專(zhuān)利名稱(chēng)：一種口蹄疫三價(jià)多肽疫苗及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的口蹄疫疫苗，特別是一種由基因工程方法生產(chǎn)的三價(jià)多肽疫苗及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，將成為動(dòng)物疫苗行業(yè)持續(xù)增長(zhǎng)動(dòng)力源。目前我國(guó)的肉類(lèi)、 蛋類(lèi)產(chǎn)量均列世界第一位，是世界畜產(chǎn)品生產(chǎn)第一大國(guó)。2004年我國(guó)全年畜牧業(yè)產(chǎn)值首次突破1萬(wàn)億元大關(guān)，畜牧業(yè)產(chǎn)值占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的比重在逐步提高。由于世界范圍內(nèi)疫情不斷，口蹄疫、禽流感、瘋牛病等，給世界各國(guó)的動(dòng)物疫病防治與控制工作提出了挑戰(zhàn)。口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是畜牧業(yè)中偶蹄類(lèi)動(dòng)物(豬、牛、羊及駱駝)的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。迄今為止，世界各國(guó)除北美、澳大利亞之外，都曾爆發(fā)過(guò)口蹄疫的大規(guī)模流行。這種疾病的流行曾對(duì)德國(guó)(1937-1938)、歐洲(1951-1952)、土耳其 (1964-1965)、英國(guó)(1967-1968)、奧地利(1973)、法國(guó)(1974)、韓國(guó)(2002)等國(guó)家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。口蹄疫的臨床診斷特點(diǎn)為口腔粘膜、蹄部和乳房的皮膚發(fā)生水皰和潰爛，由口蹄疫病毒引起，對(duì)于畜牧業(yè)，豬、牛及羊的飼養(yǎng)及畜產(chǎn)品的貿(mào)易危害極大?？谔阋卟《綩7OOt and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)屬于細(xì)小RNA病毒，對(duì)豬、牛及羊傳染途徑多，毒力強(qiáng)， 一頭病牛的排毒量可感染100萬(wàn)頭牛，1克病豬蹄部水皰皮可使10萬(wàn)頭豬感染發(fā)病。易于傳播，傳播迅速，流行面廣，生產(chǎn)性能下降，防治費(fèi)用高，發(fā)病率100%，成年畜死亡率一般 1-2%，但幼畜高達(dá)50%，甚至100%。往往幾個(gè)省，幾大洲甚至全球同時(shí)發(fā)生。直接接觸和間接接觸傳播均可，主要經(jīng)消化道傳播，還可經(jīng)呼吸道傳播，往往牛、羊、豬在同一時(shí)間內(nèi)發(fā)病，具有感染多種動(dòng)物的能力以及具有多種抗原形式，流行可呈跳躍式傳播，一年四季均可發(fā)生，每隔1-2年或3-5年就流行一次。近年來(lái)，豬發(fā)生有擴(kuò)大的趨勢(shì)。FMDV的初級(jí)復(fù)制是在咽部，然后感染鄰近的淋巴結(jié)并且進(jìn)入血流，進(jìn)而擴(kuò)散到各種器官和組織中。大多數(shù)情況下，動(dòng)物感染2-14天出現(xiàn)臨床癥狀。較年長(zhǎng)的動(dòng)物感染FMDV后很少出現(xiàn)死亡，但動(dòng)物的生殖能力、生長(zhǎng)和健康受到很大影響。國(guó)際獸疫局將FMDV列為A類(lèi)烈性傳染病。FMDV—旦發(fā)生，難以控制，每次爆發(fā)后只能屠宰和集體焚毀染病牲畜以絕后患。由于口蹄疫傳播迅速、 難于防治、補(bǔ)救措施少，被稱(chēng)為畜牧業(yè)的“頭號(hào)殺手”，對(duì)于畜牧業(yè)是毀滅性打擊。根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定，一旦出現(xiàn)口蹄疫疫情，當(dāng)事國(guó)將自動(dòng)喪失非口蹄疫疫區(qū)資格?？谔阋卟《揪哂酗@著的抗原多樣性，目前發(fā)現(xiàn)的FMDV有0、A、C、SATU SAT2、 SAT3(即南非1、2、3型)和Asial (亞洲1型)7個(gè)血清型。每種血清型還可以繼續(xù)分成多種亞型。中國(guó)原為0型FMD流行區(qū)，周邊國(guó)家是A型FMD流行區(qū)，近2年報(bào)道見(jiàn)A型、0型及Asia I型流行?？谔阋卟《绢w粒中含有一條正鏈極性的、由8500個(gè)核苷酸組成的單鏈 RNA。病毒顆粒的囊膜包括包繞單鏈RNA的四種結(jié)構(gòu)蛋白VPl (分子量34000)、VP2 (分子量 30000)、VP3(分子量26000)、VP4(分子量13500)。四種結(jié)構(gòu)蛋白每種60個(gè)分子構(gòu)成一個(gè)二十面體病毒粒子。二十面體的頂點(diǎn)由結(jié)構(gòu)蛋白VPl的免疫決定簇區(qū)域?yàn)?41-160區(qū)域和200-213區(qū)域。對(duì)于FMD，注射疫苗是目前預(yù)防口蹄疫的最有效手段。免疫疫苗有1、減毒疫苗及滅活疫苗傳統(tǒng)的減毒疫苗及滅活疫苗是利用大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，然后感染口蹄疫病毒，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、分離病毒，再用化學(xué)試劑使病毒滅活后制備而成。法國(guó)Merieux公司是最大的滅活 FMDV疫苗生產(chǎn)廠(chǎng)家。懸浮細(xì)胞、單層細(xì)胞培養(yǎng)濃度低，約1*106，成本高，制備需要嚴(yán)格的隔離、封閉條件下生產(chǎn)；此外，疫苗的貯藏運(yùn)輸保存需要冷鏈，增加成本；滅活FMDV疫苗的效價(jià)變動(dòng)較大，疫苗還存在復(fù)強(qiáng)和殘存的痕跡活病毒引起疾病流行和大規(guī)模爆發(fā)的危險(xiǎn)；另外，疫苗的質(zhì)量還經(jīng)常會(huì)影響奶牛的乳液分泌；使用滅活的FMDV疫苗雖然不常發(fā)生過(guò)敏性休克或昏迷，但一旦發(fā)生就足以造成嚴(yán)重后果；最后，首次免疫要2周至2個(gè)月內(nèi)用二次，以后每隔6個(gè)月注射一次。免疫預(yù)防工作量非常大。國(guó)際上認(rèn)為滅活FMDV疫苗接種免疫的動(dòng)物為病毒的攜帶者(滅活后殘留的活病毒顆粒的影響)，因而這種動(dòng)物和畜產(chǎn)品不能進(jìn)入國(guó)際貿(mào)易市場(chǎng)。沒(méi)有FMDV的國(guó)家如北美、澳大利亞，本土不生產(chǎn)滅活疫苗，嚴(yán)格防止疫區(qū)國(guó)家的動(dòng)物和畜產(chǎn)品進(jìn)口。2、空殼類(lèi)病毒顆粒疫苗FMDV空殼類(lèi)病毒顆粒疫苗雖然無(wú)活病毒的擴(kuò)散危險(xiǎn)，安全有效，但需采取昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)。昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)分為大量懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)及家蠶幼蟲(chóng)培養(yǎng)三種，前兩者大量培養(yǎng)技術(shù)難度大，成本高，收率低，價(jià)格高，昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)比BHK-21細(xì)胞低，后者家蠶幼蟲(chóng)需要土地種植桑樹(shù)，并受季節(jié)限制，一年一次。3、多肽疫苗合成多肽疫苗能克服常規(guī)疫苗的缺點(diǎn)，很早就被認(rèn)為是動(dòng)物傳染病預(yù)防用的終極疫苗。1982年研發(fā)出人工合成的多肽苗。使用大腸桿菌作為寄主細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間只需 20個(gè)小時(shí)，周期比用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)滅活疫苗短得多，基因工程疫苗對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，沒(méi)有泄露的危險(xiǎn)，非常安全，且生產(chǎn)出的疫苗在貯藏、運(yùn)輸和使用過(guò)程中不需要冷藏，效價(jià)穩(wěn)定。 而且，目前的FMDV疫苗，不論是滅活FMDV疫苗或者是多肽疫苗，都不能通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)分辨被免疫動(dòng)物和已感染動(dòng)物，而被免疫動(dòng)物與已感染動(dòng)物混淆會(huì)給市場(chǎng)進(jìn)出口造成極大影響。因此，制備出免疫效價(jià)提高而且可用于分辨被免疫動(dòng)物和已感染動(dòng)物的基因工程多價(jià)口蹄疫疫苗是我們不斷追求的目標(biāo)。20多年來(lái)多肽疫苗的研究多集中在VPl外殼蛋白的B細(xì)胞單一免疫決定簇，進(jìn)一步研究表明結(jié)構(gòu)蛋白VPl的免疫決定簇為141-160區(qū)域和200-213區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域的多肽片段與載體蛋白經(jīng)化學(xué)聯(lián)接后產(chǎn)生的抗體能中和病毒粒子(Nature，1982，四8 :30-33 ； J. Virology, 2000,74 :4902-4907 J. Virology,2001,75 :3164-3174 ； J.Virology,2003， 77 :8633-8640 ；Vaccine, 2002, 20 :2603-2610) 然而因中和抗體產(chǎn)生較少，合成多肽疫苗免疫動(dòng)物后所起的免疫保護(hù)作用并沒(méi)有人們當(dāng)初設(shè)想的那么理想，利用價(jià)值甚至被否認(rèn)。 在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫的過(guò)程中，單一的中和抗原表位是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。近年來(lái)的研究證明除了 VPl的B細(xì)胞免疫決定簇之外，需要VP4的T細(xì)胞免疫簇協(xié)同作用，可獲得很好的免疫中和抗體保護(hù)效果。復(fù)旦大學(xué)等單位研制的Asial基因工程疫苗含T-helper和VPl免疫決定簇疫苗具有保護(hù)效果，能夠產(chǎn)生中和抗體。美國(guó)UBI公司合成的多肽疫苗具有T-細(xì)胞Helper多肽與VPl的B細(xì)胞免疫決定簇多肽，大大增強(qiáng)了中和抗體的作用(10倍左右)，具有明確的免疫保護(hù)效果。具有良好的安全性無(wú)發(fā)熱癥狀、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生、注射部位無(wú)吸收不良現(xiàn)象、對(duì)妊娠母豬的健康狀況和妊娠沒(méi)有影響，對(duì)產(chǎn)仔成績(jī)也沒(méi)有影響。目前需要大量、廉價(jià)生產(chǎn)多肽類(lèi)疫苗。但是，化學(xué)合成超過(guò)20個(gè)氨基酸的肽鏈非常昂貴。因此，需要發(fā)展生物技術(shù)通過(guò)基因工程大量生產(chǎn)多肽。然而，實(shí)際應(yīng)用還距離很遠(yuǎn)。 根據(jù)近20年對(duì)多肽的研究報(bào)告，除胰島素外，基因工程并不比化學(xué)合成具有優(yōu)勢(shì)。根本原因是基因工程的理論發(fā)展與實(shí)際應(yīng)用尚有待發(fā)展，況且，多肽在體內(nèi)迅速降解不利于相應(yīng)抗體的誘導(dǎo)產(chǎn)生。應(yīng)利用基因工程技術(shù)制備FMDV多肽疫苗。與其他基因工程多肽產(chǎn)品一樣，生產(chǎn)需解決一系列的上游設(shè)計(jì)與下游工藝問(wèn)題。盡管有很多報(bào)道，離應(yīng)用尚遠(yuǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種新型的基因工程三價(jià)口蹄疫多肽疫苗。本發(fā)明的一種口蹄疫病毒三價(jià)多肽類(lèi)疫苗，由1個(gè)基因工程菌制備，口蹄疫病毒外殼蛋白有四種即VPl、VP2、VP3、VP4，該基因工程菌是口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞 helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接0型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接A型 VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，口蹄疫病毒三價(jià)多肽類(lèi)疫苗別含有2114個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其中η為1-5的整數(shù)。本發(fā)明的又一目的是提供所述口蹄疫疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明的三價(jià)多肽疫苗，基因工程菌其中含有串聯(lián)的基因以大腸桿菌(E.Coli) 中攜帶的Lac質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)。所述的疫苗還包括藥學(xué)上可接受的載體、輔料和/或免疫佐劑。另一方面，本發(fā)明還提供了能夠表達(dá)所述口蹄疫多肽疫苗的一種基因工程菌株。該基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒分別含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列， 其中η為1-5的整數(shù)。本發(fā)明提供所述口蹄疫疫苗在防治口蹄疫疾病中的用途以及在區(qū)分感染動(dòng)物和被免疫動(dòng)物中的用途。本發(fā)明還提供了一種偶蹄類(lèi)家畜口蹄疫病毒多肽疫苗制備方法，包括基因重組、 重組融合蛋白的制備，其特征在于(1)為合成基因工程菌，用化學(xué)合成的方法合成編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15 個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接0型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)A/Asia I重復(fù)片段，串聯(lián)4次；(2)為合成基因工程菌，將4個(gè)重復(fù)片段插入Lac質(zhì)粒載體；(3)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，得到菌株；(4)將菌株置于營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時(shí)間為12- 小時(shí)，發(fā)酵液中加入氨芐西林使其最后濃度為50μ g/ml，及IPTG，濃度為0. 5mM，發(fā)酵結(jié)束后離心獲得菌體，經(jīng)細(xì)胞粉碎，包涵體復(fù)性，融合蛋白的分離純化，凍干即可獲得產(chǎn)品，與佐劑勻漿形成三價(jià)多肽疫苗。本發(fā)明對(duì)多肽的基因工程研究包括建立了上游高效表達(dá)的設(shè)計(jì)和密集型高新技術(shù)的下游工藝，建立了高收率、低成本的簡(jiǎn)化工藝?；虼?lián)后在大腸桿菌中表達(dá)，得到具有理想的免疫原性的三價(jià)多肽疫苗，與抗體進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)獲得很好的效果。因?yàn)榇?lián)4次表達(dá)獲得的是大分子，產(chǎn)生中和抗體的量明顯增加，多肽在體內(nèi)的半衰期也得到延長(zhǎng)。用本發(fā)明的多肽制備成疫苗，可防治0、A及Asia I三種類(lèi)型的口蹄疫?？谔阋呷齼r(jià)基因工程多肽疫苗是系列多肽藥物之一，可以廉價(jià)大量生產(chǎn)。以大腸桿菌為工程菌發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間只需 12個(gè)小時(shí)，基因工程疫苗對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，沒(méi)有泄露的危險(xiǎn)。生產(chǎn)出來(lái)的疫苗在貯藏、運(yùn)輸和使用過(guò)程中無(wú)需冷鏈。一次免疫涵蓋我國(guó)全部亞型。我們的基因工程口蹄疫疫苗除免疫效價(jià)高外還可分辨被免疫動(dòng)物及已感染動(dòng)物。使用本發(fā)明的疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)1)安全性好，本發(fā)明是基因工程產(chǎn)品，不是滅活疫苗，不存在因痕量活病毒泄露而引起疾病爆發(fā)的危險(xiǎn)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，以較高劑量的疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射，在較長(zhǎng)的觀(guān)測(cè)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康存活。2)本發(fā)明的疫苗適用于基因工程的方法大規(guī)模生產(chǎn)，降低了成本?；美帽景l(fā)明的疫苗可以區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物。在自然界中，感染A型口蹄疫的動(dòng)物，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生A型口蹄疫抗體；感染0型口蹄疫的動(dòng)物，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生0型口蹄疫抗體；感染Asia I型口蹄疫的動(dòng)物，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生Asia I型口蹄疫抗體。本發(fā)明的疫苗同時(shí)具有0型、A型及Asia I型三種口蹄疫病毒VPl免疫決定簇，免疫注射后，動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗0型、抗A型、抗Asia I型三種口蹄疫的抗體，可以藉此區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物，避免給動(dòng)物進(jìn)出口造成混亂。4)本發(fā)明的疫苗含有有0型、A 型及Asia I型三種口蹄疫病毒VPl免疫決定簇，又含有VP4的T-Helper多肽，大大增強(qiáng)了中和抗體的作用，4個(gè)重復(fù)片段表達(dá)，多肽的分子量大，在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，其產(chǎn)生中和抗體的時(shí)間也大大延長(zhǎng)。


圖1是基因工程菌的表達(dá)載體中的結(jié)構(gòu)SEQ ID ；圖2是質(zhì)粒F4的構(gòu)建過(guò)程示意圖，圖示如何將基因片段串聯(lián)4次的過(guò)程；圖3是含Lac載體的基因工程菌(E. Coli)在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)圖譜(Uhr，發(fā)酵罐瑞士比歐，100L)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一本發(fā)明根據(jù)0、A及Asia I三種類(lèi)型FMDV的VPl免疫決定簇及VP4的T-細(xì)胞 helper的氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成DNA基因片段。1個(gè)基因工程菌是口蹄疫病毒毒株編碼VP4 的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的基因連接0型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，1個(gè)重復(fù)片段的核苷酸排列序列參見(jiàn)圖1。本發(fā)明的新型三價(jià)口蹄疫基因工程多肽疫苗，其含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的多肽，其中η為1-5的整數(shù)。SEQ ID含有口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接0型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，串聯(lián)4次，其表達(dá)產(chǎn)物可以刺激產(chǎn)生抗0型、Asia I 和A型口蹄疫病毒的抗體。優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗含有211—1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所編碼的多肽，其中，η為2_4的整數(shù)。最優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗含有211—1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所編碼的多肽，其中，η為3。為提高生物利用率并增強(qiáng)免疫效果，本發(fā)明的疫苗還可以含有藥學(xué)上可以接受的載體、輔料和或免疫佐劑等物質(zhì)。免疫佐劑是一種可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)的物質(zhì)，其能夠和抗原混合使用，有助于注射物質(zhì)的沉積或匯集，還能增強(qiáng)抗體反應(yīng)?？勺鳛槊庖咦魟┑奈镔|(zhì)有1)微生物及其產(chǎn)物，如分枝桿菌、短小棒狀桿菌、 百日咳桿菌以及處左蘭氏陰性桿菌的提取物脂多糖，自分枝桿菌的提取物胞壁酰二肽等。2)多聚核苷酸，如多聚肌苷酸、多聚腺苷酸、多聚左旋谷氨酸等。3)福氏佐劑 (Freund' sadjuvant)，包括不完全福氏佐劑(將抗原水溶液與油劑(石蠟油或植物油)等量混合，再加乳化劑(羊毛脂或吐溫80)制成的油包水抗原乳劑)和完全福氏佐劑(在不完全佐劑中加入分枝桿菌如卡介苗)。4)無(wú)機(jī)物，如明礬及氫氧化鋁等。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)以下物質(zhì)也可作為免疫佐劑，包括1)細(xì)菌毒素，如霍亂毒素(CT)和大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)?；肅T和LT的減毒衍生物或變異體?；萌藘?nèi)生性免疫調(diào)節(jié)因子，如IL-2、IL-12、GM-GSF。4)激素。5)脂肽。6)皂角苷，皂角苷衍生物QS-21。7)含有CpG motif的合成的寡核苷酸片段(CpG 0DN)。8)類(lèi)脂A的衍生物，如脂多糖衍生物單磷酰脂A (MPL)。9)胞壁酰二肽(MDP)的衍生物。此外，某些具有內(nèi)在的免疫刺激活性的遞送系統(tǒng)也可作為免疫佐劑用于疫苗構(gòu)建，這些遞送系統(tǒng)包括但不限于脂質(zhì)體、乳劑、螺狀體(cochleate)、病毒顆粒、微粒子和免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)。上述各種類(lèi)型的免疫佐劑均可用于本發(fā)明。佐劑可以以合適的劑量與本發(fā)明具有免疫原性的多肽配合使用，形成本發(fā)明的疫苗。優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗含有不完全福氏佐劑或氫氧化鋁，更優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗含有不完全福氏佐劑作為免疫增強(qiáng)劑。不完全福氏佐劑中羊毛脂和石蠟油的比率隨季節(jié)的變化略有不同，如，春、夏、秋季羊毛脂和石蠟油的比率約為3 7，冬季二者的比率約為 1. 5 8. 5。本發(fā)明的基因工程疫苗的制備方法，包括將2114個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核苷酸序列，可以直接合成，也可先合成若干個(gè)DNA片段，退火連接后產(chǎn)生如SEQ ID所示的DNA序列。 為了后續(xù)操作的方便，在設(shè)計(jì)DNA片段時(shí)，可以將合適的酶切位點(diǎn)引入序列兩端，以便將靶序列克隆入合適的載體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，為合成基因工程菌的載體，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接0型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，由4個(gè)DNA片段退火后連接產(chǎn)生，每個(gè)重復(fù)片段Fl含有SEQ ID所示的核酸序列和合適的限制性?xún)?nèi)切酶切點(diǎn)。利用基因工程的方法將Fl克隆到載體，然后，通過(guò)酶切后具有相互匹配的粘性末端的限制性?xún)?nèi)切酶，將F2 (含有2個(gè)串聯(lián)的Fl序列)克隆入載體，表達(dá)后的多肽含有2個(gè)重復(fù)片段(VP4+0型VPl+Asia I型VPl)。按照類(lèi)似的方法， 可以依次將F4、F8、F16克隆入載體，它們依次含有4個(gè)、8個(gè)、16個(gè)串聯(lián)的Fl序列，在合適的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)后，得到的多肽分別含有4個(gè)、8個(gè)、16個(gè)串聯(lián)的重復(fù)片段(VP4+0型 VPl+Asia I 型 VPl)。在本發(fā)明的制備方法中，用于多肽表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)可以是原核表達(dá)系統(tǒng)，還可以是真核表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)包括合適的宿主細(xì)胞，以及能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定存在的質(zhì)粒或載體。可以作為宿主細(xì)胞的例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌等；真核細(xì)胞，如酵母等?？梢允褂玫妮d體可以包括染色體來(lái)源的、非染色體來(lái)源的及合成的DNA序列。如 噬菌體DNA、桿狀病毒、細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒以及由質(zhì)粒、噬菌體和病毒DNA組合衍生的載體。優(yōu)選的，在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明的多肽。更優(yōu)選的，可以將本發(fā)明的多肽克隆入高效率的表達(dá)載體(如市售的表達(dá)載體)與載體蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。本發(fā)明還涉及一種基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒含有2114個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，其中η為1-5的整數(shù)。優(yōu)選的，所述工程菌攜帶的質(zhì)粒含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，，其中 η為2-4的整數(shù)。更優(yōu)選的，所述工程菌攜帶的質(zhì)粒含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，其中η為3。本發(fā)明還提供了所述三價(jià)基因工程多肽疫苗在預(yù)防和治療口蹄疫中的用途?？梢詫⒈景l(fā)明的疫苗注射給動(dòng)物，刺激動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗0型、抗A型、抗Asia I型三種口蹄疫的抗體，故本發(fā)明的疫苗可以用于區(qū)分免疫接種動(dòng)物和感染動(dòng)物。表1是抗原抗體反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果，抗體為0型及A型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)血清及0型口蹄疫治療后牛血清均由上海市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供，抗原為自行制備的三價(jià)基因工程多肽疫苗。表1 抗原抗體反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫病毒三價(jià)多肽類(lèi)疫苗，由1個(gè)基因工程菌制備，口蹄疫病毒外殼蛋白有四種即VP1、VP2、VP3、VP4，該基因工程菌是口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞helper的 15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接0型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，口蹄疫病毒三價(jià)多肽類(lèi)疫苗別含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其中η為1_5的整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，其中1個(gè)基因工程菌含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其中η為2-4的整數(shù)。
3.如權(quán)利要求2所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，其中1個(gè)基因工程菌含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其中η為3，其分子量是38928。
4.如權(quán)利要求3所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，基因工程菌含有4個(gè)串聯(lián)的SEQID 所示的核酸序列所編碼的蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，基因工程菌中含有串聯(lián)的基因以大腸桿菌中攜帶的Lac質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，其中所述的疫苗還包括藥學(xué)上可接受的載體、輔料和/或免疫佐劑。
7.如權(quán)利要求6所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，其中所述的免疫佐劑是福氏不完全佐劑。
8.如權(quán)利要求6所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，其中所述的免疫佐劑是Al(OH) 3。
9.如權(quán)利要求6所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，其中所述的免疫佐劑是Y-多聚谷氨酸 ploy-γ-glutamic acid。
10.一種權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗的制備方法，包括將基因工程菌的2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列克隆入載體并在表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)的步驟，其中 η為1-5的整數(shù)。
11.如權(quán)利要求10所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗的制備方法，包括將基因工程菌的 2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列克隆入載體并在表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)的步驟，其中η 為2-4的整數(shù)。
12.如權(quán)利要求11所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗的制備方法，包括將基因工程菌的 2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列克隆入載體并在表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)的步驟，其中η 為3。
13.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗的制備方法，其中所述核酸序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。
14.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗的制備方法，其中所述核酸序列在真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。
15.權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗的1個(gè)基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒含有211-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，其中η為1_5的整數(shù)。
16.如權(quán)利要求15所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗的兩種基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒分別含有21"1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核酸序列，其中η為2_4的整數(shù)。
17.如權(quán)利要求16所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗的基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒含有211-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，其中η為3。
18.權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，其用途為用于預(yù)防和治療0型、A型及Asia I 口蹄疫。
19.權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒三價(jià)多肽疫苗，其用途為用于區(qū)分感染動(dòng)物和被免疫動(dòng)物。
20.一種偶蹄類(lèi)家畜口蹄疫病毒多肽疫苗制備方法，包括基因重組、重組融合蛋白的制備，其特征在于(1)為合成基因工程菌，用化學(xué)合成的方法合成編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接0型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接 Asia I型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，串聯(lián)4次；(2)為合成基因工程菌，將4個(gè)重復(fù)片段插入Lac質(zhì)粒載體；(3)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，得到菌株；(4)將菌株置于營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時(shí)間為12-M小時(shí)， 發(fā)酵液中加入氨芐西林使其最后濃度為50μ g/ml，及IPTG，濃度為0. 5mM，發(fā)酵結(jié)束后離心獲得菌體，經(jīng)細(xì)胞粉碎，包涵體復(fù)性，融合蛋白的分離純化，凍干即可獲得產(chǎn)品，與佐劑勻漿形成三價(jià)多肽疫苗。
全文摘要
一種口蹄疫三價(jià)多肽疫苗及制備方法和用途，選擇O、Asia I、A型三種口蹄疫病毒，取VP1 B細(xì)胞決定簇，及VP4的T-細(xì)胞helper15個(gè)氨基酸的片段，串聯(lián)，克隆，不含有載體蛋白，構(gòu)建一個(gè)基因工程菌，經(jīng)過(guò)高密度發(fā)酵，細(xì)胞破碎、包涵體復(fù)性，融合蛋白的分離純化，凍干即可獲得抗原蛋白產(chǎn)品，與佐劑勻漿形成三價(jià)多肽疫苗。本發(fā)明的基因重組三價(jià)多肽疫苗所述疫苗含有2n-1個(gè)串連的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的多肽，其中，n為1-5的整數(shù)。本發(fā)明的疫苗安全性好，免疫效價(jià)高，半年內(nèi)一次免疫即可，適于大規(guī)模生產(chǎn)，保存運(yùn)輸便利，能夠有效地防治三種亞型口蹄疫，不產(chǎn)生口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3A.B.，易與感染動(dòng)物區(qū)分。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102380095SQ20101027245
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者吳曉琰, 孫玉琨, 趙泓 申請(qǐng)人:吳曉琰, 孫玉琨, 趙泓