本申請(qǐng)依據(jù)35U.S.C.§119要求2014年3月28日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/972,172、2014年7月7日提交的62/025,974及2014年7月17日提交的62/025,931的優(yōu)先權(quán)，這些專利的全部?jī)?nèi)容在此以引用的方式并入本文中用于所有目的，并且確切地說(shuō)，用于本文略述的附圖、圖例及數(shù)據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明描述了同時(shí)共接合抗原的新型免疫球蛋白組合物，其中兩種抗原都是單價(jià)結(jié)合的。所描述的新型免疫球蛋白優(yōu)選利用異二聚體Fc區(qū)。本文還描述了使用所述新型免疫球蛋白組合物，特別是用于治療目的的方法。

發(fā)明背景

基于抗體的治療劑已經(jīng)被成功地用于治療多種疾病，包括癌癥和自身免疫性/炎癥性病癥。不過(guò)仍需要針對(duì)此類藥物進(jìn)行改良，特別是增強(qiáng)其臨床功效。所研究的一種方法是將另外的新型抗原結(jié)合位點(diǎn)工程改造至基于抗體的藥物中，由此使單一免疫球蛋白分子共接合兩種不同的抗原。此類接合兩種不同抗原的非天然或替代性抗體形式通常稱為雙特異性抗體。由于抗體可變區(qū)(Fv)相當(dāng)大的多樣性使得有可能產(chǎn)生識(shí)別實(shí)際上任何分子的Fv，故產(chǎn)生雙特異性抗體的典型方法是將新的可變區(qū)引入抗體中。

已經(jīng)針對(duì)雙特異性抗體靶向研究多種替代性抗體形式(Chames&Baty，2009，mAbs 1[6]：1-9；Holliger&Hudson，2005，Nature Biotechnology 23[9]：1126-1136；及Kontermann，2012MAbs 4(2)：182，其全部以引用的方式明確地并入本文中)。起初，通過(guò)將分別產(chǎn)生單一單克隆抗體的兩個(gè)細(xì)胞系融合來(lái)制備雙特異性抗體(Milstein等人，1983，Nature 305：537-540)。盡管由此得到的雜交的雜交瘤或四源雜交瘤確實(shí)產(chǎn)生了雙特異性抗體，但其只是極少的一群，而且需要充分純化以分離出期望的抗體。針對(duì)這一點(diǎn)的工程改造方法是使用抗體片段來(lái)產(chǎn)生雙特異性抗體。由于這些片段缺乏全長(zhǎng)抗體的復(fù)雜四級(jí)結(jié)構(gòu)，使得可變輕鏈和重鏈可以連接于單一基因構(gòu)建體中。已經(jīng)產(chǎn)生許多不同形式的抗體片段，包括雙功能抗體、串聯(lián)scFv及Fab₂雙特異性抗體(Chames&Baty，2009，mAbs 1[6]：1-9；Holliger&Hudson，2005，Nature Biotechnology 23[9]：1126-1136；以引用的方式明確地并入本文中)。盡管這些形式可以在細(xì)菌中高水平表達(dá)，并且可能由于尺寸較小而具有有利的滲透益處，但其在體內(nèi)迅速清除并且可能存在與其產(chǎn)量和穩(wěn)定性有關(guān)的制造難題。造成這些缺點(diǎn)的主要原因是，抗體片段典型地缺乏抗體恒定區(qū)及其相關(guān)功能特性，包括較大的尺寸、高穩(wěn)定性，及與各種Fc受體和配體結(jié)合以維持較長(zhǎng)的血清半衰期(即，新生兒Fc受體FcRn)或用作純化的結(jié)合位點(diǎn)(即，蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G)。

近期的研究嘗試通過(guò)將雙重結(jié)合工程改造至類全長(zhǎng)抗體形式中來(lái)解決基于片段的雙特異性抗體的缺點(diǎn)(Wu等人，2007，Nature Biotechnology 25[11]：1290-1297；USSN12/477,711；Michaelson等人，2009，mAbs 1[2]：128-141；PCT/US2008/074693；Zuo等人，2000，Protein Engineering 13[5]：361-367；USSN09/865，198；Shen等人，2006，J Biol Chem 281[16]：10706-10714；Lu等人，2005，J Biol Chem280[20]：19665-19672；PCT/US2005/025472；及Kontermann，2012MAbs 4(2)：182，全部以引用的方式明確地并入本文中)。這些形式主要由于含有Fc區(qū)而克服了抗體片段雙特異性抗體的一些問(wèn)題。這些形式的一個(gè)重要缺點(diǎn)在于，由于其在同二聚體恒定鏈的頂部構(gòu)造抗原結(jié)合位點(diǎn)，使得與新抗原的結(jié)合通常是二價(jià)的。

對(duì)于在治療性雙特異性抗體形式中作為共同靶標(biāo)而引起關(guān)注的許多抗原來(lái)說(shuō)，期望的結(jié)合是單價(jià)而非二價(jià)的。對(duì)于許多免疫受體，細(xì)胞活化是通過(guò)單價(jià)結(jié)合相互作用的交聯(lián)實(shí)現(xiàn)。交聯(lián)機(jī)制典型地是由抗體/抗原免疫復(fù)合體，或經(jīng)由效應(yīng)細(xì)胞靶向細(xì)胞接合來(lái)介導(dǎo)。舉例來(lái)說(shuō)，低親和力Fcγ受體(FcγR)，如FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa單價(jià)結(jié)合至抗體Fc區(qū)。單價(jià)結(jié)合不能活化表達(dá)這些FcγR的細(xì)胞；不過(guò)，在形成免疫復(fù)合體或細(xì)胞與細(xì)胞接觸之后，受體發(fā)生交聯(lián)并且群集在細(xì)胞表面上，引起活化。對(duì)于負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)胞殺傷的受體，例如自然殺傷(NK)細(xì)胞上的FcγRIIIa來(lái)說(shuō)，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞以特別期望的方式接合靶細(xì)胞時(shí)，發(fā)生受體交聯(lián)和細(xì)胞活化(Bowles&Weiner，2005，J Immunol Methods 304：88-99，以引用的方式明確地并入本文中)。類似地，在B細(xì)胞上，抑制性受體FcγRIIb只有在與細(xì)胞表面B細(xì)胞受體(BCR)接合成免疫復(fù)合體時(shí)才下調(diào)B細(xì)胞活化，這一機(jī)制是由可溶性IgG與BCR所識(shí)別的抗原形成免疫復(fù)合體所介導(dǎo)(Heyman 2003，Immunol Lett 88[2]：157-161；Smith和Clatworthy,2010，Nature Reviews Immunology 10：328-343；以引用的方式明確地并入本文中)。在另一個(gè)實(shí)施例中，只有在T細(xì)胞相關(guān)T細(xì)胞受體(TCR)以特別期望的細(xì)胞-細(xì)胞突觸方式接合抗原呈遞細(xì)胞上載有抗原的MHC時(shí)，才發(fā)生T細(xì)胞的CD3活化(Kuhns等人，2006，Immunity 24：133-139)。實(shí)際上，使用抗CD3抗體進(jìn)行的CD3非特異性二價(jià)交聯(lián)引起細(xì)胞因子風(fēng)暴和毒性(Perruche等人，2009，J Immunol 183[2]：953-61；Chatenoud&Bluestone，2007，Nature Reviews Immunology 7：622-632；以引用的方式明確地并入本文中)。因此，對(duì)于實(shí)際臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)，用于靶細(xì)胞重定向殺傷的優(yōu)選的CD3共接合模式是單價(jià)結(jié)合，該結(jié)合只有在與共接合的靶接合后才引起活化。

CD38，又稱環(huán)腺苷二磷酸核糖水解酶，是具有長(zhǎng)C末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和短N(yùn)末端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的II型跨膜糖蛋白。在造血細(xì)胞中，功能作用的分類被認(rèn)為是CD38介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)果，包括淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子釋放、B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞發(fā)育和存活的調(diào)控，以及樹突狀細(xì)胞成熟的誘導(dǎo)。CD38在許多造血系統(tǒng)惡性疾病中以及來(lái)源于各種造血系統(tǒng)惡性疾病的細(xì)胞系中失調(diào)，造血系統(tǒng)惡性疾病包括非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma，BL)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、B慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)、B和T急性禮拜那細(xì)胞白血病(ALL)、T細(xì)胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓性白血病(AML)、毛細(xì)胞白血病(HCL)、霍奇金氏淋巴瘤(HL)及慢性骨髓性白血病(CML)。另一方面，造血系統(tǒng)的最原始的多能干細(xì)胞是CD38-。盡管近期在抗癌劑的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)方面取得了進(jìn)展，但涉及CD38表達(dá)性腫瘤的許多癌癥形式仍具有不良預(yù)后。因此，需要改進(jìn)治療此類癌癥形式的方法。

因此，盡管由抗體片段產(chǎn)生的雙特異性抗體存在生物物理學(xué)和藥物動(dòng)力學(xué)障礙，但利用類全長(zhǎng)抗體形式構(gòu)造的雙特異性抗體的缺點(diǎn)在于，其在無(wú)初級(jí)靶抗原存在下多價(jià)接合共同靶抗原，從而引起非特異性活化和潛在毒性。本發(fā)明通過(guò)引入能夠共接合不同靶抗原的新型雙特異性抗體形式解決了這一問(wèn)題。

發(fā)明概述

因此，本發(fā)明提供了結(jié)合至CD3和CD38的異二聚體抗體。這些異二聚體抗體包含第一重鏈，所述第一重鏈包含第一可變Fc結(jié)構(gòu)域及結(jié)合CD3的單鏈Fv區(qū)(scFv)。這些異二聚體抗體還包含第二重鏈，所述第二重鏈包含第二Fc可變Fc結(jié)構(gòu)域和第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域。這些異二聚體抗體另外包含第一輕鏈，所述第一輕鏈包含第一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域和第二恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域，其中所述第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域和所述第一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域結(jié)合至CD38。

在另一方面，本發(fā)明提供了選自由以下組成的組的異二聚體抗體：XENP13243；XENP13545；XENP13546；XENP13547；XENP13548；XENP13549；XENP13550；XENP13551；XENP13544；XENP13752；XENP13753；XENP13754；XENP13756；XENP13757；及XENP13694。

在又一方面，所述scFv具有了包含以下的序列：具有序列T-Y-A-M-Xaa1的vhCDR1，其中Xaa1是N、S或H(SEQ ID NO：435)；具有序列R-I-R-S-K-Xaa1-N-Xaa2-Y-A-T-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-S-V-K-G的vhCDR2，其中Xaa1是Y或A，Xaa2是N或S，Xaa3是Y或A并且Xaa4是D或A(SEQ ID NO：436)；具有序列H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y的vhCDR3，其中Xaa1是N、D或Q并且Xaa2是A或D(SEQ ID NO：437)；具有序列Xaa1-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N的vlCDR1，其中Xaa1是G、R或K，Xaa2是T或S，Xaa3是S或G并且Xaa4是N或H(SEQ ID NO：438)；具有序列Xaa1-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3的vlCDR2，其中Xaa1是G或D，Xaa2是K或N，并且Xaa3是P或S(SEQ ID NO：439)；及具有序列Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V的vlCDR3，其中Xaa1是A或L并且Xaa2是L或H(SEQ ID NO：440)。

在另一方面，scFv選自由H1.30_L1.47、H1.33_L1.47及H1.31_L1.47組成的組。

在另一方面，抗CD3可變區(qū)具有選自由以下組成的組的序列：

a)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

b)包含了具有SEQ ID NO：412的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

c)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：414的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

d)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：417的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

e)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：418的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

f)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：421的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

g)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：422的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

h)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：427的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

i)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：428的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

j)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：431的vlCDR3的序列；

k)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

1)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：423的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：432的vlCDR3的序列；

m)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：424的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：432的vlCDR3的序列；

n)包含了具有SEQ ID NO：412的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：417的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

o)包含了具有SEQ ID NO：412的vhCDR1、具有SEQ ID NO：414的vhCDR2、具有SEQ ID NO：419的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

p)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：415的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

q)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：415的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

r)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：417的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

s)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：419的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列；

t)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：417的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：433的vlCDR3的序列；

u)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：413的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：433的vlCDR3的序列；及

v)包含了具有SEQ ID NO：411的vhCDR1、具有SEQ ID NO：434的vhCDR2、具有SEQ ID NO：416的vhCDR3、具有SEQ ID NO：420的vlCDR1、具有SEQ ID NO：425的vlCDR2及具有SEQ ID NO：430的vlCDR3的序列。

在另一方面，抗CD3可變區(qū)包含了選自由以下組成的組的可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)：

SEQ ID NO：5和6；SEQ ID NO：9和10；SEQ ID NO：13和14；SEQ ID NO：17和18；SEQ ID NO：21和22；SEQ ID NO：25和26；SEQ ID NO：29和30；SEQ ID NO：33和34；SEQ ID NO：37和38；SEQ ID NO：41和42；SEQ ID NO：45和46；SEQ ID NO：49和50；SEQ ID NO：53和54；SEQ ID NO：57和58；SEQ ID NO：61和62；SEQ ID NO：65和66；SEQ ID NO：69和70；SEQ ID NO：73和74；SEQ ID NO：77和78；SEQ ID NO：81和82；SEQ ID NO：85和86；SEQ ID NO：89和90；SEQ ID NO：93和94；SEQ ID NO：97和98；SEQ ID NO：101和102；SEQ ID NO：105和106；SEQ ID NO：109和110；SEQ ID NO：113和114；SEQ ID NO：117和118；SEQ ID NO：121和122；SEQ ID NO：125和126；SEQ ID NO：129和130；SEQ ID NO：133和134；SEQ ID NO：137和138；SEQ ID NO：141和142；SEQ ID NO：145和146；SEQ ID NO：149和150；SEQ ID NO：153和154；SEQ ID NO：157和158；SEQ ID NO：161和162；SEQ ID NO：165和166；SEQ ID NO：169和170；SEQ ID NO：173和174；SEQ ID NO：177和178；SEQ ID NO：181和182；SEQ ID NO：185和186；SEQ ID NO：189和190；SEQ ID NO：193和194；SEQ ID NO：197和198；SEQ ID NO：201和202；SEQ ID NO：205和206；SEQ ID NO：209和210；SEQ ID NO：213和214；SEQ ID NO：217和218；SEQ ID NO：221和222；SEQ ID NO：225和226；SEQ ID NO：229和230；SEQ ID NO：233和234；SEQ ID NO：237和238；SEQ ID NO：241和242；SEQ ID NO：245和246；SEQ ID NO：249和250；SEQ ID NO：253和254；SEQ ID NO：257和258；SEQ ID NO：261和262；SEQ ID NO：265和266；SEQ ID NO：269和270；SEQ ID NO：273和274；SEQ ID NO：277和278；SEQ ID NO：281和282；SEQ ID NO：285和286；SEQ ID NO：289和290；SEQ ID NO：293和294；SEQ ID NO：297和298；SEQ ID NO：301和302；SEQ ID NO：305和306；SEQ ID NO：309和310；SEQ ID NO：313和314；SEQ ID NO：317和318；SEQ ID NO：321和322；SEQ ID NO：325和326；SEQ ID NO：329和330；SEQ ID NO：333和334；SEQ ID NO：337和338；SEQ ID NO：341和342；SEQ ID NO：345和346；SEQ ID NO：349和350；SEQ ID NO：353和354；SEQ ID NO：357和358；SEQ ID NO：361和362；SEQ ID NO：365和366；SEQ ID NO：369和370；SEQ ID NO：373和374；SEQ ID NO：377和378；SEQ ID NO：381和382；SEQ ID NO：385和386；SEQ ID NO：389和390；SEQ ID NO：393和394；SEQ ID NO：397和398；SEQ ID NO：401和402；SEQ ID NO：405和406；SEQ ID NO：409和410。

在另一方面，所述異二聚體抗體具有的第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域和第一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域選自由以下組成的對(duì)：H1與L1；H1與L1.24；H1與L1.96；H1.77與L1.96；H1.77與L1.97；H1.72與L1.97；H1.71與L1.96；及H1.77與L1.24。

在另一方面，本發(fā)明提供了如以上所述的異二聚體抗體，其中scFv具有帶電的scFv連接子。所述帶電的scFv連接子可以具有3至8個(gè)正電荷，并且選自由SEQ ID NO：443至451組成的組。

在另一方面，scFv具有選自由以下組成的組的序列：SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：52；SEQ ID NO：56；SEQ ID NO：60；SEQ ID NO：64；SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：72；SEQ ID NO：76；SEQ ID NO：80；SEQ ID NO：84；SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：92；SEQ ID NO：96；SEQ ID NO：100；SEQ ID NO：104；SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：112；SEQ ID NO：116；SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：124；SEQ ID NO：128；SEQ ID NO：132；SEQ ID NO：136；SEQ ID NO：140；SEQ ID NO：144；SEQ ID NO：148；SEQ ID NO：152；SEQ ID NO：156；SEQ ID NO：160；SEQ ID NO：164；SEQ ID NO：168；SEQ ID NO：172；SEQ ID NO：176；SEQ ID NO：180；SEQ ID NO：184；SEQ ID NO：188；SEQ ID NO：192；SEQ ID NO：196；SEQ ID NO：200；SEQ ID NO：204；SEQ ID NO：208；SEQ ID NO：212；SEQ ID NO：216；SEQ ID NO：220；SEQ ID NO：224；SEQ ID NO：228；SEQ ID NO：232；SEQ ID NO：236；SEQ ID NO：240；SEQ ID NO：244；SEQ ID NO：248；SEQ ID NO：252；SEQ ID NO：256；SEQ ID NO：260；SEQ ID NO：264；SEQ ID NO：268；SEQ ID NO：272；SEQ ID NO：276；SEQ ID NO：280；SEQ ID NO：284；SEQ ID NO：288；SEQ ID NO：292；SEQ ID NO：296；SEQ ID NO：300；SEQ ID NO：304；SEQ ID NO：308；SEQ ID NO：312；SEQ ID NO：316；SEQ ID NO：320；SEQ ID NO：324；SEQ ID NO：328；SEQ ID NO：332；SEQ ID NO：336；SEQ ID NO：340；SEQ ID NO：344；SEQ ID NO：348；SEQ ID NO：352；SEQ ID NO：356；SEQ ID NO：360；SEQ ID NO：364；SEQ ID NO：368；SEQ ID NO：372；SEQ ID NO：376；SEQ ID NO：380；SEQ ID NO：384；SEQ ID NO：388；SEQ ID NO：392；SEQ ID NO：396；SEQ ID NO：400；SEQ ID NO：404；SEQ ID NO：408。

在另一方面，重鏈Fc區(qū)另外包含F(xiàn)cRn變體，包括但不限于，428L/434S。

在另一方面，本發(fā)明提供核酸組合物，所述核酸組合物包含：編碼第一重鏈的第一核酸，該第一重鏈包含F(xiàn)c區(qū)和結(jié)合至CD3的scFv；編碼第二重鏈的第二核酸，該第二重鏈包含恒定重鏈和可變重鏈；及編碼輕鏈的第三核酸，其中第二重鏈和輕鏈的Fv區(qū)結(jié)合CD38。這些核酸可以在不同表達(dá)載體中，或在同一表達(dá)載體中。本發(fā)明提供了包含所述核酸組合物的宿主細(xì)胞。

在另一方面，本發(fā)明提供了制造本發(fā)明的異二聚體抗體的方法，這些方法包括：提供第一表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含編碼第一重鏈的第一核酸，該第一重鏈包含第一Fc結(jié)構(gòu)域和第一可變重鏈；提供第二表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含編碼第二重鏈的第二核酸，該第二重鏈包含第一Fc結(jié)構(gòu)域和結(jié)合CD3的單鏈Fv區(qū)(scFv)；及提供第三表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括含輕鏈的核酸；其中所述第一可變重鏈和所述輕鏈的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域結(jié)合CD38。第一表達(dá)載體、第二表達(dá)載體及第三表達(dá)載體以選自由以下組成的組的比率轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中：1∶1.5∶1.5、1∶2∶1.5、1∶0.667∶2、1∶1∶2、1∶1.5∶2及1∶2∶2。在宿主細(xì)胞中表達(dá)第一表達(dá)載體、第二表達(dá)載體及第三表達(dá)載體，分別產(chǎn)生第一氨基酸序列、第二氨基酸序列及第三氨基酸序列，由此所述第一氨基酸序列、所述第二氨基酸序列及所述第三氨基酸序列形成異二聚體抗體。

在另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)施用根據(jù)本發(fā)明的異二聚體抗體來(lái)治療有需要的患者的方法。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A和1B描繪了人類CD38的序列。圖1A描繪全長(zhǎng)序列，并且圖1B描繪細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。

圖2描繪人類CD3序列。

圖3A至3YY描繪穩(wěn)定性優(yōu)化的人源化抗CD3變體scFv、可變重鏈序列及可變輕鏈序列的氨基酸序列。(另外，應(yīng)注意，為便于純化，第一序列是組氨酸標(biāo)記形式)。CDR加下劃線。應(yīng)理解，優(yōu)化的可變鏈和優(yōu)化的輕鏈(以及scFv鏈)的穩(wěn)定性增加可以歸于構(gòu)架區(qū)以及CDR。因此，應(yīng)理解，公開的完整可變區(qū)包括公開的構(gòu)架區(qū)，不過(guò)構(gòu)架區(qū)未獨(dú)立編號(hào)。此外，scFv連接子以灰色示出。每個(gè)scFv連接子都可以用圖5中所描繪的帶電的scFv連接子替代。也就是說(shuō)，可以用任何帶電的scFv連接子，無(wú)論是帶正電或是帶負(fù)電，包括圖5中描繪的那些，取代圖3A至3YY中突出顯示的區(qū)域。

圖4A至4I描繪了可用于本發(fā)明中的所有CD3 vhCDR1-3和vlCDR1-3序列與共同CDR的組合。

圖5描繪了適合的帶正電和帶負(fù)電的scFv連接子。帶單一電荷的單一現(xiàn)有技術(shù)scFv連接子被Whitlow等人，Protein Engineering6(8)：989-995(1993)稱為“Whitlow”。應(yīng)注意，此連接子在scFv中用于減少聚集及增強(qiáng)蛋白水解穩(wěn)定性。

圖6A、6B、6C及6D描繪新型空間變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，各表的第一欄表示“對(duì)應(yīng)的”單體對(duì)；也就是說(shuō)，單體1具有405A并且對(duì)應(yīng)的空間變體是394F。值得關(guān)注的是，在不對(duì)稱三F形式的情況下，任一單體可以具有任一變體。也就是說(shuō)，scFv單體可以是單體1或單體2。另外，這些集合可以任選并且獨(dú)立地與其它空間變體以及包括電荷對(duì)、同型變體、等排變體、pI變體等在內(nèi)的其它雜二聚化變體組合，只要保持某種“鏈型”即可。此外，“單體”是指Fc結(jié)構(gòu)域；也就是說(shuō)，在三F形式中，一個(gè)單體是scFv構(gòu)建體并且另一個(gè)單體是Fab構(gòu)建體，不過(guò)實(shí)際上有兩個(gè)氨基酸序列構(gòu)成Fab構(gòu)建體(重鏈和輕鏈)的事實(shí)顯示許多適合的空間或“偏向(skew)”變體適用于本發(fā)明中。圖a6描繪了多種空間變體，這些變體可以單獨(dú)使用或與pI變體(實(shí)際上圖6中的所有變體)組合使用；不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，如果存在pI變體，那么應(yīng)保持pI變體和空間變體的“鏈型”。也就是說(shuō)，如果例如將pI變體S364K/E357Q(單體1)和L368D/K370S(單體2)與圖29C變體組合，那么空間變體的pI應(yīng)當(dāng)予以考慮并指定給正確的單體。也就是說(shuō)，例如，將改變電荷的空間變體(T411E)添加至“負(fù)值”單體中。

圖7描繪了一系列工程改造的異二聚體偏向(例如“空間異二聚化”)Fc變體以及異二聚體產(chǎn)率(通過(guò)HPLC-CIEX測(cè)定)和熱穩(wěn)定性(通過(guò)DSC測(cè)定)。未測(cè)定的熱穩(wěn)定性以“n.d.”表示。

圖8A至8C.示出“三F形式”的雙特異性免疫球蛋白。圖8A顯示scFv-Fc形式。圖8C描繪了更標(biāo)準(zhǔn)的雙特異性抗體形式，也利用了本發(fā)明的pI變體(以及任選并且獨(dú)立地其它異二聚化變體)。圖8B顯示“三F”形式(有時(shí)也稱為“開瓶器”構(gòu)型；(以及任選并獨(dú)立地其它異二聚化變體)。本文所列的許多實(shí)施方案具有雙特異性抗體的抗CD3組分作為scFv，以及抗CD38組分作為Fab片段，不過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些可以調(diào)換，其中抗CD38組分是scFv，任選地具有帶電的連接子，并且本文中的抗CD3序列scFv的Fv區(qū)被重新工程改造成Fab片段。

圖9描繪了用以減少與部分或全部FcγR受體的結(jié)合的多種適合的“基因敲除”(“KO”)變體。本文的許多變體(如果不是全部變體的)是KO變體，這些KO變體可以獨(dú)立地并且任選地與圖9中所描述的集合組合，以及與包括空間變體和pI變體在內(nèi)的本文所略述的任何異二聚化變體組合。舉例來(lái)說(shuō)，E233P/L234V/L235A/G236del可以與清單中的任何其它單一或雙重變體組合。此外，盡管在一些實(shí)施方案中優(yōu)選兩個(gè)單體含有相同的KO變體，但可能的情況是，在不同單體上組合不同的KO變體，并且僅有一個(gè)單體包含KO變體。另參看USSN61/913,870的附圖和圖例，所有這些都以引用的方式整體明確地并入，就如同其提及“基因敲除”或“切除”變體。

圖10顯示了一系列工程改造的異二聚體偏向Fc變體以及異二聚體產(chǎn)率(通過(guò)HPLC-CIEX測(cè)定)和熱穩(wěn)定性(通過(guò)DSC測(cè)定)。未測(cè)定的熱穩(wěn)定性以“n.d.”表示。

圖11.顯示抗CD38 x抗CD3雙特異性分子的結(jié)構(gòu)的示意圖。

圖12.親和力/穩(wěn)定性工程改造的變體抗CD38 x抗CD3雙特異性分子的表面等離子體共振(SPR)數(shù)據(jù)。

圖13.熒光LDH重定向T細(xì)胞的細(xì)胞毒性(RTCC)檢定，顯示了抗CD28 x抗CD3雙特異性分子對(duì)RPMI8226多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用。

圖14.RTCC檢定(膜聯(lián)蛋白(Annexin)V+)，顯示了抗CD38 x抗CD3雙特異性分子對(duì)RPMI8226多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用。T細(xì)胞與RPMI8226細(xì)胞的比率及培育時(shí)間有所變化。

圖15.列出親和力/穩(wěn)定性工程改造的變體抗CD38 x抗CD3雙特異性分子的特性的表格。編號(hào)是依據(jù)Kabat。

圖16.抗CD38 x抗CD3雙特異性分子與食蟹猴CD20+細(xì)胞的結(jié)合。

圖17.在移植huPBMC的SCID小鼠中抗CD38 x抗CD3雙特異性分子殺傷人漿細(xì)胞。觀察到人IgG2和IgE同型顯著減少。示出第22天的平均值±SEM。BLQ對(duì)于IgG2是＜1μg/mL，而對(duì)于IgE是＜16ng/mL。低于BLQ的數(shù)據(jù)點(diǎn)指定為BLQ值。

圖18.在移植huPBMC的SCID小鼠中抗CD38 x抗CD3雙特異性分子殺傷人漿細(xì)胞。觀察到人IgM顯著減少。示出第22天的平均值±SEM。IgM的BLQ是＜0.03μg/mL。低于BLQ的數(shù)據(jù)點(diǎn)指定為BLQ值。

圖19.抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體清除MM PBMC中的CD38+CD138+細(xì)胞。

圖20A至20Q顯示了本發(fā)明的CD38 X CD3scFv開瓶器的序列。

圖21顯示CD38 X CD3開瓶器的一些有用Fc結(jié)構(gòu)域的變體。

圖22A和22B描繪了抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體XENP13243和XENP13551的氨基酸序列，其中CDR加下劃線并且存在帶電連接子(連接子可以是不帶電的或被任何其它帶正電或帶負(fù)電的連接子取代，見圖7)。

圖23A、23B、23C及23D顯示了編碼抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體XENP13243和XENP13551的DNA序列。

圖24顯示了用于產(chǎn)生XENP13243和XENP13551的穩(wěn)定庫(kù)的DNA轉(zhuǎn)染比率表。列出了HC-Fab、HC-scFv及LC中轉(zhuǎn)染的DNA的相對(duì)量。

圖25A、25B、25C及25D描繪了通過(guò)蛋白質(zhì)A從XENP13243和XENP13551分批培養(yǎng)7天后收集的穩(wěn)定庫(kù)上清液中純化的物質(zhì)的陽(yáng)離子交換色譜圖。DNA轉(zhuǎn)染比率如圖24中所列。標(biāo)出積分峰面積。

圖26.由圖25中所示的陽(yáng)離子交換色譜圖鑒別的穩(wěn)定庫(kù)所產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)種類的概述。DNA轉(zhuǎn)染比率如圖24中所列。

圖27.在C57BL/6小鼠(n＝5只小鼠/組)中抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體XENP13243和XENP13551的藥物動(dòng)力學(xué)。通過(guò)非房室分析計(jì)算的半衰期值在圖例中注明。

圖28.CD38+RPMI8226細(xì)胞的重定向T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。檢定由在37℃下10,000個(gè)RPMI8226細(xì)胞與400,000個(gè)純化的人類T細(xì)胞一起培育24小時(shí)組成。通過(guò)乳酸脫氫酶(LDH)讀取細(xì)胞毒性。

圖29.通過(guò)表面等離子體共振測(cè)定的人和食蟹猴CD38和CD3與XENP13243和XENP13551的結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。檢定方式如所述。

圖30.XENP13243(上圖)和XENP13551(下圖)清除食蟹猴中的CD20-CD38+細(xì)胞。

圖31.XENP13243(上圖)和XENP13551(下圖)上調(diào)食蟹猴CD8+T細(xì)胞中的CD69。

圖32描繪了等排變體抗體恒定區(qū)及其對(duì)應(yīng)取代的清單。pI_(-)表示pI較低的變體，而pI_(+)表示pI較高的變體。這些變體可以任選并且獨(dú)立地與本發(fā)明的其它異二聚化變體組合。

圖33顯示了特定抗CD3scFv的一些帶電的連接子和數(shù)據(jù)。

圖34描繪了與使用分離變體(本文中又稱“pI變體”)及與異二聚體組裝變體(本文中又稱為“偏向變體”)的組合有關(guān)的示意圖。這些變體可以按“即插即用(plug and play)”形式使用，因?yàn)檫@些變體的作用易于轉(zhuǎn)移到具有不同F(xiàn)v區(qū)的不同抗體中并且非常穩(wěn)定。

圖35描繪了共用抗CD3 scFv-Fc的優(yōu)化。以多種方式增加穩(wěn)定性，包括置換稀有氨基酸；用不常見的接觸殘基置換氨基酸；進(jìn)行連接子工程改造(用于穩(wěn)定性和增進(jìn)純化，例如帶電scFv連接子)；及轉(zhuǎn)變成VL-VH取向。

圖36描繪了使用保持野生型穩(wěn)定性但去除所有FcγR結(jié)合的Fc基因敲除(或切除變體)。

圖37描繪了抗CD3 X抗CD38開瓶器形式的體外殺傷和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。

圖38描繪了人骨髓瘤細(xì)胞系的殺傷。XmAb13551對(duì)CD3具有高親和力，而XmAb13243具有較低親和力。達(dá)雷木單抗(Daratumumab)是抗CD38二價(jià)單特異性抗體。

圖39顯示了在小鼠中本發(fā)明的開瓶器雙特異性抗體的長(zhǎng)半衰期活性及人Ig的相應(yīng)抑制作用。

圖40顯示了XmAb13551和XmAb13243的抗CD38 X抗CD3功能，包括在血液和骨髓中猴CD38+細(xì)胞的清除。

圖41顯示，CD38+細(xì)胞清除與T細(xì)胞再分布和活化相關(guān)。

圖42顯示了用于產(chǎn)生XmAb13551(高CD3親和力)的穩(wěn)定細(xì)胞系的開發(fā)及其相應(yīng)產(chǎn)率。

圖43顯示了用于改善產(chǎn)率進(jìn)行的一些細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化，其中獲得的滴度≥3g/L，并且通過(guò)按比例放大未見到異二聚體/同二聚體比率的顯著差異。

圖44顯示由三步制造工藝得到的分析結(jié)果。該工藝產(chǎn)生極純異二聚體雙特異性分子的產(chǎn)率較高，超過(guò)55％，并且有效地去除同二聚體、HMW及LMW污染物，以及HCP。

圖45A至45U顯示了多種另外的異二聚化形式，其中任一種可以包括本發(fā)明的抗CD3和抗CD38序列。圖45A至45U描繪了多種多特異性(例如異二聚化)形式及可以用于本發(fā)明中的不同類型異二聚化變體(這些在本文中有時(shí)稱為“異二聚體支架”)的組合。此外，應(yīng)注意，所有這些形式都可以包括在Fc區(qū)中的添加變體(如以下更完整地論述)，包括“切除”或“基因敲除”變體(圖7)、改變FcγR(FcγRIIb、FcγRIIIa等)結(jié)合的Fc變體、改變與FcRn受體的結(jié)合的Fc變體等。圖45A顯示了雙scFv-Fc形式，與本文中的所有異二聚體化形式相同，該形式可以包括異二聚化變體，如pI變體、鈕與孔(KIH，在本文中又稱為空間變體或“偏向”變體)、電荷對(duì)(一小組空間變體)、等排變體，及SEED體(“鏈交換工程改造結(jié)構(gòu)域”；參見Klein等人，mAbs 4：6653-663(2012)，及Davis等人，Protein Eng Des Sel 201023：195-202)，此形式是基于人IgG和IgA的CH3結(jié)構(gòu)域不彼此結(jié)合的事實(shí)。圖45B描繪了雙特異性IgG，以及多種異二聚化變體的選擇。圖45C描繪了DVD-Ig的“單臂”形式，其利用了兩個(gè)不同的可變重鏈結(jié)構(gòu)域和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。圖45D類似，不過(guò)可變重鏈和輕鏈在重鏈對(duì)面，而非“空臂”。圖45E一般稱為“mAb-Fv”。圖45F描繪了多scFv形式；本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，類似于本文所論述的“A、B、C、D”形式，可能存在許多相連的scFv(或就這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，任何其它結(jié)合配體或功能性)。因此，圖45F可以具有1、2、3或4個(gè)scFv(例如對(duì)于雙特異性抗體，scFv可以是“順式”或“反式”的，或者都在分子的一“端”上)。圖45G描繪了異二聚體FabFc，其中Fab是由兩個(gè)不同的重鏈形成，一個(gè)含有重鏈Fab序列，而另一個(gè)含有輕鏈Fab序列。圖45H描繪了“單臂Fab-Fc”，其中一條重鏈包含F(xiàn)ab。圖45I描繪了“單臂scFv-Fc”，其中一條重鏈Fc包含scFv，而另一條重鏈?zhǔn)恰翱盏摹?。圖45J顯示了scFv-CH3，其中僅使用重鏈CH3區(qū)，各自具有其自身的scFv。圖45K描繪了mAb-scFv，其中該分子的一端二價(jià)接合抗原，并且在一條重鏈上使用scFv單價(jià)接合。圖45L描繪相同結(jié)構(gòu)，但兩條重鏈都包含另外的scFv，這些scFv可以結(jié)合同一抗原或不同抗原。圖45M顯示“CrossMab”結(jié)構(gòu)，其中由兩條不同輕鏈引起的復(fù)合體形成的問(wèn)題通過(guò)變換Fab部分中的序列而得到解決。圖45N描繪scFv，圖45O是以本文略述的連接子連接的“BiTE”或scFv-scFv，圖45P描繪DART，圖45Q描繪TandAb，并且圖45R顯示雙功能抗體。圖45S、45T及45U描繪了用于本發(fā)明中的另外的替代性支架形式。

圖46A、46B及46C描繪了穩(wěn)定性優(yōu)化的人源化抗CD3變體scFv。取代是相對(duì)于H1.1_L1.4scFv序列給出。氨基酸編號(hào)是Kabat編號(hào)。

圖47A和47B.用于本發(fā)明中的抗CD3序列的可變重鏈和可變輕鏈，包括“較強(qiáng)”和“較弱”結(jié)合序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些可以在Fab或scFv構(gòu)建體中與任何靶腫瘤抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合使用。

圖48顯示了在Biacore檢定中的結(jié)合親和力。

圖49顯示了在使用不同的輕鏈、Fab-Fc和scFv-Fc比率產(chǎn)生穩(wěn)定庫(kù)期間的異二聚體純度。

圖50.在huPBMC小鼠模型中抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體的人IgM和IgG2清除作用。

圖51A和51B顯示了針對(duì)CD38所設(shè)計(jì)的分別具有低親和力和高親和力的XENP13243和XENP13551的純化。

圖52A、52B及52C顯示了與人和猴CD38和CD3的結(jié)合，及Kd。

圖53顯示了骨髓瘤細(xì)胞的殺傷。

圖54顯示，T細(xì)胞是連環(huán)殺傷細(xì)胞，即使在靶細(xì)胞數(shù)量較多時(shí)也是如此。

圖55顯示，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域延長(zhǎng)半衰期。

圖56顯示了圖14實(shí)驗(yàn)的劑量。

圖57顯示相對(duì)于達(dá)雷木單抗更高的hIg清除率。

圖58顯示了圖16實(shí)驗(yàn)的劑量。

圖59A和59B雙特異性抗體清除猴血液和淋巴系器官中的CD38+細(xì)胞。

圖60A、60B及60C。圖60A(由血液再分布)，圖60B(CD69誘導(dǎo))及圖60C(細(xì)胞因子釋放)顯示，CD38+細(xì)胞清除與T細(xì)胞再分布和活化有關(guān)。

圖61描繪了本發(fā)明的具體應(yīng)用的若干實(shí)施方案。

發(fā)明詳述

I.綜述，

本發(fā)明針對(duì)能提供同時(shí)結(jié)合到CD3和CD38抗原的雙特異性抗體的新型構(gòu)建體?？贵w技術(shù)面臨的一個(gè)問(wèn)題是需要同時(shí)結(jié)合到兩種(或更多種)不同抗原的“雙特異性”(和/或多特異性)抗體，由此大體上使不同抗原能接近并產(chǎn)生新的功能和新的療法。一般來(lái)說(shuō)，這些抗體是通過(guò)在宿主細(xì)胞中包括每一重鏈和輕鏈的基因來(lái)產(chǎn)生。由此一般會(huì)形成期望的異二聚體(A-B)以及兩個(gè)同二聚體(A-A和B-B)。然而，形成多特異性抗體的一個(gè)主要難點(diǎn)在于，難以純化分離異二聚體抗體與同二聚體抗體，和/或相對(duì)于形成同二聚體，傾向于形成異二聚體。

本發(fā)明大體上針對(duì)產(chǎn)生異二聚體蛋白質(zhì)，如能夠基于恒定區(qū)中的氨基酸變體以若干方式共接合抗原的抗體，所述恒定區(qū)的氨基酸變體在每條鏈上不同，由此促進(jìn)異二聚體形成和/或相對(duì)于同二聚體，能夠容易地純化出異二聚體。

因此，本發(fā)明針對(duì)共接合至少第一抗原和第二抗原的新型免疫球蛋白組合物。本發(fā)明的第一抗原和第二抗原在本文中分別稱為抗原-1和抗原-2?？贵w的一條重鏈含有單鏈Fv(“scFv”，如下文所定義)，而另一重鏈?zhǔn)恰俺Ｒ?guī)”Fab形式，包含可變重鏈和輕鏈。這一結(jié)構(gòu)在本文中有時(shí)稱為“三F”形式(scFv-FAb-Fc)或“開瓶器”形式，因?yàn)榭雌饋?lái)與開瓶器大致類似(參見附圖)。兩條鏈通過(guò)使用恒定區(qū)(例如Fc結(jié)構(gòu)域和/或鉸鏈區(qū))中的氨基酸變體連在一起，所述氨基酸變體促進(jìn)異二聚體抗體的形成，如以下更完整地描述。

本發(fā)明的“三F”形式具有若干不同益處。如本領(lǐng)域中所知，基于兩個(gè)scFv構(gòu)建體的抗體類似物通常存在穩(wěn)定性和聚集問(wèn)題，這些問(wèn)題可以在本發(fā)明中通過(guò)添加“常規(guī)”重鏈和輕鏈配對(duì)得到緩解。此外，與基于兩條重鏈和兩條輕鏈的形式相對(duì)，不存在重鏈與輕鏈配對(duì)不正確(例如重鏈1與輕鏈2配對(duì)等)的問(wèn)題。

可以使用多種機(jī)制來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的異二聚體。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解并且如下文更完整地描述，這些機(jī)制可以組合以確保高度異二聚化。

一種機(jī)制在本領(lǐng)域中一般稱為“鈕與孔(knobs and holes)”(“KIH”)，或在本文中有時(shí)稱為“偏向”變體，還可以任選使用提及的氨基酸工程改造以產(chǎn)生有利于異二聚體形成，而不利于同二聚體形成的空間影響；這有時(shí)稱為“鈕與孔”，如USSN 61/596，846；Ridgway等人，Protein Engineering 9(7)：617(1996)；Atwell等人，J.Mol.Biol.1997 270：26；美國(guó)專利號(hào)8,216,805中所描述，其全部以引用的方式整體并入本文中。附圖標(biāo)識(shí)眾多基于“鈕與孔”的“單體A-單體B”對(duì)。此外，如Merchant等人，Nature Biotech.16：677(1998)中所描述，這些“鈕與孔”突變可以與二硫鍵組合以偏向形成異二聚化。

用于產(chǎn)生異二聚體的另一機(jī)制有時(shí)稱為“靜電鑲飾(electrostatic s teering)”，如Gunasekaran等人，J.Biol.Chem.285(25)：19637(2010)(以引用的方式整體并入本文中)所描述。這在本文中有時(shí)稱為“電荷對(duì)”。在這一實(shí)施方案中，使用了靜電試劑來(lái)使形成偏向異二聚化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些還可能影響pI，并由此影響純化，因此在一些情形中還可以視為pI變體。然而，由于這些靜電試劑強(qiáng)迫異二聚化并且不被用作純化工具，故其被歸類為“空間變體”。這些包括但不限于，D221E/P228E/L368E與D221R/P228R/K409R的配對(duì)(例如，這些是“單體對(duì)應(yīng)集合”)及C220E/P228E/368E與C220R/E224R/P228R/K409R的配對(duì)。(應(yīng)注意，重鏈和輕鏈二硫鍵的形成不再需要220突變?nèi)コ腚装彼?，以下將更完整地描?。

在本發(fā)明中，有若干基本機(jī)制可以便利異二聚體蛋白質(zhì)的純化，一種機(jī)制基于使用pI變體，以使每一單體具有不同pI，由此允許A-A、A-B及B-B二聚體蛋白質(zhì)的等電純化。作為替代方案，“三F”形式還允許基于尺寸進(jìn)行分離。如下文進(jìn)一步略述，相對(duì)于同二聚體，使形成“偏向”異二聚體也是可能的(如下文大體上略述)。因此，空間異二聚化變體與pI或電荷對(duì)變體的組合特別適用于本發(fā)明。另外，如以下更完整地略述，三F形式的scFv單體可以包括帶電的scFv連接子(帶正電或帶負(fù)電)，由此進(jìn)一步增進(jìn)pI以達(dá)到純化目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，一些三F形式可以使用帶電的scFv連接子，不必額外的pI調(diào)整，而本發(fā)明也的確使用了含帶電的scFv連接子的偏向變體(及Fc、FcRn與KO變體的組合)。

在利用pI作為分離機(jī)制以產(chǎn)生異二聚體三F形式的本發(fā)明中，可以將氨基酸變體引入一個(gè)或兩個(gè)單體多肽中；也就是說(shuō)，一個(gè)單體(在本文中簡(jiǎn)稱為“單體A”)的pI可以工程改造成與單體B不同，或單體A與單體B都變?yōu)閹щ姷模渲袉误wA的pI增加，而單體B的pI降低。如以下更完整地略述，任一單體或兩個(gè)單體的pI變化可以通過(guò)去除或添加帶電殘基(例如，中性氨基酸被帶正電或帶負(fù)電的氨基酸殘基置換，例如甘氨酸被谷氨酸置換)、將帶電殘基由帶正電或帶負(fù)電變?yōu)閹喾措姾?天冬氨酸變?yōu)橘嚢彼?，或?qū)щ姎埢優(yōu)橹行詺埢?例如，失去電荷；賴氨酸變?yōu)榻z氨酸)來(lái)進(jìn)行。這些變體中有許多顯示于附圖中。

因此，在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中，提供在至少一個(gè)單體中引起足夠pI變化，以使得異二聚體可以與同二聚體分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，并且如以下進(jìn)一步論述，這可以通過(guò)使用“野生型”重鏈恒定區(qū)及工程改造成增加或降低其pI的變體區(qū)(wt A-+B或wt A--B)，或通過(guò)增加一個(gè)區(qū)并降低另一區(qū)(A+ -B-或A- B+)來(lái)進(jìn)行。應(yīng)注意，在這一論述中，哪一單體包含scFv并且哪一單體包含F(xiàn)ab并不重要。

因此，一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的一種組分是在抗體恒定區(qū)中的氨基酸變體，這些變體是針對(duì)通過(guò)在一個(gè)或兩個(gè)單體中并入氨基酸取代(“pI變體”或“pI取代”)來(lái)改變二聚體蛋白質(zhì)的至少一個(gè)(如果不是兩個(gè))單體的等電點(diǎn)(pI)，由此形成“pI異二聚體”(當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是抗體時(shí)，這些稱為“pI抗體”)。如本文所示，如果兩個(gè)單體的pI相差低至0.1個(gè)pH單位，就可以實(shí)現(xiàn)異二聚體與兩個(gè)同二聚體的分離，并且0.2、0.3、0.4及0.5或更高pH單位差異全部用于本發(fā)明中。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，為實(shí)現(xiàn)良好分離而在一個(gè)或兩個(gè)單體上包括的pI變體的數(shù)量將部分取決于所關(guān)注的scFv和Fab的起始pI。也就是說(shuō)，為了確定哪一單體經(jīng)歷工程改造或沿哪一“方向”(例如，帶更高正電或帶更高負(fù)電)，對(duì)兩個(gè)靶抗原的Fv序列進(jìn)行計(jì)算并由此作出決定。如本領(lǐng)域中所知，不同的Fv將具有不同的起始pI，這一點(diǎn)被用于本發(fā)明中。一般來(lái)說(shuō)，如本文所略述，pI被工程改造成使每一單體的總pI差異是至少約0.1log，其中0.2至0.5是優(yōu)選的(如本文所略述)。

另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解并且如本文所略述，可以基于尺寸來(lái)分離異二聚體與同二聚體。舉例來(lái)說(shuō)，如圖8中所示，具有兩個(gè)scFv的異二聚體(圖8A)可以與“三F”形式的異二聚體(圖8B)和雙特異性mAb(圖8C)分離。這可以進(jìn)一步用于更高價(jià)態(tài)中，其中利用了另外的抗原結(jié)合位點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，如另外顯示，一個(gè)單體將具有兩個(gè)Fab片段，并且另一個(gè)將具有一個(gè)scFv，由此產(chǎn)生尺寸差異和分子量差異。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解并且如本文所略述，本文略述的形式還可以擴(kuò)展以提供三特異性和四特異性抗體。在這一實(shí)施方案(其中一些變化描繪于附圖中)中，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，一些抗原可以是二價(jià)結(jié)合的(例如，兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)針對(duì)單一抗原；例如，A和B可以是典型二價(jià)締合的一部分并且C和D可以任選地存在并且任選相同或不同)。應(yīng)理解，可以利用Fab與scFv的任何組合以實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果和組合。

在使用pI變體實(shí)現(xiàn)異二聚化的情況下，通過(guò)使用重鏈恒定區(qū)，又提供一種模塊化方法來(lái)設(shè)計(jì)并純化多特異性蛋白質(zhì)，包括抗體。因此，在一些實(shí)施方案中，異二聚化變體(包括偏向和純化異二聚化變體)未包括在可變區(qū)中，因此，每一個(gè)別抗體必須經(jīng)過(guò)工程改造。此外，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)輸入來(lái)自不同IgG同型的pI變體來(lái)改變pI，同時(shí)不會(huì)引入顯著免疫原性，由此使得由pI變體產(chǎn)生免疫原性的可能性顯著降低。因此，另一有待解決的問(wèn)題是說(shuō)明具有高人類序列含量的低pI恒定結(jié)構(gòu)域，例如使任何特定位置處的非人類殘基最少或避免。

在一個(gè)實(shí)施方案中，異二聚體抗體使用scFv單價(jià)接合一個(gè)抗原，并且使用FAb單價(jià)接合另一抗原。如以下所略述，這一形式也可以變化；在一些實(shí)施方案中，三個(gè)抗原都是單價(jià)接合，有一個(gè)抗原是二價(jià)接合，而另一抗原是單價(jià)接合(例如，A和C接合相同抗原，而B接合不同抗原)等。

另外，可以利用這一pI工程改造得到的附帶益處是延長(zhǎng)血清半衰期和增加FcRn結(jié)合。也就是說(shuō)，如USSN 13/194,904(以引用的方式整體并入)中所描述，降低抗體恒定結(jié)構(gòu)域(包括抗體和Fc融合物中發(fā)現(xiàn)的那些)的pI可以延長(zhǎng)體內(nèi)血清保持。這些用于增加血清半衰期的pI變體還有助于改變pI以實(shí)現(xiàn)純化。

另外，如本文所略述，可以將另外的氨基酸變體引入本發(fā)明的雙特異性抗體中，以添加另外的功能。舉例來(lái)說(shuō)，可以添加(添加到一個(gè)單體或兩個(gè)單體中)Fc區(qū)內(nèi)的氨基酸改變以促進(jìn)ADCC或CDC的增加(例如改變與Fcγ受體的結(jié)合)；允許或增加毒素和藥物添加的產(chǎn)率(例如對(duì)于ADC)；以及增加與FcRn的結(jié)合，和/或增加所得分子的血清半衰期。如本文進(jìn)一步描述并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文略述的任何和所有變體都可以任選并且獨(dú)立地與其它變體組合。

類似地，另一類功能變體是“Fcγ切除變體”或“Fc基因敲除(FcKO或KO)變體”。在這些實(shí)施方案中，對(duì)于一些治療應(yīng)用，希望減少或去除Fc結(jié)構(gòu)域與一種或多種或者全部Fcγ受體(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常結(jié)合以避免另外的作用機(jī)制。也就是說(shuō)，例如，在許多實(shí)施方案中，一般希望切除FcγRIIIa結(jié)合以消除或顯著降低ADCC活性。

此外，本發(fā)明提供了新型人源化抗CD3序列，包括CDR集合、完整可變輕鏈和重鏈，以及相連的scFv，這些scFv可以任選包括帶電的scFv連接子。使用的這些優(yōu)化序列可以呈其它抗體形式。

本發(fā)明另外提供新型抗CD38序列，包括CDR集合、完整可變輕鏈和重鏈，以及相連的scFv，這些scFv可以任選包括帶電的scFv連接子。使用的這些優(yōu)化序列可以呈其它抗體形式。

因此，本發(fā)明提供了能產(chǎn)生同時(shí)結(jié)合至CD3和CD38的雙特異性、二價(jià)抗體的新型構(gòu)建體。

此外，本發(fā)明提供了具有不同親和力的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。也就是說(shuō)，對(duì)于抗CD3和抗CD38序列，在一些情形中，可能優(yōu)選較強(qiáng)親和力，而在其它情形中，可以使用較低親和力。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的抗體構(gòu)建體包含“強(qiáng)”或“高親和力”結(jié)合至CD3的抗CD3抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，一個(gè)實(shí)例是描繪為H1.30L1.47的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(適當(dāng)時(shí)，任選包括帶電連接子))。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的抗體構(gòu)建體包含“弱”或“低親和力”結(jié)合至CD3的抗CD3抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如圖47中所示。

II.定義

為了能更完全地了解本申請(qǐng)，以下陳述若干定義。這些定義意圖涵蓋語(yǔ)法等效物。

“切除”在本文中意思指活性的降低或去除。因此，例如，“切除FcγR結(jié)合”意思指相較于不含特定變體的Fc區(qū)，F(xiàn)c區(qū)氨基酸變體具有低于50％的起始結(jié)合，其中優(yōu)選低于70％、80％、90％、95％、98％的活性損失，并且一般來(lái)說(shuō)，在Biacore檢定中，活性低于可檢測(cè)的結(jié)合水平。當(dāng)使用切除變體(在本文中有時(shí)又稱“FcγR切除變體”、“Fc切除變體”、“Fc基因敲除”(“FcKO”)變體或“基因敲除”(“KO”)變體)時(shí)，具有特定應(yīng)用的變體是圖35中描繪的那些。

如本文所使用，“ADCC”或“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”意思指表達(dá)FcγR的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體并且隨后使靶細(xì)胞溶解的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。ADCC與結(jié)合至FcγRIIIa相關(guān)；增加與FcγRIIIa的結(jié)合引起ADCC活性的增加。

如本文所使用，“ADCP”或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用意思指表達(dá)FcγR的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體并且隨后吞噬靶細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。

“修飾”在本文中意思指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失，或針對(duì)以化學(xué)方式連接至蛋白質(zhì)的部分的改變。舉例來(lái)說(shuō)，修飾可以是附接至蛋白質(zhì)的碳水化合物或PEG結(jié)構(gòu)的改變。“氨基酸修飾”在本文中意思指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。為清楚起見，除非另外說(shuō)明，否則氨基酸修飾通常是針對(duì)DNA編碼的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密碼子的20種氨基酸。

“氨基酸取代”或“取代”在本文中意思指親本多肽序列中特定位置處的氨基酸被不同氨基酸置換。確切地說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，取代是針對(duì)特定位置處非天然存在的氨基酸，這些氨基酸不是生物體內(nèi)天然存在的或是任何生物體中的。舉例來(lái)說(shuō)，取代E272Y是指272位的谷氨酸被酪氨酸置換的變體多肽，在此情形中是Fc變體。為清楚起見，蛋白質(zhì)被工程改造成改變核酸編碼序列但不改變起始氨基酸(例如CGG(編碼精氨酸)變?yōu)镃GA(仍編碼精氨酸)，用以增加宿主生物體表達(dá)水平)不是“氨基酸取代”；也就是說(shuō)，盡管產(chǎn)生了編碼同一蛋白質(zhì)的新基因，但如果該蛋白質(zhì)在其起始的特定位置處具有相同氨基酸，就不是氨基酸取代。

如本文所使用，“氨基酸插入”或“插入”意思指在親本多肽序列中的特定位置處添加氨基酸序列。舉例來(lái)說(shuō)，-233E或233E指示在233位后并且在234位前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE指示在233位后并且在234位前插入AlaAspGlu。

如本文所使用，“氨基酸缺失”或“缺失”意思指去除親本多肽序列中特定位置處的氨基酸序列。舉例來(lái)說(shuō)，G236-或G236#或G236del指示在236位處的甘氨酸缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示自233位開始缺失序列GluAspAla。類似地，一些異二聚化變體包括“K447del”，意思指缺失了447位的賴氨酸。

如本文所使用，“變體蛋白”或“蛋白質(zhì)變體”或“變體”意思指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親本蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)變體可以指蛋白質(zhì)本身、包含該蛋白質(zhì)的組合物，或編碼其的氨基酸序列。優(yōu)選蛋白質(zhì)變體相較于親本蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)氨基酸修飾，例如相較于親本，具有約一個(gè)至約七十個(gè)氨基酸修飾，并且優(yōu)選具有約一個(gè)至約五個(gè)氨基酸修飾。如以下所描述，在一些實(shí)施方案中，親本多肽，例如Fc親本多肽，是人類野生型序列，如來(lái)自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區(qū)，，不過(guò)具有變體的人類序列也可以充當(dāng)“親本多肽”。本文中的蛋白質(zhì)變體序列優(yōu)選與親本蛋白質(zhì)序列具有至少約80％一致性，并且最優(yōu)選具有至少約90％一致性，更優(yōu)選具有至少約95％、98％、99％一致性。變體蛋白質(zhì)可以指變體蛋白質(zhì)本身、包含該蛋白質(zhì)變體的組合物，或編碼其的DNA序列。因此，如本文所使用，“抗體變體”或“變體抗體”意思指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親本抗體的抗體；如本文所使用，“IgG變體”或“變體IgG”意思指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親本IgG(在許多情形中，也來(lái)自人類IgG序列)的抗體，并且如本文所使用，“免疫球蛋白變體”或“變體免疫球蛋白”意思指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親本免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。如本文所使用，“Fc變體”或“變體Fc”意思指在Fc結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸修飾的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的Fc變體是根據(jù)構(gòu)成變體的氨基酸修飾定義。因此，例如，N434S或434S是相對(duì)于親本Fc多肽，在434位具有取代絲氨酸的Fc變體，其中編號(hào)是依據(jù)EU索引。同樣，M428L/N434S定義相對(duì)于親本Fc多肽，具有取代M428L和N434S的Fc變體。野生型氨基酸的身份可能未指明，在此情形中，以上提到的變體稱為428L/434S。應(yīng)注意，提供的取代的次序是任意的，也就是說(shuō)，例如428L/434S與M428L/N434S是相同F(xiàn)c變體，等等。對(duì)于本發(fā)明中論述的有關(guān)抗體的所有位置，除非另外說(shuō)明，否則氨基酸位置編號(hào)是依據(jù)EU索引。EU索引或如在Kabat中的EU索引或EU編號(hào)方案是指EU抗體的編號(hào)(Edelman等人，1969，Proc Natl Acad Sci USA63：78-85，以引用的方式整體并入本文中)。修飾可以是添加、缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸，并且在一些情形中包括合成氨基酸。實(shí)例包括美國(guó)專利號(hào)6,586,207；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO05/74524A2；J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PICAS United States of America 99：11020-11024；及L.Wang，&P.G.Schultz，(2002)，Chem.1-10，全部以引用的方式整體并入。

如本文所使用，“蛋白質(zhì)”在本文中意思指至少兩個(gè)共價(jià)附接的氨基酸，包括蛋白質(zhì)、多肽、寡肽及肽。肽基可以包含天然存在的氨基酸和肽鍵，或合成擬肽結(jié)構(gòu)，即“類似物”，如類肽(參見Simon等人，PNAS USA 89(20)：9367(1992)，以引用的方式整體并入)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如，不是由D NA編碼的氨基酸)。舉例來(lái)說(shuō)，出于本發(fā)明的目的，高苯丙氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸及正亮氨酸被認(rèn)為是合成氨基酸，并且可以利用D-和L-(R或S)構(gòu)型的氨基酸。本發(fā)明的變體包含的修飾可以包括使用例如Schultz和同事開發(fā)的技術(shù)，包括但不限于，Cropp&Shultz，2004，Trends Genet.20(12)：625-30；Anderson等人，2004，ProcNatlAcadSci USA 101(2)：7566-71；Zhang等人，2003，303(5656)：371-3；及Chin等人，2003，Science 301(5635)：964-7(全部以引用的方式整體并入)所描述的方法并入的合成氨基酸的使用。此外，多肽可以包括一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈或末端的合成衍生化、糖基化、PEG化、環(huán)式排列、環(huán)化、連接至其它分子的連接子、與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的融合物，及肽標(biāo)簽或標(biāo)記的添加。

如本文所使用，“殘基”意思指蛋白質(zhì)中的位置及其相關(guān)氨基酸的身份。舉例來(lái)說(shuō)，天冬酰胺297(又稱為Asn297或N297)是在人類抗體IgG1中297位的殘基。

如本文所使用，“Fab”或“Fab區(qū)”意思指包含VH、CH1、VL及CL免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽。Fab可以指分離的這一區(qū)域，或處于全長(zhǎng)抗體環(huán)境中的這一區(qū)域、抗體片段或Fab融合蛋白。如本文所使用，“Fv”或“Fv片段”或“Fv區(qū)”意思指包含單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域的多肽。

如本文所使用，“IgG子類修飾”或“同型修飾”意思指將一種IgG同型的一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)變成一種不同、對(duì)準(zhǔn)的IgG同型中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸修飾。舉例來(lái)說(shuō)，由于在EU位置296處，IgG1包含酪氨酸，而IgG2包含苯丙氨酸，故IgG2中的F296Y取代被認(rèn)為是IgG子類修飾。

如本文所使用，“非天然存在的修飾”意思指并非同型的氨基酸修飾。舉例來(lái)說(shuō)，由于IgG在434位都不包含絲氨酸，故IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其混合物)中的取代434S被認(rèn)為是非天然存在的修飾。“同型”修飾是指在一個(gè)位置處的一個(gè)同型氨基酸輸入不同的同型的主鏈中；例如，IgG1氨基酸輸入IgG2主鏈中的相同位置。

如本文所使用，“氨基酸”和“氨基酸身份”意思指由DNA和RNA編碼的20種天然存在的氨基酸之一。

如本文所使用，“效應(yīng)功能”意思指由抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體相互作用引起的生物化學(xué)事件。效應(yīng)功能包括但不限于，ADCC、ADCP及CDC。

如本文所使用，“IgG Fc配體”意思指任何生物體中結(jié)合至IgG抗體Fc區(qū)形成Fc/Fc配體復(fù)合體的分子，優(yōu)選多肽。Fc配體包括但不限于，F(xiàn)cγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露糖結(jié)合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白質(zhì)A、鏈球菌蛋白質(zhì)G及病毒FcγR。Fc配體還包括Fc受體同源物(FcRH)，其為與FcγR同源的一組Fc受體(Davis等人，2002，Immunological Reviews 190：123-136，以引用的方式整體并入)。Fc配體可以包括未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合Fc的分子。特定IgG Fc配體是FcRn和Fcγ受體。如本文所使用，“Fc配體”意思指任何生物體中結(jié)合至抗體Fc區(qū)形成Fc/Fc配體復(fù)合體的分子，優(yōu)選多肽。

如本文所使用，“Fcγ受體”或“FcγR”意思指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)并且由FcγR基因編碼的蛋白質(zhì)家族的任何成員。在人體中，這一家族包括但不限于，F(xiàn)cγRI(CD64)，包括同工型FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同工型FcγRIIa(包括異型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)及FcγRIIc；及FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIa(包括異型V158和F158)和FcγRIIIb(包括異型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis等人，2002，Immunol Lett82：57-65，以引用的方式整體并入)，以及任何未發(fā)現(xiàn)的人類FcγR或FcγR同工型或異型。FcγR可以來(lái)自任何生物體，包括但不限于，人類、小鼠、大鼠、兔及猴。小鼠FcγR包括但不限于，F(xiàn)cγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何未發(fā)現(xiàn)的小鼠FcγR或者FcγR同工型或異型。

如本文所使用，“FcRn”或“新生兒Fc受體”意思指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)并且至少部分由FcRn基因編碼的蛋白質(zhì)。FcRn可以來(lái)自任何生物體，包括但不限于，人類、小鼠、大鼠、兔及猴。如本領(lǐng)域中所知，功能性FcRn蛋白質(zhì)包含兩個(gè)多肽，通常稱為重鏈和輕鏈。輕鏈?zhǔn)铅?2-微球蛋白，而重鏈?zhǔn)怯蒄cRn基因編碼。除非本文另外說(shuō)明，否則FcRn或FcRn蛋白質(zhì)是指FcRn重鏈與β-2-微球蛋白的復(fù)合體。多種FcRn變體被用于增加與FcRn受體的結(jié)合，并且在一些情形中，增加血清半衰期。增加與FcRn受體的結(jié)合并相應(yīng)地增加血清半衰期的Fc變體包括但不限于，434A、434S、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L、252Y、252Y/254T/256E及259I/308F/428L。也就是說(shuō)，圖8B的三F形式可以在任一個(gè)或兩個(gè)單體序列上具有這些FcRn變體中的任一種。為清楚起見，由于每個(gè)重鏈不同，F(xiàn)cRn變體(以及Fc變體)可以位于一個(gè)或兩個(gè)單體上。

如本文所使用，“親本多肽”意思指起始多肽，該多肽隨后經(jīng)過(guò)修飾以產(chǎn)生變體。親本多肽可以是天然存在的多肽，或是天然存在的多肽的變體或工程改造形式。親本多肽可以指多肽本身、包含親本多肽的組合物，或編碼其的氨基酸序列。因此，如本文所使用，“親本免疫球蛋白”意思指未修飾的免疫球蛋白多肽，該多肽經(jīng)過(guò)修飾以產(chǎn)生變體，并且如本文所使用，“親本抗體”意思指未修飾的抗體，該抗體經(jīng)過(guò)修飾以產(chǎn)生變體抗體。應(yīng)注意，“親本抗體”包括已知可商購(gòu)的、重組產(chǎn)生的抗體，如下文所略述。

“Fc融合蛋白”或“免疫粘附”在本文中意思指包含一般連接(任選通過(guò)連接子部分，如本文所描述)至不同蛋白質(zhì)的Fc區(qū)，如連接至靶蛋白(如本文所描述)的結(jié)合部分的蛋白質(zhì)。

如本文所使用，“位置”意思指在蛋白質(zhì)序列中的定位。位置可以依序編號(hào)，或依據(jù)公認(rèn)的格式，例如用于抗體編號(hào)的EU索引進(jìn)行編號(hào)。

在本發(fā)明的異二聚體蛋白質(zhì)的單體的情況下，“鏈型”在本文中意思指，以“相配”的兩條DNA鏈類似的方式，將異二聚化變體并入每個(gè)單體中，由此保留“相配”以形成異二聚體的能力。舉例來(lái)說(shuō)，如果一些pI變體被工程改造成單體A(例如使pI更高)，則可以利用的空間變體(“電荷對(duì)”)不會(huì)干擾pI變體，例如，將使pI更高的電荷變體放入相同“鏈”或“單體”上以保留兩種功能。

如本文所使用，“靶抗原”意思指給定抗原的可變區(qū)特異性結(jié)合的分子。靶抗原可以是蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)或其它化合物。優(yōu)選本發(fā)明的靶抗原是CD3和CD38。

如本文所使用，“靶細(xì)胞”意思指表達(dá)靶抗原的細(xì)胞。

如本文所使用，“可變區(qū)”意思指免疫球蛋白中包含一個(gè)或多個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，這些Ig結(jié)構(gòu)域基本上由分別構(gòu)成κ、λ及重鏈免疫球蛋白基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因編碼。

“野生型或WT”在本文中意思指在自然界發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因變體。WT蛋白具有并非有意修飾的氨基酸序列或核苷酸序列。

如本領(lǐng)域中充分了解的，“單鏈可變片段”、“scFv”或“單鏈Fv”在本文中意思指通常用連接子肽連接的抗體可變重鏈和輕鏈的融合蛋白。典型的scFv連接子是本領(lǐng)域中眾所周知的，一般是10至25個(gè)氨基酸長(zhǎng)并且包括甘氨酸和絲氨酸。

“帶電scFv連接子”在本文中意思指利用帶電氨基酸產(chǎn)生和純化包括至少一個(gè)scFv的異二聚體抗體的scFv連接子。適合的帶電scFv連接子示于附圖中，不過(guò)也可以使用其它連接子。一般來(lái)說(shuō)，相較于標(biāo)準(zhǔn)的不帶電scFv連接子，如通常使用的(GGGGS)_3-5序列，用于本發(fā)明中的帶電scFv連接子具有3至8(3、4、5、6、7或8都是可能的)個(gè)電荷變化(帶負(fù)電或帶正電)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，利用兩個(gè)scFv的異二聚體抗體可以具有一個(gè)帶電連接子和一個(gè)中性連接子(例如帶正電或帶負(fù)電的scFv連接子)或兩個(gè)帶相反電荷的scFv連接子(一個(gè)帶正電并且一個(gè)帶負(fù)電)。

異二聚體蛋白質(zhì)

本發(fā)明是針對(duì)產(chǎn)生多特異性，特別是雙特異性結(jié)合蛋白，并且確切地說(shuō)，一個(gè)單體包含scFv并且另一個(gè)單體包含F(xiàn)v的多特異性抗體。如本文所論述，公開的實(shí)施方案中有許多使用了結(jié)合CD3的scFv和結(jié)合CD38的Fv(或Fab)。作為替代，本文中的vh和vl抗CD38序列可以用于scFv構(gòu)建體中，其中抗CD3單體是Fab。

抗體

本發(fā)明涉及多特異性抗體(通常為治療性抗體)的產(chǎn)生。如以下所論述，術(shù)語(yǔ)“抗體”是常用的?？捎糜诒景l(fā)明中的抗體可以呈現(xiàn)如本文所描述的多種形式，包括傳統(tǒng)抗體以及下文所描述的抗體衍生物、片段及模擬物。一般來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括了含至少一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，包括但不限于，CH1、CH2、CH3及CL的任何多肽。本文中特別優(yōu)選的抗體是“三F”形式的抗體。

傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)單元典型地包含四聚體。每個(gè)四聚體典型地由兩對(duì)相同的多肽鏈構(gòu)成，每一對(duì)具有一條“輕鏈”(典型地具有約25kDa的分子量)和一條“重鏈”(典型地具有約50-70kDa的分子量)。人類輕鏈被歸類為κ輕鏈和λ輕鏈。本發(fā)明是針對(duì)IgG類別，該類別具有若干子類，包括但不限于，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。因此，如本文所使用，“同型”意思指根據(jù)恒定區(qū)的化學(xué)特征和抗原特征定義的免疫球蛋白的任何子類。應(yīng)理解，治療性抗體還可以包含同型和/或子類的混合物。舉例來(lái)說(shuō)，如美國(guó)公布2009/0163699(以引用的方式并入)中所示，本發(fā)明涵蓋IgGl/G2混合物的pI工程改造。

每條鏈的氨基末端部分包括主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的具有約100至110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，一般在本領(lǐng)域中稱為“Fv結(jié)構(gòu)域”或“Fv區(qū)”。在可變區(qū)中，重鏈和輕鏈的V結(jié)構(gòu)域各自聚集三個(gè)環(huán)，形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。每個(gè)環(huán)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(下文稱為“CDR”)，其中氨基酸序列的變化是最顯著的。“可變”是指可變區(qū)某些區(qū)段的序列在抗體間明顯不同的事實(shí)。可變區(qū)內(nèi)的變化不是均勻分布的。相反，V區(qū)由通過(guò)各自是9-15個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)的稱為“高變區(qū)”的變化極大的較短區(qū)隔開的具有15-30個(gè)氨基酸的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的相對(duì)不變的伸長(zhǎng)區(qū)組成。

每個(gè)VH及VL是由從氨基末端至羧基末端按以下次序排列的三個(gè)高變區(qū)(“互補(bǔ)決定區(qū)”，“CDR”)及四個(gè)FR構(gòu)成：FR1-CDR1-FR2-CD R2-FR3-CDR3-FR4。

高變區(qū)一般涵蓋來(lái)自輕鏈可變區(qū)中大致氨基酸殘基24-34(LCDR1；“L”表示輕鏈)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重鏈可變區(qū)中大致31-35B(HCDR1；“H”表示重鏈)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)的氨基酸殘基；Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)；和/或形成高變環(huán)的那些殘基(例如，輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)及91-96(LCDR3)，以及重鏈可變區(qū)中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本發(fā)明的特定CDR描述于下。

貫穿本說(shuō)明書，當(dāng)提到可變結(jié)構(gòu)域中的殘基(近似地，輕鏈可變區(qū)的殘基1-107及重鏈可變區(qū)的殘基1-113)時(shí)，一般使用Kabat編號(hào)系統(tǒng)(例如Kabat等人，同上文(1991))。

CDR有助于形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，或更確切地說(shuō)，表位結(jié)合位點(diǎn)?！氨砦弧笔侵概c抗體分子可變區(qū)中的特定抗原結(jié)合位點(diǎn)相互作用的決定子，稱為抗原決定簇。表位是通常具有特定結(jié)構(gòu)特征以及特定電荷特征的分子組，如氨基酸或糖側(cè)鏈等。單一抗原可能具有超過(guò)一個(gè)表位。

表位可以包含直接參與結(jié)合的氨基酸殘基(又稱表位的免疫優(yōu)勢(shì)組分)及不直接參與結(jié)合的其它氨基酸殘基，如被特定抗原結(jié)合肽有效阻斷的氨基酸殘基；換句話說(shuō)，氨基酸殘基是在特定抗原結(jié)合肽的范圍內(nèi)。

表位可以是構(gòu)象表位或線性表位。構(gòu)象表位是通過(guò)空間并置來(lái)自線性多肽鏈不同區(qū)段的氨基酸而產(chǎn)生。線性表位是由多肽鏈中的相鄰氨基酸殘基產(chǎn)生的表位。構(gòu)象表位與非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在變性溶劑存在下與前者的結(jié)合喪失，而與后者的結(jié)合不然。

表位典型地在獨(dú)特的空間構(gòu)象中包括至少3個(gè)并且更通常，至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。識(shí)別同一表位的抗體可以在簡(jiǎn)單的免疫檢定中驗(yàn)證，該免疫檢定顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原的結(jié)合的能力，例如“重新分級(jí)(binning)”。

每條鏈的羧基末端部分界定主要負(fù)責(zé)效應(yīng)功能的恒定區(qū)。Kabat等人收集了眾多的重鏈和輕鏈可變區(qū)的初級(jí)序列?；谶@些序列的保守程度，其將個(gè)別初級(jí)序列分入CDR和構(gòu)架中，并且列出其清單(參見SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版，NIH publication，No.91-3242，E.A.Kabat等人，以引用的方式整體并入)。

在免疫球蛋白的IgG子類中，在重鏈中存在若干免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。“免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域”在本文中意思指具有截然不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白區(qū)域。在本發(fā)明中關(guān)注的是重鏈結(jié)構(gòu)域，包括恒定重鏈(CH)結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域。就IgG抗體來(lái)說(shuō)，IgG同型各自具有三個(gè)CH區(qū)。因此，就IgG來(lái)說(shuō)，“CH”結(jié)構(gòu)域如下：“CH1”是指如在Kabat中，根據(jù)EU索引的位置118-220。“CH2”是指如在Kabat中，根據(jù)EU索引的位置237-340，并且“CH3”是指如在Kabat中，根據(jù)EU索引的位置341-447。如本文所示并且如下文所描述，pI變體可以在一個(gè)或多個(gè)CH區(qū)，以及鉸鏈區(qū)(如下文所論述)中。

應(yīng)注意，本文所描繪的序列以CH1區(qū)118位起始；可變區(qū)不包括在內(nèi)，除非指明。舉例來(lái)說(shuō)，根據(jù)EU編號(hào)，SEQ ID NO：2的第一個(gè)氨基酸，在序列表中指定為“1”位，對(duì)應(yīng)于CH1區(qū)的118位。

另一類Ig重鏈結(jié)構(gòu)域是鉸鏈區(qū)?！般q鏈”或“鉸鏈區(qū)”或“抗體鉸鏈區(qū)”或“免疫球蛋白鉸鏈區(qū)”在本文中意思指包含在抗體第一恒定結(jié)構(gòu)域與第二恒定結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸的柔性多肽。IgG CH1結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上終止于EU位置220，并且IgG CH2結(jié)構(gòu)域在殘基EU位置237處開始。因此，對(duì)于IgG，抗體鉸鏈在本文中定義為包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中編號(hào)是依據(jù)Kabat中的EU索引。在一些實(shí)施方案中，例如就Fc區(qū)來(lái)說(shuō)，包括下鉸鏈區(qū)，其中“下鉸鏈”一般是指226位或230位。如本文所示，也可以在鉸鏈區(qū)中產(chǎn)生pI變體。

輕鏈一般包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(含有輕鏈CDR并且與可變重鏈結(jié)構(gòu)域一起形成Fv區(qū))及恒定輕鏈區(qū)(通常稱為CL或Cκ)。

以下略述的用于另外的取代的另一關(guān)注區(qū)域是Fc區(qū)。如本文所使用，“Fc”或“Fc區(qū)”或“Fc結(jié)構(gòu)域”意思指包含抗體恒定區(qū)但不包括第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域并且在一些情況下不包括部分鉸鏈的多肽。因此，F(xiàn)c是指IgA、IgD及IgG的后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、IgE和IgM的后三個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，以及這些結(jié)構(gòu)域N末端的柔性鉸鏈。對(duì)于IgA和IgM，F(xiàn)c可以包括J鏈。對(duì)于IgG，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及在Cγ1(Cγ1)與Cγ2(Cγ2)之間的下鉸鏈區(qū)。盡管Fc區(qū)的邊界可能變化，但人類IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為包括殘基C226或P230至其羧基末端，其中編號(hào)是依據(jù)如在Kabat中的Eu索引。在一些實(shí)施方案中，如以下更完整地描述，對(duì)Fc區(qū)進(jìn)行氨基酸修飾，例如以改變與一個(gè)或多個(gè)FcγR受體或與FcRn受體的結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，這些抗體是全長(zhǎng)的?！叭L(zhǎng)抗體”在本文中意思指構(gòu)成抗體的天然生物形式的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)，包括如本文略述的一個(gè)或多個(gè)修飾。

作為替代，抗體可以包括多種結(jié)構(gòu)，分別包括但不限于，抗體片段、單克隆抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(在本文中有時(shí)稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人源化抗體、抗體融合物(有時(shí)稱為“抗體綴合物”)及各自的片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是抗體片段，只要其含有至少一個(gè)能夠工程改造以產(chǎn)生異二聚體(如pI工程改造)的恒定結(jié)構(gòu)域即可?？梢允褂玫钠渌贵w片段包括了含有經(jīng)過(guò)pI工程改造的本發(fā)明的CH1、CH2、CH3、鉸鏈及CL結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)的片段。舉例來(lái)說(shuō)，F(xiàn)c融合物是Fc區(qū)(CH2和CH3，任選地帶有鉸鏈區(qū))與另一蛋白質(zhì)融合的融合物。本領(lǐng)域中已知多種Fc融合物，并且其可以通過(guò)添加本發(fā)明的異二聚化變體加以改進(jìn)。在本發(fā)明的情形中，可以利用本文所描述的異二聚化變體的任何組合制備出包含CH1；CH1、CH2及CH3；CH2；CH3；CH2和CH3；CH1和CH3的抗體融合物，其中任一個(gè)或全部可以任選地具有鉸鏈區(qū)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，一個(gè)單體包括了包含連接至Fc結(jié)構(gòu)域的scFV的重鏈，而另一單體包括了包含連接至Fc結(jié)構(gòu)域的Fab的重鏈(例如“典型”重鏈)，及輕鏈。如本文所使用，“Fab”或“Fab區(qū)”意思指包含VH、CH1、VL及CL免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽。Fab可以指分離的這一區(qū)域，或處于全長(zhǎng)抗體環(huán)境中的這一區(qū)域、抗體片段或Fab融合蛋白。如本文所使用，“Fv”或“Fv片段”或“Fv區(qū)”意思指包含單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域的多肽。

嵌合抗體及人源化抗體

在一些實(shí)施方案中，抗體可以是來(lái)自例如嵌合抗體和/或人源化抗體不同物種的混合物。一般來(lái)說(shuō)，“嵌合抗體”和“人源化抗體”是指組合來(lái)自超過(guò)一種物種的區(qū)域的抗體。舉例來(lái)說(shuō)，“嵌合抗體”傳統(tǒng)上包含來(lái)自小鼠(或在一些情形中，大鼠)的可變區(qū)和來(lái)自人類的恒定區(qū)?！叭嗽椿贵w”一般是指可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)與人類抗體中所見序列交換的非人類抗體。一般來(lái)說(shuō)，在人源化抗體中，除CDR外的整個(gè)抗體是由人類來(lái)源的多核苷酸編碼或除在其CDR內(nèi)外，與此類抗體的一致。這些CDR的一部分或全部是由源于非人類生物體的核酸編碼，將其移植到人類抗體可變區(qū)的β-折疊構(gòu)架中以產(chǎn)生抗體，該抗體的特異性是由移植的CDR決定。此類抗體的產(chǎn)生描述于例如WO92/11018；Jones，1986，Nature 321：522-525；Verhoeyen等人，1988，Science 239：1534-1536中，全部以引用的方式整體并入。通常需要所選受體構(gòu)架殘基“回復(fù)突變”成相應(yīng)的供體殘基以重新得到最初移植的構(gòu)建體中喪失的親和力(US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213，全部以引用的方式整體并入)。人源化抗體還任選包含免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分，典型地包含人類免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分，并因此典型地包含人類Fc區(qū)。人源化抗體也可以使用免疫系統(tǒng)經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的小鼠產(chǎn)生。Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654，以引用的方式整體并入。本領(lǐng)域眾所周知使非人類抗體人源化和重構(gòu)的多種技術(shù)和方法(參見Tsurushita&Vasquez，2004，Humanization of Monoclonal Antibodies，Molecular Biology of B Cells，533-545，Elsevier Science(USA)，及其中引用的參考文獻(xiàn)，全部以引用的方式整體并入)。人源化方法包括但不限于以下文獻(xiàn)中所描述的方法：Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988；Nature 332：323-329；Verhoeyen等人，1988，Science，239：1534-1536；Queen等人，1989，Proc Natl Acad Sci，USA86：10029-33；He等人，1998，J.Immunol.160：1029-1035；Carter等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-9；Presta等人，1997，Cancer Res.57(20)：4593-9；Gorman等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：4181-4185；O’Connor等人，1998，Protein Eng 11：321-8，全部以引用的方式整體并入。人源化或降低非人類抗體可變區(qū)免疫原性的其它方法可以包括表面重塑法，如例如Roguska等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：969-973(以引用的方式整體并入)中所描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域中所知，親本抗體經(jīng)歷親和力成熟。可以采用基于結(jié)構(gòu)的方法進(jìn)行人源化和親和力成熟，如例如USSN 11/004，590中所描述?？梢圆捎没谶x擇的方法使抗體可變區(qū)人源化和/或親和力成熟，包括但不限于以下文獻(xiàn)中所描述的方法：Wu等人，1999，J.Mol.Biol.294：151-162；Baca等人，1997，J.Biol.Chem.272(16)：10678-10684；Rosok等人，1996，J.Biol.Chem.271(37)：22611-22618；Rader等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：8910-8915；Krauss等人，2003，Protein Engineering 16(10)：753-759，全部以引用的方式整體并入。其它人源化方法可以涉及僅部分CDR的移植，包括但不限于USSN 09/810，510；Tan等人，2002，J.Immunol.169：1119-1125；De Pascalis等人，2002，J.Immunol.169：3076-3084中所描述的方法，全部以引用的方式整體并入。

多特異性抗體構(gòu)建體

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解并且如以下更完整地論述，本發(fā)明的異二聚體融合蛋白呈多種構(gòu)型，其中圖B中所示的優(yōu)選實(shí)施方案為“三F”構(gòu)建體。

異二聚體重鏈恒定區(qū)

因此，本發(fā)明基于使用含有變體重鏈恒定區(qū)作為第一結(jié)構(gòu)域的單體提供異二聚體蛋白質(zhì)。“單體”在本文中意思指異二聚體蛋白質(zhì)的一半。應(yīng)注意，傳統(tǒng)的抗體實(shí)際上是四聚體(兩條重鏈和兩條輕鏈)。在本發(fā)明的上下文中，一個(gè)重鏈-輕鏈對(duì)(如果適用，例如，如果單體包含F(xiàn)ab)被視為“單體”。類似地，包含scFv的重鏈區(qū)被視為單體?；旧?，每個(gè)單體包含足夠的重鏈恒定區(qū)以允許異二聚化工程改造，不管是全部恒定區(qū)，例如Ch1-鉸鏈-CH2-CH3；Fc區(qū)(CH2-CH3)；還是僅僅CH3結(jié)構(gòu)域。

變體重鏈恒定區(qū)可以包含重鏈恒定區(qū)的全部或一部分，包括全長(zhǎng)構(gòu)建體、CH1-鉸鏈-CH2-CH3，或其部分，包括例如CH2-CH3或單獨(dú)CH3。此外，每個(gè)單體的重鏈區(qū)可以是相同主鏈(CH1-鉸鏈-CH2-CH3或CH2-CH3)或不同主鏈。該定義內(nèi)還包括N末端和C末端截短和添加；例如，一些pI變體包括在重鏈結(jié)構(gòu)域的C末端添加帶電氨基酸。

因此，一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的“三F”構(gòu)建體的一個(gè)單體是(scFv區(qū)-鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域)，并且另一個(gè)是(VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3加相連的輕鏈)，及異二聚化變體，包括空間變體和pI變體、Fc和FcRn變體，以及這些區(qū)域中包括的另外的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(任選帶有連接子)。

除本文略述的異二聚化變體(例如空間變體和pI變體)外，重鏈區(qū)還可以含有另外的氨基酸取代，包括如下文所論述的改變FcγR和FcRn結(jié)合的變化。

此外，一些單體可以利用連接子用于“開瓶器”的scFv部分。在三F形式中，使用了一個(gè)帶電scFv連接子。如本文所述，取決于針對(duì)靶抗原的scFv的固有pI以及針對(duì)另一靶抗原的Fab的固有pI，帶電scFv連接子可以是帶正電或帶負(fù)電的。在雙scFv形式中，在一個(gè)單體(帶正電或帶負(fù)電的)或兩個(gè)單體(一個(gè)帶正電并且一個(gè)帶負(fù)電)上使用單一帶電scFv連接子。在這一實(shí)施方案中，兩個(gè)連接子各自的電荷無(wú)需相同(例如，一個(gè)是+3，而另一個(gè)是-4等)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗CD3抗原結(jié)合位點(diǎn)是scFv，并且包括帶正電的scFv連接子。作為替代，抗CD38抗原結(jié)合位點(diǎn)可以是“開瓶器”構(gòu)建體的scFv。

異二聚化變體包括多種不同類型的變體，包括但不限于，空間變體(包括帶電變體)和pI變體，這些變體可以任選并且獨(dú)立地與任何其它變體組合。在這些實(shí)施方案中，“單體A”與“單體B”相配很重要；也就是說(shuō)，如果異二聚體蛋白質(zhì)基于空間變體和pI變體，那么這些需要與每個(gè)單體正確地相配：例如，起作用的空間變體集合(單體A上的1個(gè)集合，單體B上的1個(gè)集合)與pI變體集合(單體A上的1個(gè)集合，單體B上的1個(gè)集合)組合，由此使每個(gè)單體上的變體被設(shè)計(jì)用于實(shí)現(xiàn)期望的功能。在例如空間變體也可以改變電荷的情況下，正確集合需與正確單體相配。

值得注意的是，本文略述的異二聚化變體(例如，包括但不限于附圖中所示的那些變體)可以任選并且獨(dú)立地與任何其它變體并且在任何其它單體上組合。因此，例如，來(lái)自一個(gè)附圖的單體1的pI變體可以添加至不同附圖中的單體1或來(lái)自單體2的其它異二聚化變體上。也就是說(shuō)，對(duì)于異二聚化很重要的是，存在變體“集合”，一個(gè)集合是針對(duì)一個(gè)單體，并且一個(gè)集合是針對(duì)另一單體。這些集合是來(lái)自圖1與1(例如，單體1清單可以相配)還是變換(單體1的pI變體與單體2的空間變體)的組合并無(wú)關(guān)系。然而，如本文所述，當(dāng)如以上所略述進(jìn)行組合時(shí)，“鏈型”應(yīng)得到保留，由此有利于異二聚化；例如，增加pI的帶電變體應(yīng)與增加的pI變體和/或具有增加的pI的scFv連接子一起使用等。另外，對(duì)于另外的Fc變體(如對(duì)于FcγR結(jié)合、FcRn結(jié)合、切除變體等)來(lái)說(shuō)，任一單體或兩個(gè)單體可以任選并獨(dú)立地包括所列變體中的任一種。在一些情形中，兩個(gè)單體都具有另外的變體并且在一些情形中，僅一個(gè)單體具有另外的變體，或這些變體可以組合。

異二聚化變體

本發(fā)明例如在如圖8B中所描繪的“三F”或“開瓶器”支架上提供多特異性抗體形式。

空間變體

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)添加空間變體可以促進(jìn)異二聚體的形成。也就是說(shuō)，通過(guò)改變每個(gè)重鏈中的氨基酸，不同重鏈締合形成異二聚體結(jié)構(gòu)的可能性高于形成具有相同F(xiàn)c氨基酸序列的同二聚體。適合空間變體示于附圖中。

一種機(jī)制一般在本領(lǐng)域中稱為“鈕與孔”，還可以任選使用提到的氨基酸工程改造以產(chǎn)生有利于異二聚體形成，而不利于同二聚體形成的空間影響；這有時(shí)稱為“鈕與孔”，如USSN 61/596,846；Ridgway等人，Protein Engineering 9(7)：617(1996)；Atwell等人，J.Mol.Biol.1997270：26；美國(guó)專利號(hào)8,216,805中所描述，其全部以引用的方式整體并入本文中。圖4和5(下文進(jìn)一步描述)標(biāo)識(shí)眾多基于“鈕與孔”的“單體A-單體B”對(duì)。此外，如Merchant等人，Nature Biotech.16：677(1998)中所描述，這些“鈕與孔”突變可以與二硫鍵組合以偏向形成異二聚化。

用于產(chǎn)生異二聚體的另一機(jī)制有時(shí)稱為靜電鑲飾，如Gunasekaran等人，J.Biol.Chem.285(25)：19637(2010)(以引用的方式整體并入本文中)所描述。這在本文中有時(shí)稱為“電荷對(duì)”。在這一實(shí)施方案中，使用了靜電試劑來(lái)使形成偏向異二聚化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些還可能影響pI，并由此影響純化，因此在一些情形中也可以視為pI變體。然而，由于這些靜電試劑強(qiáng)迫異二聚化并且不被用作純化工具，故其被歸類為“空間變體”。這些包括但不限于，附圖中產(chǎn)生超過(guò)75％異二聚化的變體，如D221E/P228E/L368E與D221R/P228R/K409R的配對(duì)(例如，這些是“單體對(duì)應(yīng)集合”)及C220E/P228E/368E與C220R/E224R/P228R/K409R的配對(duì)。

另外的單體A和單體B變體可以任選并且獨(dú)立地以任何量與其它變體組合，如本文略述的pI變體，或US 2012/0149876的圖37中所示的其它空間變體，該案的附圖和圖例以引用的方式明確地并入本文中。

在一些實(shí)施方案中，本文略述的空間變體可以任選并且獨(dú)立地與包括pI變體(或其它變體，如Fc變體、FcRn變體、切除變體等)在內(nèi)的任何異二聚化變體一起并入一個(gè)或兩個(gè)單體中。

異二聚體的pI(等電點(diǎn))變體

一般來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，存在兩個(gè)通用類別的pI變體：增加蛋白質(zhì)pI(堿性變化)的變體及降低蛋白質(zhì)pI(酸性變化)的變體。如本文所描述，這些變體的所有組合都可以進(jìn)行：一個(gè)單體可以是野生型，或是pI與野生型無(wú)顯著不同的變體，并且另一單體可以是偏堿性或偏酸性的。作為替代，每個(gè)單體是變化的，一個(gè)偏堿性并且一個(gè)偏酸性。

優(yōu)選的pI變體組合示于附圖中。

重鏈酸性pI變化

因此，當(dāng)使包含變體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的一個(gè)單體正值更大(例如，降低pI)時(shí)，可以進(jìn)行以下取代中的一個(gè)或多個(gè)：S119E、K133E、K133Q、T164E、K205E、K205Q、N208D、K210E、K210Q、K274E、K320E、K322E、K326E、K334E、R355E、K392E、K447缺失、在c末端添加肽DEDE、G137E、N203D、K274Q、R355Q、K392N及Q419E。如本文所略述并且如附圖中所示，這些變化是相對(duì)于IgG1顯示，但所有同型以及同型混合物可以按此方式改變。

在重鏈恒定結(jié)構(gòu)域來(lái)自IgG2-4的情況下，還可以使用R133E和R133Q。

堿性pI變化

因此，當(dāng)使包含變體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的一個(gè)單體負(fù)值更大(例如，增加pI)時(shí)，可以進(jìn)行以下取代中的一個(gè)或多個(gè)：Q196K、P217R、P228R、N276K及H435R。如本文所略述并且如附圖中所示，這些變化是相對(duì)于IgG1顯示，但所有同型以及同型混合物可以按此方式改變。

抗體異二聚體輕鏈變體

就基于抗體的異二聚體來(lái)說(shuō)，例如在至少一個(gè)單體除重鏈結(jié)構(gòu)域外還包含輕鏈的情況下，也可以在輕鏈中產(chǎn)生pI變體。降低輕鏈pI的氨基酸取代包括但不限于，K126E、K126Q、K145E、K145Q、N152D、S156E、K169E、S202E、K207E及在輕鏈c末端添加肽DEDE。在這一類別中基于恒定λ輕鏈的變化包括R108Q、Q124E、K126Q、N138D、K145T及Q199E中的一個(gè)或多個(gè)取代。此外，還可以增加輕鏈的pI。

同型變體

此外，本發(fā)明的許多實(shí)施方案是基于一種IgG同型中特定位置處的pI氨基酸“輸入”另一同型中，由此減小或消除不想要的免疫原性被引入變體中的可能性。也就是說(shuō)，出于多種原因，包括高效應(yīng)功能，IgG1是治療性抗體的常見同型。然而，IgG1的重鏈恒定區(qū)的pI高于IgG2(8.10對(duì)7.31)。通過(guò)將IgG2在特定位置處的殘基引入IgG1主鏈中，使所得單體的pI降低(或增加)并且另外展現(xiàn)較長(zhǎng)的血清半衰期。舉例來(lái)說(shuō)，IgG1在137位具有甘氨酸(pI 5.97)，而IgG2具有谷氨酸(pI 3.22)；輸入谷氨酸將影響所得蛋白質(zhì)的pI。如以下所描述，一般需要多個(gè)氨基酸取代來(lái)顯著影響變體抗體的pI。然而，應(yīng)注意，如以下所論述，甚至IgG2分子的變化也能夠增加血清半衰期。

在其它實(shí)施方案中，進(jìn)行非同型氨基酸變化，以降低所得蛋白質(zhì)的總體電荷狀態(tài)(例如通過(guò)將pI較高的氨基酸變?yōu)閜I較低的氨基酸)，或?qū)崿F(xiàn)結(jié)構(gòu)適應(yīng)性以得到穩(wěn)定性等，下文將更進(jìn)一步描述。

此外，通過(guò)對(duì)重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域進(jìn)行pI工程改造，可以見到異二聚體每個(gè)單體的顯著變化。如本文所論述，兩個(gè)單體的pI相差至少0.5可以允許通過(guò)離子交換色譜法或等電聚焦，或?qū)Φ入婞c(diǎn)敏感的其它方法進(jìn)行分離。

等排變體

此外，如圖47中所示，可以制備等排pI變體，例如尺寸與親本氨基酸大致相同的電荷變體。

計(jì)算pI

每個(gè)單體的pI可以取決于變體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的pI及包括變體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和融合搭配物在內(nèi)的總單體的pI。因此，在一些實(shí)施方案中，基于變體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，使用附圖中的表計(jì)算pI的變化。作為替代，可以比較每個(gè)單體的pI。類似地，計(jì)算“起始”可變區(qū)(例如scFv或Fab)的pI以了解哪個(gè)單體將在哪一方向上工程改造。

另外賦予更佳FcRn體內(nèi)結(jié)合的pI變體

在pI變體降低單體的pI的情況下，其可以具有改善體內(nèi)血清保持的附加益處。

盡管仍有待檢驗(yàn)，但相信Fc區(qū)在體內(nèi)具有較長(zhǎng)半衰期，因?yàn)樵趐H 6下與FcRn在核內(nèi)體中的結(jié)合隔離Fc(Ghetie和Ward，1997Immunol Today.18(12)：592-598，以引用的方式整體并入)。核內(nèi)體區(qū)室接著使Fc再循環(huán)至細(xì)胞表面。一旦該區(qū)室向細(xì)胞外空間開放，則較高的pH值，約7.4，誘導(dǎo)Fc釋放回血液中。在小鼠中，Dall’Acqua等人顯示，在pH 6和pH 7.4下FcRn結(jié)合增加的Fc突變體實(shí)際上具有降低的血清濃度以及與野生型Fc相同的半衰期(Dall’Acqua等人，2002，J.Immunol.169：5171-5180，以引用的方式整體并入)。在pH 7.4下Fc對(duì)FcRn的親和力增加被認(rèn)為禁止Fc釋放回血液中。因此，增加Fc體內(nèi)半衰期的Fc突變理想地將增加在較低pH值下FcRn的結(jié)合，同時(shí)仍允許在較高pH值下釋放Fc。氨基酸組氨酸在6.0至7.4的pH值范圍內(nèi)改變其電荷狀態(tài)。因此，在Fc/FcRn復(fù)合體的重要位置處發(fā)現(xiàn)His殘基在意料之中。

近來(lái)，已提出可變區(qū)具有較低等電點(diǎn)的抗體也可能具有較長(zhǎng)的血清半衰期(Igawa等人，2010PEDS.23(5)：385-392，以引用的方式整體并入)。不過(guò)，這一機(jī)制仍有待了解。此外，可變區(qū)隨抗體而不同。具有較低pI和較長(zhǎng)半衰期的恒定區(qū)變體將提供一種改善抗體的藥物動(dòng)力學(xué)特性的更具模塊化的方法，如本文所論述。

用于本實(shí)施方案中的pI變體以及其在純化優(yōu)化方面的用途公開于附圖中。

變體的組合

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所闡述的所有異二聚化變體可以任選并且獨(dú)立地以任何方式組合，只要其保持其“鏈型”或“單體區(qū)分”即可。此外，所有這些變體都可以組合成任何異二聚化形式。

就pI變體來(lái)說(shuō)，盡管附圖中顯示了特別適用的實(shí)施方案，但遵循改變兩個(gè)單體之間的pI差異以促進(jìn)純化的基本原則，也可以產(chǎn)生其它實(shí)施方案。

本發(fā)明的抗體一般是分離的或重組的?！胺蛛x的”當(dāng)用于描述本文所公開的各種多肽時(shí)，意思指多肽經(jīng)過(guò)鑒別并且從表達(dá)多肽的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物分離和/或回收。通常，分離的多肽是通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備?！胺蛛x的抗體”是指抗體基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體。

“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合至”特定抗原或表位，或?qū)μ囟乖虮砦弧熬哂刑禺愋浴币馑贾概c非特異性相互作用明顯不同的結(jié)合。特異性結(jié)合可以例如通過(guò)測(cè)定一個(gè)分子的結(jié)合與對(duì)照分子的結(jié)合的差異來(lái)測(cè)量，對(duì)照分子一般是結(jié)構(gòu)類似但不具有結(jié)合活性的分子。舉例來(lái)說(shuō)，特異性結(jié)合可以通過(guò)與類似于靶標(biāo)的對(duì)照分子競(jìng)爭(zhēng)來(lái)測(cè)定。

針對(duì)特定抗原或表位的特異性結(jié)合可以例如通過(guò)抗體針對(duì)抗原或表位的至少約10-4M、至少約10-5M、至少約10-6M、至少約10-7M、至少約10-8M、至少約10-9M，或至少約10-10M、至少約10-11M、至少約10-12M或更高的KD來(lái)展現(xiàn)，其中KD是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。典型地，特異性結(jié)合抗原的抗體的KD是對(duì)照分子相對(duì)于該抗原或表位的KD的20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更高倍數(shù)。

另外，針對(duì)特定抗原或表位的特異性結(jié)合可以例如通過(guò)抗體針對(duì)抗原或表位的KA或Ka是該表位相對(duì)于對(duì)照物的KA或Ka的至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更高倍數(shù)來(lái)展現(xiàn)，其中KA或Ka是指特定抗體-抗原相互作用的締合速率。

修飾的抗體

除以上略述的修飾外，還可以進(jìn)行其它修飾。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)并入二硫橋連接VH和VL結(jié)構(gòu)域來(lái)使分子穩(wěn)定(Reiter等人，1996，Nature Biotech.14：1239-1245，以引用的方式整體并入)。此外，如下文所略述，可以對(duì)抗體進(jìn)行多種共價(jià)修飾。

抗體的共價(jià)修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且一般(但不總是)在翻譯后進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)使抗體的特定氨基酸殘基與有機(jī)衍生化試劑反應(yīng)，將若干類型的抗體共價(jià)修飾引入分子中，該衍生化試劑能夠與所選側(cè)鏈或者N末端或C末端殘基反應(yīng)。

半胱氨?；鶜埢畛Ｅcα-鹵代乙酸酯(及相應(yīng)胺)，如氯代乙酸或氯代乙酰胺反應(yīng)，得到羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。半胱氨?；鶜埢€可以通過(guò)與溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙?；姿狨ァ-烷基順丁烯二酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對(duì)氯苯甲酸汞、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑等反應(yīng)來(lái)進(jìn)行衍生化。

此外，在半胱氨酸處的修飾特別適用于抗體-藥物綴合物(ADC)應(yīng)用(下文進(jìn)一步描述)。在一些實(shí)施方案中，抗體恒定區(qū)可以工程改造成含有一個(gè)或多個(gè)特別具有“硫醇反應(yīng)性”的半胱氨酸，由此使藥物部分更具特異性以及控制性放置。參見例如美國(guó)專利號(hào)7,521,541，以引用的方式整體并入本文中。

組氨酰基殘基通過(guò)與焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反應(yīng)進(jìn)行衍生化，因?yàn)檫@一試劑對(duì)組氨?；鶄?cè)鏈具有相對(duì)較高特異性。對(duì)溴苯甲酰甲基溴也是有用的；反應(yīng)優(yōu)選在pH 6.0下于0.1M二甲胂酸鈉中進(jìn)行。

賴氨?；桶被┒藲埢c琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑進(jìn)行衍生化具有逆轉(zhuǎn)賴氨?；鶜埢碾姾傻淖饔?。用于使含α-氨基的殘基衍生化的其它適合試劑包括酰亞胺酯，如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氫化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；及轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。

精氨?；鶜埢ㄟ^(guò)與一種或若干常規(guī)試劑反應(yīng)進(jìn)行修飾，這些試劑中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮及茚三酮。使精氨酸殘基衍生化需要反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)殡夜倌軋F(tuán)的pKa較高。此外，這些試劑可以與賴氨酸的基團(tuán)以及精氨酸ε-氨基反應(yīng)。

可以對(duì)酪氨?；鶜埢M(jìn)行特殊修飾，其中特別值得關(guān)注的是，通過(guò)與芳香族重氮鹽化合物或四硝基甲烷反應(yīng)將光譜標(biāo)記引入酪氨酰基殘基中。最常見的是，使用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷分別形成O-乙酰基酪氨?；镔|(zhì)和3-硝基衍生物。使用125I或131I使酪氨?；鶜埢饣灾苽錁?biāo)記的蛋白質(zhì)用于放射免疫檢定中，以上描述的氯胺T法是適合的。

羧基側(cè)基(天冬氨?；蚬劝滨；?通過(guò)與碳化二亞胺(R’-N＝C＝N--R’)反應(yīng)進(jìn)行選擇性修飾，其中R和R’是任選不同的烷基，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬氨?；凸劝滨；ㄟ^(guò)與銨離子反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成天冬酰胺?；凸劝滨０孵；鶜埢?。

用雙官能試劑進(jìn)行衍生化適用于使抗體與不溶于水的載體基質(zhì)或表面交聯(lián)以用于包括以下所描述的方法在內(nèi)的多種方法中。常用交聯(lián)劑包括例如1，1-雙(重氮乙?；?-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸形成的酯、同雙官能酰亞胺酯，包括二琥珀酰亞胺基酯，如3，3’-二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)，及雙官能順丁烯二酰亞胺，如雙-N-順丁烯二酰亞胺基-1，8-辛烷。衍生化試劑，如甲基-3-[(對(duì)疊氮基苯基)二硫基]亞胺丙酸酯得到能夠在光存在下形成交聯(lián)的可光活化的中間體。作為替代，采用了不溶于水的反應(yīng)性基質(zhì)，如cynomolgusogen bromide活化的碳水化合物及美國(guó)專利號(hào)3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537及4,330,440(全部以引用的方式整體并入)中描述的反應(yīng)性基質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)固定。

谷氨酰胺?；吞於０孵；鶜埢３７謩e脫去酰胺基，得到相應(yīng)的谷氨?；吞於滨；鶜埢?。作為替代，這些殘基在微酸性條件下脫去酰胺基。這些殘基的任一形式都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化；絲氨?；蛱K氨?；鶜埢牧u基的磷酸化；賴氨酸、精氨酸及組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86頁(yè)[1983]，以引用的方式整體并入)；N末端胺的乙?；?；及任何C末端羧基的酰胺化。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，標(biāo)記(包括熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、磁性標(biāo)記、放射性標(biāo)記等)都可以添加至抗體(以及本發(fā)明的其它組合物)中。

糖基化

另一類共價(jià)修飾是糖基化的改變。在另一實(shí)施方案中，本文所公開的抗體可以被修飾成包括一個(gè)或多個(gè)工程改造的糖型。如本文所使用，“工程改造的糖型”意思指共價(jià)附接到抗體的碳水化合物組合物，其中所述碳水化合物組合物在化學(xué)上不同于親本抗體。工程改造的糖型可以用于多種目的，包括但不限于，增強(qiáng)或減弱效應(yīng)功能。工程改造的糖型的一種優(yōu)選形式是脫巖藻糖基化，經(jīng)顯示，其可能通過(guò)與FcγRIIIa受體更緊密結(jié)合而與ADCC功能增加相關(guān)。在這一情形中，“脫巖藻糖基化”意思指，宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的大部分抗體基本上不含巖藻糖，例如產(chǎn)生的抗體中有90％、95％、98％不具有明顯的巖藻糖作為抗體碳水化合物部分的組分(一般附接在Fc區(qū)中的N297位)。在功能上定義，脫巖藻糖基化的抗體一般對(duì)FcγRIIIa受體展現(xiàn)至少50％或更高親和力。

工程改造的糖型可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法產(chǎn)生(等人，1999，Nat Biotechnol 17：176-180；Davies等人，2001，Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等人，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等人，2003，J Biol Chem 278：3466-3473；US 6,602,684；USSN10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1，全部以引用的方式整體并入；(技術(shù)[Biowa，Inc.，Princeton，NJ]；糖基化工程改造技術(shù)[Glycart Biotechnology AG，Zürich，Switzerland])。這些技術(shù)中有許多是基于例如通過(guò)在工程改造或其它方式處理的各種生物體或細(xì)胞株(例如Lec-13CHO細(xì)胞或大鼠雜交瘤YB2/0細(xì)胞)中表達(dá)IgG，通過(guò)調(diào)控糖基化路徑中所涉及的酶(例如，F(xiàn)UT8[α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶]和/或(β1-4-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III[GnTIll])，或通過(guò)在表達(dá)IgG之后對(duì)碳水化合物進(jìn)行修飾來(lái)控制巖藻糖化程度和/或?qū)Ψ止矁r(jià)附接至Fc區(qū)的寡糖。舉例來(lái)說(shuō)，Seattle Genetics的“糖工程改造的抗體”或“SEA技術(shù)”通過(guò)添加在制造期間抑制巖藻糖基化的經(jīng)修飾糖來(lái)起作用；參見例如20090317869，以引用的方式整體并入本文中。工程改造的糖型典型地是指不同碳水化合物或寡糖；由此，抗體可以包括工程改造的糖型。

作為替代，工程改造的糖型可以指包含不同碳水化合物或寡糖的IgG變體。如本領(lǐng)域中所知，糖基化模式可以取決于蛋白質(zhì)的序列(例如存在或不存在特定糖基化氨基酸殘基，如下文所論述)，或產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞或生物體。特定表達(dá)系統(tǒng)論述于下。

多肽的糖基化典型地是N-連接或O-連接的。N-連接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。因此，在多肽中這些三肽序列中任一種的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羥基氨基酸，最常見是絲氨酸或蘇氨酸，不過(guò)也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。

在抗體中添加糖基化位點(diǎn)通常是通過(guò)改變氨基酸序列，以使其含有上述三肽序列中的一個(gè)或多個(gè)來(lái)實(shí)現(xiàn)(對(duì)于N-連接的糖基化位點(diǎn))。還可以通過(guò)起始序列中一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基的添加或取代來(lái)進(jìn)行改變(對(duì)于O-連接的糖基化位點(diǎn))。為便利起見，優(yōu)選通過(guò)在DNA水平上的變化，特別是通過(guò)使編碼靶多肽的DNA在預(yù)先選擇的堿基處突變，由此產(chǎn)生會(huì)翻譯成期望的氨基酸的密碼子，來(lái)改變抗體氨基酸序列。

增加抗體上碳水化合物部分的數(shù)量的另一種方式是糖苷與蛋白質(zhì)的化學(xué)或酶促偶合。這些工序的優(yōu)勢(shì)在于，其不需要在具有進(jìn)行N-連接和O-連接糖基化的糖基化能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。取決于所用偶合模式，糖可以附接至(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基；(c)游離硫氫基，如半胱氨酸的硫氫基；(d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的羥基；(e)芳香族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族殘基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)。這些方法描述于WO87/05330及Aplin和Wriston，1981，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306頁(yè)中，二者以引用的方式整體并入。

去除起始抗體上存在的碳水化合物部分(例如翻譯后)可以通過(guò)化學(xué)方式或酶促方式實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)脫糖基化需要使蛋白質(zhì)暴露于化合物三氟甲烷磺酸，或等效化合物。這一處理使得除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖裂解，而多肽保持完整?；瘜W(xué)脫糖基化描述于Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52及Edge等人，1981，Anal.Biochem.118：131(都以引用的方式整體并入)中?？梢酝ㄟ^(guò)使用Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138：350(以引用的方式整體并入)所描述的多種內(nèi)切和外切糖苷酶來(lái)酶促裂解多肽上的碳水化合物部分。如Duskin等人，1982，J.Biol.Chem.257：3105(以引用的方式整體并入)所描述，使用化合物衣霉素可以防止在潛在的糖基化位點(diǎn)處發(fā)生糖基化。衣霉素阻止蛋白質(zhì)-N-糖苷鍵聯(lián)的形成。

另一類抗體共價(jià)修飾包含以例如2005-2006PEG Catalog from Nektar Therapeutics(可見于Nektar網(wǎng)站)；美國(guó)專利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337(全部以引用的方式整體并入)中陳述的方式，將抗體連接至各種非蛋白質(zhì)聚合物，包括但不限于，各種多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。此外，如本領(lǐng)域中所知，可以在抗體內(nèi)的各種位置進(jìn)行氨基酸取代以促進(jìn)如PEG等聚合物的添加。參見例如，美國(guó)公布號(hào)2005/0114037A1，以引用的方式整體并入。

用于另外的功能的另外的Fc變體

除pI氨基酸變體外，出于多種原因，包括但不限于，改變與一種或多種FcγR受體的結(jié)合、改變與FcRn受體的結(jié)合等，還可以進(jìn)行眾多有用的Fc氨基酸修飾。

因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以包括氨基酸修飾，包括本文略述的異二聚化變體，這些變體包括pI變體。

FcγR變體

因此，可以進(jìn)行眾多有用的Fc取代以改變與一種或多種FcγR受體的結(jié)合。使結(jié)合增加以及使結(jié)合減少的取代可以是有用的。舉例來(lái)說(shuō)，已知增加與Fc RIIIa的結(jié)合一般引起ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；在這種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)中，表達(dá)FcγR的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞的溶解)增加。類似地，在一些情況下，降低與FcγRIIb(抑制性受體)的結(jié)合也是有益的。用于本發(fā)明中的氨基酸取代包括USSN 11/124,620(特別是圖41)、11/174,287、11/396,495、11/538,406中所列的取代，全部以引用的方式以其全文并且特別是關(guān)于本文公開的變體明確地并入本文中。所用特定變體包括但不限于，236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L及299T。

此外，如USSN 12/341,769(以引用的方式整體并入本文中)中特別公開的，有另外的Fc取代可用于增加與FcRn受體的結(jié)合并增加血清半衰期，包括但不限于，434S、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L及259I/308F/428L。

Fc切除變體

用于本發(fā)明中的另外的變體是切除(例如減少或除去)與Fcγ受體的結(jié)合的變體。這將是減少本發(fā)明的異二聚體抗體的潛在作用機(jī)制(例如降低ADCC活性)所希望的。眾多適合的Fc切除變體描繪于圖35中，并且可以任選并獨(dú)立地包括或不包括與任何其它異二聚化變體(包括pI變體和空間變體)的組合。

在一些實(shí)施方案中，特別使用含有pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、偏向變體368D/370S及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的第一單體(“負(fù)側(cè)”)與不包含pI變體、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的正側(cè)的配對(duì)(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)，其中正側(cè)是scF v單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第二個(gè)實(shí)施方案利用了包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的第一負(fù)側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)與包含pI變體Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的正側(cè)(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第三個(gè)實(shí)施方案利用了包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的第一負(fù)側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)與不具有pI變體、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的正側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第四個(gè)實(shí)施方案利用了含有pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、偏向變體368D/370S及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K的第一單體(“負(fù)側(cè)”)與不包含pI變體、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K的正側(cè)(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)。第五個(gè)實(shí)施方案利用了包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K的第一負(fù)側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)與包含pI變體Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K的正側(cè)(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)。第六個(gè)實(shí)施方案利用了包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del、偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的第一負(fù)側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)與包含偏向變體S364K/E357Q及切除變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K的正側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第七個(gè)實(shí)施方案利用了含有pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、偏向變體368D/370S及切除變體S239K/S267K的第一單體(“負(fù)側(cè)”)與不包含pI變體、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S239K/S267K的正側(cè)的配對(duì)(任選兩個(gè)單體都含有Fc Rn變體428L/434S)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第八個(gè)實(shí)施方案利用了包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S239K/S267K的第一負(fù)側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)與包含pI變體Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S239K/S267K的正側(cè)(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電s cFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第九個(gè)實(shí)施方案利用了包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447de l、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S239K/S267K的第一負(fù)側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)與不具有pI變體、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S239K/S267K的正側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第十個(gè)實(shí)施方案利用了含有pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、偏向變體368D/370S及切除變體S267K/P329K的第一單體(“負(fù)側(cè)”)與不包含pI變體、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S267K/P329K的正側(cè)的配對(duì)(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第十一個(gè)實(shí)施方案利用了包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S267K/P329K的第一負(fù)側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)與包含pI變體Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S267K/P329K的正側(cè)(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗CD3時(shí))。第12個(gè)實(shí)施方案利用了包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S267K/P329K的第一負(fù)側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)與不具有pI變體、偏向變體S364K/E357Q及切除變體S267K/P329K的正側(cè)單體(任選兩個(gè)單體都含有FcRn變體428L/434S)的配對(duì)，其中正側(cè)是scFv單體并含有帶電scFv連接子(特別是在scFv是抗C D3時(shí))。

連接子

必要時(shí)，本發(fā)明還任選提供連接子，以例如增加另外的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如例如圖11、12及13中所描繪，其中分子的“另一端”含有另外的抗原結(jié)合組分。此外，如以下所略述，連接子還任選用于抗體藥物綴合物(ADC)系統(tǒng)中。當(dāng)用于接合中心mAb-Fv構(gòu)建體的組分時(shí)，連接子一般是包含通過(guò)肽鍵接合的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的多肽并且用于連接一種或多種本發(fā)明組分。此類連接子多肽是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見例如，Holliger，P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak，R.J.等人(1994)Structure 2：1121-1123)。多種連接子可以用于本文所描述的一些實(shí)施方案中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明中使用至少三種不同的連接子類型。

“連接子”在本文中又稱為“連接子序列”、“間隔子”、“系栓序列”或其語(yǔ)法等效詞。眾所周知同雙官能連接子或異雙官能連接子(參見1994Pierce Chemical Company catalog，有關(guān)交聯(lián)劑的技術(shù)章節(jié)，第155-200頁(yè)，以引用的方式整體并入)。(注意“連接子”與“scFv連接子”和“帶電scFv連接子”之間的區(qū)別)?？梢允褂枚喾N策略將分子共價(jià)連接在一起。這些包括但不限于，蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的N末端與C末端之間的多肽鍵聯(lián)、經(jīng)由二硫鍵進(jìn)行的鍵聯(lián)，及經(jīng)由化學(xué)交聯(lián)試劑進(jìn)行的鍵聯(lián)。在本實(shí)施方案的一個(gè)方面，連接子是通過(guò)重組技術(shù)或肽合成而產(chǎn)生的肽鍵。連接子肽主要可以包括以下氨基酸殘基：Gly、Ser、Ala或Thr。連接子肽的長(zhǎng)度應(yīng)適于以一定方式連接兩個(gè)分子使得這些分子相對(duì)彼此呈現(xiàn)正確的構(gòu)象，由此其保持期望的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接子是約1至50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，優(yōu)選是約1至30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用1至20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的連接子。有用的連接子包括甘氨酸-絲氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n及(GGGS)n，其中n是至少一的整數(shù)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-絲氨酸聚合物；及其它柔性連接子。作為替代，多種非蛋白質(zhì)聚合物，包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可以用作連接子，也就是說(shuō)，可以作為連接子使用。

其它連接子序列可以包括CL/CH1結(jié)構(gòu)域的任何長(zhǎng)度的任何序列，但非CL/CH1結(jié)構(gòu)域的所有殘基；例如CL/CH1結(jié)構(gòu)域的前5-12個(gè)氨基酸殘基。連接子可以來(lái)源于免疫球蛋白輕鏈，例如Cκ或Cλ。連接子可以來(lái)源于任何同型的免疫球蛋白重鏈，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、C8、Cε及Cμ。連接子序列還可以來(lái)源于其它蛋白質(zhì)，如類Ig蛋白質(zhì)(例如TCR、FcR、KIR)、鉸鏈區(qū)來(lái)源的序列及來(lái)自其它蛋白質(zhì)的其它天然序列。

抗體-藥物綴合物

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體與藥物綴合，形成抗體-藥物綴合物(ADC)。一般來(lái)說(shuō)，ADC被用于腫瘤學(xué)應(yīng)用中，其中使用抗體-藥物綴合物局部遞送細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞抑制劑允許將藥物部分靶向遞送至腫瘤，由此實(shí)現(xiàn)更高功效、更低毒性等。有關(guān)此技術(shù)的評(píng)述提供于Ducry等人，Bioconjugate Chem.，21：5-13(2010)；Carter等人，Cancer J.14(3)：154(2008)；及Senter，Current Opin.Chem.Biol.13：235-244(2009)中，全部以引用的方式整體并入本文中。

因此，本發(fā)明提供多特異性抗體與藥物的綴合物。一般來(lái)說(shuō)，綴合是通過(guò)共價(jià)附接至抗體進(jìn)行(如以下進(jìn)一步描述)，并且一般依賴于連接子，通常依賴于肽鍵聯(lián)(如下文所描述，該鍵聯(lián)可以設(shè)計(jì)成對(duì)蛋白酶在靶位點(diǎn)處裂解敏感或不敏感)。此外，如以上所描述，連接子-藥物單元(LU-D)的鍵聯(lián)可以通過(guò)附接至抗體內(nèi)的半胱氨酸實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，每個(gè)抗體的藥物部分?jǐn)?shù)量可以取決于反應(yīng)條件而變化，并且可以在1∶1至10∶1的藥物∶抗體間變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，實(shí)際數(shù)量是平均值。

因此，本發(fā)明提供多特異性抗體與藥物的綴合物。如以下所描述，ADC中的藥物可以是多種藥劑，包括但不限于，細(xì)胞毒性劑，如化學(xué)治療劑、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性綴合物)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明另外提供了使用ADC的方法。

用于本發(fā)明中的藥物包括細(xì)胞毒性藥物，特別是用于癌癥療法中的那些。此類藥物一般包括DNA損傷劑、抗代謝物、天然產(chǎn)物及其類似物。細(xì)胞毒性劑的示例性類別包括酶抑制劑，如二氫葉酸還原酶抑制劑及胸苷酸合成酶抑制劑；DNA嵌入劑；DNA裂解劑；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑；蒽環(huán)霉素家族藥物；長(zhǎng)春堿類藥物；絲裂霉素類；博萊霉素類；細(xì)胞毒性核苷；蝶啶家族類藥物；烯二炔類；鬼臼毒素類；多拉司他汀類(dolastatins)；美登素類；分化誘導(dǎo)劑；及紫杉醇類。

這些類別的成員包括例如甲氨蝶呤、甲蝶呤、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、美法侖、白諾生(leurosine)、魯拉西酮(leurosideine)、放射菌素、道諾霉素、阿霉素、絲裂霉素C、絲裂霉素A、洋紅霉素(caminomycin)、氨蝶呤、太利蘇霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素及鬼臼毒素衍生物如依托泊苷或磷酸依托泊苷、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、紫杉烷(包括紫杉醇、泰諾帝(taxotere))、視黃酸、丁酸、N8-乙酰亞精胺、喜樹堿、卡里奇霉素(calicheamicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、烯-二炔、倍癌霉素A(duocarmycin A)、倍癌霉素SA、卡里奇霉素、喜樹堿、類美登素(maytansinoid)(包括DM1)、單甲基奧瑞他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)、單甲基奧瑞他汀F(MMAF)及類美登素(DM4)，及其類似物。

所用毒素可以呈抗體-毒素綴合物形式并且包括細(xì)菌毒素如白喉毒素、植物毒素如蓖麻毒素、小分子毒素如格爾德霉素(Mandler等人(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、類美登素(EP 1391213；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)及卡里奇霉素(Lode等人(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可以通過(guò)包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制在內(nèi)的機(jī)制發(fā)揮其細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用。

涵蓋多特異性抗體與一種或多種小分子毒素的綴合物，這些小分子毒素如類美登素、多拉司他汀、奧瑞他汀、單端孢霉烯、卡里奇霉素及CC1065，以及這些毒素的具有毒素活性的衍生物。

類美登素

適合用作類美登素藥物部分的美登素化合物是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且可以根據(jù)已知方法從天然來(lái)源分離，使用基因工程改造技術(shù)制備(參見Yu等人(2002)PNAS 99：7968-7973)或根據(jù)已知方法合成制備美登醇和美登醇類似物。如以下所描述，可以通過(guò)并入功能活性基團(tuán)，如硫醇或胺基用于綴合抗體，來(lái)修飾藥物。

示例性類美登素藥物部分包括具有修飾的芳香族環(huán)的那些，如：C-19-脫氯(美國(guó)專利號(hào)4,256,746)(通過(guò)氫化鋰鋁還原安絲菌素(ansamytocin)P2制備)；C-20-羥基(或C-20-脫甲基)+/-C-19-脫氯(美國(guó)專利號(hào)4,361,650和4,307,016)(通過(guò)使用鏈球菌或放線菌脫甲基化，或使用LAH脫氯來(lái)制備)；及C-20-脫甲氧基、C-20-酰氧基(--OCOR)+/-脫氯(美國(guó)專利號(hào)4,294,757)(通過(guò)使用酰氯進(jìn)行?；瘉?lái)制備)，以及在其它位置處具有修飾的那些。

示例性類美登素藥物部分還包括具有如以下修飾的那些：C-9-SH(美國(guó)專利號(hào)4,424,219)(通過(guò)美登醇與H2S或P2S5反應(yīng)來(lái)制備)；C-14-烷氧基甲基(脫甲氧基/CH2OR)(美國(guó)專利號(hào)4,331,598)；C-14-羥甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國(guó)專利號(hào)4,450,254)(由Nocardia制備)；C-15-羥基/酰氧基(美國(guó)專利號(hào)4,364,866)(通過(guò)用鏈球菌轉(zhuǎn)化美登醇來(lái)制備)；C-15-甲氧基(美國(guó)專利號(hào)4,313,946和4,315,929)(從滑桃樹(Trewia nudlflora)分離)；C-18-N-脫甲基(美國(guó)專利號(hào)4,362,663和4,322,348)(通過(guò)用鏈球菌使美登醇脫甲基化來(lái)制備)；及4，5-脫氧(美國(guó)專利號(hào)4,371,533)(通過(guò)用三氯化鈦/LAH還原美登醇來(lái)制備)。

特別有用的是DM1(公開于美國(guó)專利號(hào)5,208,020中，以引用的方式并入)和DM4(公開于美國(guó)專利號(hào)7,276,497中，以引用的方式并入)。另參見5,416,064、WO/01/24763、7,303,749、7,601,354、USSN12/631,508、WO02/098883、6,441,163、7,368,565、WO02/16368及WO04/1033272(全部以引用的方式整體明確地并入)中的其它類美登素衍生物及方法。

含有類美登素的ADC、其制備方法及其治療應(yīng)用公開于例如美國(guó)專利號(hào)5,208,020、5,416,064、6,441,163以及歐洲專利EP 0 425 235B1中，其公開內(nèi)容以引用的方式明確地并入本文中。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：8618-8623(1996)描述了包含稱為DM1的類美登素連接至針對(duì)人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體C242的ADC。已發(fā)現(xiàn)，該綴合物針對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞具有高細(xì)胞毒性，并且在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)檢定中顯示出抗腫瘤活性。

Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)描述了一類ADC，其中類美登素經(jīng)由二硫化物連接子與結(jié)合至人結(jié)腸癌細(xì)胞系上的抗原的鼠類抗體A7綴合，或與結(jié)合HER-2/neu癌基因的另一鼠類單克隆抗體TA.1綴合。在體外測(cè)試TA.1-類美登素綴合物針對(duì)人乳癌細(xì)胞系SK-BR-3的細(xì)胞毒性，該細(xì)胞系每個(gè)細(xì)胞表達(dá)3×105個(gè)HER-2表面抗原。該藥物綴合物得到的細(xì)胞毒性程度類似于游離類美登素藥物，通過(guò)增加每個(gè)抗體分子的類美登素分子數(shù)量可以增加該細(xì)胞毒性程度。A7-類美登素綴合物在小鼠中顯示較低的全身細(xì)胞毒性。

奧瑞他汀和多拉司他汀

在一些實(shí)施方案中，ADC包含多特異性抗體與多拉司他汀或多拉司他汀肽類似物及衍生物奧瑞他汀的綴合物(美國(guó)專利號(hào)5,635,483、5,780,588)。經(jīng)顯示，多拉司他汀和奧瑞他汀可干擾微管動(dòng)力學(xué)、GTP水解以及核和細(xì)胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)，并具有抗癌(美國(guó)專利號(hào)5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或奧瑞他汀藥物部分可以通過(guò)肽藥物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附接至抗體(WO02/088172)。

示例性?shī)W瑞他汀實(shí)施方案包括Senter等人于2004年3月28日提交的Proceedings of the American Association for Cancer Research，第45卷，Abstract Number 623中所公開及美國(guó)專利公布號(hào)2005/0238648(其公開內(nèi)容以引用的方式整體明確地并入)中所描述的N末端連接的單甲基奧瑞他汀藥物部分DE和DF。

示例性?shī)W瑞他汀實(shí)施方案是MMAE(參見美國(guó)專利號(hào)6,884,869，以引用的方式整體明確地并入)。

另一示例性?shī)W瑞他汀實(shí)施方案是MMAF(參見US2005/0238649、5,767,237及6,124,431，以引用的方式整體明確地并入)。

包含MMAE或MMAF和各種連接子組分(如本文進(jìn)一步描述)的其它示例性實(shí)施方案具有以下結(jié)構(gòu)和縮寫(其中Ab是指抗體并且p是1至約8)：

典型地，基于肽的藥物部分可以通過(guò)在兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來(lái)制備。此類肽鍵可以例如根據(jù)肽化學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的液相合成法(參見E.Schroder和K.Lubke，“The Peptides”，第1卷，第76-136頁(yè)，1965，Academic Press)制備。奧瑞他汀/多拉司他汀藥物部分可以根據(jù)以下中的方法制備：美國(guó)專利號(hào)5,635,483；美國(guó)專利號(hào)5,780,588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit，G.R.等人，Synthesis，1996，719-725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat Biotechnol21(7)：778-784。

卡里奇霉素

在其它實(shí)施方案中，ADC包含本發(fā)明的抗體與一個(gè)或多個(gè)卡里奇霉素分子的綴合物。舉例來(lái)說(shuō)，Mylotarg是第一種市售ADC藥物并且利用了卡里奇霉素γ1作為有效負(fù)荷(參見美國(guó)專利號(hào)4,970,198，以引用的方式整體并入)。其它卡里奇霉素衍生物描述于美國(guó)專利號(hào)5,264,586、5,384,412、5,550,246、5,739,116、5,773,001、5,767,285及5,877,296中，全部以引用的方式明確地并入?？股乜ɡ锲婷顾丶易迥軌蛞詠喥つ枬舛犬a(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。對(duì)于卡里奇霉素家族綴合物的制備，參見美國(guó)專利號(hào)5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(都屬于American Cyanamid Company)?？梢允褂玫目ɡ锲婷顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α2I、N-乙?；?γ1I、PSAG及θI1(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等人，Cancer Research58：2925-2928(1998)；及以上提到的屬于American Cyanamid的美國(guó)專利)?？梢跃Y合抗體的另一抗腫瘤藥物是QFA，即，抗葉酸劑?？ɡ锲婷顾睾蚎FA都具有細(xì)胞內(nèi)作用位點(diǎn)并且不易于跨過(guò)質(zhì)膜。因此，這些藥劑通過(guò)抗體介導(dǎo)的內(nèi)化作用被細(xì)胞吸收使其細(xì)胞毒性作用大幅增加。

倍癌霉素

CC-1065(參見4,169,888，以引用的方式并入)和倍癌霉素是ADC中所利用的抗腫瘤抗生素家族的成員。這些抗生素看來(lái)是通過(guò)在DNA小溝中的腺嘌呤N3位進(jìn)行序列選擇性烷基化來(lái)起作用，由此起始了引起細(xì)胞凋亡的一系列事件。

倍癌霉素的重要成員包括倍癌霉素A(美國(guó)專利號(hào)4,923,990，以引用的方式并入)和倍癌霉素SA(美國(guó)專利號(hào)5,101,038，以引用的方式并入)，以及如美國(guó)專利號(hào)7,517,903、7,691,962、5,101,038、5,641,780、5,187,186、5,070,092、5,070,092、5,641,780、5,101,038、5,084,468、5,475,092、5,585,499、5,846,545、WO2007/089149、WO2009/017394A1、5,703,080、6,989,452、7,087,600、7,129,261、7,498,302及7,507,420(全部以引用的方式明確地并入)中所描述的大量類似物。

其它細(xì)胞毒性劑

可以與本發(fā)明的抗體綴合的其它抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲霉素(streptozoicin)、長(zhǎng)春新堿及5-氟尿嘧啶、美國(guó)專利號(hào)5,053,394、5,770,710中所描述的統(tǒng)稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合體的藥劑家族，以及埃斯培拉霉素(美國(guó)專利號(hào)5,877,296)。

可以使用的酶活性酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊諾霉素(enomycin)及霉菌毒素(tricothecene)。參見例如，1993年10月28日公布的WO 93/21232。

本發(fā)明另外涵蓋在抗體與具有核溶解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶，如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的ADC。

為了選擇性破壞腫瘤，抗體可以包含高放射性原子。多種放射性同位素可用于產(chǎn)生放射性綴合的抗體。實(shí)例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。

放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記可以通過(guò)已知方式并入綴合物中。舉例來(lái)說(shuō)，肽可以是生物合成的，或可以通過(guò)使用涉及例如氟-19替代氫的適合氨基酸前驅(qū)物進(jìn)行化學(xué)氨基酸合成進(jìn)行合成。標(biāo)記，如Tc99m或I123、Re186、Re188及In111，可以經(jīng)由肽中的半胱氨酸殘基附接。釔-90可以經(jīng)由賴氨酸殘基附接。IODOGEN法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可以用于并入碘-123?！癕onoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal，CRC Press1989)詳細(xì)描述了其它方法。

對(duì)于包含多種抗體的組合物來(lái)說(shuō)，載藥量由p表示，p是每個(gè)抗體中藥物分子的平均數(shù)量。載藥量可以在每個(gè)抗體1至20個(gè)藥物(D)的范圍內(nèi)。在綴合反應(yīng)的制備中每個(gè)抗體的藥物平均數(shù)量可以通過(guò)常規(guī)方式，如質(zhì)譜法、ELISA檢定及HPLC來(lái)表征。關(guān)于p的抗體-藥物綴合物的定量分布也可以得到測(cè)定。

在一些情形中，可以通過(guò)如反相HPLC或電泳法等方式實(shí)現(xiàn)均勻抗體-藥物綴合物(其中p是某一值)自具有其它載藥量的抗體-藥物綴合物的分離、純化及表征。在示例性實(shí)施方案中，p是2、3、4、5、6、7或8，或其分?jǐn)?shù)。

抗體-藥物綴合復(fù)合物可以通過(guò)熟練技術(shù)人員已知的任何技術(shù)產(chǎn)生。簡(jiǎn)單地說(shuō)，抗體-藥物綴合復(fù)合物可以包括作為抗體單元的多特異性抗體、藥物，及任選存在的接合藥物與結(jié)合劑的連接子。

多種不同反應(yīng)可用于將藥物和/或連接子共價(jià)附接至結(jié)合劑。這可以通過(guò)結(jié)合劑(例如抗體分子)的氨基酸殘基的反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括賴氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游離羧酸基團(tuán)、半胱氨酸的硫氫基及芳香族氨基酸的各種部分。常用的非特異性共價(jià)附接方法是將化合物的羧基(或氨基)連接到抗體的氨基(或羧基)的碳化二亞胺反應(yīng)。另外，使用了如二醛或酰亞胺酯等雙官能試劑來(lái)連接化合物的氨基與抗體分子的氨基。

此外，可用于附接藥物與結(jié)合劑的是席夫堿反應(yīng)。這一方法涉及含有二醇或羥基的藥物的高碘酸鹽氧化，由此形成一種醛，該醛然后與結(jié)合劑反應(yīng)。附接經(jīng)由與結(jié)合劑的氨基形成席夫堿來(lái)發(fā)生。還可以使用異硫氰酸酯作為偶合劑用于共價(jià)地附接藥物與結(jié)合劑。熟練技術(shù)人員已知其它技術(shù)并且這些技術(shù)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，使中間體，即連接子前驅(qū)物與藥物在適當(dāng)條件下反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，使用了藥物和/或中間體上的反應(yīng)性基團(tuán)。藥物與中間體之間的反應(yīng)產(chǎn)物，或衍生化的藥物，隨后與本發(fā)明的多特異性抗體在適當(dāng)條件下反應(yīng)。

應(yīng)理解，出于制備本發(fā)明的綴合物的目的，還可以對(duì)期望的化合物進(jìn)行化學(xué)修飾以便使所述化合物更易于反應(yīng)。舉例來(lái)說(shuō)，可以將官能團(tuán)，例如胺、羥基或硫氫基，附加至藥物中對(duì)該藥物的活性或其它特性具有最小或可接受的影響的位置。

連接子單元

典型地，抗體-藥物綴合復(fù)合物在藥物單元與抗體單元之間包含連接子單元。在一些實(shí)施方案中，連接子在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外條件下是可裂解的，因此該連接子在適當(dāng)環(huán)境中裂解而使藥物單元從該抗體釋放。舉例來(lái)說(shuō)，分泌某些蛋白酶的實(shí)體腫瘤可以用作可裂解連接子的靶；在其它實(shí)施方案中，利用的是細(xì)胞內(nèi)蛋白酶。在又其它實(shí)施方案中，連接子單元是不可裂解的，并且藥物是例如通過(guò)抗體在溶酶體中降解而釋放。

在一些實(shí)施方案中，連接子可以在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中(例如，在溶酶體或核內(nèi)體或細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷內(nèi))存在的裂解劑作用下裂解。連接子可以例如是一種肽基連接子，它被細(xì)胞內(nèi)肽酶或蛋白酶(包括但不限于，溶酶體或核內(nèi)體蛋白酶)裂解。在一些實(shí)施方案中，肽基連接子是至少兩個(gè)氨基酸長(zhǎng)或至少三個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)。

裂解劑可以包括但不限于，組織蛋白酶B和D，及纖溶酶，已知其都水解二肽藥物衍生物，引起活性藥物在靶細(xì)胞內(nèi)部釋放(參見例如，Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123)?？梢员幻噶呀獾碾幕B接子存在于CD38表達(dá)細(xì)胞中。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用能被癌組織中高水平表達(dá)的硫醇依賴性蛋白酶，即組織蛋白酶-B裂解的肽基連接子(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly連接子(SEQ ID NO：X))。此類連接子的其它實(shí)例描述于例如美國(guó)專利號(hào)6,214,345中，以引用的方式整體并入本文中并用于所有目的。

在一些實(shí)施方案中，可以被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶裂解的肽基連接子是Val-Cit連接子或Phe-Lys連接子(參見例如，美國(guó)專利號(hào)6,214,345，該案描述了在val-cit連接子存在下阿霉素的合成)。

在其它實(shí)施方案中，可裂解連接子具有pH敏感性，即，對(duì)在某些pH值下進(jìn)行的水解敏感。典型地，pH敏感性連接子在酸性條件下可水解。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用在溶酶體中可水解的酸不穩(wěn)定性連接子(例如，腙、縮氨基脲、縮氨基硫脲、順-烏頭酰胺、原酸酯、乙縮醛、縮酮等)。(參見例如，美國(guó)專利號(hào)5,122,368、5,824,805、5,622,929；Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123；Neville等人，1989，Biol.Chem.264：14653-14661。)此類連接子在中性pH條件(如在血液中的那些)下相對(duì)穩(wěn)定，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶體的近似pH值)下不穩(wěn)定。在某些實(shí)施方案中，可水解連接子是硫醚連接子(如例如，經(jīng)由酰基腙鍵附接至治療劑的硫醚；參見例如美國(guó)專利號(hào)5,622,929)。

在又其它實(shí)施方案中，連接子可以在還原條件下裂解(例如，二硫化物連接子)。本領(lǐng)域中已知多種二硫化物連接子，包括例如，可以使用SATA(N-琥珀酰亞胺基-5-乙?；虼宜狨?、SPDP(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)及SMPT(N-琥珀酰亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)、SPDB及SMPT形成的那些。(參見例如，Thorpe等人，1987，Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak等人，In Immunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel編，Oxford U.Press，1987。另參見美國(guó)專利號(hào)4,880,935。)

在其它實(shí)施方案中，連接子是丙二酸酯連接子(Johnson等人，1995，Anticancer Res.15：1387-93)、順丁烯二酰亞胺基苯甲酰基連接子(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3’-N-酰胺類似物(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。

在又其它實(shí)施方案中，連接子單元是不可裂解的，并且藥物是通過(guò)抗體降解來(lái)釋放。(參見美國(guó)公布號(hào)2005/0238649，以引用的方式整體并入本文中并用于所有目的)。

在許多實(shí)施方案中，連接子是自降解的。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“自降解性間隔子”是指能夠?qū)蓚€(gè)隔開的化學(xué)部分共價(jià)連接在一起成為分三部分的穩(wěn)定分子的雙官能化學(xué)部分。如果其與第一部分的鍵裂解，那么其將自發(fā)與第二化學(xué)部分分離。參見例如，WO2007059404A2、WO06110476A2、WO05112919A2、WO2010/062171、WO09/017394、WO07/089149、WO 07/018431、WO04/043493及WO02/083180，這些專利是針對(duì)藥物-可裂解基質(zhì)綴合物，其中藥物和可裂解基質(zhì)任選通過(guò)自降解性連接子連接，并且全部都以引用的方式明確地并入。

通常，連接子對(duì)于細(xì)胞外環(huán)境基本上不敏感。如本文所使用，就連接子來(lái)說(shuō)，“對(duì)于細(xì)胞外環(huán)境基本上不敏感”意味著，當(dāng)抗體-藥物綴合復(fù)合物存在于細(xì)胞外環(huán)境(例如，血漿)中時(shí)，抗體-藥物綴合復(fù)合物樣品中不超過(guò)約20％、15％、10％、5％、3％或不超過(guò)約1％的連接子裂解。

可以例如通過(guò)將抗體-藥物綴合復(fù)合物與血漿一起溫育預(yù)定時(shí)間段(例如2、4、8、16或24小時(shí))，然后對(duì)血漿中存在的游離藥物的量進(jìn)行定量，來(lái)確定連接子是否對(duì)于細(xì)胞外環(huán)境基本上不敏感。

在其它不相互排斥的實(shí)施方案中，連接子促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化。在某些實(shí)施方案中，連接子當(dāng)與治療劑綴合(也就是說(shuō)，在如本文所描述的抗體-藥物綴合復(fù)合物的連接子-治療劑部分的環(huán)境下)時(shí)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化。在又其它實(shí)施方案中，連接子當(dāng)與奧瑞他汀化合物和本發(fā)明的多特異性抗體綴合時(shí)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化。

可以用于本發(fā)明的組合物和方法的多種示例性連接子描述于WO 2004-010957、美國(guó)公布號(hào)2006/0074008、美國(guó)公布號(hào)20050238649及美國(guó)公布號(hào)2006/0024317中(其各自以引用的方式并入本文中并用于所有目的)。

載藥量

載藥量是以p表示并且是分子中每個(gè)抗體的藥物部分的平均數(shù)量。載藥量(“p”)可以是每個(gè)抗體1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)部分(D)，不過(guò)平均數(shù)量常常是分?jǐn)?shù)或小數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，載藥量為1至4常常是有用的，并且1至2也是有用的。本發(fā)明的ADC包括抗體與一系列藥物部分(1至20個(gè))的綴合物的集合。在由綴合反應(yīng)制備的ADC中每個(gè)抗體的藥物部分的平均數(shù)量可以通過(guò)常規(guī)方式，如質(zhì)譜法和ELISA檢定來(lái)表征。

就p來(lái)說(shuō)，ADC的定量分布也可以得到測(cè)定。在一些情形中，可以通過(guò)如或電泳法等方式實(shí)現(xiàn)均勻ADC(其中p是某一值)自具有其它載藥量的ADC的分離、純化及表征。

對(duì)于一些抗體-藥物綴合物，p可能受抗體上附接位點(diǎn)的數(shù)量限制。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)附接點(diǎn)是半胱氨酸硫醇時(shí)，如在以上示例性實(shí)施方案中，抗體可以僅具有一個(gè)或若干個(gè)半胱氨酸硫醇基，或可能僅具有一個(gè)或若干個(gè)可以附接連接子的具有足夠反應(yīng)性的硫醇基。在某些實(shí)施方案中，較高的載藥量，例如p＞5，可能引起某些抗體-藥物綴合物聚集、不溶解、毒性或是細(xì)胞滲透性損失。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的載藥量范圍是1至約8；約2至約6；約3至約5；約3至約4；約3.1至約3.9；約3.2至約3.8；約3.2至約3.7；約3.2至約3.6；約3.3至約3.8；或約3.3至約3.7。實(shí)際上，經(jīng)顯示，對(duì)于某些ADC，每個(gè)抗體的最佳藥物部分比率可以低于8，并且可以是約2至約5。參見US 2005-0238649 A1(以引用的方式整體并入本文中)。

在某些實(shí)施方案中，低于理論最大量的藥物部分在綴合反應(yīng)期間與抗體綴合?？贵w可以含有例如不與藥物-連接子中間體或連接子試劑(如以下所論述)反應(yīng)的賴氨酸殘基。一般來(lái)說(shuō)，抗體包含許多游離的反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基，這些基團(tuán)可以連接至藥物部分；實(shí)際上，抗體中大部分的半胱氨酸硫醇?xì)埢且远驑蛐问酱嬖?。在某些?shí)施方案中，抗體可以在部分或總體還原條件下被如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)等還原劑還原，產(chǎn)生反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基。在某些實(shí)施方案中，抗體經(jīng)歷變性條件，由此展現(xiàn)反應(yīng)性親核基團(tuán)，如賴氨酸或半胱氨酸。

ADC的負(fù)荷(藥物/抗體比)可以通過(guò)不同方式控制，例如：(i)限制藥物-連接子中間體或連接子試劑相對(duì)于抗體的摩爾過(guò)量；(ii)限制綴合反應(yīng)時(shí)間或溫度；(iii)針對(duì)半胱氨酸硫醇修飾的部分或限制性還原條件；(iv)通過(guò)重組技術(shù)對(duì)抗體的氨基酸序列進(jìn)行工程改造，由此修飾半胱氨酸殘基的數(shù)量和位置以控制連接子-藥物附接的數(shù)量和/或位置(如本文及WO2006/034488(以引用的方式整體并入本文中)中所公開而制備的硫代Mab或硫代Fab)。

應(yīng)理解，在超過(guò)一個(gè)親核基團(tuán)與藥物-連接子中間體或連接子試劑，隨后藥物部分試劑反應(yīng)的情況下，所得產(chǎn)物是分布有附接至抗體的一個(gè)或多個(gè)藥物部分的ADC復(fù)合物的混合物。每個(gè)抗體的平均藥物數(shù)量可以由該混合物，通過(guò)雙重ELISA抗體檢定來(lái)計(jì)算，該檢定對(duì)于抗體具有特異性并且對(duì)于藥物具有特異性?？梢酝ㄟ^(guò)質(zhì)譜法鑒別出該混合物中的個(gè)別ADC分子，并通過(guò)HPLC，例如疏水相互作用色譜法進(jìn)行分離。

在一些實(shí)施方案中，具有單一負(fù)荷值的均勻ADC可以通過(guò)電泳或色譜法從綴合混合物分離。

測(cè)定ADC的細(xì)胞毒性作用的方法

已知確定藥物或抗體-藥物綴合物是否對(duì)細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞抑制作用和/或細(xì)胞毒性作用的方法。一般來(lái)說(shuō)，抗體藥物綴合物的細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性可以通過(guò)以下方式測(cè)量：使表達(dá)抗體藥物綴合物的靶蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于細(xì)胞培養(yǎng)基中；培養(yǎng)細(xì)胞約6小時(shí)至約5天的時(shí)間；及測(cè)量細(xì)胞活力?？梢允褂没诩?xì)胞的體外檢定來(lái)測(cè)量抗體藥物綴合物的活力(增殖)、細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用(胱天蛋白酶活化)。

為了確定抗體藥物綴合物是否發(fā)揮細(xì)胞抑制作用，可以使用胸苷并入檢定。舉例來(lái)說(shuō)，可以將以5,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中的表達(dá)靶抗原的癌細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)時(shí)間，并使其在該72小時(shí)時(shí)間的最后8小時(shí)里暴露于0.5μCi的3H-胸苷。在存在和不存在抗體藥物綴合物情況下測(cè)量培養(yǎng)的細(xì)胞中3H-胸苷的并入。

為測(cè)定細(xì)胞毒性，可以測(cè)量壞死或細(xì)胞凋亡(程序式細(xì)胞死亡)。壞死典型地伴隨質(zhì)膜滲透性的增加；細(xì)胞膨脹；及質(zhì)膜的破裂。細(xì)胞凋亡典型地以膜起泡、細(xì)胞質(zhì)濃縮及內(nèi)源性內(nèi)切核酸酶活化為特征。這些針對(duì)癌細(xì)胞的作用的任一種的測(cè)定表明，抗體藥物綴合物可用于治療癌癥。

細(xì)胞活力可以通過(guò)測(cè)定細(xì)胞中如中性紅、臺(tái)盼藍(lán)或ALAMAR^TM藍(lán)等染料的吸收情況來(lái)測(cè)量(參見例如，Page等人，1993，Intl.J.Oncology 3：473-476)。在此類檢定中，在含有染料的培養(yǎng)基中培育細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，并通過(guò)分光光度法測(cè)量殘留的染料，由此反映染料的細(xì)胞吸收。還可以使用蛋白質(zhì)結(jié)合染料磺基若丹明B(sulforhodamine B，SRB)來(lái)測(cè)量細(xì)胞毒性(Skehan等人，1990，J.Natl.Cancer Inst.82：1107-12)。

作為替代，在通過(guò)檢測(cè)活細(xì)胞而非死細(xì)胞進(jìn)行的有關(guān)哺乳動(dòng)物細(xì)胞存活和增殖情況的定量比色檢定中使用四唑鹽，如MTT(參見例如，Mosmann，1983，J.Immunol.Methods 65：55-63)。

細(xì)胞凋亡可以通過(guò)測(cè)量例如DNA片段化進(jìn)行定量?？捎蒙虡I(yè)上的光度測(cè)定法在體外定量測(cè)定DNA片段化。此類檢定的實(shí)例，包括TUNEL(用于檢測(cè)片段化DNA中并入的標(biāo)記的核苷酸)和基于ELISA的檢定，描述于Biochemica，1999，第2期，第34-37頁(yè)(Roche Molecular Biochemicals)中。

還可以通過(guò)測(cè)量細(xì)胞形態(tài)的變化來(lái)確定細(xì)胞凋亡。舉例來(lái)說(shuō)，與壞死相同，可以通過(guò)測(cè)量某些染料(例如熒光染料，如例如吖啶橙或溴乙錠)的吸收情況來(lái)確定質(zhì)膜完整性的喪失。用于測(cè)量凋亡細(xì)胞數(shù)量的方法描述于Duke和Cohen，Current Protocols in Immunology(Coligan等人編，1992，第3.17.1-3.17.16頁(yè))中。細(xì)胞也可以用DNA染料(例如吖啶橙、溴乙錠或碘丙錠)標(biāo)記，并觀察細(xì)胞的染色質(zhì)縮合和邊集情況以及內(nèi)核膜?？梢越?jīng)過(guò)測(cè)量以測(cè)定細(xì)胞凋亡的其它形態(tài)變化包括例如，細(xì)胞質(zhì)濃縮、膜起泡增加及細(xì)胞收縮。

凋亡細(xì)胞的存在可以在培養(yǎng)物的附著部分和“漂浮”部分中測(cè)量。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)去除上清液，使附著的細(xì)胞胰蛋白酶化，合并在離心洗滌步驟(例如，2000rpm下10分鐘)之后得到的標(biāo)本，并檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(例如，通過(guò)測(cè)量DNA片段化)來(lái)收集兩個(gè)部分。(參見例如，Piazza等人，1995，Cancer Research 55：3110-16)。

在體外，可以在適合動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)本發(fā)明的多特異性抗體的治療性組合物的作用。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用異體癌癥模型，其中將癌癥外植體或傳代的異種移植組織引入免疫功能低下的動(dòng)物，如裸小鼠或SCID小鼠中(Klein等人，1997，Nature Medicine 3：402-408)?？梢允褂脺y(cè)量腫瘤形成、腫瘤消退或轉(zhuǎn)移抑制等的檢定來(lái)測(cè)量功效。

用于實(shí)行前述方法的治療性組合物可以配制成包含適于期望的遞送方法的載劑的藥物組合物。適合載劑包括當(dāng)與治療性組合物組合時(shí)保持治療性組合物的抗腫瘤功能并且一般不與患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的任何物質(zhì)。實(shí)例包括但不限于，多種標(biāo)準(zhǔn)藥物載劑，如無(wú)菌磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液、抑菌水等(一般參見，Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，A.Osal.編，1980)。

供體外施用的抗體組合物

根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的配制物是通過(guò)將具有期望的純度的抗體與可選的藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編[1980])混合來(lái)制備，這些配制物是呈凍干的配制物或水溶液形式?？山邮艿妮d劑、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對(duì)接受者無(wú)毒，并且包括：緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)；芐索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷酯，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽平衡離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；及/或非離子型表面活性劑，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文中的配制物根據(jù)所治療的特定適應(yīng)癥的需要，還可以含有超過(guò)一種活性化合物，優(yōu)選具有不會(huì)彼此不利地影響的互補(bǔ)活性的那些活性化合物。舉例來(lái)說(shuō)，可能期望提供具有其它特異性的抗體。作為替代，或除此之外，組合物可以包含細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)抑制劑和/或小分子拮抗劑。此類分子宜以有效達(dá)成預(yù)定目的的量組合存在。

活性成分還可以覆埋在例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合所制備的微囊中，例如分別覆埋在膠狀藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳液、納米粒子及納米膠囊)中或在巨乳液中的羥甲基纖維素或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊。這些技術(shù)公開于Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編(1980)中。

打算用于體內(nèi)施用的配制物應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌或近似無(wú)菌的。這易于通過(guò)濾過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜來(lái)實(shí)現(xiàn)。

可以制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的適合實(shí)例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透性基質(zhì)，這些基質(zhì)呈成形物品，例如薄膜或微囊的形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國(guó)專利號(hào)3,773,919)、L-谷氨酸與L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構(gòu)成的可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠在100天內(nèi)釋放分子，而某些水凝膠在更短時(shí)間段內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。

當(dāng)囊封的抗體在體內(nèi)保持較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，其可能由于在37℃下暴露于水分而變性或聚集，由此導(dǎo)致生物活性喪失及可能的免疫原性變化。取決于所涉及的機(jī)制，可以設(shè)計(jì)合理的策略實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。舉例來(lái)說(shuō)，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)硫醇-二硫化物交換而形成分子間S-S鍵，那么可以通過(guò)修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍干、控制水分含量、使用適當(dāng)添加劑及產(chǎn)生特定聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。

施用方法

本發(fā)明的抗體和化學(xué)治療劑是根據(jù)已知方法，如以推注或通過(guò)經(jīng)一段時(shí)間連續(xù)輸注進(jìn)行靜脈內(nèi)施用、通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、外敷或吸入途徑施用給受試者。優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下施用所述抗體。

治療方法

在本發(fā)明的方法中，使用了療法來(lái)提供針對(duì)疾病或病癥的陽(yáng)性治療反應(yīng)?！瓣?yáng)性治療反應(yīng)”意圖指疾病或病癥的改善，和/或與該疾病或病癥有關(guān)的癥狀的改善。舉例來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性治療反應(yīng)是指以下疾病改善中的一種或多種：(1)贅生細(xì)胞的數(shù)量減少；(2)贅生細(xì)胞死亡增加；(3)贅生細(xì)胞存活受抑制；(5)腫瘤生長(zhǎng)抑制(即，在某種程度上減慢，優(yōu)選停止)；(6)患者存活率增加；及(7)與疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的一定程度減輕。

在任何給定疾病或病癥中的陽(yáng)性治療反應(yīng)可以通過(guò)該疾病或病癥特有的標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定。腫瘤反應(yīng)可以使用篩查技術(shù)，如磁共振成像(MRI)掃描、x線放射成像、計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)掃描、骨掃描成像、內(nèi)窺鏡檢查，及腫瘤活檢取樣，包括骨髓穿刺(BMA)和循環(huán)中腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)等，通過(guò)腫瘤形態(tài)的變化(即，總腫瘤負(fù)荷、腫瘤尺寸等)來(lái)評(píng)估腫瘤反應(yīng)。

除這些陽(yáng)性治療反應(yīng)外，經(jīng)歷療法的受試者還可能經(jīng)歷疾病相關(guān)癥狀改善的有益作用。

因此，對(duì)于B細(xì)胞腫瘤來(lái)說(shuō)，受試者可能經(jīng)歷所謂的B癥狀，即，盜汗、發(fā)熱、體重減輕和/或風(fēng)疹的減少。對(duì)于惡變前病癥，利用多特異性治療劑的療法可以阻止相關(guān)惡性病癥的發(fā)展和/或延長(zhǎng)相關(guān)惡性病癥發(fā)展前的時(shí)間，例如，罹患意義未明單克隆丙球蛋白病(MGUS)的受試者的多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展。

疾病的改善可以通過(guò)完全反應(yīng)表征?！巴耆磻?yīng)”意圖指不存在臨床上可檢測(cè)的疾病以及任何先前異常的放射成像研究(就骨髓瘤來(lái)說(shuō)，骨髓和腦脊髓液(CSF)或異常單克隆蛋白質(zhì))的正常化。

此類反應(yīng)可以在根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療之后持續(xù)至少4至8周，或有時(shí)是6至8周。作為替代，疾病的改善可以歸類為部分反應(yīng)?！安糠址磻?yīng)”意圖指在無(wú)新病變存在下，所有可測(cè)量的腫瘤負(fù)荷(即，受試者體內(nèi)存在的惡性細(xì)胞的數(shù)量，或測(cè)量的腫塊體積，或異常單克隆蛋白質(zhì)的量)的至少50％降低，該反應(yīng)可以持續(xù)4至8周，或6至8周。

根據(jù)本發(fā)明的治療包括“治療有效量”的所用藥劑?！爸委熡行Я俊笔侵敢运鑴┝坎⑶以谒钑r(shí)間段內(nèi)有效達(dá)成期望的治療結(jié)果的量。

治療有效量可以根據(jù)多種因素而變化，如疾病狀態(tài)；個(gè)體的年齡、性別及體重；以及藥物在個(gè)體中引起期望的反應(yīng)的能力。治療有效量還是抗體或抗體部分的治療有益作用超過(guò)其任何有毒或有害作用的量。

腫瘤療法的“治療有效量”還可以通過(guò)其使疾病進(jìn)展穩(wěn)定的能力來(lái)測(cè)量。一種化合物抑制癌癥的能力可以在預(yù)測(cè)在人類腫瘤中的功效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)。

作為替代，組合物的這種特性可以通過(guò)用熟練從業(yè)人員已知的體外檢定檢查化合物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力來(lái)評(píng)價(jià)。治療化合物的治療有效量可以減小腫瘤大小，或以其它方式改善受試者的癥狀。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠基于如受試者的體格、受試者癥狀的嚴(yán)重程度及所選特定組合物或施用途徑等因素確定此類量。

劑量方案經(jīng)調(diào)整以提供最佳的期望反應(yīng)(例如治療反應(yīng))。舉例來(lái)說(shuō)，可以施用單次推注；可以隨時(shí)間投與若干分次劑量；或可以按治療情況的緊急性指示按比例減小或增加劑量。不經(jīng)腸組合物可以配制成單位劑型以便劑量的施用和均一性。如本文中所使用，單位劑型是指適合作為單一劑量用于待治療的受試者的物理離散單元；每一單元含有經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生期望的治療作用的預(yù)定量的活性化合物與所需藥物載劑的組合。

本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格是由以下因素規(guī)定并且直接取決于以下因素：(a)活性化合物的獨(dú)特特征及有待實(shí)現(xiàn)的特定治療作用，及(b)本領(lǐng)域中混配此類活性化合物用于治療個(gè)體的敏感性所固有的局限。

用于本發(fā)明中的多特異性抗體的有效劑量和劑量方案取決于有待治療的疾病或病癥，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

用于本發(fā)明中的多特異性抗體的治療有效量的示例性、非限制性范圍是約0.1-100mg/kg，如約0.1-50mg/kg，例如約0.1-20mg/kg，如約0.1-10mg/kg，例如約0.5mg/kg，如約0.3mg/kg、約1mg/kg或約3mg/kg。在另一實(shí)施方案中，施用的抗體劑量是1mg/kg或更高，如1至20mg/kg劑量，例如5至20mg/kg劑量，例如8mg/kg劑量。

具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的醫(yī)療從業(yè)人員能容易地確定所需藥物組合物的有效量并開具處方。舉例來(lái)說(shuō)，醫(yī)師或獸醫(yī)可以低于獲得所期望的治療作用所需劑量的劑量的以藥物組合物形式使用的藥物開始，并逐步增加劑量直到達(dá)到所期望的作用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是以10至500mg/kg，如200至400mg/kg的周劑量通過(guò)輸注施用。此類施用可以重復(fù)例如1至8次，如3至5次。施用可以通過(guò)經(jīng)2至24小時(shí)，如2至12小時(shí)時(shí)間連續(xù)輸注來(lái)進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是經(jīng)一段較長(zhǎng)時(shí)間，必要時(shí)超過(guò)24小時(shí)，通過(guò)緩慢連續(xù)輸注施用，以降低副作用，包括毒性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是以250mg至2000mg，如例如300mg、500mg、700mg、1000mg、1500mg或2000mg周劑量施用，達(dá)8次，如4至6次。施用可以通過(guò)經(jīng)2至24小時(shí)，如2至12小時(shí)時(shí)間連續(xù)輸注來(lái)進(jìn)行。必要時(shí)，此方案可以在例如6個(gè)月或12個(gè)月后重復(fù)一次或多次。可以通過(guò)在施用后，例如取出生物樣品測(cè)量血液中本發(fā)明化合物的量，并使用靶向多特異性抗體的抗原結(jié)合區(qū)的抗獨(dú)特性抗體來(lái)測(cè)定或調(diào)整劑量。

在另一實(shí)施方案中，每周施用一次多特異性抗體，持續(xù)2至12周，如3至10周，如4至8周。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)維持療法施用多特異性抗體，例如一周一次，持續(xù)6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)包括輸注一次多特異性抗體，隨后輸注多特異性抗體與放射性同位素的綴合物的方案，施用多特異性抗體。該方案可以例如在7至9天后重復(fù)進(jìn)行。

在非限制性實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的治療可以按抗體的日劑量，在起始治療后第1天、2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天、第30天、第31天、第32天、第33天、第34天、第35天、第36天、第37天、第38天、第39天或第40天中至少一天，或者第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第9周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周、第16周、第17周、第18周、第19周或第20周中至少一周，或其任何組合，使用單次劑量，或每24小時(shí)、12小時(shí)、8小時(shí)、6小時(shí)、4小時(shí)或2小時(shí)，或其任何組合以分次劑量以每天約0.1-100mg/kg，如0.5mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg的量提供。

在一些實(shí)施方案中，其多特異性抗體分子是與一種或多種另外的治療劑，例如化學(xué)治療劑組合使用。DNA損傷性化學(xué)治療劑的非限制性實(shí)例包括拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑(例如伊立替康、拓?fù)涮婵?、喜樹堿及其類似物或代謝物，以及阿霉素)；拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑(例如，依托泊苷、替尼泊苷及道諾霉素)；烷化劑(例如，美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、噻替哌、異環(huán)磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、鏈佐星、達(dá)卡巴嗪(decarbazine)、甲氨蝶呤、絲裂霉素C及環(huán)磷酰胺)；DNA嵌入劑(例如，順鉑、奧沙利鉑及卡鉑)；DNA嵌入劑和自由基產(chǎn)生劑如博萊霉素；及核苷模擬物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitibine)、吉西他濱、氟達(dá)拉濱、阿糖胞苷、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁及羥基脲)。

破壞細(xì)胞復(fù)制的化學(xué)治療劑包括：太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽及相關(guān)類似物；長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿及相關(guān)類似物；沙立度胺、來(lái)那度胺及相關(guān)類似物(例如CC-5013和CC-4047)；蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑(例如甲磺酸伊馬替尼和吉非替尼)；蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米)；NF-κB抑制劑，包括IκB激酶抑制劑；結(jié)合至癌癥中過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)并由此下調(diào)細(xì)胞復(fù)制的抗體(例如曲妥珠單抗、利妥昔單抗、西妥昔單抗及貝伐單抗)；及其它已知在癌癥中上調(diào)、過(guò)表達(dá)或活化的蛋白質(zhì)或酶的抑制劑，這些蛋白質(zhì)或酶的抑制使細(xì)胞復(fù)制下調(diào)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以在用(硼替佐米)治療之前、同時(shí)或之后使用。

所有引用的參考文獻(xiàn)都以引用的方式整體明確地并入本文中。

盡管以上出于說(shuō)明的目的描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不背離所附權(quán)利要求書中所描述的本發(fā)明的情況下，可以對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行多種變更。

實(shí)施例

以下提供實(shí)施例以說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例不打算將本發(fā)明局限于任何特定應(yīng)用或操作理論。對(duì)于本發(fā)明中論述的所有恒定區(qū)，編號(hào)是根據(jù)Kabat中的EU索引(Kabat等人，1991，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，United States Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，以引用的方式整體并入)。抗體領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，這一慣例由免疫球蛋白序列特定區(qū)域中的非順次編號(hào)組成，由此能夠歸一化提及免疫球蛋白家族中的保守位置。因此，通過(guò)EU索引定義的任何給定免疫球蛋白的位置不必對(duì)應(yīng)于其順次序列。

實(shí)施例1.原型“三F”雙特異性抗體。

本發(fā)明描述了共接合第一抗原和第二抗原的新型免疫球蛋白組合物?？贵w的一條重鏈含有單鏈Fv(“scFv”，如本文所定義)，而另一重鏈?zhǔn)恰俺Ｒ?guī)”Fab形式，包含可變重鏈和輕鏈(參見圖1)。這一結(jié)構(gòu)在本文中有時(shí)稱為“三F”形式(scFv-Fab-Fc)。兩條鏈通過(guò)二聚體Fc區(qū)連在一起(參見圖2)。Fc區(qū)可以通過(guò)氨基酸取代進(jìn)行修飾以便能有效純化“三F”異二聚體。另外，F(xiàn)c區(qū)可以通過(guò)氨基酸取代進(jìn)行修飾以促進(jìn)“三F”異二聚體的形成。以下更完整地描述Fc取代的實(shí)例。

“三F”形式中可以包括Fc取代以便能相對(duì)于不希望的雙scFv-Fc和mAb同二聚體，有效地純化出所希望的“三F”異二聚體。此情形的一個(gè)實(shí)例是納入改變每個(gè)單體的等電點(diǎn)(pI)，以使每個(gè)單體具有不同pI的Fc取代。在這一情形中，所期望的“三F”異二聚體的pI將不同于不希望的雙scFv-Fc和mAb同二聚體，由此促進(jìn)“三F”異二聚體的等電純化(例如，陰離子交換色譜柱、陽(yáng)離子交換色譜柱)。這些取代還有助于純化后(例如IEF凝膠、cIEF及分析型IEX柱)任何污染性雙scFv-Fc和mAb同二聚體的測(cè)定和監(jiān)測(cè)。有關(guān)可以在Fc單體1和Fc單體2中進(jìn)行以便能有效純化所期望的“三F”異二聚體的取代的清單，參見圖3。

“三F”形式中可以包括Fc取代以便相對(duì)于不希望的雙scFv-Fc和mAb同二聚體，使形成“偏向”于所期望的“三F”異二聚體。舉例來(lái)說(shuō)，有關(guān)可以在Fc單體1和Fc單體2中進(jìn)行以使制造“偏向”于“三F”異二聚體的取代的清單，參見圖4。圖3和圖4中所列的氨基酸取代可以組合，以增加可以與任何污染性雙scFv-Fc和mAb同二聚體純化分離的“三F”異二聚體的產(chǎn)率。

在優(yōu)化“三F”形式中所包括的scFv結(jié)構(gòu)域之后，可以通過(guò)一種便利的方式將優(yōu)化的scFv結(jié)構(gòu)域與多條標(biāo)準(zhǔn)抗體重鏈偶合。舉例來(lái)說(shuō)，用于募集T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抗CD3scFv可以與多條抗腫瘤抗原抗體重鏈(例如，結(jié)合CD5、CD20、CD30、CD40、CD33、CD38、EGFR、EpCAM、Her2、HM1.24或其它腫瘤抗原的那些)偶合。宜與標(biāo)準(zhǔn)抗體重鏈偶合的優(yōu)化的scFv結(jié)構(gòu)域的其它實(shí)例包括有關(guān)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抗CD16 scFv；有關(guān)抑制活性的抗CD32b scFv(此處，偶合的抗體重鏈將結(jié)合例如CD19、CD40、CD79a、CD79b或其它免疫受體)；及有關(guān)跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體scFv、抗胰島素受體或抗LRP1。

實(shí)施例2.來(lái)源于“三F”形式的多特異性抗體。

可以通過(guò)將結(jié)合第三抗原的另外的scFv或Fab結(jié)構(gòu)域附接至“三F”重鏈之一的C末端來(lái)構(gòu)建多特異性抗體。參看例如圖5。作為替代，C末端scFv或Fab可以結(jié)合第一抗原或第二抗原，由此賦予二價(jià)并增加對(duì)該抗原的總體結(jié)合親和力。

還可以通過(guò)將“三F”形式的scFv-Fc重鏈與重排的抗體重鏈偶合來(lái)構(gòu)建多特異性抗體，如圖6中所描繪。此類重排抗體重鏈可以包括結(jié)合第三抗原的另外的Fv區(qū)，或者結(jié)合第一抗原或第二抗原的另外的Fv區(qū)，由此賦予二價(jià)并增加對(duì)該抗原的總體結(jié)合親和力。

實(shí)施例3.抗CD19 Fab x抗CD3 scFv“三F”雙特異性抗體。

抗CD19 Fab x抗CD3 scFv“三F”雙特異性抗體的氨基酸序列列于附圖中。能夠相對(duì)于不希望的雙scFv-Fc和mAb同二聚體有效純化出所希望的“三F”異二聚體的氨基酸取代加下劃線。優(yōu)選的人源化抗CD3可變區(qū)的氨基酸序列列于圖2和圖6中(其中CDR加下劃線)。以下給出表達(dá)和純化所希望的“三F”物質(zhì)及其生物活性的一些實(shí)施例。

圖9中略述了XENP11874的產(chǎn)生，其為具有抗CD19 Fab和抗CD3 scFv的“三F”雙特異性抗體。在圖9A中，顯示出通過(guò)離子交換從不希望的雙scFv-Fc和mAb同二聚體純化出希望的“三F”異二聚體。通過(guò)IEF凝膠檢查“三F”部分的純度(數(shù)據(jù)示于USSN 61/818,410的圖9B中，該案所有附圖和圖例以引用的方式明確地并入)。最后，使用SEC確定“三F”產(chǎn)物的均勻尺寸(數(shù)據(jù)示于USSN 61/818,410的圖9C中，該案所有附圖和圖例以引用的方式明確地并入)。

經(jīng)顯示，XENP11874，即抗CD19 Fab x抗CD3 scFv“三F”雙特異性抗體具有有效生物活性。XENP11874有效募集T細(xì)胞以清除B細(xì)胞的能力顯示于USSN 61/818,410的圖10中，該案以引用的方式明確地并入。

USSN 61/818,410的圖11(以引用的方式明確地并入)中略述了XENP11924的產(chǎn)生，其為具有抗CD19 Fab和抗CD3 scFv的“三F”雙特異性抗體。在USSN 61/818,410的圖11A中，顯示出通過(guò)離子交換從不希望的雙scFv-Fc和mAb同二聚體純化出希望的“三F”異二聚體。如圖11B(USSN 61/818,410)中所示，通過(guò)IEF凝膠檢查“三F”部分的純度。最后，使用SEC確定“三F”產(chǎn)物的均勻尺寸(參見例如USSN 61/818,410的圖11C中)。

經(jīng)顯示，XENP11924，即抗CD19 Fab x抗CD3 scFv“三F”雙特異性抗體具有有效生物活性。XENP11924有效募集T細(xì)胞以殺傷Raji腫瘤細(xì)胞系的能力顯示于USSN 61/818,410的圖12中。

實(shí)施例4.抗CD38 Fab x抗CD3 scFv“三F”雙特異性抗體。

抗CD38 Fab x抗CD3scFv“三F”雙特異性抗體的氨基酸序列列于USSN 61/818,410的圖13中。能夠相對(duì)于不希望的雙scFv-Fc和mAb同二聚體有效純化出所希望的“三F”異二聚體的氨基酸取代加下劃線。以下給出表達(dá)和純化所希望的“三F”物質(zhì)及其生物活性的一些實(shí)施例。

USSN 61/818,410的圖14中略述了XENP11925的產(chǎn)生，其為具有抗CD38 Fab和抗CD3 scFv的“三F”雙特異性抗體。在USSN61/818,410的圖14A中，顯示出通過(guò)離子交換從不希望的雙scFv-Fc和mAb同二聚體純化出希望的“三F”異二聚體。如USSN 61/818,410的圖14B中所示，通過(guò)IEF凝膠檢查“三F”部分的純度。最后，使用SEC確定“三F”產(chǎn)物的均勻尺寸(參見例如USSN 61/818,410的圖14C中)。

經(jīng)顯示，XENP11925，即抗CD38 Fab x抗CD3 scFv“三F”雙特異性抗體具有有效生物活性。XENP11925有效募集T細(xì)胞以殺傷RPMI8226腫瘤細(xì)胞系的能力顯示于USSN 61/818,410的圖15中。

實(shí)施例5.使pI改變的同型恒定區(qū)變體不穩(wěn)定的鑒別和修復(fù)。

如以上所描述，可以嘗試通過(guò)利用IgG子類(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)之間的同型差異使增加或降低pI的取代引起免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)降到最低?；谶@一原理，設(shè)計(jì)出一組新的新型同型。這些新變體稱為ISO(-)、ISO(+)及ISO(+RR)。在鉸鏈-CH2-CH3(H-CH2-CH3)系統(tǒng)(僅Fc區(qū))中確定這些新型同型的熱穩(wěn)定性。如以上所描述，表達(dá)并純化蛋白質(zhì)。這一概念驗(yàn)證系統(tǒng)的序列列于圖16中。

利用差示掃描量熱法(DSC)測(cè)定的熱穩(wěn)定性測(cè)量值(圖17)揭示，I SO(-)/ISO(+RR)異二聚體(XENP12488，其序列參看圖16)不如野生型IgG1(XENP8156，其序列參看圖16)穩(wěn)定。隨后的工程改造嘗試鑒別出ISO(-)重鏈中的取代N384S/K392N/M397V為不穩(wěn)定的來(lái)源。因此，設(shè)計(jì)出稱為ISO(-NKV)的變體并進(jìn)行測(cè)試(參看圖16)。在這一變體中，384位、392位及397位被復(fù)原成野生型IgG1(S384N/N392K/M397V)。通過(guò)DSC測(cè)量ISO(-NKV)/ISO(+RR)異二聚體(XENP12757，其序列參看圖16)的熱穩(wěn)定性并發(fā)現(xiàn)與野生型IgG1的熱穩(wěn)定性相當(dāng)(圖17)。這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了選擇或不選擇改變pI的特定同型取代以避免引起不穩(wěn)定的因素的重要性。

實(shí)施例6.另外的異二聚體偏向Fc變體。

如以上所描述，可以制備異二聚體偏向Fc變體以相對(duì)于不希望的同二聚體，傾向于形成希望的異二聚體。在鉸鏈-CH2-CH3系統(tǒng)(僅Fc區(qū))中設(shè)計(jì)出另外的異二聚體偏向Fc變體L368D/K370S-S364K/E357Q(XENP12760，其序列參看圖18)并進(jìn)行測(cè)試。如以上所描述，表達(dá)并純化蛋白質(zhì)。

使用陽(yáng)離子交換(CIEX)色譜柱，通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)檢查僅在單鏈蛋白質(zhì)A純化步驟后存在的蛋白質(zhì)(參看圖19)。此允許相對(duì)于不希望的同二聚體測(cè)定希望的異二聚體的產(chǎn)率。L368D/K370S-S364K/E357Q變體(XENP12760，圖19下圖)的存在相對(duì)于不存在這一變體(XENP12757，圖19頂圖)的情形引入了對(duì)于所希望的異二聚體的形成的極強(qiáng)偏好。應(yīng)注意，具有L368D/K370S-S364K/E357Q變體的異二聚體的產(chǎn)率是95.8％，而不具有該變體的異二聚體的產(chǎn)率僅52.7％。

此外，設(shè)計(jì)出另外的異二聚體偏向Fc變體并進(jìn)行測(cè)試。圖36顯示了一系列工程改造的異二聚體偏向Fc變體以及異二聚體產(chǎn)率(通過(guò)HPLC-CIEX測(cè)定)和熱穩(wěn)定性(通過(guò)DSC測(cè)定)。特別優(yōu)選具有較高異二聚體產(chǎn)率和較高熱穩(wěn)定性的L368D/K370S-S364K/E357Q變體。

實(shí)施例7.在Fab-scFv-Fc背景下的另外的異二聚體偏向Fc變體。

將異二聚體偏向Fc變體L368D/K370S-S364K/E357Q工程改造成抗CD19 x抗CD3Fab-scFv-Fc(有關(guān)氨基酸序列，參看圖15)。對(duì)照Fab-scFv-Fc XENP13228缺乏這些異二聚體偏向Fc變體。利用等電聚焦(IEF)凝膠檢查僅在單鏈蛋白質(zhì)A純化步驟后存在的蛋白質(zhì)。此允許相對(duì)于不希望的同二聚體測(cè)定希望的異二聚體的產(chǎn)率。L368D/K370S-S364K/E357Q變體(XENP13122，圖22右圖)的存在相對(duì)于不存在這一變體(XENP13228，圖22左圖)的情形引入了對(duì)于所希望的異二聚體的形成的極強(qiáng)偏好。

實(shí)施例7.構(gòu)建抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體

通過(guò)優(yōu)化人類鏈含量使抗CD38抗體OKT10人源化(Lazar等人，Mol.Immunol.，(2007)，44：1986-1998)，并產(chǎn)生含有人源化抗CD38 Fv和抗CD3結(jié)構(gòu)域的雙特異性分子(圖37)。通過(guò)Blue Heron Biotechnologies(Bothell，WA)，由利用自動(dòng)基因合成得到的合成寡核苷酸和PCR產(chǎn)物合成希望的基因區(qū)段。在293E細(xì)胞中表達(dá)在pTT5載體中的抗體構(gòu)建體，并依序通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)A和使用GE HiTrap SP陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行的IEX色譜法進(jìn)行純化，以分離出希望的異二聚體雙特異性抗體?？贵wFc結(jié)構(gòu)域含有工程改造的異二聚體Fc區(qū)以便有效純化雙特異性分子。通過(guò)使用Biacore 3000在SPR上篩選Fv區(qū)文庫(kù)來(lái)改善雙特異性分子對(duì)CD38的親和力(圖38)。

實(shí)施例8.抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體的體外特性

在LDH重定向T細(xì)胞的細(xì)胞毒性(RTCC)檢定(圖39)中及在利用不同T細(xì)胞：RPMI8226比率的膜聯(lián)蛋白V+RTCC檢定(圖40)中針對(duì)殺傷RPMI8226多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞系的能力篩選優(yōu)化的雙特異性分子。另外，使用直接結(jié)合檢定評(píng)估優(yōu)化的分子與食蟹猴抗CD38的交叉反應(yīng)(圖41)。概述優(yōu)化的抗CD38 x抗CD3雙特異性分子的各種特性的表格顯示于圖42中。

實(shí)施例8.在移植huPBMC的SCID小鼠中抗CD38 x抗CD3雙特異性分子殺傷人漿細(xì)胞

在移植huPBMC的SCID小鼠模型中針對(duì)殺傷人漿細(xì)胞的能力篩選優(yōu)化的雙特異性分子。第0天，用α-ASGM1處理每組各10只的數(shù)組小鼠以清除SCIDNK細(xì)胞，隨后在第1天，移植3×107個(gè)人PBMC。第4天，基于總IgG含量隨機(jī)分組。在移植PBMC之后第7天和第15天，給予抗CD38 x抗CD3雙特異性分子或?qū)φ瘴?。在?4天和第21天測(cè)定IgG2、IgE及IgM滴度。包括5mg/kg劑量的達(dá)雷木單抗(一種抗CD38IgG1抗體)作為對(duì)照物。觀察到相較于達(dá)雷木單抗，在抗CDCD38 x抗CD3雙特異性分子存在下，人Ig同型顯著減少。(圖43和圖44)。

實(shí)施例4.抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體清除多發(fā)性骨髓瘤患者PBMC中的CD38+CD138+細(xì)胞

將來(lái)自兩個(gè)MM供體的PBMC與1μg/mL抗CD38 x抗CD3雙特異性分子一起培育24小時(shí)，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)來(lái)自預(yù)先門控的活細(xì)胞(通過(guò)FSC相對(duì)SSC分選)的CD38+CD138+細(xì)胞進(jìn)行技術(shù)，并針對(duì)PBS處理的對(duì)照物對(duì)事件進(jìn)行歸一化。結(jié)果顯示于圖45中。雙特異性抗體能夠在此濃度下有效清除MM細(xì)胞。

實(shí)施例5.抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體的氨基酸和DNA序列。

抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體XENP13243和XENP13551的氨基酸和DNA序列分別列于圖50和圖51中。

實(shí)施例6.在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)中產(chǎn)生抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體的穩(wěn)定庫(kù)。

使用Selexis專有的SURE Technology Platform^TM，根據(jù)圖3中所列的比率，用編碼XENP13243和XENP13551的DNA轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，以產(chǎn)生平行穩(wěn)定庫(kù)。轉(zhuǎn)染的DNA由含有圖52中所列DNA的單順反子載體組成。穩(wěn)定庫(kù)細(xì)胞在10mL離心管中培養(yǎng)7天，并在第7天，提取出5mL培養(yǎng)物上清液，通過(guò)蛋白質(zhì)A親和色譜法純化，并利用陽(yáng)離子交換色譜法進(jìn)行分析。由于產(chǎn)生的可能蛋白質(zhì)被設(shè)計(jì)成具有不同的等電點(diǎn)，故陽(yáng)離子交換色譜法能夠分析CHO細(xì)胞隨不同DNA比率而分泌的蛋白質(zhì)種類。圖4列出XENP13243和XENP13551在圖3中所列每一指定DNA比率下的陽(yáng)離子交換色譜圖。在用于陽(yáng)離子交換色譜分析的條件下，HC-Fab同二聚體在約15分鐘時(shí)洗脫；所期望的異二聚體雙特異性抗體在約22分鐘時(shí)洗脫；HC-scFv單體在約26分鐘時(shí)洗脫；并且HC-scFv同二聚體在約29分鐘時(shí)洗脫。不同蛋白質(zhì)種類的量的概述列于圖54中。

意外的是，宿主細(xì)胞中三種核酸(HC-scFv、HC及LC)的轉(zhuǎn)染比率可以驅(qū)使異二聚體的形成。若干DNA轉(zhuǎn)染比率形成占總蛋白質(zhì)A純化的物質(zhì)超過(guò)80％的量的優(yōu)選的雙特異性異二聚體。形成超過(guò)80％的異二聚體的優(yōu)選比率是1∶1.5∶1.5、1∶2∶1.5、1∶0.667∶2、1∶1∶2、1∶1.5∶2及1∶2∶2(全部以HC-Fab∶HC-scFv∶LC列出)。一些DNA比率形成超過(guò)90％的量的優(yōu)選的雙特異性異二聚體。形成超過(guò)90％的異二聚體的優(yōu)選比率是1∶1.5∶1.5、1∶2∶1.5、1∶1∶2及1∶2∶2(全部以HC-Fab∶HC-scFv∶LC列出)。一種DNA比率形成超過(guò)95％的量的優(yōu)選的雙特異性異二聚體。形成超過(guò)95％的異二聚體的特別優(yōu)選的比率是1∶2∶2(以HC-Fab∶HC-scFv∶LC列出)。

實(shí)施例7.抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體在C57BL/6小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)。

靜脈內(nèi)給予C57BL/6小鼠(n＝5只/組)2mg/kg單次劑量的抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體XENP13243和XENP13551。在施用測(cè)試物后1小時(shí)以及1天、3天、6天、10天、14天、17天及21天，經(jīng)由眶竇穿刺(OSP)對(duì)小鼠抽血，并將血液處理成血清以測(cè)定測(cè)試物含量。通過(guò)免疫檢定測(cè)定血清濃度并繪制于圖6中。使用Phoenix WinNonlin 6.3的非房室分析模塊測(cè)定測(cè)試物的半衰期。半衰期列于圖55中。應(yīng)注意，在雙特異性抗體的設(shè)計(jì)中包括Fc區(qū)使得半衰期與典型單克隆抗體相當(dāng)。典型的不含F(xiàn)c的雙特異性抗體，如BiTE或DART形式，具有短得多的半衰期，為約數(shù)小時(shí)。

實(shí)施例8.由抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體介導(dǎo)的CD38+RPMI8226細(xì)胞的重定向T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

使用抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體XENP13243和XENP13551介導(dǎo)CD38+RPMI 8226細(xì)胞的重定向T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。該檢定由在37℃下10,000個(gè)RPMI8226細(xì)胞與400,000個(gè)純化的人類T細(xì)胞一起培育24小時(shí)組成。通過(guò)乳酸脫氫酶(LDH)讀取細(xì)胞毒性。結(jié)果示于附圖中。.

實(shí)施例9.抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體的結(jié)合親和力。

經(jīng)由Biacore 3000通過(guò)表面等離子體共振測(cè)量XENP13243和XENP13551對(duì)人和食蟹猴CD38和CD3的親和力。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，并使用BIAevaluation軟件測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果列于附圖中。

實(shí)施例10.利用抗CD38 x抗CD3雙特異性抗體清除食蟹猴的CD38+細(xì)胞。

經(jīng)由靜脈內(nèi)輸注對(duì)六組食蟹猴(n＝2只/組)施用XENP13243或XENP13551。間隔3周對(duì)每只猴施用兩次劑量。初始劑量是5ng/kg、50ng/kg及500ng/kg，并且第二次劑量是2μg/kg、5μg/kg及20μg/kg。觀察到CD20-CD38+細(xì)胞以劑量依賴性方式清除(參看附圖)。觀察到CD8+T細(xì)胞上CD69上調(diào)證實(shí)T細(xì)胞的募集(參看附圖)。