本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種用農桿菌介導對雨生紅球藻進行基因轉化的方法及其應用。

背景技術：

蝦青素(astaxanthin，3,3'-二羥基-β,β胡蘿卜素-4,4'-二酮，c40h52o4,圖1)是一種紅色酮式類胡蘿卜素，廣泛存在于水生生物特別是藻類和水生動物中。蝦青素是一種優(yōu)質的天然抗氧化劑，其抗氧化活性比β-胡蘿卜素要強20倍。蝦青素在生物體內可與蛋白質結合而呈現(xiàn)青色、藍色和棕色等不同顏色，具有較強的著色功能。由于蝦青素具有多種生理功效，如在抗氧化性、抗腫瘤、預防癌癥、增強免疫力、改善視力等方面都有一定的效果，近年來已成為國內外科研機構及水產養(yǎng)殖、化妝品、醫(yī)藥、食品等眾多行業(yè)的研究熱點。

在自然界中，蝦青素可由微藻、植物、真菌及細菌等合成，其中雨生紅球藻(haematococcuspluvialis)具有最強的合成能力，因而廣泛應用于商業(yè)化生產天然蝦青素。雨生紅球藻是一種單細胞的淡水綠藻，隸屬于綠藻門(chlorophata)、綠藻綱(chlorophyeeae)、團藻目(volvoeales)、紅球藻科(haematoeoeeaceae)，紅球藻屬(haematocoeeus)。由雨生紅球藻合成的天然蝦青素已經被證實可以提高機體免疫力，防止紫外線(uv-a)對細胞的損傷，抑制癌細胞生長，延滯衰老過程，預防心血管疾病，因此具有巨大的醫(yī)療應用前景[hand,liy,huq.astaxanthininmicroalgae:pathways,functionsandbiotechnologicalimplications.algae,2013,28:131-147]。

雨生紅球藻生活史復雜多樣，主要包括營養(yǎng)生長和轉化產蝦青素兩個階段：在光強較弱、營養(yǎng)豐富的適宜環(huán)境中以綠色游動的營養(yǎng)細胞形態(tài)存在，在這個過程中雨生紅球藻細胞中存在鞭毛，呈游動狀態(tài)，生長旺盛，生物量 增加明顯，此階段即為營養(yǎng)生長階段；第二個階段：當其處于不利的環(huán)境條件(即脅迫條件，如高光照、高鹽、高溫或營養(yǎng)鹽饑餓)時，便失去鞭毛，以不動的厚壁孢子形態(tài)存在，生長速率減慢，基本上呈靜止狀態(tài)，這時細胞內會積累大量的蝦青素，從而使細胞呈現(xiàn)紅色，此階段為蝦青素積累階段。

目前用于商業(yè)化生產天然蝦青素的雨生紅球藻大多為篩選得到的野生型品種，這種野生型紅球藻細胞中蝦青素的含量非常有限(2％以下)，在實驗室規(guī)模上最高的含量也不超過4％，且生長速度慢，細胞密度低，對培養(yǎng)技術要求高，目前只能以較高的生產成本進行小規(guī)模的培養(yǎng)。利用轉基因技術來改善雨生紅球藻的品質，獲得生長速度快、蝦青素含量高、耐受性強的新品種是突破現(xiàn)有產量及成本限制的有效手段，具有巨大的商業(yè)優(yōu)勢和廣闊的市場前景。

目前已有報道建立了基因槍法[steinbrennerj,sandmanng.transformationofthegreenalgahaematococcuspluvialiswithaphytoenedesaturaseforcceleratedastaxanthinbiosynthesis[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,2006,72(12):7477-7484.]對雨生紅球藻進行轉基因改造的方法，該方法是以定點誘變的八氫番茄紅素脫氫酶基因為篩選標記，用農藥達草滅進行篩選，成功獲得了轉化子，轉化效率約為10^-6cells/μgdna，經pcr、southernblot和westernblot鑒定，證明了目的基因成功整合進雨生紅球藻的基因組并表達。但該法需要昂貴的儀器基因槍，操作過程復雜且穩(wěn)定性差，所用的報告基因需定點突變改造不易獲得，轉化效率較低，不利于推廣使用。

另有使用農桿菌eha101成功轉化雨生紅球藻sag-19a的報道[kathiresans,chandrashekara,ravishankarga,etal.agrobacterium-mediatedtransformationinthegreenalgahaematococcuspluvialis(chlorophyceae,volvocales).journalofphycology,2009,45(3):642-649.]，該法以潮霉素為篩選標記，β-葡萄醛酸酶(β-glucuronidase，gus)和綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)為報告基因，獲得了穩(wěn)定的轉化子，并進行了pcr、southernblot鑒定以及gus活性鑒定和綠色熒光觀察等，證明了外源基因整合進了雨生紅球藻的基因組并表達。該法包含藻的預培養(yǎng)、藻菌共培養(yǎng)及篩選等步驟，給出了關鍵影響因素如潮霉素使用濃度、乙酰丁香酮 (acetosyringone,簡稱as)使用濃度、共培養(yǎng)光照強度等條件對轉化效果的影響。但經實驗，發(fā)現(xiàn)存在以下問題：①該法給出的具體參數(shù)不適用于該報道以外的其他紅球藻藻株，如紅球藻藻種(nies-144)。而nies-144是一株廣泛使用的實驗室模式株，由于同時具有異養(yǎng)生長的能力，常被用于發(fā)酵生產雨生血球藻的生物質，是一種具有重要的具產業(yè)化應用前景的藻株。②該法揭露的共培養(yǎng)光照強度為18.75±2.5μmol·m^-2·s^-1，然而實際上，在該光照條件下大部分的紅球藻細胞(包括但不限于nies144)會迅速向不動孢子轉變，并積累蝦青素，從而不利于獲得轉化子；③該法中的藻細胞是直接涂布在固體tap平板上進行培養(yǎng)，會導致細胞失水死亡，成活率較低；④該法不包含對農桿菌進行活性誘導的步驟及優(yōu)化相關條件。

總之，該方法轉化效率較低，可重復性差，不適用于其他雨生紅球藻藻種，因此研究更加高效穩(wěn)定及廣泛適用性的轉化方法有利于推進雨生紅球藻基因工程領域的發(fā)展。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用農桿菌介導對雨生紅球藻進行基因轉化的方法，用以提高農桿菌介導的轉化效率。

本發(fā)明的目的還在于提供所述基因轉化方法在制備轉基因雨生紅球藻中的應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種用農桿菌介導對雨生紅球藻進行基因轉化的方法，該方法包括將已轉化質粒的農桿菌與待轉化雨生紅球藻共培養(yǎng)的步驟，其在共培養(yǎng)前還包括對所述農桿菌進行活性誘導的步驟。

優(yōu)選，對所述農桿菌進行活性誘導是在ph5.2-5.6、30μm≥as的濃度≥0μm。更優(yōu)選，對所述農桿菌進行活性誘導是在ph5.4、7.5μmas的培養(yǎng)環(huán)境下進行。在弱酸性環(huán)境和as存在的情況下，對農桿菌進行活性誘導，可以顯著提高轉化率。本領域應理解，一旦進行誘導的步驟則即可對農桿菌活性產生影響，較佳誘導時間至少為4h，考慮到時間成本等綜合因素，2-8小時是一個較佳的時間范圍。

優(yōu)選，所述共培養(yǎng)的光照強度為0-10μmol·m^-2·s^-1。在較弱的光照條件下，可以避免藻細胞過快轉化成不動孢子。更優(yōu)選，所述共培養(yǎng)的光照強度為5μmol·m^-2·s^-1。

優(yōu)選，菌藻共培養(yǎng)的ph值為5.2-5.6。菌藻在此ph環(huán)境下共培養(yǎng)具有更好的轉化效率。

進一步，在共培養(yǎng)后還包括篩選轉化子的步驟。其在固體培養(yǎng)基上篩選轉化子。優(yōu)選，共培養(yǎng)后的藻細胞在含增稠劑溶液環(huán)境中鋪平板到所述固體培養(yǎng)基上進行轉化子篩選。本領域技術人員應理解，這里的增稠劑是對藻細胞不構成損傷的增稠劑，其具有一定防止水分過快揮發(fā)的作用，從而增加藻細胞的存活率。所述的增稠劑包括但不限于玉米淀粉、土豆淀粉等等。

通常，以抗性基因作為選擇標記。篩選轉化子分兩階段培養(yǎng)，第一階段為弱光階段，光照強度為0-5μmol·m^-2·s^-1條件下培養(yǎng)7天，第二階段為強光培養(yǎng)，在5-10μmol·m^-2·s^-1培養(yǎng)30-35天。第一階段持續(xù)7天的弱光，可以選擇性地使野生型細胞迅速死亡；第二階段較強的光照有利于轉化子的正常生長。在本發(fā)明的實例中，使用潮霉素抗性選擇標記，篩選轉化子使用的潮霉素濃度有效濃度為5-7μg/ml。

進一步，在篩選轉化子后，還包括對轉化子鑒定的步驟。

進一步，在共培養(yǎng)前還包括雨生紅球藻活化和預培養(yǎng)的步驟。所述預培養(yǎng)的光照強度優(yōu)選為0-10μmol·m^-2·s^-1。所述預培養(yǎng)是將活化后的藻細胞在含增稠劑的溶液環(huán)境中鋪平板到固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

具體地，本發(fā)明方法包括以下步驟：

s1雨生紅球藻的活化及預培養(yǎng)；

s2農桿菌的活化和質粒轉化；

s3對步驟s2中獲得的農桿菌進行擴培及活性誘導；

s4農桿菌和藻細胞共培養(yǎng)；

s5轉化子篩選；

s6轉化子鑒定。

優(yōu)選的，在s1雨生紅球藻預培養(yǎng)中，在鋪板前將淀粉溶液或用于增稠、起到防止水分快速喪失的物質混合到藻細胞后再進行鋪板，所述預培養(yǎng)的光照強度為0-10μmol·m^-2·s^-1；更優(yōu)選的，所述淀粉溶液為玉米淀粉溶液。玉米淀粉用量為0.39-2.36mg/cm²，優(yōu)選用量為0.79-1.57mg/cm²，即按常規(guī)9cm直徑培養(yǎng)平板為25-150mg/板，優(yōu)選為50-100mg/板?，F(xiàn)有技術在藻的預培養(yǎng)中，是將綠色游動的營養(yǎng)生長期的細胞涂布在含培養(yǎng)基的固體瓊脂平板上培養(yǎng)，由于細胞較大且細胞壁較脆弱，不能充分利用培養(yǎng)基的營養(yǎng)，且易失水而死亡，細胞萌發(fā)率較低。本發(fā)明的方法是將適量的玉米淀粉溶液混合藻細胞后鋪板，大幅提高了藻細胞的成活率。

優(yōu)選的，所述步驟s3的活性誘導中，其誘導條件是ph值5.2-5.6的酸性條件，加入誘導劑as，該as的濃度范圍是0-30μm。

步驟s4，現(xiàn)有技術在藻菌共培養(yǎng)時，光照強度高達18.75±2.5μmol·m^-2·s^-1；但實際上，雨生紅球藻在較強光照下易于向不動孢子形態(tài)轉化，從而不利于農桿菌轉化。在步驟s4中，本發(fā)明的方法對共培養(yǎng)轉化階段的光照強度進行了優(yōu)化，找出了最有利于轉化的光強度，選擇光照強度為0-10μmol·m^-2·s^-1條件下共培養(yǎng)。這樣的光強度，不會使藻細胞過快轉化成不動孢子(不動孢子細胞壁增厚且細胞活性降低，無法進行有效轉化)，提高轉化率。優(yōu)選的，光照強度是5μmol·m^-2·s^-1。

此外，在步驟s4中，農桿菌與藻細胞共培養(yǎng)時，本發(fā)明將s3中得到的農桿菌菌體懸浮液一并(“一并”的含義是指由步驟s3中直接承繼過來的各成分，包括酸性環(huán)境)鋪在預培養(yǎng)雨生紅球藻的平板上，使共培養(yǎng)的環(huán)境也為弱酸性環(huán)境(ph5.2-5.6)。因為弱酸性環(huán)境有利于藻細胞接受外源基因，利于農桿菌將目標基因介導至藻細胞的基因組上。

s5中，本發(fā)明的方法對“轉化子篩選”過程中的光照強度進行了優(yōu)化，包括兩階段培養(yǎng)，第一階段為弱光階段，光照強度為0-5μmol·m^-2·s^-1條件下培養(yǎng)7天，第二階段為強光培養(yǎng)，在約5-10μmol·m^-2·s^-1培養(yǎng)30-35天。第一階段持續(xù)7天的弱光，可以選擇性地使野生型細胞迅速死亡；第二階段較強的光照有利于轉化子的正常生長。

s5中，潮霉素濃度的有效范圍為5-7μg/ml的hyg，此濃度的潮霉素 可以選擇性殺死野生型血球藻而保留轉化子。若潮霉素濃度過高，hyg會殺死幾乎全部的野生型及轉化子，而潮霉素過低野生型存活率太高，干擾轉化子的生長。

步驟s5中，經步驟s4的共培養(yǎng)后，將藻細胞混合淀粉溶液或用于增稠、起到防止水分快速喪失的物質，如玉米淀粉(對藻無害的增稠劑)平鋪在agar平板上培養(yǎng)，防止水分過快喪失，提高轉化子的存活率。

在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供了所述雨生紅球藻進行基因轉化的方法，該方法包括如下步驟：

s1雨生紅球藻的活化及預培養(yǎng)，所述預培養(yǎng)的條件是：在鋪板前將淀粉溶液或用于增稠、起到防止水分快速喪失的物質混合到藻細胞后再進行鋪板，所述預培養(yǎng)的光照強度為0-10μmol·m^-2·s^-1；

s2農桿菌的活化和質粒轉化；

s3對步驟s2中獲得的農桿菌進行擴培及活性誘導，所述誘導條件是ph值5.2-5.6的酸性條件，加入誘導劑as，該as的濃度范圍是0-30μm；

s4農桿菌和藻細胞共培養(yǎng)，光照強度為0-10μmol·m^-2·s^-1，ph值為5.2-5.6；

s5轉化子篩選，培養(yǎng)前將藻細胞混合淀粉溶液或用于增稠、起到防止水分快速喪失的物質，培養(yǎng)中分兩階段培養(yǎng)，第一階段為弱光階段，光照強度為0-5μmol·m^-2·s^-1條件下培養(yǎng)7天，第二階段為強光培養(yǎng)，在約5-10μmol·m^-2·s^-1培養(yǎng)30-35天；潮霉素濃度的有效范圍為5-7μg/ml；

s6轉化子鑒定。

有益效果

首先，本發(fā)明加入了對經質粒轉化的農桿菌的活性誘導步驟，通過調節(jié)ph達到弱酸性環(huán)境、以及添加適當濃度的as，能夠有效增加含目標基因農桿菌的介導轉化活性；其次，菌藻共培養(yǎng)時，將活性誘導步驟得到的農桿菌菌體懸浮液鋪在預培養(yǎng)雨生紅球藻的平板上，因而使共培養(yǎng)也是在酸性環(huán)境下進行；再次，藻種預培養(yǎng)步驟、菌藻共培養(yǎng)步驟、篩選步驟中均采用增稠劑防止水分過快喪失造成細胞死亡，可大幅提高細胞成活率；再次，共培養(yǎng) 的光強選擇范圍，可避免雨生紅球藻細胞過快轉化成不動孢子；最后，本發(fā)明在篩選轉化子步驟中，選用的hyg濃度的確定以及兩階段培養(yǎng)方法等等，本發(fā)明借助上述方法，實現(xiàn)了農桿菌介導雨生紅球藻的轉化，并獲得了較好的轉化率及轉化穩(wěn)定性。

本發(fā)明有效建立了使用農桿菌高效轉化雨生紅球藻的方法，優(yōu)化關鍵影響因素和條件，從而實現(xiàn)較高的轉化效率和較好的可重復性，以便通過基因工程手段對藻種進行改良，開發(fā)更有經濟價值的紅球藻藻種(生長速度更快、蝦青素含量更高)，提高工業(yè)化生產價值。

附圖說明

圖1為現(xiàn)有技術中蝦青素(a)、蝦青素單酯(b)和蝦青素雙酯(c)的結構圖；

圖2為轉化用表達載體pcam-gfp質粒的框圖；

圖3為本發(fā)明實施例2中添加玉米淀粉鋪板對雨生紅球藻成活率的影響，培養(yǎng)皿中含1％agartap培養(yǎng)基，a1為直接涂布400個細胞，a4為400個藻細胞混合100mg玉米淀粉；

圖4為本發(fā)明實施例4中誘導劑ph值對轉化率的影響；

圖5為本發(fā)明實施例5中誘導劑as濃度對轉化率的影響；

圖6為轉化子篩選，w為野生型對照，t1-3為轉化子平板；

圖7為轉化子hptii和egfp基因pcr鑒定，t為陽性對照，w為陰性對照，m為marker，1-10為轉化子。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。例如，雨生紅球藻的活化、平板培養(yǎng)的培養(yǎng)基、質粒轉化農桿菌的方式、菌藻共培養(yǎng)的方式等等，除特別指明外，本發(fā)明對此并無限定。需要說明的是，除另有特別注明的外，在本申請文件中出現(xiàn)的有關濃度和光強的范圍值0，均包括等于0的情況。

實驗材料的準備

雙元質粒：pcam-gfp，該質粒的框圖如圖2所示，該質粒含有camv35s啟動子驅動的新霉素磷酸轉移酶基因，其表達的產物可使潮霉素hyg失活。

農桿菌菌株：lba4404

basal培養(yǎng)基：三水乙酸納1.987g/l，酵母提取物2.0g/l，六水氯化鎂0.2g/l，硫酸亞鐵0.01g/l，二水氯化鈣0.02g/l，l-天冬氨酸0.405g/l，調節(jié)ph值6.8。

yeb培養(yǎng)基：牛肉浸膏5g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨5g/l，蔗糖5g/l，七水硫酸鎂4g/l，調ph7.4。固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5g/100ml。使用時加入50μg/ml利福平(rifampicin,rif)、50μg/ml硫酸鏈霉素(streptomycin,str)、50μg/ml卡那霉素(kanamycin,kan)。

tap培養(yǎng)基：2.42gtris，25mltap鹽，0.375ml磷酸鹽，1.0ml微量元素，1.0ml乙酸，定容到1l，調ph7.0。

誘導培養(yǎng)基：調節(jié)液體tap的ph值并添加不同濃度的乙酰丁香酮(acetosyringone,as)。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：在ph7.0的tap中加入1％濃度的瓊脂及不同濃度的as。

篩選培養(yǎng)基：在ph7.0的tap中加入1％濃度的瓊脂、750μg/ml頭孢霉素(cefotaxime,cef)以及5μg/ml潮霉素(hygromycin,hyg)，其中頭孢霉素可殺死農桿菌，潮霉素可殺死野生型雨生紅球藻。

實施例1農桿菌介導對雨生紅球藻進行基因轉化的方法的詳細實施例第一步雨生紅球藻的活化及預培養(yǎng)

將固體平板(本發(fā)明中所用平板直徑是9cm)上劃線分離的單克隆雨生紅球藻nies-144挑取到含10mlbasal培養(yǎng)基的50ml三角瓶里，約15-20μmol·m^-2·s^-1、20℃下靜置培養(yǎng)10d。轉接入含100mlbasal培養(yǎng)基的250ml三角瓶里同等條件下培養(yǎng)4d，再以10％的比例接種在含100mlbasal培養(yǎng)基的250ml三角瓶里下靜置培養(yǎng)4d。在3000rpm、2min條件下離心收集藻，用無菌ddh2o洗滌一次后重懸，調節(jié)細胞密度，將2×10⁶ 個細胞混合100mg玉米淀粉溶液后均勻鋪在含15μmas及1％agar的tap固體平板上，風干后在5μmol·m^-2·s^-1、20℃下靜置培養(yǎng)2d(光照太強會導致血球藻轉化成不動孢子)。

第二步農桿菌的活化，質粒轉化

s2-1，農桿菌的活化：于-80℃冰箱中取出保存的農桿菌lba4404，用接種環(huán)劃線于含有50μg/mlrif和str的yeb平板上，28℃倒置培養(yǎng)48小時；挑單菌落接種于含有50μg/mlrif和str的yeb液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)(28℃，180rpm)20h左右。

s2-2，質粒轉化農桿菌：4℃、8000rpm，離心5min收集s2-1中所獲得的菌液，棄上清并用無菌ddh2o洗滌兩次。用預冷的0.05m氯化鈣溶液將菌液懸浮混勻，靜止冰浴30分鐘，即為農桿菌感受態(tài)細胞。取0.1μg左右的重組質粒(含有待轉化的目的基因)加入100μl的農桿菌感受態(tài)細胞中，混勻后冰浴10min，液氮速凍5min，立即轉入37℃的水浴鍋中，孵育1min后立即冰浴3-5min，加入500μlyeb液體培養(yǎng)基于搖床中震蕩培養(yǎng)(28℃，180rpm)2h。取出后涂在含有50mg/l的kan和50mg/lrif的lb平板上面，28℃倒置培養(yǎng)48h左右至長出單菌落為止。挑單菌落進行pcr鑒定，陽性菌落接種于含有50μg/ml的rif、str和kan的yeb液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)(28℃，180rpm)20h，加入15％的甘油后保存在-80℃冰箱中備用。

第三步農桿菌活性誘導

取800μl凍存的lba4404菌液接種在含50μg/mlrif、str、kan和hyg的10mlyeb培養(yǎng)基里，180rpm、28℃下培養(yǎng)約15h至od600為0.2。8000g、1min離心收集400μl菌體，用無菌ddh2o洗滌后再用600μl含15μmas的液體tap(調酸性ph，5.2-5.6)重懸，于24℃、180rpm下誘導4h。

第四步農桿菌與雨生紅球藻共培養(yǎng)

將步驟三得到的600μl菌體混合溶液(含有as及酸性ph＝5.2-5.6等，即換句話是，經過活性誘導的含目標基因的農桿菌混合液)，均勻鋪在前述預培養(yǎng)雨生紅球藻的平板上，靜置15min后風干，再于5μmol·m^-2·s^-1、22 ℃下倒置培養(yǎng)2days。

第五步篩選雨生紅球藻轉化子

用含750μg/mlcef的ddh2o將共培養(yǎng)后的藻洗脫下來，3000rpm離心2min，小心吸取上層菌懸液棄去，重復約2-3次至上層液體變?yōu)榍逡海o置0.5h，去上清，將三分之一藻細胞混合100mg玉米淀粉平鋪在1％agar平板上，hyg濃度均為5μg/mlhyg，于20℃下先在0-5μmol·m^-2·s^-1下倒置培養(yǎng)一周，光照強度為0-5μmol·m^-2·s^-1，再在約5-10μmol·m^-2·s^-1倒置培養(yǎng)3-5周，光照強度為5-10μmol·m^-2·s^-1。

第六步雨生紅球藻轉化子外源基因整合及表達鑒定方法

pcr鑒定：

分別以轉基因雨生紅球藻和野生型藻(作為陰性對照，wt)為模板，使用hptⅱ-f和hptⅱ-r組成的引物對(如seqidno.1和seqidno.2所示)檢測hptⅱ基因，使用egfp-f和egfp-r組成的引物對(如seqidno.3和seqidno.4所示)檢測egfp基因。

hptⅱ-f(seqidno.1)：5'-gtgtcacgttgcaagacctg-3'

hptⅱ-r(seqidno.2)：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'

egfp-f(seqidno.3)：5'-aaggacgacggcaactacaagacc-3'；

egfp-r(seqidno.4)：5'-cacgaactccagcaggaccatg-3'。

hptⅱ基因pcr反應條件：95℃預變性8min，然后經38個循環(huán)(95℃45s、60.8℃30s、72℃45s)72℃10min。

egfp基因pcr反應條件：95℃預變性8min，然后經38個循環(huán)(95℃45s、62℃30s、72℃45s)72℃10min。

取5μlpcr物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，eb染色觀察。

結果表明：在轉基因雨生紅球藻中均可以pcr擴增獲得hptⅱ基因的目的片段(407bp)和egfp基因的目的片段(372bp)；在野生型雨生紅球藻中沒有目的條帶。說明外源基因已經成功插入轉基因藻的基因組中。

實施例2添加玉米淀粉鋪板以提高雨生紅球藻flotownies-144的成 活率

(1)雨生紅球藻的培養(yǎng)

將固體平板上劃線分離的單克隆雨生紅球藻nies-144挑取到含10mlbasal培養(yǎng)基的50ml三角瓶里，約15-20μmol·m^-2·s^-1、20℃下靜置培養(yǎng)10d。轉接入含100mlbasal培養(yǎng)基的250ml三角瓶里同等條件下培養(yǎng)4d，再以10％的比例接種在含100mlbasal培養(yǎng)基的250ml三角瓶里下靜置培養(yǎng)4d。3000rpm、2min條件下離心收集藻，用無菌ddh2o洗滌一次后重懸。

(2)玉米淀粉的制備

稱取10g玉米淀粉裝入50ml離心管中，加入無水乙醇震蕩混勻后靜置5min，4000rpm離心去上清，重復一次；加入無菌ddh2o震蕩混勻后靜置5min，4000rpm離心去上清，重復一次；加入75％的乙醇定容至50ml，室溫靜置3d。使用時用適量無菌ddh2o洗滌三次，徹底去除乙醇。

(3)混合玉米淀粉和雨生紅球藻培養(yǎng)

將400個藻細胞混合100mg玉米淀粉均勻鋪在90mm一次性培養(yǎng)皿中，風干后用封口膜包裹，在光照培養(yǎng)箱中約10μmol·m^-2·s^-1、20℃下靜置培養(yǎng)，15d后統(tǒng)計細胞存活率。

對照組不使用玉米淀粉，其余條件均相同，制作三個平行。

對照組的藻細胞存活率約為1.17±0.67％，而實驗組約為54.2±4.58％，提高了約46倍，如圖3所示。

實施例3雨生紅球藻flotownies-144在tap固體培養(yǎng)基上對hyg的抗性

(1)雨生紅球藻的培養(yǎng)

同實施例2中(1)。

(2)含目標基因的農桿菌活化

分取800μl凍存的野生型lba4404和含pcam-gfp質粒lba4404菌液接種在含50μg/mlrif和str的10mlyeb培養(yǎng)基里，180rpm、28℃下培養(yǎng)約15h至od600為0.2。8000g、1min離心收集400μl菌體，用無菌 ddh2o洗滌后再用600μl含15μmas的液體tap(ph5.2)重懸，于24℃、180rpm下誘導4h。

(3)藻菌共培養(yǎng)

調節(jié)細胞密度，將2×10⁶個細胞混合100mg玉米淀粉后均勻鋪在含1％agar的tap固體平板上，風干后在5μmol·m^-2·s^-1、20℃下靜置培養(yǎng)2d。將600μl菌體均勻鋪在前述預培養(yǎng)雨生紅球藻的平板上，靜置15min后風干，再于5μmol·m^-2·s^-1、22℃下倒置培養(yǎng)2d。

(4)雨生紅球藻篩選

用含750μg/mlcef的ddh2o將共培養(yǎng)后的藻洗脫下來，3000rpm離心2min，小心吸取上層菌懸液棄去，重復約2-3次至上層液體變?yōu)榍逡?，靜置0.5h，去上清，將5×10⁵個藻細胞混合100mg玉米淀粉平鋪在1％agar平板上，hyg濃度分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8和9μg/mlhyg，于20℃下先在5μmol·m^-2·s^-1下倒置培養(yǎng)一周，再在約10-15μmol·m^-2·s^-1倒置培養(yǎng)4-5周。

共培養(yǎng)時涂布野生型農桿菌組在0-4μg/mlhyg的平板上可見有藻落生長，在5-9μg/mlhyg的平板上藻落完全死亡；共培養(yǎng)時涂布含pcam-gfp質粒的農桿菌組在在0-4μg/mlhyg的平板上可見有藻落生長，在5-7μg/mlhyg的平板上可見有單藻落長出，在8-9μg/mlhyg的平板上藻落完全死亡。

表1雨生紅球藻對不同濃度hyg的抗性表現(xiàn)

表1表中“+”表示有藻落或單克隆長出，“－”表示沒有藻落或單克隆長出。

實施例4不同ph下雨生紅球藻flotownies-144的基于pcr鑒定egfp基因的轉化率

(1)雨生紅球藻的培養(yǎng)同實施例2中(1)。

(2)含目標基因的農桿菌活化

使用含pcam-gfp質粒的農桿菌lba4404菌株，只是使用ph分別為7.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0六組不同ph的誘導劑tap，其余操作條件均相同(as濃度15μm)且與參照實施例3中(2)。

(3)藻菌共培養(yǎng)同實施例3中的(3)。

(4)雨生紅球藻篩選

篩選使用的tap平板含5μg/mlhyg，其余條件與實施例3中的(4)相同。

(5)雨生紅球藻egfp基因的pcr鑒定

分別以轉基因雨生紅球藻和野生型藻(作為陰性對照，wt)為模板，使用egfp-f和egfp-r組成的引物對(如seqidno.3和seqidno.4所示)檢測egfp基因。

egfp-f(seqidno.3)：5'-aaggacgacggcaactacaagacc-3'；

egfp-r(seqidno.4)：5'-cacgaactccagcaggaccatg-3'。

egfp基因pcr反應條件：95℃預變性8min，然后經38個循環(huán)(95℃45s、62℃30s、72℃45s)72℃10min。

取5μlpcr物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，eb染色觀察。

結果表明：在轉基因雨生紅球藻中均可以pcr擴增獲得egfp基因的目標片段(372bp)；在野生型雨生紅球藻中沒有目標條帶。

經實驗ph的有效使用范圍為5.2-5.6，而在其余條件不能獲得轉化子。實驗統(tǒng)計結果如圖4所示。

實施例5不同as濃度下雨生紅球藻flotownies-144的基于pcr鑒定egfp基因的轉化率

(1)雨生紅球藻的培養(yǎng)同實施例2中(1)。

(2)含目標基因的農桿菌活化

使用含pcam-gfp質粒的農桿菌lba4404菌株，只是使用分別為0μm、7.5μm、15μm、30μm、50μm、100μm、200μm共七組不同濃度as的誘導劑tap，各組其余操作條件完全相同(ph＝5.2)且同實施例3中(2)。

(3)藻菌共培養(yǎng)同實施例3中的(3)。

(4)雨生紅球藻篩選同實施例4中的(4)。

(5)雨生紅球藻egfp基因的pcr鑒定同實施例4中的(5)。

經實驗as的有效使用范圍為0-30μm，而在其余條件不能獲得轉化子，具體統(tǒng)計結果如圖5所示。

實施例6雨生紅球藻flotownies-144轉化子的hptⅱ和egfp基因的pcr鑒定

(1)雨生紅球藻的預培養(yǎng)同實施例2中(1)。

(2)含目標基因的農桿菌活化

使用含pcam-gfp質粒的農桿菌lba4404菌株，其余同實施例3中(2)。

(3)藻菌共培養(yǎng)同實施例3中的(3)。

(4)雨生紅球藻篩選同實施例4中的(4)，篩選使用的tap平板含5μg/mlhyg。

(5)雨生紅球藻hptii和egfp基因的pcr鑒定

hptii基因的pcr鑒定：分別以轉基因雨生紅球藻和野生型藻(作為陰性對照，wt)為模板，使用hptⅱ-f和hptⅱ-r組成的引物對(如seqidno.1和seqidno.2所示)檢測hptⅱ基因。

hptⅱ-f(seqidno.1)：5'-gtgtcacgttgcaagacctg-3'

hptⅱ-r(seqidno.2)：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'

hptⅱ基因pcr反應條件：95℃預變性8min，然后經38個循環(huán)(95℃45s、60.8℃30s、72℃45s)72℃10min。

取5μlpcr物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，eb染色觀察。

egfp基因的pcr鑒定同實施例4中的(5)。

結果表明：在轉基因雨生紅球藻中均可以pcr擴增獲得hptⅱ基因的目的片段(407bp)和egfp基因的目的片段(372bp)；轉化結果如圖6所示，w為野生型對照，t1-3為轉化子平板；圖7為對經復篩后的10株轉化子進行hyg和egfp基因進行pcr鑒定結果，條帶分別為407bp和372bp， t為陽性對照，w為陰性對照，m為marker，1-10為轉化子。其中1-5為批次1獲得的轉化子pcr結果圖，6-10為批次2中獲得的轉化子的pcr結果圖，兩個批次的鑒定結果顯示了較好的重復性。

經三次重復上述最優(yōu)條件下的實驗過程，計算平均轉化率約為42±17個/10⁶個藻細胞。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，例如，將發(fā)明使用的藻株替換為其他具有相同或相似生長周期的藻株，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。