本申請要求于2014年4月24日提交的美國臨時申請第61/983,900號的權益，其全部公開內容據此通過引用并入本文。

技術領域

本公開內容涉及具有包含季銨基團的N-取代基的靛紅酸酐衍生物和相關的鄰氨基苯甲酸酯衍生物以及此類衍生物用于化學偶聯(lián)和用于使材料的表面改性的用途。

背景

常常合意的是，使化合物偶聯(lián)至另一種化合物或材料，用于包括標記靶化合物或材料和/或使靶化合物或材料官能化的多種應用。此類偶聯(lián)工藝可以被用于使小分子和/或大分子偶聯(lián)在一起。例如，碳二亞胺偶聯(lián)方案例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(硫代-NHS)可以被用于使分別包含羧基或氨基的兩個獨特的大分子偶聯(lián)。

靛紅酸酐(還被稱為2H-3,1-苯并噁嗪-2,4(1H)-二酮)及其衍生物通常被用作有機合成中的中間體。然而，它們還已經在偶聯(lián)反應中被使用并且被用于使材料改性。例如，WO2012076794A1和美國專利申請公布20130253179公開了偶聯(lián)的靛紅酸酐或其衍生物以使核糖核酸(RNA)關于RNA的某些核糖部分官能化。WO2007145940公開了通過用N-甲基靛紅酸酐標記分子來分析RNA分子的結構。美國專利第3,346,327號和第2,150,968號公開了使用靛紅酸酐和其衍生物用于使羊毛和纖維素改性。

然而，某些偶聯(lián)方案要求使用昂貴的試劑和/或導致形成必須從期望的反應產物中除去的不期望的副產物。此外，某些偶聯(lián)反應可以是緩慢的和/或難以監(jiān)測且實時定量。另外，包括靛紅酸酐及其衍生物的許多偶聯(lián)方案使用通常是較不合意的無水反應介質。

因此，對于可以被用于標記靶化合物或材料和/或使靶化合物或材料官能化和/或使化合物或材料偶聯(lián)在一起的化合物存在持續(xù)的需求。

本公開內容的概述

本公開內容的優(yōu)點包括具有包含季銨基團的N-取代基的靛紅酸酐衍生物和相關的鄰氨基苯甲酸酯衍生物。靛紅酸酐衍生物和鄰氨基苯甲酸酯衍生物可以被用于包括標記靶材料和/或使靶材料官能化和/或用于使材料偶聯(lián)在一起的多種應用。

這些優(yōu)點和其他優(yōu)點通過具有包含季銨基團的N-取代基的靛紅酸酐衍生物至少部分地被滿足。此類靛紅酸酐衍生物可以具有以下的式：

其中V、W、Y和Z獨立地代表H、N₃、NO₂、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、支鏈的或直鏈的烷基、支鏈的或直鏈的烯基、支鏈的或直鏈的炔基、支鏈的或直鏈的烷氧基、甲酰基、乙?；?、或鹵素；L₁代表連接基；R₃和R₄獨立地代表直鏈的或支鏈的烷基、烷基醚，或一起形成環(huán)雜烷基、或環(huán)雜芳基；Q^-代表陰離子；p是從0至2的整數；當p是0時，L₂代表有機側基(pendant organo group)；當p大于0時，L₂代表第二獨立的連接基；R₁代表化學反應性基團、結合基團或可檢測的標記物。

本公開內容的靛紅酸酐衍生物的實施方案單獨地或組合地包括以下的特征。例如，當p是1時，L₂是連接基并且R₁可以是化學反應性基團例如疊氮化物、炔、被保護的硫醇、包含二硫化物部分的基團、烯烴、芳基烯馬來酰亞胺、縮醛、醛、酮、縮酮、腙、環(huán)氧化物、N-羥基琥珀酰亞胺酯、(硫代)N-羥基琥珀酰亞胺酯基、硫酯、硼酸、硼酸酯、或三烷氧基甲硅烷基；其中V和Z可以是H并且W和Y可以獨立地代表H、N₃、NO₂、NH₂、NHR₅、NR₅R₅、C_1-6烷基、C_1-6烯基、C_1-6炔基、-CHO或縮醛；R₃和R₄可以獨立地代表C_1-6烷基或一起形成5-6元環(huán)雜環(huán)；R₅可以代表C_1-8脂肪族基團；Q^-可以是鹵素陰離子例如Cl^-、Br^-或I^-；L₁可以是二基(di-radical)C_1-60有機基；當p大于零時，L₂代表二基C_1-60有機基并且當p是零時，L₂代表C_1-60有機側基?？蛇x擇地，L₁和L₂可以獨立地代表R₅、Ar、R₅-Ar、Ar-R₅、R₅-Ar-R₅、-(CH₂)n-、-(R₅O)m-(CH₂)n-、-(CH₂)n–(R₅O)m-R₅、-(CH₂)n–(OR₅)m-R₅，其沿著主鏈具有或不具有雜原子，和-(CH₂)n–(OR₅)m-XR₅、以及-(CH₂)n₁–(OR₅)m₁-HA-(CH₂)n₂–(OR₅)m₂-R₅，其中R₅代表C_1-8脂肪族基團；Ar代表二基芳基；n、n₁和n₂獨立地代表1至30的整數；m、m₁和m₂獨立地代表0至30的整數；HA代表雜原子的基團例如-CO-、-C(O)X-、-XC(O)-、-X-、-S-、-S(O)-、-XS(O)₂-、-S(O)₂X-；并且X代表O、S、NH、或NR₅，條件是如果X是-NH-，那么仲胺大體上不與靛紅酸酐衍生物的酸酐反應。

本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以由其片段容易地被制備并且提供用于制備該衍生物的方法。

本公開內容的另一方面包括一種使材料改性的方法，該方法通過使本公開內容的靛紅酸酐衍生物與材料組合以形成(i)靛紅酸酐衍生物，其包含通過R₁偶聯(lián)的材料，具有式(II)的結構，或(ii)鄰氨基苯甲酸酯衍生物，其具有通過靛紅酸酐衍生物的酸酐偶聯(lián)的材料，具有式(III)的結構：

變量V、W、Y、Z、L₁、L₂、Q^-、R₃、R₄、p和R₁代表如用于上文式(I)的衍生物所描述的相同的取代基，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合。M代表材料并且R'₁代表由R₁和材料(M)的反應或相互作用形成的基團。對于本公開內容有用的材料包括例如生物材料、聚合物、官能化的材料、玻璃、陶瓷、塑料、木材、紡織品、羊毛、紙、纖維素、金屬、金屬合金等等。材料可以呈微米顆?；蚣{米顆粒的尺寸并且呈平板(flat sheet)、球體、棒等等的形狀。

本公開內容的另一方面包括根據式(III)的鄰氨基苯甲酸酯衍生物：

變量V、W、Y、Z、L₁、L₂、Q^-、R₃、R₄、p、R₁、M和Xa代表如上文所描述的相同的取代基，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合。

在某些實施方案中，式(III)的鄰氨基苯甲酸酯包括作為材料的生物材料，例如其中在式(III)中的M代表“Bio”。此類生物材料包括例如RNA、RNA適配體、及其官能化的衍生物(例如Olaptesed pegol(NOX-A12)和Emapticap pegol(NOX-E36),Noxxon Pharma)、DNA、DNA適配體、及其官能化的衍生物(例如抗核仁素適配體AS1411)、蛋白質(例如，鏈霉親和素、中性抗生物素蛋白(Neutravidin)、抗生物素蛋白)、肽(例如，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、環(huán)狀-RGD等等)、肽模擬物(例如，α_vβ₃拮抗劑S247等等)、酶(例如，Elspar(門冬酰胺酶))、肽適配體、抗體(Ab)(例如，(曲妥單抗)、(貝伐單抗)、(西妥昔單抗)等等)、抗體片段(例如，抗原結合片段(Fab)例如(雷尼單抗)、單鏈可變片段(scFv)以及第三代3G分子)、糖(葡萄糖、葡萄糖胺等等)、淀粉等等。

本公開內容的另一方面包括具有多官能度的鄰氨基苯甲酸酯，例如，其中在式(III)中的M代表L₃-R”₁。此類鄰氨基苯甲酸酯可以具有以下的式：

變量V、W、Y、Z、L₁、L₂、Q^-、R₃、R₄、p和R₁代表如用于本文中的式(I)的衍生物所描述的相同的取代基，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合。例如，HXa代表NH₂基團、NHR₅基團、SH基團、或OH基團，并且L₃和R”₁分別代表如用于本文中的式(I)的L₁和R₁所描述的相同的基團，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合。

本公開內容的鄰氨基苯甲酸酯衍生物可以由其片段容易地被制備并且提供用于制備該衍生物的方法。

本公開內容的另一方面包括一種試劑盒，包含至少第一靛紅酸酐衍生物，所述第一靛紅酸酐衍生物具有包含季銨基團的N-取代基。在某些實施方案中，靛紅酸酐衍生物具有至少一種化學反應性基團或至少一種結合基團。在其他實施方案中，試劑盒包含第二靛紅酸酐衍生物，所述第二靛紅酸酐衍生物具有包含季銨基團的N-取代基，其中第一靛紅酸酐衍生物包含第一化學反應性基團，并且第二靛紅酸酐衍生物包含第二化學反應性基團，所述第二化學反應性基團能夠與第一靛紅酸酐衍生物的第一化學反應性基團化學地反應以使第一靛紅酸酐衍生物和第二靛紅酸酐衍生物偶聯(lián)。

本發(fā)明的另外的優(yōu)點依據以下詳述對于本領域技術人員將容易地變得是明顯的，其中簡易地通過說明實施本發(fā)明所預期的最優(yōu)模式的方式，僅示出和描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。如將被認識到的，本發(fā)明能夠具有其他和不同的實施方案，并且本發(fā)明的若干細節(jié)能夠在各種明顯的方面具有修改，而全部不背離本發(fā)明。因此，附圖和描述被認為本質上是說明性的，并且不認為是限制性的。

附圖簡述

對附圖作出參考，其中具有相同參考數字指定的要素自始至終代表類似的要素并且在附圖中：

圖1是用本公開內容的靛紅酸酐衍生物使基底的表面例如玻璃表面改性的圖示。

圖2圖示了通過本公開內容的靛紅酸酐衍生物將生物材料偶聯(lián)至放射性標記物。

圖3圖示了兩步偶聯(lián)反應，其中本公開內容的靛紅酸酐衍生物被用于使兩種材料彼此偶聯(lián)。

圖4是示出用本公開內容的靛紅酸酐衍生物標記的牛血清白蛋白的相對熒光隨時間的圖表。

圖5是示出緩沖液、未標記的DNA適配體以及用本公開內容的靛紅酸酐衍生物通過DNA上的氨基引物標記的DNA適配體的相對熒光的圖表。

圖6圖示了用于用本公開內容的靛紅酸酐衍生物標記牛血清白蛋白和胰島素且使牛血清白蛋白和胰島素軛合的方案。

圖7是示出未標記的試劑和用本公開內容的靛紅酸酐衍生物標記的牛血清白蛋白和胰島素的相對熒光的圖表。

圖8是示出在1,3-雙極性環(huán)加成之后的軛合的牛血清白蛋白的相對熒光的圖表。

圖9是示出用本公開內容的靛紅酸酐衍生物軛合的氨基官能化的納米顆粒的相對熒光的圖表。

本公開內容的詳述

本公開內容涉及具有包含季銨基團的N-取代基的靛紅酸酐衍生物和相關的鄰氨基苯甲酸酯衍生物。這些衍生物對于標記靶材料和/或使靶材料官能化和/或對于使材料偶聯(lián)在一起是有用的。本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以有利地是水溶性的。靛紅酸酐衍生物的水溶性通過化合物上的季銨基團來促進。當靛紅酸酐衍生物在含水介質中偶聯(lián)時，水溶性可以是有利的，所述含水介質對于最生物化學是優(yōu)選的介質。另外，本公開內容的靛紅酸酐衍生物的某些從常用商業(yè)起始試劑被容易地制備或衍生并且由于在常用有機溶劑中的高極性和低溶解度可以從非含水反應介質中容易地被分離。此外，提供了與靛紅酸酐衍生物相關的鄰氨基苯甲酸酯以及其用途。

目前有用的靛紅酸酐衍生物可以具有以下的式：

變量V、W、Y和Z獨立地代表H；N₃(疊氮基)；NO₂(硝基)；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；支鏈的或直鏈的烷基，例如C_1-8烷基例如甲基、乙基、丙基、異丙基；支鏈的或直鏈的烯基，例如C_1-8烯基例如乙烯基；支鏈的或直鏈的炔基，例如C_1-8炔基例如乙炔基(-C≡CH)；支鏈的或直鏈的烷氧基例如甲氧基、乙氧基；甲酰基(–CHO)、乙酰基(-COR₅)、鹵素例如氟、氯、溴、碘。R₅代表可以是直鏈的、支鏈的、無環(huán)的、環(huán)狀的、飽和的或不飽和的C_1-8脂肪族基團。本文脂肪族基團包括直鏈的、支鏈的、無環(huán)的、環(huán)狀的、飽和的或不飽和的。L₁代表連接基，例如兩個氮原子之間的二基有機基團(di-radical organo group)。R₃和R₄獨立地代表直鏈的或支鏈的烷基，例如C_1-8烷基例如甲基、乙基、正丙基、正丁基等等；烷基醚；或一起形成環(huán)雜烷基例如吡咯烷基、哌啶基、嗎啉基、哌嗪基；或環(huán)雜芳基例如吡啶基、咪唑基等等。Q^-代表陰離子例如鹵離子例如氟陰離子、氯陰離子、溴陰離子、或碘陰離子、磺酸鹽陰離子、硫酸鹽陰離子、或羧酸鹽陰離子。變量p是從0至2的整數，例如，p可以是0、1、或2。當p是0時，靛紅酸酐衍生物不包括R₁基團并且L₂代表在季氨氮上的有機側基。當p大于0時，R₁是存在的并且L₂代表第二獨立的連接基例如在季氮和一個或更多個R₁基團之間的二基有機基團。當p是2時，在靛紅酸酐衍生物上存在兩個R₁基團，所述R₁基團可以是相同的或不同的。

作為連接基，L₁和L₂獨立地代表二基有機基團，例如二基C_1-60有機基，所述二基有機基團可以是脂肪族的或芳香族的或包括兩者的元素。二基有機基團可以包括沿著主鏈的和/或取代基的雜原子。作為側基，L₂代表有機側基例如C_1-60有機側基，所述有機側基可以是脂肪族的或芳香族的或包括兩者的元素。側基可以包括沿著主鏈的和/或取代基的雜原子。沿著連接基二基有機基團或有機側基的主鏈的雜原子(HA)可以包括以下中的一種或更多種：-CO-、-C(O)X-、-XC(O)-、-X-、-S-、-S(O)-、-XS(O)₂-、-S(O)₂X-，其中X是O、S、NH或NR₅，條件是如果X是-NH-，那么仲胺大體上不與靛紅酸酐衍生物的酸酐反應。即，仲胺不是堿性的，是由于其具有吸電子取代基例如芳基或被二硝基苯基取代的仲胺。具有沿著主鏈的雜原子的二基有機基團或有機側基包括聚醚類，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚四亞甲基氧化物(poly(tetramethylene oxide))(還被稱為聚四氫呋喃)、聚酯類、聚酰胺類、乙基噁唑啉類，等等。此外，L₁和L₂的二基有機基團或有機側基可以獨立地包括主鏈上或主鏈外的取代基，例如烷基、芳基、烷氧基、硫醚、酰胺、鹵素，等等。

如果存在，那么R₁代表化學反應性基團、結合劑、或可檢測的標記物。例如，R₁可以是化學反應性基團例如疊氮化物、炔、被保護的硫醇、包含二硫化物部分的基團例如二硫吡啶基、烯烴、芳基烯例如苯乙烯基團、馬來酰亞胺、縮醛、醛、酮、縮酮、腙、環(huán)氧化物、N-羥基琥珀酰亞胺酯、(硫代)N-羥基琥珀酰亞胺酯基、硫酯、硼酸(B(OH)₂)基、硼酸酯(例如，B(OR₆)₂基)、三烷氧基甲硅烷基(例如，Si(OR₇)₃基團)，其中每個R₆可以是相同的或不同的并且代表直鏈的或支鏈的烷基，例如C_1-8烷基例如甲基、乙基、正丙基、正丁基等等，或芳基或雜芳基，或一起形成環(huán)烷基例如(-CH₂CH₂-)、或環(huán)雜烷基例如CH₃N(CH₂CH₂-)₂、O(CH₂CH₂-)₂，環(huán)芳基或環(huán)雜芳基；并且其中每個R₇可以是相同的或不同的并且代表直鏈的或支鏈的烷基，例如C_1-8烷基例如甲基、乙基、正丙基、正丁基等等；或R₁可以是結合基團例如生物素基團或半抗原例如2,4-二硝基苯基；或R₁可以是可檢測的標記物例如染料、熒光團或放射性標記物。在本公開內容中有用的靛紅酸酐衍生物優(yōu)選地具有至少一種化學反應性基團或至少一種結合基團或至少一種可檢測的標記物。

在本公開內容的一方面中，V、W、Y和Z獨立地代表氫、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、疊氮基、C_1-6烷基、烯基或炔基、甲酰基、或乙?；?。在實施方案中，V和Z是H并且W和Y獨立地代表H、N₃、NO₂、NH₂、NHR₅、NR₅R₅、C_1-6烷基、C_1-6烯基例如-CH＝CH₂、C_1-6炔基例如-C≡CH、-CHO或縮醛。在另一個實施方案中，V、Y和Z可以是H并且W可以是H、N₃、NO₂、NH₂、NHR₅、NR₅R₅、C_1-6烷基、C_1-6烯基例如-CH＝CH₂、C_1-6炔基例如-C≡CH、-CHO或縮醛。R₃和R₄獨立地代表C_1-6烷基或一起形成5-6元環(huán)雜環(huán)例如吡咯烷基。Q^-代表鹵離子。L₁代表二基C_1-30有機基例如二基C_1-20有機基，L₁可以是脂肪族的或芳香族的或包括兩者的元素并且其可以包括沿著主鏈的和/或取代基的雜原子，如上文所描述的。L₂代表C_1-30有機基，例如C_1-20有機基，L₂可以是脂肪族的或芳香族的或包括兩者的元素并且其可以包括沿著主鏈的和/或取代基的雜原子，如上文所描述的。當p是0時，L₂是二基C_1-30有機基例如二基C_1-20有機基并且當p是1時，L₂是C_1-30有機側基例如C_1-20有機側基。在實施方案中，L₁和L₂獨立地代表C_1-30烷基、芳基、C_2-30醚、聚醚、或其某些組合并且還可以包括以下中的一種或更多種或不包括以下：酯類、酰胺類、季胺類、沿著主鏈或其上的側基的芳基和雜芳基，例如，L₁和L₂獨立地代表R₅、Ar、R₅-Ar、Ar-R₅、R₅-Ar-R₅、-(CH₂)n-、-(R₅O)m-(CH₂)n-、-(CH₂)n-(R₅O)m-R₅、-(CH₂)n-(OR₅)m-R₅，其沿著主鏈具有或不具有雜原子，以及-(CH₂)n-(OR₅)m-XR₅、和-(CH₂)n₁-(OR₅)m₁-HA-(CH₂)n₂-(OR₅)m₂-R₅，其中X、R₅和雜原子(HA)是如上文所定義的；Ar代表二基芳基例如亞苯基；n、n1和n2獨立地代表1至30、例如1至8并且優(yōu)選地1至6的整數；m、m1和m2獨立地代表0至30、例如0至8并且優(yōu)選地0至6的整數。

具有包含季銨基團的N-取代基的靛紅酸酐衍生物的另外的實例在下面表1中被提供。

表1

對于表1中的化合物和式的V、W、Y、Z、Q^-和R₅的變量是如較前面所定義的。變量n代表1至30、例如1至8并且優(yōu)選地1至6的整數并且m代表0至30、例如0至8并且優(yōu)選地0至6的整數。在實施方案中，表1中的式4、式5、式7或式8具有R₃和R₄，R₃和R₄獨立地代表C_1-6烷基或一起形成5-6元環(huán)雜環(huán)，例如吡咯烷基；并且L₁和L₂獨立地代表-R₅-、-(CH₂)n-、-(R₅O)m-(CH₂)n-、-(CH₂)n–(R₅O)m-R₅-、-(CH₂)n-(OR₅)m-R₅-，其沿著主鏈具有或不具有雜原子，以及-(CH₂)n-(OR₅)m-XR₅-、-(CH₂)n₁-(OR₅)m₁-HA-(CH₂)n₂-(OR₅)m₂-R₅-，其中X、R₅和雜原子(HA)是如上文所定義的；n、n1和n2獨立地代表1至30、例如1至8并且優(yōu)選地1至6的整數；m、m1和m2獨立地代表0至30、例如0至8并且優(yōu)選地0至6的整數。表1中的化合物和式的另外的實施方案獨立地或以任何組合的方式包括，其中V和Z是H并且W和Y獨立地代表H、N₃或NO₂，或其中V、Y、Z各自代表H并且W代表H、N₃、或NO₂；Q^-代表鹵離子，例如Cl^-、Br^-或I^-。

本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以從常用起始材料被容易地制備。例如，本公開內容的靛紅酸酐衍生物一般可以根據下文示出的方案1或方案2來制備。

方案1

方案2

如在方案1中所示出的，靛紅酸酐衍生物可以通過使靛紅酸酐胺與Q-L₂-(R₁)p化合物反應來制備?？蛇x擇地，并且如在方案2中所示出的，靛紅酸酐衍生物可以通過使Q-取代的靛紅酸酐與胺化合物反應來制備。在方案1和方案2中所示出的程序提供用于制備本公開內容的靛紅酸酐衍生物的多樣化工藝。

在本公開內容的一個實施方案中，V、W、Y、Z是H，L₁是-(CH₂)₂-，R₃和R₄是甲基，p是1并且靛紅酸酐衍生物可以根據以下程序來制備。

方法A

方法A可以通過使等摩爾量的A1和QL₂R₁在反應燒瓶中混合來進行。可以將充足的溶劑例如丙酮添加至反應燒瓶以剛好溶解兩種反應物。燒瓶可以被加蓋并且將混合物加溫至約40-45℃以促進反應。通過此方法A制備的許多靛紅酸酐衍生物產生結晶化合物，該結晶化合物可以被過濾以除去溶劑和未反應的起始材料。通過此方法A制備的靛紅酸酐衍生物還可以被促進以通過添加非溶劑例如二乙醚形成結晶化合物。非結晶衍生物可以通過色譜法來純化。遲緩的反應可以使用不同的溶劑，例如2-丁酮，并且反應混合物加溫至約60℃。另外，可以添加催化量的NaI以使反應加速。在丙酮中可溶的產物可以通過柱色譜法來純化。例如，以下靛紅酸酐衍生物A2可以使用方法A由以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料來制備和化合物A1來制備。

表2

在本公開內容的另一個實施方案中，V、W、Y、Z是H，L₁是-(CH₂)₃-，p是1并且靛紅酸酐衍生物可以根據以下程序來制備。

方法B

方法B可以通過使等摩爾量的B1和(CH₃)₂NL₂R₁在反應燒瓶中混合來進行?？梢詫⒊渥愕娜軇├绫砑又练磻獰恳詣偤萌芙鈨煞N反應物。燒瓶可以被加蓋并且將混合物加溫至約40-45℃以促進反應。通過此方法B制備的許多靛紅酸酐衍生物產生結晶化合物，該結晶化合物可以被過濾以除去溶劑和未反應的起始材料。通過此方法B制備的靛紅酸酐衍生物還可以被促進以通過添加非溶劑例如二乙醚形成結晶化合物。非結晶衍生物可以通過色譜法來純化。遲緩的反應可以使用不同的溶劑例如2-丁酮，并且反應混合物加溫至約60℃。在丙酮中可溶的產物可以通過柱色譜法來純化。例如，以下靛紅酸酐衍生物B2可以使用方法B由以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料和化合物B1來制備。

表3

包括各個表格中的那些的、本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以以與通過方法A或方法B制備的衍生物類似的方式來制備。另外，A1和B1的起始化合物可以從以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料分別根據如以下示出的方法C或方法D容易地被制備。

方法C

方法C可以在惰性氣氛例如氮氣氣氛中進行。在此程序中，可以將化合物C1溶解在干燥的二甲基甲酰胺(DMF)中并且可以添加2當量的氫化鈉。氫化鈉的添加可以是這樣的：其避免起泡?？蛇x擇地，碳酸鉀可以替代氫化鈉而使用。然后，可以添加胺鹽酸鹽(ClCH₂CH₂N⁺HR₃R₄Cl^-)。產物可以通過將反應混合物添加至冰水并且濾去產物或通過萃取而獲得。類似地，聚乙二醇化的胺鹽酸鹽(例如，ClCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂N⁺HR₃R₄Cl^-)可以替代胺鹽酸鹽(ClCH₂CH₂N⁺HR₃R₄Cl^-)而使用。例如，以下起始靛紅酸酐C2可以使用方法C由以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料和化合物C1來制備。

表4

方法D可以在惰性氣氛例如氮氣氣氛中進行。在此程序中，可以將化合物D1溶解在干燥的DMF中并且可以添加氫化鈉。氫化鈉的添加可以是這樣的：其避免起泡。然后，可以添加氯碘化合物(CL-L₁-I)。當反應是完全的時，DMF可以在加熱和真空下從反應混合物被除去，在DMF的加熱和除去期間，碘化物交換氯化物?？梢詫堄辔飸腋?溶解在THF中。產物可以通過將漿料添加至冰水并且濾去固體產物或通過將液體產物萃取到有機相中而獲得。

方法D

例如，以下起始靛紅酸酐D2可以使用方法D由以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料和化合物D1來制備。

表5

本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以被用于多種應用。在本公開內容的一方面中，具有包含季銨基團的N-取代基并且還具有至少一種反應性基團或至少一種結合基團的靛紅酸酐衍生物可以被用于使材料改性。即，本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以被用于標記靶材料和/或使靶材料官能化和/或使材料偶聯(lián)在一起。

在一方面中，本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以與材料組合以形成(i)靛紅酸酐衍生物，其包含通過R₁偶聯(lián)的材料，具有式(II)的結構，或(ii)鄰氨基苯甲酸酯衍生物，其具有通過有靛紅酸酐衍生物的酸酐偶聯(lián)的材料，具有如以下示出的式(III)的結構：

變量V、W、Y、Z、L₁、L₂、Q^-、R₃、R₄、p和R₁代表如用于上文式(I)的衍生物所描述的相同的取代基，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合。M代表材料并且R'₁代表由R₁和材料(M)的反應或相互作用形成的基團。例如，當R₁是化學反應性基團時，M可以具有互補的化學反應性基團并且R'₁代表從如例如下文表8中那里示出的偶聯(lián)的產物?？蛇x擇地，R'₁可以代表R₁的結合基團與材料的相互作用。在某些情況下，酸酐官能團和R₁兩者均可以與胺反應。為了區(qū)分兩個可能的反應位點，芳基環(huán)上的反應性取代基(V、W、Y、Z)可以變化以增大或降低酸酐的反應性。

靛紅衍生物的酸酐和R₁朝向給定材料的相對反應性可以主要地通過選擇合適的R₁基團來調整。此外，芳基環(huán)上的基團(V、W、Y、Z)和用于R₃、R₄和連接基L₂的基團可以被選擇以影響靛紅衍生物的酸酐和R₁的相對反應性。例如，相對于R₁，使V為體積大的烷基將減緩在酸酐部分處的反應速率?？蛇x擇地，相對于R₁，使W、Y和Z為吸電子的將增大在酸酐處的反應速率。

除了能夠調節(jié)分子的酸酐部分的反應速率，芳香族取代基(V、W、Y、Z)還可以包括化學反應性基團例如疊氮基，所述化學反應性基團將本公開內容的靛紅酸酐衍生物從雙官能的試劑(酸酐和化學反應性R₁)改變成多官能的試劑(酸酐、化學反應性R₁以及一種或更多種反應性V、W、Y和/或Z)。例如，下文的靛紅酸酐衍生物57可以與生物材料中的氨基通過酸酐反應以形成具有進入到生物分子中的馬來酰亞胺和疊氮化物的雙官能度的鄰氨基苯甲酸酯。

此類多官能試劑從而允許選擇將生物材料連接至兩種另外的材料。在上文實例的情況下，鄰氨基苯甲酸可以使包含硫醇的材料偶聯(lián)以與馬來酰亞胺反應并且使包含炔的另一種材料偶聯(lián)以通過1,3-雙極性疊氮化合物/炔環(huán)加成與疊氮化物反應。此多化合價對于至材料表面例如生物分子的添加是有價值的貢獻。

本公開內容的方面包括通過使靛紅酸酐衍生物與具有可以與靛紅酸酐衍生物的R₁化學反應的基團組合而使材料改性。靛紅衍生物的酸酐和R₁朝向給定材料的相對反應性可以主要地通過選擇合適的R₁基團來調整。芳基環(huán)上的基團(V、W、Y、Z)和用于R₃、R₄和連接基L₂的基團可以被選擇以影響靛紅衍生物的酸酐和R₁的相對反應性。在本公開內容的一個實施方案中，該方法包括使具有作為化學反應性R₁基團的NHS酯或硫酯的靛紅酸酐衍生物和具有與R₁反應的伯胺的材料組合以得到式(II)的衍生物。

本公開內容的另一方面包括通過使本公開內容的靛紅酸酐衍生物與可以與靛紅酸酐衍生物的酸酐化學反應的材料組合而使材料改性。方案3圖示使本公開內容的靛紅酸酐衍生物與材料組合的實施方案。

方案3

如在此方案3中所示出的，式(I)的靛紅酸酐衍生物可以與具有親核基團HXa的材料(M)組合，其中HXa代表例如NH₂基團、NHR₅基團、SH基團、或OH基團，以隨著二氧化碳的釋放而形成具有式(III)的鄰氨基苯甲酸酯。即，式(I)的靛紅酸酐衍生物可以與表示為HXaM的材料軛合以形成式(III)，其中M是該材料并且Xa代表例如NH基、NR₅基團、S基團、或O基團。有利地，式(III)的鄰氨基苯甲酸酯是熒光劑。因此，當反應完成時，在方案3中圖示的偶聯(lián)反應可以提供實時熒光信號指示。

另外，由于衍生物上的季銨基團，本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以有利地是水溶性的，這允許使材料在含水介質例如水中改性，所述含水介質對于最生物化學是優(yōu)選的介質。雖然水可以與如在方案3中所示出的靛紅衍生物的酸酐官能團反應，但是發(fā)現(xiàn)本公開內容的靛紅酸酐可以與材料(M)進行比與水的水解明顯地更迅速的反應。因此，可以使用過量的靛紅酸酐衍生物以形成高收率的式(III)的鄰氨基苯甲酸酯并且任何未反應的靛紅酸酐衍生物都可以在其后被水解并且容易地除去。

此外，當R₁是化學反應性基團時，可以制備本公開內容的靛紅酸酐衍生物以與具有親核基團的材料(M)在比與R₁的任何反應明顯地更高的程度上反應。這可以通過選擇R₁和用于如上文解釋的V、W、Y、Z的基團來進行。

例如，當V、W、Y、Z全部是H并且R₁是環(huán)氧基團時，具有伯胺的材料將與靛紅酸酐衍生物的酸酐幾乎排他地反應。這通過用衍生物1aa(在下文實施例部分中描述的)的迅速注射NMR實驗來示出。當衍生物1aa(在下文實施例部分中描述的)與在緩沖至8.4的pH的D₂O中的1當量的正丁胺反應(用于在蛋白質的賴氨酸殘基中的堿性胺的模型)時，示出該胺與酸酐官能團反應，而沒有觀察到與環(huán)氧基團的反應。但是，當R₁是如在衍生物1x(在下文實施例部分中描述的)中的NHS酯時，分析示出，對于朝向正丁胺的酸酐和NHS酯兩者，反應速率是類似的。因此，芳基環(huán)上的取代基(V、W、Y、Z)應當被調節(jié)以調整相對反應速率。例如，相對于NHS酯，使V為體積大的烷基將減緩在酸酐部分處的反應速率?？蛇x擇地，相對于NHS酯，使W或Y為吸電子的將增大在酸酐處的反應速率。

對于本公開內容是有用的材料包括例如生物材料(Bio)例如RNA及其官能化的衍生物、DNA及其官能化的衍生物、蛋白質、肽、肽模擬物、酶、適配體、抗體、抗體片段、藥物、糖、淀粉等等。如本文所使用的，材料不限于大分子并且可以包括小分子例如藥物。另外有用的材料包括聚合物例如可水解和和可生物降解的聚合物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己內酯(PCL)-聚乙二醇共聚物，以及可以被用于藥用物質的遞送和被用作診斷物。對于本公開內容是有用的材料還包括玻璃、陶瓷、塑料、木材、紡織品、羊毛、紙、纖維素、金屬、金屬合金等等。材料可以呈微米顆?；蚣{米顆粒的尺寸并且呈平板、球體、棒的形狀。納米顆粒包括有機的、無機的或無機/有機的聚合物雜化物。例如，可以在本公開內容中使用的其他材料包括形狀因素(form factor)例如16孔板或96孔板。在本公開內容中是有用的另外的材料包括具有例如其中材料可以表示為HXaL₃-R”₁的官能度的那些。

本公開內容的另一方面包括式(III)的鄰氨基苯甲酸酯，其中材料是生物材料。此類鄰氨基苯甲酸酯衍生物可以根據式(IIIA)來表示：

變量V、W、Y、Z、L₁、L₂、Q^-、R₃、R₄、p、R₁和Xa代表如上文所描述的相同的取代基，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合并且基團“Bio”代表生物材料。

在本公開內容的一個實施方案中，式(IIIA)的鄰氨基苯甲酸酯包括生物材料例如RNA、RNA適配體、及其官能化的衍生物(例如Olaptesed pegol(NOX-A12)和Emapticap pegol(NOX-E36),Noxxon Pharma)、DNA、DNA適配體、及其官能化的衍生物(例如抗核仁素適配體AS1411)、蛋白質(例如，鏈霉親和素、中性抗生物素蛋白(Neutravidin)、抗生物素蛋白)、肽(例如，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、環(huán)狀-RGD等等)、肽模擬物(例如，α_vβ₃拮抗劑S247等等)、酶(例如，Elspar(門冬酰胺酶))、肽適配體、抗體(Ab)(例如，(曲妥單抗)、(貝伐單抗)、(西妥昔單抗)等等)、抗體片段(例如抗原結合片段(Fab)例如(雷尼單抗)、單鏈可變片段(scFv)以及第三代3G分子)、糖(葡萄糖、葡萄糖胺等等)、淀粉等等。

例如，靛紅酸酐衍生物可以被用于通過將生物素基團偶聯(lián)至材料使生物材料例如RNA及其官能化的衍生物、DNA及其官能化的衍生物、蛋白質、肽、肽模擬物、酶、適配體、抗體、抗體片段、藥物、糖、淀粉等等改性。即，當本公開內容的靛紅酸酐衍生物包含生物素基團(例如，式(I)的R₁是生物素基團)時，此類衍生物可以被用于生物材料的生物素化中。生物材料的生物素化可以例如通過使包含生物素基團的本公開內容的靛紅酸酐衍生物與生物材料組合來進行。這樣的組合形成諸如在式(IIIA)中示出的鄰氨基苯甲酸酯衍生物，其中Bio是生物材料并且R₁是生物素基團。下文提供了鄰氨基苯甲酸酯的另外的實例。

用生物素標記并且軛合抗體(Ab)

包含生物素基團的本公開內容的靛紅酸酐衍生物在生物素化反應中是特別地有利的，因為生物素化的程度可以合理地被定量。多種生物材料的生物素化包括將至少一種生物素分子共價附接至材料。生物素形成可以被開發(fā)以分離、純化、并且確定產生的生物素化的分子的具有鏈霉親和素(和其他鏈霉親和素類似物例如抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白)的高度特異性非共價絡合物。已知生物素化度即被添加至材料的生物素的量是高度合意的(以便不干擾被衍生化的分子的生物活性)。同樣地高度合意的是，產生的生物素化的程度是可定量的。因為生物素不具有固有地有用的發(fā)色團，所以此定量通常通過使用熒光標記的鏈霉親和素(或抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)，或使用抗生素蛋白/鏈霉親和素連接的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶通過二級測定例如抗生物素抗體或酶活性測定被實現(xiàn)。

然而，包含生物素基團的本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以改善這些檢測問題并且被用于生物素化的生物分子的構建。在一個這樣的實施例中并且如在下文方案4中所圖示的，抗體(即，抗MUC1抗體BC2(abcam，ab89492))可以用包含生物素基團的靛紅酸酐衍生物例如衍生物1s來標記以提供BC2-1s生物軛合物(bioconjugate)。

方案4

鄰氨基苯甲酸酯中固有的獨特的吸光度(340nm-360nm)(即，靛紅酸酐衍生物和生物材料的軛合物)可以被用于直接定量生物素化的程度而不需要二級測定檢測。另外，標記的BC2-1s生物軛合物將具有獨特的熒光光譜(激發(fā)/發(fā)射340nm/420nm)，是由于可以被用于在其中熒光檢測是便利的(例如，凝膠內熒光(in-gel fluorescence)等等)多種條件下容易地確定生物素化的BC2-1s生物軛合物的鄰氨基苯甲酸部分。

用熒光團標記并且軛合抗體(Ab)

本公開內容的靛紅酸酐衍生物的另一應用包括通過將熒光化合物偶聯(lián)至此使生物材料改性?？贵w的熒光標記是以同樣的方式用于生物領域和生物醫(yī)學領域中的多種應用的廣泛實踐。本公開內容的實施例包括熒光標記的抗體用于檢測高度特異性抗原的用途，其中其存在是特別的生理狀態(tài)的診斷。

包含化學反應性基團(例如，式(I)的R₁是化學反應性基團)的本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以被用于使生物材料例如抗體與熒光團偶聯(lián)。在一個這樣的實施例中并且如在下文方案5中所圖示的，抗-EGFR抗體ICR10(abcam，ab231)可以用包含化學反應性基團的靛紅酸酐衍生物例如衍生物1w來標記以提供ICR10-1w生物軛合物。

方案5

用1w使ICR10衍生化將賦予獨特的吸收特性(340nm-360nm)并且將還致使ICR10熒光劑分別具有340nm/420nm的激發(fā)/發(fā)射最大值。這些性質將使最終使用者能夠容易地確定在用1w衍生化之后的ICR10Ab的官能化的程度。另外，用1w處理之后的固定在抗體上的炔化學反應性基團允許將另一種材料即熒光團偶聯(lián)到ICR10-1w軛合物上。使ICR10-1w軛合物通過化學反應性炔基與FITC-PEG-N₃(NANOCS,PG2-AZFC-2k)偶聯(lián)產生被熒光素標記的ICR10抗體。此軛合物現(xiàn)在將展現(xiàn)出約495nm/515nm的激發(fā)發(fā)射波長(指示熒光素)，使得此軛合物適于其中熒光檢測是合意的應用(例如，共聚焦顯微鏡學、流式輔助細胞分選(flow assisted cell sorting)(FACS)等等)。

用藥物標記并且軛合抗體(Ab)

本公開內容的靛紅酸酐衍生物的另一應用包括通過將藥物偶聯(lián)至此使生物材料改性。在主要地癌癥化療中的應用下，抗體-藥物軛合物(ADC)是相對地新的一類靶治療劑。用于ADC的構建的一種常用策略是通過產自于抗體(或抗體片段)的硫醇和馬來酰亞胺改性的藥物之間的邁克爾加成反應使藥物固定。

包含化學反應性基團(例如，式(I)的R₁是化學反應性基團)的本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以被用于使生物材料例如抗體與藥物偶聯(lián)。在一個這樣的實例中并且如在下文方案6A和方案6B中所圖示的，抗體可以與藥物軛合。

方案6A

方案6B

例如，EGFR抗體(528)(Santa Cruz,sc-120)的抗體片段可以用多柔比星-2r軛合物來化學選擇性地標記(方案6A)。此策略可以被用于具有能夠經歷用2r改性的親核中心的多種藥物?？蛇x擇地并且如在方案6B中所示出的，EGFR抗體(528)的ADC可以使用2r通過經由產自于Ab的賴氨酸殘基的改性將馬來酰亞胺結合至Ab上來產生。使用Ab-2r軛合物的獨特的吸光度(吸光度340nm-360nm)，可以確定結合至Ab上的馬來酰亞胺殘基的數目。另外，包含合適地反應性硫醇的感興趣的藥物可以通過硫醇藥物和馬來酰亞胺官能團之間的邁克爾加成化學選擇性地被結合至Ab-2r。

基于硫代-NHS和NHS的化學

本公開內容的靛紅酸酐衍生物的另一應用包括使用此類衍生物作為用于使材料改性的基于硫代-NHS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)化學的替代物。本公開內容的靛紅酸酐衍生物上的季銨基團促進衍生物的水溶性，這在使用含水反應介質的生物化學中是有利的。本公開內容的靛紅酸酐衍生物還提供的優(yōu)勢是反應的程度可以合理地被定量，因為靛紅酸酐具有有區(qū)別的熒光和紫外信號。包含硫代-NHS基團或NHS基團(例如，式(I)的R₁是(硫代)N-羥基琥珀酰亞胺酯基團或N-羥基琥珀酰亞胺酯)的本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以被用作用于使材料改性的基于硫代-NHS或NHS的化學的替代物。

材料的官能化和固定

本公開內容的靛紅酸酐衍生物的另一應用包括使材料例如玻璃改性。玻璃表面的官能化廣泛地被實踐以用于生物技術工業(yè)內的應用。例如，具有環(huán)氧官能度的玻璃表面廣泛地被用于多種生物材料例如蛋白質、肽、以及改性的和未改性的寡核苷酸的固定。

包含化學反應性基團(例如，式(I)的R₁是環(huán)氧化物反應性基團)的本公開內容的靛紅酸酐衍生物可以被用于使材料例如玻璃官能化。然后，官能化的材料可以被用于使生物材料固定化。例如并且如在圖1中所示出的，包含環(huán)氧化物的本公開內容的靛紅酸酐衍生物例如衍生物1aa可以在環(huán)氧化物涂覆的玻璃表面的制備中被使用。用1aa制造環(huán)氧化物涂覆的玻璃表面可以容易地通過簡單的兩步工藝容易地實現(xiàn)。首先，玻璃表面可以用(3-氨基丙基)三乙氧基甲硅烷(APTES)(Sigma-Aldrich,A3648)來處理以提供親核表面。其次，1aa的溶液可以適用于表面，其中1aa將與APTES的氨基幾乎排他地在1aa的酸酐處反應，留下環(huán)氧化物表面用于在前面提及的應用中的衍生化。

通過靛紅酸酐衍生物將生物材料偶聯(lián)至放射性標記物

包含硼或硅官能團的本公開內容的靛紅酸酐衍生物在構建其中期望氟-18(¹⁸F)放射性核素的結合的材料中是有用的。¹⁸F放射性核素常用于正電子發(fā)射斷層掃描成象(PET)中。作為核醫(yī)學成像技術的PET的應用在醫(yī)學界內是普遍的。PET利用正電子發(fā)射的放射性核素以用于γ射線的檢測。典型地，這通過包含選擇的放射性核素的代謝活性小分子的引入來實現(xiàn)。當前，用于PET的工業(yè)標準放射性藥物是2-脫氧-2-(¹⁸F)氟-D-葡萄糖(FDG)。在操作上，此工藝要求FDG的全身性施用，F(xiàn)DG然后被代謝活性細胞不加選擇地代謝。因此，攝取是代謝活性的函數。由于癌細胞的增加的代謝活性，PET常常被用作闡明癌癥和癌癥轉移的手段。雖然，相對于健康細胞，存在通過癌細胞的增加的攝取，但是高度合意的是，將可能的有害的放射性暴露特定地限于疾病的部位。裝飾有細胞靶向劑(例如，適配體、抗體、抗體片段、肽、肽模擬物、糖等等)的納米顆粒用作作為¹⁸F標記的成像劑的選擇性遞送劑的分子骨架的用途可以有效地改善與結合¹⁸F的小分子的全身性遞送相關的問題。

在一個這樣的實施例中并且如在圖2中所圖示的，具有氨基官能團的納米顆粒，例如具有氨基官能化的表面的50nm金(Au)納米顆粒(AP)(可商購自Sigma Aldrich)可以用包含硼酸酯基團的靛紅酸酐衍生物例如衍生物34來標記以提供AuNP-34軛合物。然后，此衍生物可以用¹⁸F^-源直接處理以制備適于體內成像和診斷的AuNP-34-B(¹⁸F)^-₃衍生物。

在另一個實施例中，氨基官能化的納米顆粒可以用包含硅氧烷基團的靛紅酸酐衍生物例如衍生物43來標記以提供納米顆粒-43軛合物。然后，此衍生物可以用¹⁸F^-源直接處理以制備適于體內成像和診斷的NP-43-Si(¹⁸F)^-₃衍生物。

具有多官能度的鄰氨基苯甲酸酯

本公開內容的另一方面包括具有多官能度的鄰氨基苯甲酸酯。此類鄰氨基苯甲酸酯具有在下文多個方案中示出的式(IIIB)的結構。

例如，方案7A圖示使本公開內容的靛紅酸酐衍生物與材料組合以產生具有多官能度的鄰氨基苯甲酸酯的實施方案，其中材料可以被表示為HXaL₃-R”₁。

方案7A

變量V、W、Y、Z、L₁、L₂、Q^-、R₃、R₄、p和R₁代表如用于上文式(I)的衍生物所描述的相同的取代基，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合。例如，HXa代表NH₂基團、NHR₅基團、SH基團、或OH基團，并且L₃和R”₁分別代表如用于上文式(I)的L₁和R₁所描述的相同的基團，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合。

式IIIB的鄰氨基苯甲酸酯可以通過簡單地將表示為HXa-L₃R”₁的材料添加至式(I)的靛紅酸酐衍生物來制備。當HXa-L₃R”₁是胺時，反應可以在水或水和混溶的有機溶劑例如乙腈中常規(guī)地進行，以在必要時幫助溶解HXa-L₃R”₁。當HXa-L₃R”₁是醇時，無水極性質子惰性溶劑例如DMSO和DMF可以被用于使用于反應的I溶解。

可選擇地，式(IIIB)的鄰氨基苯甲酸酯可以通過在下文方案7B和方案7C中示出的路線來制備。

方案7B

方案7C

在這些可選擇的路線中，最后步驟將在丙酮中進行，具有最后的自清潔季銨化步驟的優(yōu)點。

在本公開內容的實施方案中，式(IIIB)的鄰氨基苯甲酸酯可以包含如在下文表6中提供的基團。

表6.式(IIIB)的鄰氨基苯甲酸酯的實例

在本公開內容的另一個實施方案中，式(IIIA)的鄰氨基苯甲酸酯可以包含如在下文表7中提供的基團。

表7.式(IIIA)的鄰氨基苯甲酸酯的實例

通過互補的靛紅酸酐衍生物偶聯(lián)材料

本公開內容的靛紅酸酐衍生物的另外的應用包括通過互補的靛紅酸酐衍生物偶聯(lián)不同的材料。例如，圖3圖示通用兩步偶聯(lián)反應，其中本公開內容的靛紅酸酐衍生物被用于使用互補的R₁化學反應性基團例如兩個不同的衍生物上的R_1a和R_1b將兩種材料(HX_aM_a和HX_bM_b)彼此偶聯(lián)。互補的反應性基團R_1a和R_1b各自獨立地代表可以與彼此反應的化學反應性基團。R_1a和R_1b基團分別作為半環(huán)和環(huán)在圖3中被圖示。R_1a和R_1b基團可以在容易地形成共價化學鍵的基團之中選擇，例如在點擊化學反應中已知的。

如在該圖中所示出的，具有包含季銨基團的N-取代基和基團(R_1a)的第一靛紅酸酐衍生物與材料HX_aM_a組合，而具有包含季銨基團的N-取代基和第二基團(R_1b)的第二靛紅酸酐衍生物與材料HX_bM_b組合。如在圖3中進一步圖示的，第一基團(R_1a)可以與第二基團(R_1b)化學地反應或結合以使兩種材料偶聯(lián)。

在本公開內容的實施方案中，不同的材料通過第一靛紅酸酐衍生物和第二靛紅酸酐衍生物的使用來偶聯(lián)。第一靛紅酸酐衍生物可以具有式(IVA)的結構，且第二靛紅酸酐衍生物具有式(IVB)的結構，如下：

其中Va、Vb、Wa、Wb、Ya、Yb、Za、Zb、L₁a、L₂a、L₁b、L₂b、Q^-a、Q^-b、R₃a、R₃b、R₄a、R₄b分別獨立地代表來自以下的基團：V、W、Y、Z、L₁、L₂、Q^-、R₃、R₄，包括各個變量中的每個的全部各種組合和子組合?；鶊FR_1a和R_1b代表如選自R₁的互補的化學反應性基團。

例如，R_1a和R_1b基團可以在容易地形成共價化學鍵的基團之中選擇，例如在點擊化學反應中已知的，例如，R_1a和R_1b可以在疊氮化物、炔、馬來酰亞胺、被保護的硫醇、烯烴、腙、醛、酮、縮醛以及縮酮中來選擇。下文表8圖示用于R_1a和R_1b的互補反應性基團。

表8

本公開內容的靛紅酸酐衍生物的偶聯(lián)反應可以包括例如當R_1a是烯烴并且R_1b是硫醇時。R_1a和R_1b基團可以使用光通過形成碳-硫鍵來偶聯(lián)。在其他情況下，本文描述的化合物的含疊氮化物或含炔的部分可以被用于使該化合物通過從疊氮化物官能團或炔官能團和其他化學物質的炔官能團或疊氮化物官能團通過碳-氮雜環(huán)的點擊化學的形成偶聯(lián)至另一類化學物質。

試劑盒

在本公開內容的另一方面中，具有包含季銨基團的N-取代基的靛紅酸酐衍生物可以被包含在試劑盒中。此類試劑盒可以被制備并且被銷售以使生物分子連接在一起或使生物分子與用于遞送藥物的其他材料連接或使生物材料連接至可檢測的標記物例如放射性標記物或熒光團或兩者。

試劑盒包含至少第一靛紅酸酐衍生物，所述第一靛紅酸酐衍生物具有包含季銨基團的N-取代基。試劑盒還可以包含第二靛紅酸酐衍生物，所述第二靛紅酸酐衍生物具有包含季銨基團的N-取代基，其中第一靛紅酸酐衍生物包含第一化學反應性基團，并且第二靛紅酸酐衍生物包含第二化學反應性基團，該第二化學反應性基團能夠與第一靛紅酸酐衍生物的第一化學反應性基團化學地反應以使第一靛紅酸酐衍生物和第二靛紅酸酐衍生物偶聯(lián)。在本公開內容的實施方案中，第一靛紅酸酐衍生物可以具有式(IVA)的結構，且第二靛紅酸酐衍生物具有式(IVB)的結構。在本公開內容的實施方案中，試劑盒包含表1中的式4、式5、式7、或式8中的一種或更多種化合物，例如來自式5的疊氮化物和炔或來自式7的酰肼和醛。

試劑盒還可以包括關于如何使用第一靛紅酸酐衍生物和/或第二靛紅酸酐衍生物的說明書。說明書可以作為插入物被包括、被并入到容器中和/或試劑盒的包裝中。

實施例

以下實施例意圖進一步說明本公開內容的某些優(yōu)選的實施方案并且本質上不是限制性的。本領域技術人員將認識到或能夠使用不超過常規(guī)的實驗確定本文描述的特定的物質和程序的許多等效物。

化合物1a至1d根據一般方案8和下文描述的一般程序來制備。

方案8

1)

2)

表9

用于合成靛紅酸酐衍生物1a-d的一般程序：向舒?zhèn)惪藷?Schlenk flask)在干燥的氮氣(N₂)下添加(1.5g，36mmol)60wt％礦物油中的氫化鈉(NaH)(在上文表中示出的1a和1a'需要2當量的NaH)。向此添加15ml的干燥的己烷，然后允許懸浮液短暫地攪拌以沉降，并且己烷通過套管除去。使此工藝重復三次。向新沖洗的NaH在室溫下添加無水二甲基甲酰胺(DMF)(30ml)，產生混濁的懸浮液。向此懸浮液一次地添加靛紅酸酐(5.1g，30mmol)。在此添加之后，添加另外的20ml的無水DMF并且將產生的懸浮液攪拌持續(xù)60分鐘，在此時間之后一次添加被取代的烷基鹵(在上表中示出的L₁-Q₁)(36mmol)。將產生的懸浮液攪拌持續(xù)約18小時，產生包含期望的產物的澄清的且有顏色的溶液。將產生的溶液在真空下在約100℃下濃縮，產生深顏色粘稠的殘余物。然后，將此殘余物溶解在二氯甲烷(150ml)中并且用100ml的飽和的碳酸氫鈉(NaHCO₃)(含水的)萃取三次。最后，將有機層用100ml的鹽水溶液洗滌一次。然后，收集有機層并且用活性炭(0.5g)攪拌持續(xù)30分鐘。然后，將產生的有機溶液通過一層硫酸鎂(MgSO₄)過濾以除去活性炭并且干燥殘余的水的溶液兩者。然后，將產生的溶液在真空下濃縮以除去二氯甲烷，產生淺顏色的固體，然后使該淺顏色的固體從異丙醇中重結晶。

衍生物1n至1s根據方案9和下文描述的一般程序來制備。

方案9

表10

用于從1b合成靛紅酸酐衍生物的一般程序。向包含1b(約99mg，0.3mmol)的3ml螺旋加蓋的小瓶添加1ml的試劑級干燥丙酮。將混合物加熱以溶解試劑，隨后通過0.4μm注射器過濾器過濾以除去任何不溶性氨基酸(來自1b的水解)。向此溶液添加對應的親核體(CH₃)₂N-L₂R₁(在上文表中示出的)(0.3mmol)并且允許溶液在40℃下靜置持續(xù)18小時。最終產物是固體并且通常通過抽吸過濾來分離。產物通過NMR和ESI質譜法來確證。結晶產物通過NMR分析是純的，除痕量的丙酮之外。當沒有觀察到固體沉淀物時，反應混合物的NMR和ESI質譜法被用于確證產物形成。在¹H NMR中，氨基的氮上的甲基氫的是診斷物。在起始胺(CH₃)₂N-L₂R₁中的這些氫共振是在約2ppm處，而產物的對應的氫(季銨化的胺上的甲基)是在3.1ppm和3.3ppm之間?；衔?s在使用的溶劑中不結晶并且在用旋轉蒸發(fā)除去溶劑之后，作為粘稠的油獲得。NMR分析通過此程序示出1s大于95％純度。

衍生物1t至1aa根據一般方案10和下文描述的一般程序來制備。

方案10

1a R₃＝R₄＝CH₃

1a'R₃＝R₄＝CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂

表11

用于從1a合成靛紅酸酐衍生物的一般程序：向包含1a(70mg，0.3mmol)的3ml螺旋加蓋的小瓶添加1ml的試劑級干燥丙酮。將混合物加熱以溶解試劑，然后通過0.4μm注射器過濾器過濾以除去任何不溶性氨基酸(來自1a的水解)。向此溶液添加對應的親核體QL₂R₁(在上文表中示出的)(0.3mmol)并且允許溶液在40℃下靜置持續(xù)18小時。這些反應通過¹H NMR來監(jiān)測；氨基的氮上的甲基氫的是診斷物。在起始材料(1a)中的這些氫共振是在約2.3ppm處，而產物的對應的氫是在3.1ppm和3.3ppm之間。最終產物典型地是固體并且通過抽吸過濾來分離。產物通過NMR和ESI質譜法來確證。產物通常是純的，除痕量的丙酮之外。當沒有觀察到固體時，反應混合物的ESI質譜法和NMR光譜學被用于確證產物形成。如果產物可以不被誘導結晶，那么將溶劑通過旋轉蒸發(fā)除去以留下粘稠的油。收率通過粗重量來確定并且純度通過NMR來確定。

酸酐和化學反應性R₁基團的相對反應性

靛紅酸酐衍生物1aa是雙親電試劑，其中兩種反應性末端(酸酐和環(huán)氧化物)朝向胺是反應性的。用此試劑迅速注射NMR實驗示出在兩個末端處存在反應速率的顯著差異。與用碳酸氫鈉緩沖至8.4的pH的D₂O中的1當量的正丁胺的反應(用于蛋白質的賴氨酸殘基中的堿性氨基的模型)示出胺與酸酐官能團反應，而沒有觀察到與環(huán)氧基團的反應。

靛紅酸酐衍生物1x也是雙親電試劑，其中兩種反應性末端(酸酐和NHS酯)朝向胺是反應性的。用此試劑以1當量的正丁胺的NMR動力學研究示出對于兩個末端，反應速率是類似的。但是，芳基環(huán)上的取代基(V、W、X、Y)允許調節(jié)相對反應速率。例如，相對于NHS酯，使V為體積大的烷基預計減緩在酸酐部分處的反應速率?？蛇x擇地，相對于NHS酯，使W或X為吸電子的預計增大在酸酐處的反應速率。

牛血清白蛋白的標記

靛紅酸酐衍生物1w被用于根據方案11和下文描述的程序標記牛血清白蛋白。

方案11

向牛血清白蛋白(BSA)在5mM碳酸氫鈉(pH 8.4和25℃)中的40mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1w(在DI H₂O中的1mg/ml)。立即將此溶液在20分鐘內分別使用350ex/420em的峰值激發(fā)發(fā)射波長監(jiān)測熒光。圖4是示出對應于炔至BSA中的結合的、標記的BSA隨時間的相對熒光的圖表。此產物將準備用于附接至另一個分子上的互補的疊氮化物官能團以使它們使用疊氮化物-偶聯(lián)點擊反應偶聯(lián)在一起。

DNA適配體的標記

靛紅酸酐衍生物1p被用于根據方案12和下文描述的程序用5’NH₂引物標記DNA適配體。

方案12

向DNA適配體(DNA Apt)在5mM碳酸氫鈉(pH 8.4和25℃)中的1mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1p(在DI H₂O中的1mg/ml)。將產生的溶液留在25℃下溫育持續(xù)約5分鐘，在此時間之后，將DNA Apt-1p通過凝膠滲透色譜法(GPC)(Princeton Separations CS-10)清除掉水解的和未反應的1p。然后，分別使用350nm/420nm的峰值激發(fā)/發(fā)射波長，測量純化的DNA Apt-1p生物軛合物的熒光。DNA Apt-1p生物軛合物的熒光直接與未標記的DNA Apt比較，如在圖5中所示出的，圖5證明疊氮化物已經被結合至DNA上。此疊氮化物軛合物準備與炔配偶體(alkyne partner)在疊氮化物-炔點擊反應中偶聯(lián)以使兩種互補的配偶體偶聯(lián)在一起。

標記和軛合牛血清白蛋白和人類胰島素

靛紅酸酐衍生物1w和1q被用于根據圖6中示出的方案和下文描述的程序標記牛血清白蛋白(BSA)和人類胰島素。

向牛血清白蛋白(BSA)在5mM碳酸氫鈉(pH 8.4和25℃)中的20mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1w(在DI H₂O中的1mg/ml)，(步驟1；圖6中的方案13)。將產生的溶液留在室溫下溫育持續(xù)約5分鐘，在此時間之后，將BSA-1w軛合物通過凝膠滲透色譜法(GPC)(Princeton Separations CS-10)清除掉水解的和未反應的1w。然后，分別使用340ex/420em的峰值激發(fā)發(fā)射波長分析純化的BSA-1w軛合物的熒光，圖7。熒光測量使用相同的激發(fā)波長/發(fā)射波長與未標記的BSA(10mg/ml)比較。由于緩沖液，而觀察到最小背景熒光。

向人胰島素(制造商)在5mM碳酸氫鈉(pH 8.4和25℃):二甲基亞砜(DMSO)的80:20溶液中的20mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1w(在DI H₂O中的1mg/ml)。將產生的溶液留在室溫下溫育持續(xù)約5分鐘，在此時間之后，將胰島素-1w軛合物通過凝膠滲透色譜法(GPC)(Princeton Separations CS-10)清除掉水解的和未反應的1w。然后，分別使用340ex/420em的峰值激發(fā)發(fā)射波長分析純化的胰島素-1w軛合物的熒光，圖7。熒光測量使用相同的激發(fā)波長/發(fā)射波長與未標記的胰島素(10mg/ml)比較。由于緩沖液，而觀察到最小背景熒光。重復此程序，用于用1q標記胰島素。參見圖6，方案14。NMR DOSY實驗能夠示出具有CF₃基團的片段具有與胰島素相同的擴散速率，示出1q被軛合至胰島素。這些實驗示出炔基和氟基兩者均可以被結合至胰島素中。胰島素-1w軛合物是用于疊氮化物-炔點擊反應中的疊氮化物的偶聯(lián)配偶體，同時胰島素-1w軛合物證明用氟部分改性分子的能力。

將第二材料偶聯(lián)至BSA-1w鄰氨基苯甲酸酯

上文制備的BSA-1w鄰氨基苯甲酸酯根據圖6的方案13，步驟2和下文描述的程序通過BSA-1w與化合物A的銅催化的1,3-雙極性環(huán)加成進一步地被衍生化。

向牛血清白蛋白(BSA)在5mM碳酸氫鈉(pH 8.4和25℃)中的40mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1w(在DI H₂O中的1mg/ml)，并且使產生的溶液靜置在室溫下溫育超過30分鐘。在此之后，將50μl的溶液通過凝膠滲透色譜法(GPC)(Princeton Separations CS-10)清除掉水解的和未反應的1w。BSA的標記分別使用340nm/420nm的峰值激發(fā)/發(fā)射波長通過熒光來確證(參見圖4)。在用1w標記BSA之后，根據Hong等人的方法“Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation”Angew Chem.Int.Ed.Engl.2009:48(52):9879-9883進行優(yōu)化的熒光銅催化的疊氮化物-炔環(huán)加成。選擇此方法，因為其與寬分類的生物分子是相容的，是迅速的并且反應的進展通過由BSA-1w-A的形成產生的熒光來監(jiān)測。簡言之；將25μl的BSA-1w(20mg/ml)添加至407.5μl的磷酸鹽緩沖液(100mM，pH 7)、10μl的A、2.5μl CuSO4(在DI H₂O中的20mM)、5.0μl的三(3-羥基丙基三唑基甲基)胺(THTPA)(在去離子H₂O中50mM)、抗壞血酸鈉(在去離子H₂O中的100mM)、以及氨基胍鹽酸鹽(在去離子H₂O中的100mM)。將產生的溶液留在室溫下避光溫育持續(xù)60分鐘。點擊反應分別使用340nm/420nm和404nm/470nm的峰值激發(fā)/發(fā)射波長通過熒光來監(jiān)測，圖8。該順序使用熒光示出了在生物分子上的合適位置使用1w之后，炔可以被用于疊氮化物-炔點擊反應。

納米顆粒的標記和官能化

靛紅酸酐衍生物1w被用于根據以下程序標記包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的納米顆粒并且使包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的納米顆粒官能化。

將用表面上的伯氨基(按wt％計，以0.00001％氨基官能度和0.0001％氨基官能度)官能化的10mg的納米顆粒(NP)添加至單獨的1.5ml微離心管，然后分散到250μl的去離子H₂O中。向這些中的每個添加50μl的1w(在去離子H₂O中的1mg/ml)。將產生的溶液留在室溫下溫育持續(xù)30分鐘。在此之后，將NP-1w軛合物在離心機上以21,000rcf在4℃下成球以除去水解的和未反應的1w兩者。然后，將NP-1w小球再分散到500μl的去離子H₂O中并且如上文再次成球。將此重復3次。最后，將清潔的NP-1w軛合物分散到1ml的去離子H₂O中并且分別使用340nm/420nm的峰值激發(fā)/發(fā)射波長記錄熒光，圖9。在納米顆粒的情況下觀察到的熒光(圖9)是至納米顆粒的表面的炔附接的證據。然后，可以使NP-1w與包含疊氮化物的分子配對以進行疊氮化物-炔點擊化學，從而使分子附接至納米顆粒。

雖然要求保護的本發(fā)明已經詳細地并且參考其特定的實施方案被描述，但是對本領域技術人員將明顯的是，可以對要求保護的本發(fā)明做出各種改變和修改，而不偏離要求保護的本發(fā)明的精神和范圍。因此，例如，本領域技術人員將認識到或能夠使用不超過常規(guī)的實驗確定本文描述的特定的物質和程序的許多等效物。這樣的等效物被認為是在本發(fā)明的范圍內并且被以下權利要求覆蓋。