本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地，涉及j1001-2化合物的生物合成基因簇及其應(yīng)用，更具體地，涉及j1001-2化合物的生物合成基因簇、微生物和制備j1001-2化合物的方法。

背景技術(shù)：

聚酮化合物是天然產(chǎn)物最多的類群之一，因其巨大的藥用價(jià)值而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用、獸用和農(nóng)用等領(lǐng)域。例如抗生素紅霉素、抗寄生蟲抗生素阿維菌素等。聚酮化合物是有聚酮合酶(pks)催化形成的，以模塊形式組裝成的基因簇決定了聚酮化合物結(jié)構(gòu)從而決定了其生物活性，因此一個(gè)新化合物的基因簇對其后續(xù)研究有著極為重要的意義。

隨著致病菌耐藥性問題的日益嚴(yán)峻，臨床上對新抗生素的需求也顯得更為迫切。為了應(yīng)對這一局面，人們一方面對已有抗生素進(jìn)行改造，另一方面也加快了新型抗生素篩選的步伐。j1001-2化合物是最近發(fā)現(xiàn)的一種抗生素，具有良好的抑菌活性。

迄今為止，還沒有j1001-2化合物生物合成基因簇相關(guān)研究的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種具有抗菌活性的抗生素-j1001-2化合物的生物合成基因簇。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種j1001-2化合物的生物合成基因簇，其中，所述j1001-2化合物結(jié)構(gòu)如下，

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述生物合成基因簇包括：

ⅰ型線性聚酮合成酶基因模塊，所述ⅰ型線性聚酮合成酶基因模塊包括：2a1基因、2a2基因、2a3基因、2a4基因、2a5基因、2a6基因、2a7基因、2a8基因、2a9基因、2a10基因和2a11基因；

糖基合成相關(guān)基因模塊，所述糖基合成相關(guān)基因模塊包括：2g1基因、2g2基因、2g3基因、2g4基因、2g5基因、2g6基因、2g7基因、2g8基因和2m基因；以及

修飾基因模塊，所述修飾基因模塊包括：2o基因、2i基因、2e基因、2p1基因和2p2基因。

發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明實(shí)施例的j1001-2化合物的生物合成基因簇可以控制j1001-2化合物的生物合成。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述2a1基因編碼seqidno：1所示的氨基酸序列；所述2a2基因編碼seqidno：2所示的氨基酸序列；所述2a3基因編碼seqidno：3所示的氨基酸序列；所述2a4基因編碼seqidno：4所示的氨基酸序列；所述2a5基因編碼seqidno：5所示的氨基酸序列；所述2a6基因編碼seqidno：6所示的氨基酸序列；所述2a7基因編碼seqidno：7所示的氨基酸序列；所述2a8基因編碼seqidno：8所示的氨基酸序列；所述2a9基因編碼seqidno：9所示的氨基酸序列；所述2a10基因編碼seqidno：10所示的氨基酸序列；所述2a11基因編碼seqidno：11所示的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述2g1基因編碼seqidno：12所示的氨基酸序列；所述2g2基因編碼seqidno：13所示的氨基酸序列；所述2g3基因編碼seqidno：14所示的氨基酸序列；所述2g4基因編碼seqidno：15所示的氨基酸序列；所述2g5基因編碼seqidno：16所示的氨基酸序列；所述2g6基因編碼seqidno：17所示的氨基酸序列；所述2g7基因編碼seqidno：18所示的氨基酸序列；所述2g8基因編碼seqidno：19所示的氨基酸序列；所述2m基因編碼seqidno：20所示的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述2o基因編碼seqidno：21所示的氨基酸序列；所述2i基因編碼seqidno：22所示的氨基酸序列；所述2e基因編碼seqidno：23所示的氨基酸序列；所述2p1基因編碼seqidno：24所示的氨基酸序列；所述2p2基因編碼seqidno：25所示的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該生物合成基因簇進(jìn)一步包括：調(diào)節(jié)基因模塊，所述調(diào)節(jié)基因模塊包括：2r1基因、2r2基因、2r3基因、2r4基因、2t1基因、2t2基因、2t3基因、2t4基因和2t5基因。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述2r1基因編碼seqidno：26所示的氨基酸序列；所述2r2基因編碼seqidno：27所示的氨基酸序列；所述2r3基因編碼seqidno：28所示的氨基酸序列；所述2r4基因編碼seqidno：29所示的氨基酸序列；所述2t1基因編碼seqidno：30所示的氨基酸序列；所述2t2基因編碼seqidno：31所示的氨基酸序列；所述2t3基因編碼seqidno：32所示的氨基酸序列；所述2t4基因編碼seqidno：33所示的氨基酸序列；所述2t5基因編碼seqidno：34所示的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，沿著基因的3’-5’端，所述2t2基因、所述2t1基因、所述2g8基因、所述2g7基因、所述2g6基因、所述2r4基因、所述2r3基因、所述2p1基因、所述2a8基因、所述2a11基因、所述2a9基因、所述2p2基因、所述2i基因、所述2o基因、所述2a10基因、所述2e基因、所述2a7基因、所述2g5基因、所述2g1基因、所述2g2基因、所述2g3基因、所述2g4基因、所述2m基因、所述2a6基因、所述2a5基因、所述2a4基因、所述2a3基因、所述2a2基因、所述2a1基因、所述2r2基因、所述2r1基因、所述2t5基因、所述2t4基因和所述2t3基因依次串聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述生物合成基因簇具有seqidno：35所示的核苷酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種微生物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微生物具有前述的生物合成基因簇。發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)，利用該微生物進(jìn)行發(fā)酵處理，可以高效、簡單和低成本地合成j1001-2化合物。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微生物為鏈霉菌。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種制備j1001-2化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：利用前述的微生物進(jìn)行發(fā)酵處理，以便得到發(fā)酵后的微生物；將所述發(fā)酵后的微生物進(jìn)行破壁處理，以便得到含有所述j1001-2化合物的溶液；以及從所述含有所述j1001-2化合物的溶液中純化所述j1001-2化合物，以便得到所述j1001-2化合物的純品。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制備j1001-2化合物的方法，利用前述的微生物進(jìn)行發(fā)酵處理，可以高效地合成j1001-2化合物。然后，通過微生物破壁處理和分離純化處理，可以高效、簡單和低成本地獲得j1001-2化合物純品。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的j1001-2化合物的生物合成基因簇序列結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的制備j1001-2化合物的方法的流程示意圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的j1001-2化合物的生物合成途徑的流程示意圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的j1001-2化合物的圖譜示意圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

在本發(fā)明的描述中，術(shù)語“縱向”、“橫向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明而不是要求本發(fā)明必須以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對本發(fā)明的限制。

需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種j1001-2化合物的生物合成基因簇。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該生物合成基因簇包括：

ⅰ型線性聚酮合成酶基因模塊，所述ⅰ型線性聚酮合成酶基因模塊包括：2a1基因、2a2基因、2a3基因、2a4基因、2a5基因、2a6基因、2a7基因、2a8基因、2a9基因、2a10基因和2a11基因；

糖基合成相關(guān)基因模塊，該糖基合成相關(guān)基因模塊包括：2g1基因、2g2基因、2g3基因、2g4基因、2g5基因、2g6基因、2g7基因、2g8基因和2m基因；以及

修飾基因模塊，該修飾基因模塊包括：2o基因、2i基因、2e基因、2p1基因和2p2基因。

發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明實(shí)施例的j1001-2化合物的生物合成基因簇可以控制j1001-2化合物的生物合成。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該生物合成基因簇(在本發(fā)明中，也簡稱為“基因簇”)為鏈霉菌的生物合成基因簇，具有seqidno：35所示的核苷酸序列，具體如下：

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以該鏈霉菌的生物合成基因簇為例，對生物合成基因簇進(jìn)行解釋說明，該生物合成基因簇包括ⅰ型線性聚酮合成酶基因模塊、糖基合成相關(guān)基因模塊和修飾基因模塊。下面對該鏈霉菌的生物合成基因簇各模塊進(jìn)行詳細(xì)描述，具體如下：

其中，ⅰ型線性聚酮合成酶基因模塊包括2a1，2a2，2a3，2a4，2a5，2a6，2a7，2a8，2a9，2a10和2a11共11個(gè)基因，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a1基因編碼seqidno：1所示的氨基酸序列。具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a1基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第92698-101334個(gè)堿基處，長度為8637個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為2878個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a2基因編碼seqidno：2所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a2基因位于該鏈霉菌的基因簇序列第85970-92683個(gè)堿基處，長度為6714個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為2237個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a3基因編碼seqidno：3所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a3基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第73776-85781個(gè)堿基處，長度為12006個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為4001個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a4基因編碼seqidno：4所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a4基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第62077-73755個(gè)堿基處，長度為11679個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為3892個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a5基因編碼seqidno：5所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a5基因簇位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第50179-62031個(gè)堿基處，長度為11853個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為3950個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a6基因編碼seqidno：6所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a6基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第45212-50158個(gè)堿基處，長度為4947個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為1648個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a7基因編碼seqidno：7所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a7基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第33430-38406個(gè)堿基處，長度為4977個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為1658個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a8基因編碼seqidno：8所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a8基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第7986-19214個(gè)堿基處，長度為11229個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為3742個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a9基因編碼seqidno：9所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a9基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第25758-28115個(gè)堿基處，長度為2358個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為785個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a10基因編碼seqidno：10所示的氨基酸序列，具體如下：

mepieestgdsrlaerlatatpeereqllrglvlrhaaeileapeldeesnfvengltsl60

ralqlskalmndtgleaplvaivehptptllgkflsetyeadaa(seqidno：10)

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a10基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第32185-32499個(gè)堿基處，長度為315個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶的acp蛋白，長度為104個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a11基因編碼seqidno：11所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2a11基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第19227-25730個(gè)堿基處，長度為6504個(gè)堿基對，編碼聚酮合成酶，長度為2167個(gè)氨基酸。

其中，糖基合成相關(guān)基因模塊包括2g1、2g2、2g3、2g4、2g5、2g6、2g7、2g8和2m共9個(gè)基因，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g1基因編碼seqidno：12所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g1基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第40030-40842個(gè)堿基處，長度為813個(gè)堿基對，編碼葡萄糖-1-磷酸：ttp胸苷基轉(zhuǎn)移酶，長度為270個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g2基因編碼seqidno：13所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g2基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第40839-41831個(gè)堿基處，長度為993個(gè)堿基對，編碼dtdp葡萄糖-4,6-脫水酶，長度為330個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g3基因編碼seqidno：14所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g3基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第41895-43199個(gè)堿基處，長度為1305個(gè)堿基對，編碼ndp-d-葡萄糖-3，4-脫水酶，長度為434個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g4基因編碼seqidno：15所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g4基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第43196-44194個(gè)堿基處，長度為999個(gè)堿基對，編碼ndp-d-葡萄糖-4，6-脫水酶，ndp-d-葡萄糖-4-異構(gòu)酶，ndp-d-葡萄糖-4-還原酶長度為332個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g5基因編碼seqidno：16所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g5基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第38479-39750個(gè)堿基處，長度為1272個(gè)堿基對，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，長度為423個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g6基因編碼seqidno：17所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g6基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第3445-4629個(gè)堿基處，長度為1185個(gè)堿基對，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，長度為394個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g7基因編碼seqidno：18所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g7基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第1169-2848個(gè)堿基處，長度為1680個(gè)堿基對，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，長度為559個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g8基因編碼seqidno：19所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2g8基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第1-1116個(gè)堿基處，長度為1116個(gè)堿基對，編碼內(nèi)切葡聚糖酶，長度為371個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2m基因編碼seqidno：20所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2m基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第44191-45117個(gè)堿基處，長度為927個(gè)堿基對，編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，長度為308個(gè)氨基酸。

其中，修飾基因，包括2o、2i、2e、2p1和2p2共5個(gè)基因，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2o基因編碼seqidno：21所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2o基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第30711-32147個(gè)堿基處，長度為1437個(gè)堿基對，編碼環(huán)氧化物酶，長度為478個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2i基因編碼seqidno：22所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2i基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第29661-30569個(gè)堿基處，長度為909個(gè)堿基對，編碼酮甾異構(gòu)酶，長度為302個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2e基因編碼seqidno：23所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2e基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第32547-33428個(gè)堿基處，長度為882個(gè)堿基對，編碼環(huán)氧化物水解酶，長度為293個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2p1基因具有seqidno：24所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2p1基因位于該鏈霉菌的基因簇氨基酸序列第6809-7960個(gè)堿基處，長度為1152個(gè)堿基對，編碼細(xì)胞色素p450蛋白，長度為383個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2p2基因編碼seqidno：25所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2p2基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第28182-29462個(gè)堿基處，長度為1281個(gè)堿基對，編碼細(xì)胞色素p450蛋白，長度為426個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該生物合成基因簇進(jìn)一步包括：調(diào)節(jié)基因模塊，該調(diào)節(jié)基因模塊包括：2r1基因、2r2基因、2r3基因、2r4基因、2t1基因、2t2基因、2t3基因、2t4基因和2t5基因，上述基因的序列信息具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2r1基因編碼seqidno：26所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2r1基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第103016-103636個(gè)堿基處，長度為621個(gè)堿基對，編碼調(diào)節(jié)蛋白，長度為206個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2r2基因編碼seqidno：27所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2r2基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第102065-102829個(gè)堿基處，長度為765個(gè)堿基對，編碼調(diào)節(jié)蛋白，長度為254個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2r3基因編碼seqidno：28所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2r3基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第5548-6558個(gè)堿基處，長度為1011個(gè)堿基對，編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，長度為336個(gè)氨基酸

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2r4基因編碼seqidno：29所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2r4基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第4589-5539個(gè)堿基處，長度為951個(gè)堿基對，編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，長度為316個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t1基因編碼seqidno：30所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t1基因位于該鏈霉菌的seqidno：35所示的基因序列片段外，長度為1428個(gè)堿基對，編碼膜整合型轉(zhuǎn)移蛋白，長度為475個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t2基因具有seqidno：31所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t2基因位于該鏈霉菌的seqidno：35所示的基因序列片段外，具有seqidno:36所示的核苷酸序列，長度為687個(gè)堿基對，編碼abc轉(zhuǎn)移因子，長度為228個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t3基因編碼seqidno：32所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t3基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第106595-107239個(gè)堿基處，長度為645個(gè)堿基對，編碼雙組分反饋調(diào)節(jié)因子，長度為214個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t4基因編碼seqidno：33所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t4基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第105490-106689個(gè)堿基處，長度為1200個(gè)堿基對，編碼化學(xué)受體，長度為399個(gè)氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t5基因編碼seqidno：34所示的氨基酸序列，具體如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，2t5基因位于該鏈霉菌的基因簇核苷酸序列第104394-105497個(gè)堿基處，長度為1104個(gè)堿基對，編碼雙組分傳感器組氨酸激酶，長度為367個(gè)氨基酸。

參考圖1，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，沿著基因的5’-3’端，2t2基因、2t1基因、2g8基因、2g7基因、2g6基因、2r4基因、2r3基因、2p1基因、2a8基因、2a11基因、2a9基因、2p2基因、2i基因、2o基因、2a10基因、2e基因、2a7基因、2g5基因、2g1基因、2g2基因、2g3基因、2g4基因、2m基因、2a6基因、2a5基因、2a4基因、2a3基因、2a2基因、2a1基因、2r2基因、2r1基因、2t5基因、2t4基因和2t3基因依次串聯(lián)。

此外，需要說明的是，本發(fā)明中，“串聯(lián)”僅表示基因的連接順序，相鄰基因間即可以是直接連接，也可以是存在其它基因片段或者連接處的部分序列存在相互重疊。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，2t2基因、2g7基因、2r4基因、2r3基因、2p2基因、2g5基因、2g3基因、2g4基因、2m基因、2a6基因、2a5基因、2a4基因、2a3基因、2a2基因、2a1基因、2t5基因和2t3基因的表達(dá)方向相同。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，2t1基因、2g8基因、2g6基因、2p1基因、2a8基因、2a11基因、2a9基因、2i基因、2o基因、2a10基因、2e基因、2a7基因、2g1基因、2g2基因、2r2基因、2r1基因、2t4基因的表達(dá)方向相同。

微生物

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種微生物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該微生物具有前述的生物合成基因簇。發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)，利用該微生物進(jìn)行發(fā)酵處理，可以高效、簡單和低成本地合成j1001-2化合物。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微生物為鏈霉菌。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，微生物為streptomyceshygroscopicus亞型鏈霉菌。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種制備j1001-2化合物的方法。參考圖2，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對該方法進(jìn)行解釋說明，該方法包括：

s100發(fā)酵處理

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用前述的微生物進(jìn)行發(fā)酵處理，得到發(fā)酵后的微生物。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，發(fā)酵培養(yǎng)基條件：可溶性淀粉(30g/l),黃豆餅粉(10g/l),酵母提取物(2.5g/l)，碳酸鈣(3g/l)。由此，發(fā)酵效果好，j1001-2化合物產(chǎn)量高。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，發(fā)酵處理的時(shí)間為7-8天。

s200破壁處理

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將發(fā)酵后的微生物進(jìn)行破壁處理，得到含有j1001-2化合物的溶液。

s300純化

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從含有所述j1001-2化合物的溶液中純化所述j1001-2化合物，得到j(luò)1001-2化合物產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，將含有j1001-2化合物的溶液后旋干，采用乙酸乙酯萃取，濃縮后，用硅膠柱粗分離，后用半制備hplc進(jìn)一步純化得到目標(biāo)產(chǎn)物。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制備j1001-2化合物的方法，利用前述的微生物進(jìn)行發(fā)酵處理，可以高效地合成j1001-2化合物。然后，通過微生物破壁處理和分離純化處理，可以高效、簡單和低成本地獲得j1001-2化合物純品。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，通過基因預(yù)測，推測出j1001-2化合物的生物合成途徑如圖3。一方面由聚酮合成基因簇催化丙酰輔酶a和甲基丙二酰輔酶a的延伸合成最終形成長鏈脂肪酸鏈，在通過2o、2i和2e基因的修飾并得到j(luò)1001-2的中間產(chǎn)物，另一方面通過2g1、2g2、2g3、2g4和2m等基因催化得到糖基，再由糖基轉(zhuǎn)移酶2g5、2g6、2g7將糖基轉(zhuǎn)移到脂肪酸鏈上，最后由p450酶2p1和2p2作用形成j1001-2。

下面參考具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自illumina公司。

實(shí)施例1

將streptomyceshygroscopicus亞型鏈霉菌接種于sfm平板，培養(yǎng)三天到四天左右。待sfm培養(yǎng)基中形成菌落時(shí)，挑單菌落至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天到四天左右，按照1％的量接菌至發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的成份為可溶性淀粉30g/l，黃豆餅粉10g/l，酵母抽提物2.5g/l，caco33g/l，ph7.2)中。培養(yǎng)條件：30度，220轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)7到8天時(shí)間。

待培養(yǎng)到第7或8天時(shí)，收取發(fā)酵液，高速離心使上清與菌絲體分離，菌絲體加入等量的丙酮破菌，超聲20min，旋蒸丙酮，上清與菌絲體采用等量的乙酸乙酯萃取，重復(fù)一次。旋蒸濃縮至干，后用硅膠柱粗分離，得到粗品用hplc檢測產(chǎn)物，鑒于hplc結(jié)果顯示該該菌的產(chǎn)量比較高，因此，我們也對濃縮完的樣品進(jìn)行了tlc點(diǎn)板，并在碘缸里顯色，將很明顯的點(diǎn)摳下，用甲醇溶解，高速離心取上清做質(zhì)譜確定目標(biāo)點(diǎn)的位置結(jié)果如圖4所示，表明該化合物為j1001-2化合物。

實(shí)施例2

以streptomyceshygroscopicus亞型鏈霉菌為研究對象，研究j1001-2化合物生物合成基因簇的序列信息，具體方法如下：

1、提取dna

(1)將streptomyceshygroscopicus亞型鏈霉菌接種于tsby培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后，7000rpm×5min收集菌體。

(2)將收集的菌體棄上清，加30mlsetbuffer，打散，離心7000rpm，5分鐘。再次棄上清，加10mlsetbuffer，打散菌體，加300μl溶菌酶(100mg/ml)，37℃水浴30-60分鐘，再加100μl蛋白酶k(100mg/ml)，10μlrnase(10mg/ml)，37℃水浴30分鐘。

(3)向步驟(2)得到的混合物中加入1.2ml10％sds,55℃水浴2小時(shí)，每隔15分鐘輕搖至液體逐漸澄清。

(4)向步驟(3)得到的液體中加入4ml5mnacl，混勻，冷卻至37℃。加10ml氯仿，輕輕混勻30分鐘，離心12000rpm，15分鐘。

(5)取步驟(4)離心的上清液，再次加10ml氯仿，輕輕混勻30分鐘，離心12000rpm，15分鐘。

(6)取步驟(5)離心的上清液，加入0.8倍體積的異丙醇，輕輕混旋至出現(xiàn)絲狀dna。

(7)挑出dna于ep管中，加70％的乙醇洗，然后倒掉乙醇，自然風(fēng)干，溶于一定量的雙蒸水中，提取獲得鏈霉菌的dna。

2、dna序列分析

將該基因組送至測序公司進(jìn)行基因組測序，得到其基因組信息，對組裝后的基因組，使用genemarks進(jìn)行編碼蛋白基因的預(yù)測。隨后利用antismash軟件預(yù)測出與j1-001化合物合成基因簇相似的區(qū)域，并綜合j1-001化合物合成基因簇中蛋白在該菌編碼基因數(shù)據(jù)集中比對結(jié)果，挖掘出j1001-2合成相關(guān)基因?；虼氐慕Y(jié)構(gòu)如圖2所示，負(fù)責(zé)化合物j1001-2的生物合成，各個(gè)基因的功能分析見表1。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。