片段進(jìn)行直接測序。將BSSL 10或BSSL 11(如上所述) 用作引物。用ABI 373 OXL DNA分析儀(Applied Biosystems)分析所述反應(yīng)。蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡分析將獲自患者2、3和4的肝組織碎片(約100-200mg)或血細(xì)胞(獲自IOml全血的多核粒性白細(xì)胞或單核細(xì)胞)在包含蛋白酶抑制劑W.047 % NH3、0.4% Triton Χ-100、0· 08%十二燒基硫酸鈉(SDQ、lMini CompleteTablet/50ml (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)]的緩沖液中勻漿。將所述勻漿于14，OOOrpm離心lOmin，收集上清并上樣至偶聯(lián)了抗-人BSSL多克隆抗體的HiTrap NHS-活化柱(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 在兔中制備所述BSSL抗體并且如前人所述進(jìn)行純化(Hansson等人，1993)。用添加了 0.02%疊氮化鈉(妝隊(duì))和0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后，用包含0. IM甘氨酸(pH 2. 5)、0· 02% NaN3和0. 01% EDTA的緩沖液洗脫結(jié)合的物質(zhì)。于4°C進(jìn)行所有步驟以將蛋白質(zhì)裂解風(fēng)險最小化。在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上分離洗脫的蛋白質(zhì)并且轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad， Hercules, CA)。使用 ECL Advance Western Blotting Detection Kit 按照生產(chǎn)商的建議 (GE Healthcare)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法。將多克隆抗-人BSSL抗體(Hansson等人1993)用作一抗，將過氧化物酶-共軛的驢-抗-兔IgG (DAK0，Glostrup，Denmark)用作二抗。將分離自人乳汁的BSSL(Blacliberg和Hernell 1981)和來自人胰腺的蛋白質(zhì)提取物用作蛋白質(zhì)印跡法中的陽性對照。組織學(xué)分析和油紅0染代將用于組織學(xué)評價的標(biāo)本在4%仲甲醛、0. IM磷酸緩沖液(pH 7.0)中固定過夜， 包埋在石蠟中、用顯微鏡用薄片切片機(jī)切片并且用蘇木精和伊紅染色。對于油紅0染色， 于4°C將組織在4%仲甲醛、0. IM磷酸緩沖液(pH 7.0)中固定池并且通過于4°C在PBS中的30%蔗糖溶液中溫育過夜進(jìn)行冷凍保護(hù)。之后將標(biāo)本包埋在Tissue Tek OCT化合物中 (Sakura FinetekEurope B. V. , Zoeterwoude, The Netherlands)，在干冰上冷凍并且 _70°C 保存直到進(jìn)行切片。分析后，用恒冷箱切片機(jī)切割8-μ m厚的切片并且固定到SuperFrost Plus 玻片上(Menzel-Glaser，Braunschweig, Germany)。室溫下用油紅 0 染色液(60% 異丙醇中0. 3%油紅0)將切片染色lOmin，然后用60%異丙醇洗滌。免疫組織化學(xué)和免疫熒光染代如上文對油紅0染色所述將組織樣品固定、包埋并且冷凍切片。將一滴10μ 1的分離的血細(xì)胞涂抹至SuperFrost Plus玻片上(Menzel-Glaser)并且在加濕室中于室溫下放置lh。用3x PBS(2min)和Ix PBS (2x 2min)洗滌細(xì)胞并且于室溫下在4%仲甲醛、0. IM 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中固定20min。對于單染-免疫組織化學(xué)研究，用Tris-緩沖鹽水(TBS ；50mM Tris-HCl，pH 7. 5， 150mM NaCl)將晾干的切片洗滌3x 5min。通過在80%甲醇溶液中與0. 6%過氧化氫(H2O2)溫育封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。接著先后用TBS和TBS-Tn^WT 0. 1% Triton X-100 的TBS)洗滌后，在TBS-T中將切片與10%正常馬血清(NHS)溫育lh。加入第一抗體(兔抗-BSSL，1 1000稀釋于TBS-T+10% NHS中)并且溫育2h。在TBS-T (3x5min)中洗滌后， 加入生物素化二抗[羊抗-兔(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA，USA)，1 4000 稀釋于TBS-T+10% NHS中]并且溫育lh。在PBS(3x;3min)中洗滌切片并且與Vectastain Elite ABC 試劑(Vector Laboratories Inc.)溫育 lh，再次在 PBS (3x min)中洗滌并且在二氨基聯(lián)苯(DAB)溶液[將1片DAB(IOmg)溶解于15ml PBS+12y 1 H2O2中]中顯色。最后， 用Mayer蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染、脫水并且固定在DPX顯微鏡封片劑(Merck Sharp&Dohme, Sweden)中。陰性對照包含與兔免疫前血清而非一抗溫育的切片。對于免疫熒光染色，將如上文所述處理并固定于SuperFrost Plus玻片上的晾干的肝切片或分離的血細(xì)胞在PBS中洗滌lOmin。通過在H2A中溫育IOmin封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。在PBS(3x 3min)中洗滌后，在TBS-T中將切片或細(xì)胞與10% NHS溫育lh。加入稀釋于TBS-T+10% NHS中的一抗并溫育2h。在TBS-T(3x 5min)中洗滌切片或細(xì)胞。加入二抗(1 1000稀釋于TBS_T+10% NHS)并且將所述樣品溫育lh。將4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI ；分子探針)用于核復(fù)染。在TBS-T(3x5min)中洗滌切片或細(xì)胞并且固定于Vectashield熒光介質(zhì)中。陰性對照由與兔免疫前血清而非一抗溫育的切片或細(xì)胞組成。對于非透性化細(xì)胞的染色，在所有步驟中用TBS-T替換PBS。所有一抗(除了抗-BSSL)的主要反應(yīng)性總結(jié)在表1中。表1.免疫細(xì)胞標(biāo)記和BSSL在人肝臟中的共定位
權(quán)利要求
1.防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的方法，包括向需要此類治療的個體給藥藥學(xué)有效量的BSSL拮抗劑。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述BSSL拮抗劑是特異結(jié)合于人BSSL的抗體或抗體片段。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述BSSL拮抗劑是包含與編碼人BSSL的多聚核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的一部分互補(bǔ)的序列的RNAi分子或反義多聚核苷酸。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述炎性疾病選自與自身免疫疾病、過敏相關(guān)的炎癥，與呼吸道、胃腸道疾病相關(guān)的炎癥，與骨和關(guān)節(jié)相關(guān)的炎癥，與結(jié)締組織重建或肌骨骼病、心臟病或血管相關(guān)的炎癥，與氧化一氮的產(chǎn)生相關(guān)的炎癥，與皮膚、腹部、外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼或淚腺、耳、鼻、口、肺、心臟、肝臟、胰腺、甲狀腺、腎臟、生殖泌尿道相關(guān)的炎癥，或與感染或外傷相關(guān)的炎癥。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述炎性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
7.用于防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的藥物組合物，包含BSSL拮抗劑和藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述BSSL拮抗劑是特異結(jié)合于人BSSL的抗體或抗體片段。
9.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。
10.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述BSSL拮抗劑是包含與編碼人BSSL的多聚核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的一部分互補(bǔ)的序列的RNAi分子或反義多聚核苷酸。
11.權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述炎性疾病選自與自身免疫疾病、過敏相關(guān)的炎癥，與呼吸道、胃腸道疾病相關(guān)的炎癥，與骨和關(guān)節(jié)相關(guān)的炎癥，與結(jié)締組織重建或肌骨骼病、心臟病或血管相關(guān)的炎癥，與氧化一氮的產(chǎn)生相關(guān)的炎癥，與皮膚、腹部、外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼或淚腺、耳、鼻、口、肺、心臟、肝臟、胰腺、甲狀腺、腎臟、生殖泌尿道相關(guān)的炎癥，或與感染或外傷相關(guān)的炎癥。
12.權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中所述炎性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
13.BSSL拮抗劑在制備用于防止、預(yù)防和/或治療炎性疾病的藥物組合物中的用途。
14.權(quán)利要求13所述的用途，其中所述BSSL拮抗劑是特異結(jié)合于人BSSL的抗體或抗體片段。
15.權(quán)利要求14所述的用途，其中所述抗體是單克隆抗體。
16.權(quán)利要求13所述的用途，其中所述BSSL拮抗劑是包含與編碼人BSSL的多聚核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的一部分互補(bǔ)的序列的RNAi分子或反義多聚核苷酸。
17.權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的用于防止和/或治療炎性疾病的用途，其中所述病癥選自與自身免疫疾病、過敏相關(guān)的炎癥，與呼吸道、胃腸道疾病相關(guān)的炎癥，與骨和關(guān)節(jié)相關(guān)的炎癥，與結(jié)締組織重建或肌骨骼病、心臟病或血管相關(guān)的炎癥，與氧化一氮的產(chǎn)生相關(guān)的炎癥，與皮膚、腹部、外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)、目艮或淚腺、耳、鼻、口、肺、心臟、肝臟、胰腺、甲狀腺、腎臟、生殖泌尿道相關(guān)的炎癥，或與感染或外傷相關(guān)的炎癥。
18.權(quán)利要求17所述的用途，其中所述炎性疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明提供用于防止、預(yù)防和治療諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性疾病的方法和藥物組合物，所述藥物組合物包含蛋白質(zhì)膽鹽激活脂肪酶(BSSL)的拮抗劑。本發(fā)明還涉及包含BSSL拮抗劑的藥物組合物以及它們在用于防止、預(yù)防和治療諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性疾病的方法中的用途。根據(jù)本發(fā)明使用的適合的BSSL拮抗劑是BSSL抗體。
文檔編號A61K39/395GK102458464SQ201080025267
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日
發(fā)明者倫納特·古斯塔夫·倫德貝格, 奧勒·赫奈爾, 蘇珊·林德奎斯特 申請人:倫納特·古斯塔夫·倫德貝格, 奧勒·赫奈爾, 蘇珊·林德奎斯特