本發(fā)明涉及一種用基因重組技術(shù)構(gòu)建o型口蹄疫病毒重組核酸、重組疫苗株及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)和生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

口蹄疫(foot-and-mouthdisease，fmd)是由fmd病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，fmdv)引起的豬、牛和羊等偶蹄動物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。fmdv是一種單股正鏈rna病毒，屬小rna病毒科(picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(aphthovirus)，具有a、o、c、asial、sat1、sat2、和sat3型7個不同的血清型，型間無交叉保護(hù)，我國主要流行o型，a型和asia1型口蹄疫，其中o型流行情況復(fù)雜，危害最為嚴(yán)重，對畜產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失。

流行于我國的o型口蹄疫毒株主要有cathay、panasia和mya-98三種拓?fù)湫投局?，cathay流行毒是豬適應(yīng)毒株，臨床上主要引起豬發(fā)病，在我國及周邊國流行和蔓延近40年；panasia毒株屬于me-sa遺傳拓?fù)湫停?999年在我國西藏、海南多個省份發(fā)生大流行，毒株宿主范圍很廣；mya-98毒株屬于sea拓?fù)湫?，自?010年廣東白云區(qū)發(fā)生由該毒株引起的口蹄疫疫情后，我國大面積爆發(fā)由其引起的疫情。鑒于目前國內(nèi)o型口蹄疫流行的現(xiàn)狀，勢必要求開發(fā)制備的疫苗能夠同時預(yù)防多個毒株，疫苗種毒的抗原譜要足夠?qū)挘軐Ξ?dāng)前流行毒株都有效保護(hù)。

病毒反向遺傳操作技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對病毒基因的改造和修飾，通過篩選將t細(xì)胞免疫應(yīng)答較高的毒株構(gòu)建反向遺傳操作系統(tǒng)，作為構(gòu)建重組疫苗株的框架，進(jìn)而獲得生產(chǎn)性能、抗原匹配性、免疫原性等特征改良的疫苗株，實(shí)現(xiàn)無需流行毒株構(gòu)建疫苗株的方式，可以根據(jù)周邊或其他國家流行毒株，建立有針對性的疫苗儲備，實(shí)現(xiàn)更為主動的疫苗毒株構(gòu)建和改良，改變了從流行毒株馴化疫苗株成功率低、費(fèi)時費(fèi)力、受病毒免疫抑制、抗原性差和抗體應(yīng)答晚等自然屬性制約，對整體提升疫苗品質(zhì)和效力具有重大意義。

傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方法受多種因素的限制，為了適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需要，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用在多種疫苗的生產(chǎn)中，不僅縮短了疫苗生產(chǎn)周期，降低勞動強(qiáng)度、提高生產(chǎn)規(guī)模和降低生產(chǎn)成本，還因自動化程度高，工藝條件穩(wěn)定、可控，能夠減少批間差異，提高了疫苗質(zhì)量，同時，自2012年2月1日起，各級獸醫(yī)行政管理部門停止受理轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線項(xiàng)目獸藥gmp驗(yàn)收申請，這就要求疫苗種毒必須要適應(yīng)懸浮細(xì)胞，具有良好的生產(chǎn)性能，不僅病變時間短、滴度高、病變穩(wěn)定，同時要具備產(chǎn)量高的特點(diǎn)，方可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

因此，本研究利用已建立的具有較強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)為框架，將篩選的mya-98毒株作為抗原骨架進(jìn)行重組病毒的構(gòu)建與制備，從疫苗毒種源頭技術(shù)入手，發(fā)明了適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的制苗種毒，提高抗原產(chǎn)能、抗原性、獲得產(chǎn)量高、抗體應(yīng)答強(qiáng)和交叉免疫保護(hù)率高等特征的疫苗種毒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種分離的口蹄疫病毒核酸及其在制備口蹄疫病毒重組核酸和/或口蹄疫病毒重組疫苗株中的用途、一種口蹄疫病毒重組核酸、包含所述重組核酸的口蹄疫重組病毒、由所述重組核酸編碼的口蹄疫重組病毒、包含所述口蹄疫重組病毒的口蹄疫重組疫苗株、一種制備所述口蹄疫重組病毒的方法、由所述方法制備得到的口蹄疫重組疫苗、所述口蹄疫重組疫苗在制備用于預(yù)防和/或控制動物口蹄疫疾病的藥物中的用途。

一方面，本發(fā)明涉及一種分離的口蹄疫病毒核酸。

在本申請中，“分離的”是指一種物質(zhì)(例如多肽或者核酸)與它在自然界中正常存在的環(huán)境相分離或存在于與它在自然界中正常存在的環(huán)境不同的環(huán)境中。

在某些實(shí)施方式中，所述分離的口蹄疫病毒核酸由口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的基因組中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因組成。在某些實(shí)施方式中，所述分離的口蹄疫病毒核酸的序列如seqidno:1所示。

另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的口蹄疫病毒核酸在制備口蹄疫病毒重組核酸和/或口蹄疫病毒重組疫苗株中的用途。

另一方面，本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒重組核酸。

在某些實(shí)施方式中，所述重組核酸的序列包含非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的核酸序列，但是其中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因被口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的核酸序列中相對應(yīng)的基因片段替換。在某些實(shí)施方式中，所述o/jscz/2013株的核酸序列中相對應(yīng)的基因片段與所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因等長或者不等長。在某些實(shí)施方式中，所述o/jscz/2013株的核酸序列中相對應(yīng)的基因片段與所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因片段等長。在某些實(shí)施方式中，所述o/jscz/2013株的核酸序列中相對應(yīng)的基因片段為由o/jscz/2013株的基因組中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因組成的基因片段。

在某些實(shí)施方式中，所述o/jscz/2013株的核酸序列中相對應(yīng)的基因片段如seqidno:1所示。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的l基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的至少100個連續(xù)的核苷酸序列，例如105個、110個、115個、120個、125個、130個、135個、140個、145個、150個、155個、160個、165個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個或者180個連續(xù)的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的l基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的177個連續(xù)的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的p2基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的p2基因中與p1基因相連接的至少1000個連續(xù)的核苷酸序列，例如1050個、1100個、1150個、1200個、1201個、1202個、1203個、1204個、1205個、1206個、1207個、1208個、1209個或者1210個連續(xù)的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的p2基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的p2基因中與p1基因相連接的1206個連續(xù)的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的177個連續(xù)的核苷酸序列、全部p1基因、以及p2基因中與p1基因相連接的1206個連續(xù)的核苷酸序列被由o/jscz/2013株的基因組中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因組成的基因片段替換。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的177個連續(xù)的核苷酸序列、全部p1基因、以及p2基因中與p1基因相連接的1206個連續(xù)的核苷酸序列被如seqidno:1所示的序列替換。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在口蹄疫病毒的基因組中，l基因、p1基因和p2基因從5’端至3’端依次排列。在本申請中，“相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因”是指l基因的3’端與p1基因的5’端可操作地相互連接，p1基因的3’端與p2基因的5’端可操作地相互連接。

在本申請中，“l(fā)基因”是指口蹄疫病毒的基因組中l(wèi)基因的一部分或全部，例如，l基因中與p1基因相連接的至少100個連續(xù)的核苷酸序列，例如105個、110個、115個、120個、125個、130個、135個、140個、145個、150個、155個、160個、165個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個或者180個連續(xù)的核苷酸序列。

在本申請中，“p2基因”是指口蹄疫病毒的基因組中p2基因的一部分或全部，例如，p2基因中與p1基因相連接的至少1000個連續(xù)的核苷酸序列，例如1050個、1100個、1150個、1200個、1201個、1202個、1203個、1204個、1205個、1206個、1207個、1208個、1209個或者1210個連續(xù)的核苷酸序列。

在本申請中，“口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的核酸序列中相對應(yīng)的基因片段”是指口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的基因組中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因，其中l(wèi)基因可以是o/jscz/2013株l基因的全部或者一部分，p2基因可以是o/jscz/2013株p2基因的全部或者一部分。

在本申請中，“非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株”是指口蹄疫病毒的核酸的部分或全部不是來源于o/jscz/2013株的毒株，例如，可以是來自于o/cha/99株、o/gdby/2010株、a/gd/2013株及oie推薦的高效疫苗株等口蹄疫病毒株。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株為o/cha/99株。

另一方面，本發(fā)明涉及一種包含所述重組核酸的口蹄疫重組病毒。

另一方面，本發(fā)明涉及一種由所述重組核酸編碼的口蹄疫重組病毒。

另一方面，本發(fā)明涉及一種包含所述口蹄疫重組病毒的口蹄疫重組疫苗株。

在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫重組疫苗株為a、o、c、asial、sat1、sat2、或者sat3型口蹄疫重組疫苗株。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫重組疫苗株為o型口蹄疫重組疫苗株。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫重組疫苗株能夠激發(fā)對o型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實(shí)施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為mya-98、panasia或cathay譜系毒株，在某些實(shí)施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為o/by/cha/2010、o/0834或o/0718，并且所述口蹄疫重組疫苗株對o/by/cha/2010、o/0834或o/0718的pd50值均大于6。

另一方面，本發(fā)明涉及一種制備所述口蹄疫重組病毒的方法。

在某些實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟：

1)、用特異性引物op12a-f和op12a-r與o/jscz/2013毒株的cdna核酸混合，以擴(kuò)增得到o/jscz/2013毒株的l基因、p1基因及p2基因，將獲得的基因片段替換插入真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pro/cha/99中，得到pro-fmdv的重組質(zhì)粒，所述特異性引物分別是：

op12a-f:5'-ttttccttaagggacaggaacacgccgtgtttgcctgcgt-3'(seqidno:2)

op12a-r:5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaaccttc-3'(seqidno:3)；

2)、用步驟1)得到的真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pro-fmdv轉(zhuǎn)染口蹄疫病毒敏感細(xì)胞，獲得口蹄疫重組病毒。

在某些實(shí)施方式中，所述o/jscz/2013毒株的l基因、p1基因及p2基因包含如seqidno:1所示的核酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫病毒敏感細(xì)胞為bhk-21細(xì)胞或ibrs-2細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，獲得的所述口蹄疫重組病毒適于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，獲得的所述口蹄疫重組病毒的146s抗原含量為4.0μg/ml以上(146s抗原含量的測定方法如中國發(fā)明專利zl201310017378.8所述，其全文通過引用并入本申請)。在某些實(shí)施方式中，對獲得的所述口蹄疫重組病毒進(jìn)行滅活。在某些實(shí)施方式中，所述滅活用二乙烯亞胺進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，在所述滅活之后對所述口蹄疫重組病毒進(jìn)行乳化。在某些實(shí)施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進(jìn)行。

另一方面，本發(fā)明涉及由所述方法制備得到的口蹄疫重組疫苗。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫重組疫苗能夠激發(fā)對o型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實(shí)施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為mya-98、panasia或cathay譜系的流行毒株。在某些實(shí)施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為o/by/cha/2010、o/0834或o/0718，并且所述口蹄疫重組疫苗株對o/by/cha/2010、o/0834或o/0718的pd50值均大于6。

另一方面，本發(fā)明涉及所述口蹄疫重組疫苗在制備用于預(yù)防和/或控制動物口蹄疫疾病的藥物中的用途。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫疾病為a、o、c、asial、sat1、sat2、或者sat3型口蹄疫疾病。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫疾病為o型口蹄疫疾病。在某些實(shí)施方式中，所述動物為偶蹄類動物。在某些實(shí)施方式中，所述動物為豬、牛或羊。

本發(fā)明具有如下積極效果：

本發(fā)明依據(jù)口蹄疫分子流行病學(xué)，借助已經(jīng)建立的高效反向遺傳操作技術(shù)，通過相關(guān)基因的改造，進(jìn)行口蹄疫疫苗株多種表型的改善和提高，構(gòu)建了病變時間短、病毒滴度高、抗原匹配性高、病毒產(chǎn)量高的重組疫苗株，解決了篩選疫苗種毒的生產(chǎn)和馴化的問題，以此疫苗毒株框架為構(gòu)建高效疫苗種毒奠定基礎(chǔ)。

1)、在病毒水平上提高了口蹄疫疫苗株的生產(chǎn)性能，病變時間降低，病毒滴度提高，重組毒株穩(wěn)定傳代后病變時間可縮短至11h左右，測定重組病毒ro-fmdv的毒價為8.33，而流行毒株為7.5，說明獲得的重組毒株的滴度比流行毒提高約10倍，降低了抗原生產(chǎn)成本。

2)、實(shí)現(xiàn)提高疫苗毒株抗原匹配性和免疫應(yīng)答性，本發(fā)明構(gòu)建的疫苗毒株的結(jié)構(gòu)蛋白與流行毒株一致，抗原匹配性完全匹配，提高了疫苗株與流行毒株的針對性。

3)、實(shí)現(xiàn)提高疫苗毒株抗原譜廣的特點(diǎn)，以分子流行病學(xué)為基礎(chǔ)，對mya-98毒株進(jìn)行大量篩選，選擇抗原位點(diǎn)與本譜系流行毒株的匹配性好，且與其它譜系，cathay和panasia流行毒株抗原交叉重疊，表現(xiàn)較高的抗原匹配性的o/jscz/2013毒株作為抗原骨架進(jìn)行重組疫苗株的構(gòu)建，通過交叉免疫中和試驗(yàn)及攻毒試驗(yàn)表明，重組疫苗株能夠有效保護(hù)mya-98、panasia和cathay流行毒株，pd50分別為13.59、7.05、9.0，實(shí)現(xiàn)了該重組疫苗株的抗原廣譜性。

4)、本發(fā)明的重組疫苗株ro-fmdv的骨架為高效疫苗株，在懸浮bhk-21細(xì)胞上培養(yǎng)生產(chǎn)獲得的抗原，其抗原含量可達(dá)4.0μg/ml以上，比流行毒在懸浮細(xì)胞上的產(chǎn)量提高約2倍以上，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

5)、本發(fā)明的重組疫苗株ro-fmdv具有對宿主致病性降低的特性。

6)、用含相同抗原含量的重組毒與野生毒分別制備滅活疫苗，免疫宿主動物豬，在第7天，5/7的ro-fmdv疫苗免疫組動物抗體效價≥1:45，而野毒株疫苗免疫組僅3/7的動物效價≥1:45；在第14天，6/7的ro-fmdv疫苗免疫動物抗體效價≥1:90，而僅3/7的野生毒疫苗免疫動物抗體效價≥1:90。攻毒結(jié)果表明，ro-fmdv疫苗免疫動物攻毒100％(7/7)免疫保護(hù)，而野生毒疫苗免疫動物攻毒71.5％(5/7)免疫保護(hù)。說明重組疫苗株免疫動物后能夠較早應(yīng)答，且產(chǎn)生較高水平的抗體，攻毒保護(hù)率為100％。

7)、本發(fā)明技術(shù)不僅改變了疫苗毒篩選馴化技術(shù)受病毒自然屬性制約大、費(fèi)時費(fèi)力、成功率低的缺陷，可以實(shí)現(xiàn)更為主動有效的疫苗毒株構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了口蹄疫滅活疫苗毒種制備工藝的革新，具有重大應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中fmdvo/jscz/2013株l基因、p1基因及p2基因片段的電泳圖，其中1為擴(kuò)增片段，m為dnamarker。

圖2為實(shí)施例1中o型口蹄疫病毒重組質(zhì)粒pro-fmdv的構(gòu)建策略示意圖。

圖3為實(shí)施例2中重組病毒ro-fmdv感染bhk-21細(xì)胞后引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)，其中a表示正常bhk-21細(xì)胞；b表示出現(xiàn)cpe的bhk-21細(xì)胞。

圖4為seqidno:1的核酸序列。

圖5為seqidno:2和seqidno:3的核酸序列。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室近年來的毒株積累和對其全基因組序列的分析研究，將我國o型口蹄疫病毒o/jscz/2013株l基因、p1基因及p2基因片段，通過合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與已經(jīng)建立的o型口蹄疫病毒o/cha/99株的拯救系統(tǒng)中相應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行替換，得到一種o型口蹄疫病毒感染性克隆pro-fmdv，在bhk-21細(xì)胞或ibrs-2細(xì)胞上拯救后，得到重組o型口蹄疫病毒ro-fmdv，其與流行毒的抗原匹配性完全匹配，且與panasia和cathay譜系的流行毒株抗原交叉重疊，抗原譜廣。該重組疫苗株生產(chǎn)性能好，用懸浮bhk-21細(xì)胞生產(chǎn)，其抗原含量可達(dá)4.0μg/ml以上，制備的疫苗可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的抗體應(yīng)答，具有高滴度、高抗原產(chǎn)能、抗原譜廣、致病性降低、抗體應(yīng)答水平較高、免疫保護(hù)率高的特點(diǎn)。

下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何限定。

下列實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(f.m.奧斯伯，r.e.金斯頓，j.g.賽德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍譯，北京：科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。

實(shí)施例1.o型口蹄疫重組病毒感染性克隆的構(gòu)建：

發(fā)明人所用o/jscz/2013毒株由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局指定國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室保藏，公眾可通過農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局批示的委托函獲得。根據(jù)o/jscz/2013株基因組序列，設(shè)計合成一對擴(kuò)增引物，op12a-f(5'-ttttccttaagggacaggaacacgccgtgtttgcctgcgt-3')和op12a-r(5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaaccttc-3')，用rnaeasyminikit(qiagen)提取o/jscz/2013毒株的總rna，用引物olignoti(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cdna，用具有極強(qiáng)延伸能力的primescriptreversetranscriptase(takara公司)反轉(zhuǎn)錄酶，按照產(chǎn)品說明書配制20μl反應(yīng)體系，于42℃反應(yīng)1h備用，以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cdna為模板，用引物op12a-f和op12a-r與o/jscz/2013毒株的cdna核酸混合，以擴(kuò)增獲得o/jscz/2013毒株的l基因、p1基因及p2基因片段。擴(kuò)增用適合長片段擴(kuò)增、性能優(yōu)良的la(takara公司)dna聚合酶，按照產(chǎn)品說明書配制50μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃3min30s，35個循環(huán)后，72℃10min，純化回收pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并送測序，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示，大小為3591bp，與預(yù)期大小相符，測序結(jié)果顯示是seqidno:1所示的核苷酸序列。

將得到的含有o/jscz/2013毒株l基因、p1基因和p2基因以及o型口蹄疫病毒o/cha/99株拯救系統(tǒng)的質(zhì)粒pro/cha/99(公開于授權(quán)專利“asia1型口蹄疫重組病毒及其制備方法和應(yīng)用”zl201310175323.x和“a型口蹄疫重組疫苗株及其制備方法和應(yīng)用”zl201310175324.4中，其全文通過引用并入本申請中)分別用aflii和clai雙酶切后，純化回收相應(yīng)的目的片段，連接、轉(zhuǎn)化至jm109感受態(tài)細(xì)胞中，測序鑒定陽性克隆，獲得含o/jscz/2013毒株l基因p1基因及p2基因的重組質(zhì)粒pro-fmdv，構(gòu)建方法如圖2所示。

實(shí)施例2.o型口蹄疫重組病毒的拯救：

用plasmidplusmaxikit(qiagen公司)制備由實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒pro-fmdv，當(dāng)bhk-21細(xì)胞生長至80％時用于轉(zhuǎn)染，在脂質(zhì)體lipofectamine^tm2000(invitrogen)的介導(dǎo)下將4μg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞，同時設(shè)立脂質(zhì)體對照和正常細(xì)胞對照，放置于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染6h后棄去上清，加入mem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞出現(xiàn)90％左右病變時收獲病毒，反復(fù)凍融3次后再次接種bhk-21細(xì)胞，直到病毒能穩(wěn)定地產(chǎn)生細(xì)胞病變，出現(xiàn)細(xì)胞變圓，聚集成葡萄狀分布，最終細(xì)胞崩解成碎片。將得到的o型口蹄疫重組病毒命名為ro-fmdv，在圖3中，a：為正常對照bhk-21細(xì)胞圖片；b：拯救的重組病毒ro-fmdv感染bhk-21細(xì)胞出現(xiàn)的cpe的圖片。

實(shí)施例3.o型口蹄疫重組病毒的鑒定：

3.1rt-pcr鑒定重組病毒

將穩(wěn)定傳代的重組病毒ro-fmdv感染bhk-21細(xì)胞的上清用rnaeasyminikit(qiagen)提取總rna，反轉(zhuǎn)錄后，擴(kuò)增，純化回收后送測序，結(jié)果顯示獲得的重組o型口蹄疫病毒的l基因、p1基因及p2基因與o/jscz/2013株的基因序列是一致的。

3.2間接免疫熒光鑒定病毒抗原

將轉(zhuǎn)染后傳至第2代的細(xì)胞上清，接種至底部放置了載玻片的生長有bhk-21細(xì)胞的六孔板里(單層細(xì)胞生長至60％～70％)，置于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中，12h后按常規(guī)方法做間接免疫熒光，一抗為o型fmdv兔陽性血清，二抗為標(biāo)記fitc羊抗兔igg(sigma公司)，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。接種第2代細(xì)胞液的bhk-21細(xì)胞中可見綠色特異性熒光，而正常細(xì)胞對照無可見熒光產(chǎn)生，表明重組o型口蹄疫病毒感染的bhk-21細(xì)胞中有fmdv蛋白的表達(dá)。

實(shí)施例4.o型口蹄疫重組病毒的致病力試驗(yàn)：

4.1對bhk-21細(xì)胞的致病力試驗(yàn)

按照常規(guī)方法對bhk-21細(xì)胞進(jìn)行消化，加入含10％胎牛血清的mem細(xì)胞培養(yǎng)基，將分散的細(xì)胞鋪于12孔板中，于37℃含有5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞單層長到90％時備用。用mem以10倍倍比稀釋病毒液，將各稀釋度(10^-4.0～10^-9.0)的病毒液分別加入細(xì)胞板中，每個稀釋度4孔，放入37℃含有5％co2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察3天，用reed-muench氏法測定對bhk-21細(xì)胞的半數(shù)感染量(tcid50)。按照該法測定拯救病毒ro-fmdv和流行毒的滴度，計算拯救病毒ro-fmdv的tcid50為10^-8.33/ml，流行毒株o/by/cha/2010的tcid50為10^-7.5/ml。

reed-muench計算方法是本領(lǐng)域的已有技術(shù)，現(xiàn)有文獻(xiàn)“reed,l.j.andmuench,h.(1938)."asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints".theamericanjournalofhygiene27:493–497”中對此已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)地描述，該文獻(xiàn)在此通過引用方式并入本申請用作參考。

4.2對乳鼠致病力試驗(yàn)

將重組病毒ro-fmdv和流行毒分別用pbs做10倍倍比稀釋，各取10^-4～10^-9倍比稀釋的病毒液經(jīng)皮下接種3日齡乳鼠，每個稀釋度各接種4只，接種劑量為200μl/只，連續(xù)觀察7d?？瞻讓φ战M乳鼠接種pbs緩沖液200μl/只，觀察并記錄乳鼠發(fā)病和死亡情況，用reed-muench法計算半數(shù)致死量(ld50)，拯救病毒ro-fmdv的ld50為10^-6.0/0.2ml，流行毒株o/by/cha/2010的ld50為10^-6.5/0.2ml。

4.3對豬和牛的致病力試驗(yàn)

從非疫區(qū)篩選試驗(yàn)用豬和牛，各6頭，并經(jīng)國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測o型抗體均＜1：4，fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。按常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)bhk-21細(xì)胞，制備重組病毒ro-fmdv，收獲的病毒液置于-70℃保存，重組毒采用注射途徑進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為10⁷tcid50，豬肌肉注射2ml/頭，牛舌部皮下注射1ml/頭，同時設(shè)立流行毒株o/by/cha/2010對照組，連續(xù)觀察10天，測量體溫變化并觀察記錄發(fā)病情況。攻毒結(jié)果顯示，流行毒經(jīng)注射途徑攻毒后，豬和牛從第2天開始出現(xiàn)臨床癥狀，ro-fmdv攻毒后，豬未出現(xiàn)臨床癥狀，并且對牛的致病性也降低，見表1。

表1重組疫苗株和流行毒株致病力試驗(yàn)臨床癥狀

實(shí)施例5.懸浮bhk-21細(xì)胞培養(yǎng)o型口蹄疫重組病毒：

按常規(guī)懸浮bhk-21細(xì)胞培養(yǎng)方法將懸浮細(xì)胞逐級擴(kuò)大至10l機(jī)械攪拌式動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器(默克密理博)中，細(xì)胞培養(yǎng)階段，反應(yīng)器ph值設(shè)定7.0，反應(yīng)器溶氧受空氣、氧氣和co2氣路的控制，攪拌轉(zhuǎn)速40r/min，溫度37℃，細(xì)胞培養(yǎng)至24、48小時進(jìn)行臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)及活力檢查。細(xì)胞接毒階段，反應(yīng)器ph值調(diào)至7.4-7.6，攪拌轉(zhuǎn)速按照實(shí)際細(xì)胞數(shù)調(diào)整至50r/min左右，按細(xì)胞培養(yǎng)液體積的2.0％的比例，將已知抗原含量的o型口蹄疫重組病毒或流行毒株的種毒液接種到反應(yīng)器中，從接毒后定時在無菌條件下取樣，進(jìn)行臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)及活力檢查，于-40℃保存待用，當(dāng)活細(xì)胞密度低于1.0×10⁶/ml或細(xì)胞活力≤15％后一次性全部收樣，統(tǒng)一測定口蹄疫病毒抗原含量，由結(jié)果可以看出，o型重組口蹄疫病毒的抗原含量可達(dá)4.0μg/ml以上，而流行毒的卻為2.0μg/ml左右。見表2。

表2重組疫苗株和流行毒株懸浮bhk-21細(xì)胞培養(yǎng)后抗原含量測定

實(shí)施例6.o型口蹄疫重組疫苗的制備和免疫效果評價：

6.1疫苗制備

將由懸浮bhk-21細(xì)胞制備的重組病毒ro-fmdv及野毒培養(yǎng)物分別滅活，用3mmol/l二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)30℃滅活30h，加入阻斷劑硫代硫酸鈉溶液，4℃過夜，保存?zhèn)溆?。滅活抗原?jīng)安檢后與isa206佐劑(法國seppic)以1：1比例混合制備疫苗。具體按照《中華人民共和國藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。安檢牛舌部皮下注射滅活病毒2ml/頭，連續(xù)逐日觀察6日，觀察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均無異常。實(shí)驗(yàn)用牛購自非疫區(qū)，并經(jīng)國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測o型抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。

6.2疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

將得到的安檢合格的o型口蹄疫重組病毒疫苗分別免疫10頭牛，10頭豬，同時各設(shè)2頭非免疫對照，測定其免疫效力。攻毒方法及結(jié)果判定方法均按照《manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals》(2009年版，世界動物衛(wèi)生組織(oie))中所述。

免疫豬28天后，用1000倍豬半數(shù)感染劑量(sid50劑量)的流行毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，連續(xù)觀察10天，結(jié)果表明，免疫的動物沒有臨床癥狀，100％保護(hù)，如表3所示。

表3o型口蹄疫重組疫苗免疫豬攻毒后臨床癥狀和保護(hù)情況

免疫牛28天后，用10000倍牛半數(shù)感染劑量(bid50劑量)的流行毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，連續(xù)觀察10天，結(jié)果表明：免疫的動物沒有臨床癥狀，100％保護(hù)，如表4所示。

表4o型口蹄疫重組疫苗免疫牛攻毒后臨床癥狀和保護(hù)情況

說明用該o型口蹄疫重組病毒作為疫苗株免疫豬和牛，能有效保護(hù)當(dāng)前o型口蹄疫流行毒的攻擊。

6.3重組疫苗株與流行毒株制備疫苗免疫比較試驗(yàn)

將o型口蹄疫重組病毒疫苗和流行毒株制備的疫苗分別免疫7頭豬，免疫劑量相同，于免疫后第7d，14d，21d，28d用o型fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測血清中的抗體水平。28d后，用1000倍sid50劑量的流行毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，設(shè)3頭對照，連續(xù)觀察15日。結(jié)果表明，重組疫苗株誘導(dǎo)的抗口蹄疫抗體效價隨著免疫期的延長不斷上升，抗體應(yīng)答比野毒株疫苗早，并且產(chǎn)生的抗體水平也比野毒株疫苗免疫組高。攻毒結(jié)果顯示，重組疫苗株的保護(hù)率為100％，比野毒株疫苗的保護(hù)率(71.5％)高。說明與野毒株疫苗相比，該o型口蹄疫重組疫苗免疫動物后能夠獲得更好的免疫應(yīng)答效果，如表5所示。

表5o型口蹄疫重組疫苗與流行毒株制備疫苗免疫豬后抗體應(yīng)答與保護(hù)率比較

6.4交叉免疫中和試驗(yàn)

將上述o型口蹄疫重組疫苗免疫動物所得到的血清與o/by/cha/2010(屬于mya-98)，o/0834(屬于panasia)，o/0718(屬于cathay)三株毒進(jìn)行病毒交叉免疫中和實(shí)驗(yàn)，測定抗體匹配值r，其中1≥r≥0.3表明毒株與疫苗的匹配性高，疫苗免疫動物后能抵抗此毒株的攻擊，可作為潛在疫苗株；r≤0.3表明毒株與疫苗匹配性較差，疫苗免疫動物后不能抵抗相應(yīng)毒株的攻擊。結(jié)果如表6。由表6可知，上述o型口蹄疫重組疫苗與o/by/cha/2010(屬于mya-98)，o/0834(屬于panasia)，o/0718(屬于cathay)三種毒株的匹配性高，疫苗免疫動物后能抵抗這三種毒株的攻擊，可作為潛在疫苗株。

表6病毒交叉免疫中和試驗(yàn)抗體匹配值

6.5疫苗免疫效力與交叉攻毒試驗(yàn)

按2015年版《中國獸藥典》方法進(jìn)行，口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測o抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。本試驗(yàn)所用動物均嚴(yán)格在absl-3實(shí)驗(yàn)室圈養(yǎng)。按照2015年版《中國獸藥典》記載的半數(shù)保護(hù)量(pd50)測定方法來測定疫苗的半數(shù)保護(hù)量，具體方法如下。免疫組每組15頭，免疫劑量分1頭份、1/3頭份、1/9頭份，分別免疫，28d后，分別用mya-98、panasia、cathay的流行代表毒進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為1000倍sid50，每組設(shè)3頭對照，攻毒方式為肌肉注射。連續(xù)觀察15日，根據(jù)舌面、齒齦、蹄出現(xiàn)水泡等口蹄疫癥狀判定病毒液致動物發(fā)病情況，動物發(fā)病即判為不保護(hù)。計算各組免疫動物的保護(hù)比例。最后再按照reed-muench法分別計算各組的pd50。

免疫效力及交叉攻毒試驗(yàn)測定結(jié)果表明，重組毒株對mya-98、panasia和cathay的pd50分別為13.59、7.05、9.0，對o型不同拓?fù)湫涂谔阋卟《镜拿庖弑Ｗo(hù)效力大于oie推薦的pd50(即，6)，是理想的抗o型口蹄疫重組疫苗，可用于我國及其周邊國家o型口蹄疫病毒的預(yù)防和控制，參見表7。

表7o型口蹄疫重組疫苗株免疫效力及交叉攻毒保護(hù)結(jié)果

以上所述的實(shí)施例僅表述了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可做出其它改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

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