專利名稱：口蹄疫復(fù)合多表位二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)感染引起的一種急性、高度接觸性人畜共患傳染病。本病傳播速度快、感染率高，是危害養(yǎng)殖業(yè)的烈性傳染病之一，世界各國都十分重視。雖然FMD在世界許多個(gè)國家已經(jīng)被消滅或很好地被控制了，然而在近幾年內(nèi)，F(xiàn)MD再度給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。FMD在臺(tái)灣消失了近二十年后又再度暴發(fā)流行，1997年，F(xiàn)MD疫情涉及澎湖以外的整個(gè)臺(tái)灣島，至6月，發(fā)病豬場(chǎng)達(dá)6134個(gè)，其中6050個(gè)全部銷毀，受害豬達(dá)465.7萬頭，捕殺銷毀384.8萬頭，經(jīng)濟(jì)損失巨大。1998年以來，我國周邊的國家包括緬甸、馬來西亞、蒙古、韓國、日本等均相繼暴發(fā)FMD。2001年英國暴發(fā)FMD，撲殺動(dòng)物超過400萬頭，疫情波及到歐洲大陸。我國也是一個(gè)FMD長(zhǎng)期流行的國家，自建國以來曾發(fā)生5次大流行，尤其是1999年發(fā)生的牛豬FMD是該病在國內(nèi)最嚴(yán)重的一次大流行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國撲殺患病動(dòng)物在60萬頭以上，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)15億元。鑒于FMD對(duì)養(yǎng)殖業(yè)乃至人類的嚴(yán)重威脅，本病一直被國際獸醫(yī)衛(wèi)生組織(OIE)和世界聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)列為A類烈性傳染病之首。
FMDV血清型共分7型，65個(gè)亞型，型與型之間及同型的亞型與亞型之間沒有或僅有部分交叉免疫力，因而使本病的防制變得十分困難。
FMDV的基因組為單股RNA，由大約8500個(gè)核苷酸(nt)組成，其分子量約為2.6×106，可分為5’端非編碼區(qū)、P1區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)以及3端非編碼區(qū)。其中P1區(qū)編碼主要的結(jié)構(gòu)蛋白，P2區(qū)和P3區(qū)編碼與病毒復(fù)制、翻譯，以及完整病毒粒子裝配有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白。
結(jié)構(gòu)蛋白P1區(qū)核苷酸序列全長(zhǎng)為2154nt，由1A、1B、1C和1D 4個(gè)基因編碼序列組成，長(zhǎng)度依次為167、648、660和639nt，分別編碼85、218、220和213個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)多肽。1B、1C和1D位于衣殼表面，為外衣殼蛋白。其中1D蛋白編碼多肽VP1，其大部分暴露在病毒表面，是決定病毒抗原性的主要成分。但其他三種結(jié)構(gòu)多肽也都參與免疫原性的構(gòu)成。不同血清型病毒的抗原位點(diǎn)有所不同，O型病毒有5個(gè)位點(diǎn)抗原位點(diǎn)1由1D GH環(huán)(1133-1157)和200-213個(gè)氨基酸的線性表位組成。此位點(diǎn)是FMDV最主要的抗原位點(diǎn)，也是FMDV抗原位點(diǎn)的關(guān)鍵所在；抗原位點(diǎn)2位于病毒表面的1B的βB-αβ上，由4個(gè)表位組成；抗原位點(diǎn)3位于病毒粒子表面五重軸周圍1D的βB-C環(huán)上；抗原位點(diǎn)4位于五重軸周圍1C的βB球節(jié)上；抗原位點(diǎn)5位于1D G-H環(huán)內(nèi)，此位點(diǎn)較為保守。此外，C型和A型FMDV均有4個(gè)抗原位點(diǎn)。FMDV主要抗原位點(diǎn)存在于衣殼蛋白VP1第134-158殘基中，能與高滴度中和抗體產(chǎn)生強(qiáng)陽性反應(yīng)的A型病毒多肽在第145-147殘基無RGD三聯(lián)體。O型高滴度抗血清在ELISA中能與第141-150多肽(含有RGD基序)和第135-144(位于RGD上游)反應(yīng)，表明RGD三聯(lián)體不是一刺激產(chǎn)生中和抗體的必須成分。FMDV VP1的G-H環(huán)具有識(shí)別和與中和抗體相互作用的雙重功能，某些氨基酸殘基在這兩個(gè)功能中發(fā)揮著重要作用。
P3區(qū)基因編碼序列的長(zhǎng)度為2721nt，由3A、3×3B、3C和3D組成，長(zhǎng)度依次為459、213、639和1410nt(OlK)。3A編碼序列中存在著GUAA保守基序，被認(rèn)為可能與病毒復(fù)制有關(guān)。3B又稱為VPg，可通過Tyr-OH以脂鍵共價(jià)連接到正負(fù)鏈RNA 5’端，可能作為包裝信號(hào)存在。3D是一種病毒RNA依賴性聚合酶，用以催化、合成FMDV的RNA。3C蛋白酶由213個(gè)氨基酸組成，是聚合蛋白成熟過程中最為重要的蛋白酶之一。FMDV的3C能在P1-P2和P2-P3連接處裂解聚合蛋白。在感染細(xì)胞提取物和體外富含F(xiàn)MDV翻譯的產(chǎn)物中幾乎都無法檢測(cè)到3C。它能催化裂解2C/3A位點(diǎn)和除1A/1B位點(diǎn)外的所有位點(diǎn)的二級(jí)裂解。在感染細(xì)胞中，P1被3C蛋白酶催化加工成VP0-VP1和VP3后，這三種蛋白互相作用，形成5S原體，成為病毒結(jié)構(gòu)的基本組件。
目前所設(shè)計(jì)的和正在研究的諸多基因工程疫苗仍存在許多問題和不足。在許多疫苗設(shè)計(jì)的抗原成分中仍含有大量與特異性免疫誘導(dǎo)無關(guān)的成分，如免疫抑制、增強(qiáng)抗體和自身免疫等免疫病理成分，而這些成分正是引起局部或全身不良反應(yīng)的重要因素；另外，有些疫苗在設(shè)計(jì)時(shí)為了達(dá)到純度和安全性高的目的(如寡肽疫苗)，往往采用少數(shù)幾個(gè)抗原決定簇，這樣又造成了抗原單一，免疫原性弱等缺陷。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，以O(shè)型流行株NYOO和A型FMDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因?yàn)榛A(chǔ)，以非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC及結(jié)構(gòu)蛋白VP4上的Th2細(xì)胞表位為輔助基因，以真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1為載體分子，構(gòu)建針對(duì)FMDV O、A兩血清型的二價(jià)復(fù)合多表位核酸疫苗，通過HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及BALB/c小鼠免疫實(shí)驗(yàn)，表達(dá)所需的目的蛋白并進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，以期獲得針對(duì)不同血清型和不同流行株的安全高效復(fù)合多表位DNA疫苗，從而為有效預(yù)防FMD提供理論基礎(chǔ)和疫苗儲(chǔ)備。
本發(fā)明的構(gòu)建過程是a、根據(jù)口蹄疫基因進(jìn)化樹分析，選擇ME-EA型毒株作為基因來源，根據(jù)基因序列用DNAstar軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以質(zhì)粒pMD18-T-VP1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得O型FMDV免疫原基因VP1基因；b、通過GeneBank獲得多個(gè)A型FMDV毒株VP1序列，經(jīng)BLAST比較，選取A22毒株VP1全序列，在序列5’端添加柔性肽序列及酶切位點(diǎn)，在3’端添加終止密碼子TAA，設(shè)計(jì)并合成了A型FMDV VP1序列；c、選擇FMDV的3個(gè)Th表位基因，其中2個(gè)來自非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC，每個(gè)表位肽由15個(gè)氨基酸殘基組成；1個(gè)來自高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白VP4，其長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸殘基，三個(gè)表位拼接后合成150個(gè)堿基的多表位基因；
d、將以上三個(gè)基因進(jìn)行組合及串聯(lián)，插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1載體啟動(dòng)子下游，分別構(gòu)建了含O型和A型FMDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因、非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC及結(jié)構(gòu)蛋白VP4上的Th2細(xì)胞表位基因的核酸疫苗的pVAX1-OA、pVAX1-OAT。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物是上游引物Y3(Forward primer)5′-ATGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCT-3′下游引物Y4(Reverse primer)5′-GCGGCCGCCCAAAAGCTGTTTCACAGG-3′本發(fā)明pVAX1-OA的基因序列是atg acc acc tcc aca ggt gag tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt48Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val1 5 10 15gag aac tac ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat96Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp20 25 30gtc tcg ttc ata tta gac aga ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa144Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln35 40 45att aat gcg ttg gac ctg atg caa acc cct gca cac act ttg gta ggc192Ile Asn Ala Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly50 55 60gcg ctc ctc cgt act gcc acc tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca240Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala65 70 75 80gtg aaa cac gag ggg aac ctt acc tgg gtc ccg aat ggg gcg ccc gag288Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu85 90 95gca gcg ttg gac aac acc acc aat cca acg gct tac cac aag gca ccg336Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro100 105 110ctc acc cgg ctt gca ctg cct tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct384Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala
115 120 125act gtt tac aac ggg aac tgc aag tat ggc gag agc ccc gtg acc aat432Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn130 135 140gtg aga ggt gac ctg caa gta ttg gcc cag aag gcg gca aga acg ctg480Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu145 150 155 160cct acc tcc ttc aat tac ggt gcc atc aaa gcc act cgg gtg act gaa528Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu165 170 175ctg ctt tac cgc atg aag agg gcc gaa aca tac tgc ccc tgg cct ctt576Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Trp Pro Leu180 185 190ttg gct att cac ccg agc gaa gct aga cac aaa caa aag att gtg gcg624Leu Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala195 200 205cct gtg aaa cag ctt ttg ggg acc tgg tct gca ggc ggc cgc acc acc672Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Thr Trp Ser Ala Gly Gly Arg Thr Thr210 215 220tcc aca ggt gag tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt gag aac tac720Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr225 230 235 240ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat gtc tcg ttc768Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe245 250 255ata tta gac aga ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa att aat gcg816Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Ala260 265 270ttg gac ctg atg caa acc cct gca cac act ttg gta ggc gcg ctc ctc864Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu275 280 285cgt act gcc acc tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca gtg aaa cac912Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His
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Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr370 375 380gct tac cac aag gca ccg ctc acc cgg ctt gca ctg cct tac acg gca1200Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala385 390 395 400cca cac cgt gtc ttg gct act gtt tac aac ggg aac tgc aag tat tcc1248Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser405 410 415gca ggt ggt atg ggc aga cgg ggc gac cta gag cct ctc gcg gcg agg1296Ala Gly Gly Met Gly Arg Arg Gly Asp Leu Glu Pro Leu Ala Ala Arg420 425 430gtc gcc gct cag ctt cct act tct ttc aac ttt ggt gca att caa gcc1344Val Ala Ala Gln Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Gln Ala435 440 445acg acc atc cac gag ctc ctc gtg cgc atg aag cgt gcc gaa ctc tac1392Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr450 455 460tgc ccc aga cca ctg ttg gca gtg gtg gtg tcg tct caa gac aga cac1440Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Val Val Ser Ser Gln Asp Arg His465 470 475 480aaa cag aag atc att gca cct gca aaa caa ctt ttg taa ctc gag1485Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu LeuLeu Glu485 490所構(gòu)建的兩個(gè)核酸疫苗pVAX1-OA和pVAX1-OAT可作為預(yù)防口蹄疫的新型多價(jià)基因工程疫苗。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果1、本發(fā)明獲得的重組核酸疫苗pVAX1-OA可表達(dá)完整的O、A型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因；重組核酸疫苗pVAX1-OAT可同時(shí)表達(dá)完整的O、A型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因及非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC、結(jié)構(gòu)蛋白VP4上的Th2細(xì)胞表位基因。兩種核酸疫苗表達(dá)的蛋白均可與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。
2、本發(fā)明獲得的兩種重組核酸疫苗均可刺激小鼠產(chǎn)生特異的體液免疫和細(xì)胞免疫。
3、本發(fā)明獲得的重組核酸疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
4、本發(fā)明所使用的目的基因?yàn)镺型和A型FMDV基因，從而構(gòu)建的重組核酸疫苗可作為我國預(yù)防O型和A型FMD的DNA疫苗。
5、本發(fā)明中核酸疫苗表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC輔助性Th2表位發(fā)揮了類似免疫佐劑的作用。


圖1是本發(fā)明重組核酸疫苗質(zhì)粒pVAX1-OA構(gòu)建流程圖；圖2是本發(fā)明重組核酸疫苗質(zhì)粒pVAX1-OAT構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式1.分子生物學(xué)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取及限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、重組質(zhì)粒的篩選與鑒定、PCR擴(kuò)增反應(yīng)等均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(金冬雁、黎孟楓等譯，第二版，科學(xué)出版社，1992)相關(guān)章節(jié)進(jìn)行。
2.目的基因的獲得2.1 O型FMDV主要免疫原基因VP1的克隆選擇近年來在國內(nèi)外呈主要流行趨勢(shì)的ME-EA型毒株JL-3-1999作為基因來源。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物Y3/Y4，以質(zhì)粒pMD18-T-VP1(O)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)在上游引物Y3的5′端加了起始密碼子ATG，在下游引物的5′端添加了核酸內(nèi)切酶NotI的序列。
上游引物Y3(Forward primer)5′-ATGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCT-3′下游引物Y4(Reverse primer)5′-GCGGCCGCCCAAAAGCTGTTTCACAGG-3′
PCR反應(yīng)條件如下pMD18-T-VP1(O)質(zhì)粒2u1(約100ng)F-引物(10pmol/ul) 2ulR-引物(10pmol/ul) 2ulPCR buffer5uldNTPs(2.5mM each) 5ulddH2O34ul50ul95℃預(yù)變性5min，95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，共30循環(huán)，72℃延伸5min。
2.2 A型FMDV主要免疫原VP1基因的獲得通過GeneBank獲得多個(gè)在東南亞國家流行的A型FMDV毒株VP1序列，經(jīng)BLAST比較，選取了與其它毒株同源性較高且流行較為廣泛的A22毒株，從GeneBank取得它的VP1全序列共639bp。考慮到與其它基因連接后表位間的相互干擾，在序列的5′端添加了柔性肽序列，同時(shí)為了便于基因的拼接，在5′端還插入了NotI酶切位點(diǎn)序列，在3′添加了終止密碼子TAA。設(shè)計(jì)完成后送TaKaRa公司進(jìn)行基因合成。
2.3 輔助性Th2表位基因的設(shè)計(jì)及合成在FMDV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中存在多個(gè)受MHC限制的Th2細(xì)胞表位，但不同Th2表位輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力不一，為提高二價(jià)苗的免疫效果，我們選擇了其中效果最佳的三個(gè)Th表位基因，其中兩個(gè)來自非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC，每個(gè)表位肽由15個(gè)氨基酸殘基組成；另一個(gè)來自高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白VP4，其長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸殘基。三個(gè)表位拼接后所組成的基因全長(zhǎng)150個(gè)堿基，在基因序列的5′端添加了起始密碼子ATG。通過基因合成方式獲得基因。
3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建3.1含F(xiàn)MDV O、A型VP1基因和Th2細(xì)胞表位中間載體的構(gòu)建將O型VP1基因用BamHI/EcoRI從pUCM-T-VP1(O)載體切下，定向連入質(zhì)粒pMD18-T-3ABC的3ABC基因下游，構(gòu)建成pMD18-T-3ABC-VP1(O)質(zhì)粒；再用Not I/SalI從pMD18-T-VP1(A)載體上將A型VP1基因切下后，定向插入到pMD18-T-3ABC-VP1(O)質(zhì)粒的O型VP1基因下游，從而完成基因的拼接和中間載體pMD18-T-OAT的構(gòu)建，三個(gè)片段拼接后即為預(yù)期的FMDV復(fù)合多表位基因，基因全長(zhǎng)為1494bp。取適量純化的pMD18-T-OAT質(zhì)粒，送TaKaRa公司作測(cè)序鑒定，其余部分于20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.2 含F(xiàn)MDV O、A型結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶HindIII和NotI消化質(zhì)粒pUCm-T-VP1(O)獲得O型VP1基因片段，定向插入到pMD18-T-VP1(A)載體，并使其處于VP1(A)基因的上游，獲得pMD18-T-OA質(zhì)粒；再用HincII和XbaI雙酶切后獲得OA基因片段，插入到經(jīng)EcoRV和XbaI消化的線性載體pVAX1中，構(gòu)建二價(jià)表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-OA。
3.3 含復(fù)合多表位基因OAT的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將3.1構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pMD18-T-OAT用HindIII和EcoRI雙酶切后回收OAT基因，定向插入到核酸疫苗質(zhì)粒pVAX1相同酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建含OAT基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-OAT。
4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用脂質(zhì)體法在6×30mm細(xì)胞培養(yǎng)板中接種傳代HeLa細(xì)胞1×105～3×105個(gè)/ml，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至60～80％單層，將培養(yǎng)液棄掉，用無Ca2+、Mg2+PBS洗滌細(xì)胞兩遍，備用。接種轉(zhuǎn)染試劑，即在100l 1640培養(yǎng)液中加入適量脂質(zhì)體，輕輕混勻，另用5個(gè)Eppendorf管，先在每個(gè)管中分別加入100l 1640培養(yǎng)液，然后取純化的重組質(zhì)粒DNA pVAX1-OA、pVAX1-OAT和對(duì)照質(zhì)粒pVAX1各10g滴加于前者液體中并輕輕混勻，室溫下作用15～30min，加入細(xì)胞板內(nèi)，補(bǔ)加液體至700l。置于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用8～10h，補(bǔ)加新鮮配制的含10％FCS的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48～72h，收取細(xì)胞。
5. 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)5.1 SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)染后72h，棄培養(yǎng)液，用1ml 37℃預(yù)熱的TEN(40mmol/LTris·Cl pH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脫細(xì)胞，收集于Eppendorf管中，3000rpm離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗一次，加60l細(xì)胞裂解液(10mmol/L Tris·Cl pH7.4，1mmol/LMgCl2，0.5％NP40，20g/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000rpm離心5min，取上清液，加入等量2倍上樣緩沖液混勻，于12％SDS-PAGE進(jìn)行電泳。
以轉(zhuǎn)染空白真核表達(dá)載體質(zhì)粒的細(xì)胞、空白細(xì)胞和低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(97kDa、66kDa、43kDa、31kDa、20kDa、14kDa)作對(duì)照，分別取適量樣品加等量2倍上樣緩沖液，用微量移液器加入加樣槽，以8V/cm電壓電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，換以12v/cm電壓電泳，溴酚藍(lán)至分離膠底部后，取出凝膠，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色或蛋白印跡。
5.2 Western blot檢測(cè)SDS-PAGE電泳結(jié)束后，切出含待轉(zhuǎn)移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的Whatman 3mm濾紙和1張硝酸纖維素膜(Millipore HAWP)，用軟鉛筆在纖維膜一角做好標(biāo)記。將它們漂浮于ddH2O水平面上，潤(rùn)濕后浸于水中5min，驅(qū)除膜上的氣泡，再浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.037％SDS，20％甲醇)中。在塑料支架上依次疊放浸濕的海綿、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3層濾紙和海綿，使濾紙、凝膠和硝酸纖維素膜對(duì)齊，且各層之間無氣泡存在；將塑料支架夾緊插入電轉(zhuǎn)移槽中；硝酸纖維素膜一側(cè)接陽極，凝膠一側(cè)接陰極，加轉(zhuǎn)移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·C1，0.037％SDS，20％甲醇)稍超過凝膠，以30V～35V電壓，4℃轉(zhuǎn)移14～16h。轉(zhuǎn)移完畢，將硝酸纖維素膜浸于封閉液(5％脫脂奶粉或3％BSA，150mmol/L NaCl，0.02％Tween-20)中約室溫2h，以封閉無關(guān)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)凝膠進(jìn)行染色，檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全。封閉后，用洗滌液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min；將一抗(豚鼠抗FMDV多克隆血清)用抗體稀釋液(0.01mol/L TBS，1％BSA，0.05％Tween-20)適當(dāng)稀釋，滴在保鮮膜上，然后將硝酸纖維素膜正面(吸附抗原面)向下覆蓋在加抗體的保鮮膜上，室溫反應(yīng)2h；用洗滌液洗膜3次，每次5min；同樣方法加酶標(biāo)二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗豚鼠IgG)，室溫反應(yīng)2h；用洗滌液洗膜3次，每次5min；膜稍干，加酶底物反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)。
酶底物反應(yīng)液配制(1)NBT(氮蘭四唑)在10ml 70％的二甲基酰胺中溶解0.5g NBT；(2)BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)在10ml 100％二甲基酰胺中溶解0.5g BCIP；(3)堿性磷酸酶緩沖液100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·Cl pH9.5。取66 l NBT與10ml堿性磷酸酶緩沖液混勻，加入33l BCIP，該溶液在30min內(nèi)使用；將洗滌過的膜移入淺托盤中，按0.1ml/cm2加入底物反應(yīng)液，于室溫平緩搖動(dòng)進(jìn)行溫育顯色。顯色5～20min后將硝酸纖維素膜移至蒸餾水中，終止顯色，觀察結(jié)果。
5.3 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)按步驟4的方法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到長(zhǎng)有70％HeLa細(xì)胞單層的玻片上，5％CO2、37℃培養(yǎng)三d后，取出玻片，用PBS液沖洗三次，100％冷丙酮固定10～30min，再用PBS液洗滌三次；用含有3％BSA的PBS封閉2h，沖洗三次，每次5min；加入一抗(兔抗FMDV血清)，37℃作用2h后，沖洗3次；加入二抗(異硫氰熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG)，室溫避光作用1h，沖洗3次；吸干，滴加50％甘油水溶液，倒置于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察(加入二抗后操作步驟均應(yīng)避光進(jìn)行；一般情況下，盡量在較短時(shí)間內(nèi)完成拍照，以免熒光淬滅)。
6 核酸疫苗質(zhì)粒免疫小鼠用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA，PEG純化后溶于無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用紫外分光光度法進(jìn)行DNA定量，終濃度調(diào)至1μg/μl 。
6.1 實(shí)驗(yàn)分組6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分成9組，每組12只，分別按100ug/只腿部肌肉注射重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒pVAX1和PBS溶液。每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，第三次免疫后10d殺鼠取血清和脾淋巴細(xì)胞檢測(cè)抗體、T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量及CTL活性。分組情況見表1。
6.2 脾T淋巴細(xì)胞的制備小鼠免疫后斷頸處死取脾，用載玻片毛面相對(duì)研磨脾臟，加入4mlPBS，通過濾膜過濾去除組織碎片；將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管，2000rpm離心10min，棄上清；加入3ml紅細(xì)胞裂解液懸浮細(xì)胞(Tris-NH4Cl緩沖液，取Tris 1.03g及NH4Cl 3.735g，加雙餾水至500ml，過G-5漏斗，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?室溫放置10min，2000rpm離心10min，棄上清；加入4ml Hank’s液洗滌并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，離心(同上)后加入適量10％1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)1×107個(gè)/ml。


6.3 脾T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的檢測(cè)制備小鼠脾單細(xì)胞懸液1-2×106/ml，用熒光洗液洗兩遍(熒光洗液100ml 0.15M PBS(pH7.4)，2％NBS)。加入PE標(biāo)記的抗CD4+抗體和FITC標(biāo)記的抗CD8+抗體各20μl，總體積為40ul混勻，或加入FITC標(biāo)記的CD3抗體45μl，置4℃避光30min，取出后用熒光洗液洗兩遍。加入0.5ml熒光保存液(熒光保存液100ml 0.15M PBS(pH7.4)，2％葡萄糖，1％甲醛，0.1％NaN3)，4℃保存(一周以內(nèi))，用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞亞群。FACS共檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，分別得到脾細(xì)胞中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
6.4脾特異性CTL殺傷活性檢測(cè)6.4.1靶細(xì)胞將FMDV O型VP1基因定向插入真核表達(dá)載體質(zhì)粒pDisplay中，構(gòu)建含F(xiàn)MDV嵌合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pDisplay-VP1。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒大量制備并純化后轉(zhuǎn)染BALB/c小鼠P815細(xì)胞(小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞)，用G418(350μg/ml)進(jìn)行加壓篩選，當(dāng)對(duì)照細(xì)胞大部分死亡后，換含G418(150μg/ml)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)約2周，用間接免疫熒光進(jìn)行鑒定。該靶細(xì)胞可用于CTL檢測(cè)。靶細(xì)胞的具體制備參見相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。
取培養(yǎng)24-48h的靶細(xì)胞，洗滌3次，用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/ml。
6.4.2刺激細(xì)胞應(yīng)用絲裂霉素(80g/ml)對(duì)上述制備的靶細(xì)胞作用4h后，調(diào)整到1×106個(gè)/ml，備用。
6.4.3淋巴細(xì)胞的制備無菌條件下解剖小鼠，加少量Hank’s液，于200目銅網(wǎng)上碾磨分散脾細(xì)胞，制備淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液。用含2μg/ml的ConA、20ng/ml IL-2的1640培養(yǎng)液，于37℃5％CO2培養(yǎng)1-2d。按10∶1加入刺激細(xì)胞作用24～48h，在調(diào)整脾細(xì)胞數(shù)到1×107個(gè)/ml。(注意將刺激細(xì)胞和脾細(xì)胞充分混勻)，繼續(xù)培養(yǎng)4-5d。
6.4.4特異性CTL活性檢測(cè)1)效應(yīng)細(xì)胞的記數(shù)將每個(gè)樣品板中的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)，最后調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×106個(gè)/ml。
2)靶細(xì)胞的記數(shù)將經(jīng)G418加壓篩選的靶細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)，計(jì)算所需靶細(xì)胞數(shù)量。
3)脾細(xì)胞與靶細(xì)胞的處理將兩種細(xì)胞均用Hank s液洗滌一次后，最后一次用5％胎牛血清的1640培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。
4)上板將經(jīng)過上述處理的效應(yīng)細(xì)胞(1×106個(gè)/ml)和靶細(xì)胞分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)樣品設(shè)8個(gè)孔，其中4個(gè)孔加靶細(xì)胞，按效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞分別為50∶1和25∶1。另設(shè)實(shí)驗(yàn)測(cè)試孔及對(duì)照孔。
5)將上述37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中至少培養(yǎng)4h后，盡量使脾細(xì)胞和靶細(xì)胞充分接觸。
6)待作用完全后(即4h后)，250g離心4min。
7)用移液器小心從96孔板每一孔中移出50l液體，分別加入另外一塊ELISA板的相應(yīng)孔內(nèi)(注意樣品順序)，再加入預(yù)先用底物緩沖液配置的底物混合物50l作用30min(注意底物及底物混合物用完后迅速置于-20℃冰箱內(nèi)，不得長(zhǎng)時(shí)間放置于37℃條件下；二者作用過程中，須用鉑紙等遮光)。
8)作用30min后，加入硫酸終止液50l，充分混合后在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)。
9)根據(jù)測(cè)得數(shù)據(jù)計(jì)算每組脾細(xì)胞的殺傷活性 6.5免疫小鼠血清抗體效價(jià)檢測(cè)眼眶采血后分離血清，離心收集上清備用。用間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，同時(shí)用非免疫鼠血清做陰性對(duì)照，主要參照《動(dòng)物病毒學(xué)》第二版進(jìn)行。具體操作如下ELISA試劑PBS(pH7.4)NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，溶于1000ml蒸餾水；包被液(pH7.6)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，溶于1000ml水中；或用pH9.6的PBS包被；封閉液用PBS緩沖液配3％BSA；洗滌液PBS緩沖液中加0.05％Tween-20；底物溶液pH5.0磷酸檸檬酸緩沖液0.2M Na2HPO4(28.4g/L)25.7ml與0.1M檸檬酸24.3ml混合后，取出10ml，加入以下成分鄰苯二胺(OPD)4mg，30％H2O210ul。混勻后立即使用。
步驟1)包被用包被液等體積稀釋抗原，在96孔酶標(biāo)板每孔加入，100ul 37℃包被1.5h(也可4℃包被過夜)；2)封閉加入100ul/孔的封閉液，37℃封閉1.5h；3)洗滌用洗滌液洗板三次，每次3min；4)結(jié)合一抗用含0.3％BSA的PBS緩沖液倍比稀釋抗血清，每孔加100ul，其中一列加倍比稀釋的對(duì)照陽性血清，每孔100ul。37℃孵育1.5h；5)洗滌用洗滌液洗板3次，每次3min；6)結(jié)合二抗用含0.3％BSA的PBS緩沖液按適當(dāng)比例(參照說明書)稀釋，37℃孵育1.5h；7)洗滌用洗滌液洗板5次，每次3min；8)顯色每孔加100ul底物溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，暗處放置1～3min，待顯色后每孔加入50ul 30％濃硫酸終止顯色；9)讀板使用酶標(biāo)儀讀490nm的OD值。
檢測(cè)結(jié)果將獲得的兩種核酸疫苗pVAX1-OA和pVAX1-OAT轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Western-blot檢測(cè)，結(jié)果均為陽性。說明構(gòu)建的核酸疫苗在體外可分別表達(dá)O、A型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因及Th2細(xì)胞表位基因。將此核酸疫苗免疫小鼠后，能刺激脾T淋巴細(xì)胞增殖，激發(fā)產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)和抗O、A型FMDV抗體；含非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC輔助性Th2表位的重組質(zhì)粒pVAX1-OAT誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平明顯高于不含該T表位的pVAX1-OA和pVRI-OA重組質(zhì)粒。
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫復(fù)合多表位二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建，其構(gòu)建過程是a、根據(jù)口蹄疫基因進(jìn)化樹分析，選擇ME-EA型毒株作為基因來源，根據(jù)基因序列用DNAstar軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以質(zhì)粒pMD18-T-VP1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得O型FMDV免疫原基因VP1基因；b、通過GeneBank獲得多個(gè)A型FMDV毒株VP1序列，經(jīng)BLAST比較，選取A22毒株VP1全序列，在序列5’端添加柔性肽序列及酶切位點(diǎn)，在3’端添加終止密碼子TAA，設(shè)計(jì)并合成了A型FMDV VP1序列；c、選擇FMDV的3個(gè)Th表位基因，其中2個(gè)來自非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC，每個(gè)表位肽由15個(gè)氨基酸殘基組成；1個(gè)來自高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白VP4，其長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸殘基，三個(gè)表位拼接后合成150個(gè)堿基的多表位基因；d、將以上三個(gè)基因進(jìn)行組合及串聯(lián)，插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1載體啟動(dòng)子下游，分別構(gòu)建了含O型和A型FMDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因、非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC及結(jié)構(gòu)蛋白VP4上的Th2細(xì)胞表位基因的核酸疫苗的pVAX1-OA、pVAX1-OAT。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的口蹄疫復(fù)合多表位二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建，其特征在于所設(shè)計(jì)的引物是上游引物Y3(Forward primer)5′-ATGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCT-3′下游引物Y4(Reverse primer)5′-GCGGCCGCCCAAAAGCTGTTTCACAGG-3′
3.根據(jù)權(quán)利1所述的口蹄疫復(fù)合多表位二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建，其pVAX1-OA的基因序列是atg acc acc tcc aca ggt gag tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt48Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val1 5 10 15gag aac tac ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat96Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp20 25 30gtc tcg ttc ata tta gac aga ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa144Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln35 40 45att aat gcg ttg gac ctg atg caa acc cct gca cac act ttg gta ggc192Ile Asn Ala Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly50 55 60gcg ctc ctc cgt act gcc acc tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca240Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala65 70 75 80gtg aaa cac gag ggg aac ctt acc tgg gtc ccg aat ggg gcg ccc gag288Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu85 90 95gca gcg ttg gac aac acc acc aat cca acg gct tac cac aag gca ccg336Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro100 105 110ctc acc cgg ctt gca ctg cct tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct384Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala115 120 125act gtt tac aac ggg aac tgc aag tat ggc gag agc ccc gtg acc aat432Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn130 135 140gtg aga ggt gac ctg caa gta ttg gcc cag aag gcg gca aga acg ctg480Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu145 150 155 160cct acc tcc ttc aat tac ggt gcc atc aaa gcc act cgg gtg act gaa528Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu165 170 175ctg ctt tac cgc atg aag agg gcc gaa aca tac tgc ccc tgg cct ctt576Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Trp Pro Leu180 185 190ttg gct att cac ccg agc gaa gct aga cac aaa caa aag att gtg gcg624Leu Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala195 200 205cct gtg aaa cag ctt ttg ggg acc tgg tct gca ggc ggc cgc acc acc672Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Thr Trp Ser Ala Gly Gly Arg Thr Thr210 215 220tcc aca ggt gag tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt gag aac tac720Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr225 230 235 240ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat gtc tcg ttc768Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe245 250 255ata tta gac aga ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa att aat gcg816Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Ala260 265 270ttg gac ctg atg caa acc cct gca cac act ttg gta ggc gcg ctc ctc864Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu275 280 285cgt act gcc acc tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca gtg aaa cac912Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His290 295 300gag ggg aac ctt acc tgg gtc ccg aat ggg gcg ccc gag gca gcg ttg960Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu305 310 315 320gac aac acc acc aat cca acg gct tac cac aag gca ccg ctc acc cgg1008Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg325 330 335ctt gca ctg cct tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct act gtt tac1056Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr340 345 350aac ggg aac tgc aag tat tcc gca ggt ggt atg ggc aga cgg ggc gac1104Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser Ala Gly Gly Met Gly Arg Arg Gly Asp355 360 365cta gag cct ctc gcg gcg agg gtc gcc gct cag ctt cct act tct ttc1152Leu Glu Pro Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Thr Ser Phe370 375 380aac ttt ggt gca att caa gcc acg acc atc cac gag ctc ctc gtg cgc1200Asn Phe Gly Ala Ile Gln Ala Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg385 390 395 400atg aag cgt gcc gaa ctc tac tgc ccc aga cca ctg ttg gca gtg gtg1248Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Val405 410 415gtg tcg tct caa gac aga cac aaa cag aag atc att gca cct gca aaa1296Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys420 425 430caa ctt ttg taa ctc gag1314Gln Leu Leu Leu Glu435
4.根據(jù)權(quán)利1所述的口蹄疫復(fù)合多表位二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建，其pVAX1-OAT的基因序列是atg gca gca att gag ttc ttt gag ggc atg gtc cac gac tcc atc aaa48Met Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys1 5 10 15gcc gtt ctt gcc aaa gac gga gct gac act ttc atc gtc ggc act ggc96Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr Gly20 25 30aat act ggc agc ata ata aac aac tac tac atg cag cag tat caa aac144Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn35 40 45tct atg gac ggg atc cag atc tcc agt ctt acc acc tcc aca ggt gag192Ser Met Asp Gly Ile Gln Ile Ser Ser Leu Thr Thr Ser Thr Gly Glu50 55 60tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt gag aac tac ggt ggt gag aca240Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr65 70 75 80cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat gtc tcg ttc ata tta gac aga288Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg85 90 95ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa att aat gcg ttg gac ctg atg336Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Ala Leu Asp Leu Met100 105 110caa acc cct gca cac act ttg gta ggc gcg ctc ctc cgt act gcc acc384Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr115 120 125tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca gtg aaa cac gag ggg aac ctt432Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu130 135 140acc tgg gtc ccg aat ggg gcg ccc gag gca gcg ttg gac aac acc acc480Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr145 150 155 160aat cca acg gct tac cac aag gca ccg ctc acc cgg ctt gca ctg cct528Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro165 170 175tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct act gtt tac aac ggg aac tgc576Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys180 185 190aag tat ggc gag agc ccc gtg acc aat gtg aga ggt gac ctg caa gta624Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val195 200 205ttg gcc cag aag gcg gca aga acg ctg cct acc tcc ttc aat tac ggt672Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly210 215 220gcc atc aaa gcc act cgg gtg act gaa ctg ctt tac cgc atg aag agg720Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg225 230 235 240gcc gaa aca tac tgc ccc tgg cct ctt ttg gct att cac ccg agc gaa768Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Trp Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Ser Glu245 250 255gct aga cac aaa caa aag att gtg gcg cct gtg aaa cag ctt ttg ggg816Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly260 265 270acc tgg tct gca ggc ggc cgc acc acc tcc aca ggt gag tcg gct gac864Thr Trp Ser Ala Gly Gly Arg Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp275 280 285ccc gtg act gcc act gtt gag aac tac ggt ggt gag aca cag gtc cag912Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln290 295 300aga cgc caa cac acg gat gtc tcg ttc ata tta gac aga ttt gtg aaa960Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys305 310 315 320gta aca cca aaa gac caa att aat gcg ttg gac ctg atg caa acc cct1008Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Ala Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro325 330 335gca cac act ttg gta ggc gcg ctc ctc cgt act gcc acc tac tac ttc1056Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe340 345 350gca gat cta gaa gtg gca gtg aaa cac gag ggg aac ctt acc tgg gtc1104Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val355 360 365ccg aat ggg gcg ccc gag gca gcg ttg gac aac acc acc aat cca acg1152Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr370 375 380gct tac cac aag gca ccg ctc acc cgg ctt gca ctg cct tac acg gca1200Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala385 390 395 400cca cac cgt gtc ttg gct act gtt tac aac ggg aac tgc aag tat tcc1248Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser405 410 415gca ggt ggt atg ggc aga cgg ggc gac cta gag cct ctc gcg gcg agg1296Ala Gly Gly Met Gly Arg Arg Gly Asp Leu Glu Pro Leu Ala Ala Arg420 425 430gtc gcc gct cag ctt cct act tct ttc aac ttt ggt gca att caa gcc1344Val Ala Ala Gln Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Gln Ala435 440 445acg acc atc cac gag ctc ctc gtg cgc atg aag cgt gcc gaa ctc tac1392Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr450 455 460tgc ccc aga cca ctg ttg gca gtg gtg gtg tcg tct caa gac aga cac1440Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Val Val Ser Ser Gln Asp Arg His465 470 475 480aaa cag aag atc att gca cct gca aaa caa ctt ttg taa ctc gag1485Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Leu Glu485 490
5.所構(gòu)建的兩個(gè)核酸疫苗pVAX1-OA和pVAX1-OAT可作為預(yù)防口蹄疫的新型多價(jià)基因工程疫苗。
全文摘要
一種口蹄疫復(fù)合多表位二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的在于，以O(shè)型流行株NYOO和A型FMDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因?yàn)榛A(chǔ)，以非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC及結(jié)構(gòu)蛋白VP4上的Th2細(xì)胞表位為輔助基因，以真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1為載體分子，構(gòu)建針對(duì)FMDV O、A兩血清型的二價(jià)復(fù)合多表位核酸疫苗，通過HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及BALB/c小鼠免疫實(shí)驗(yàn)，表達(dá)所需的目的蛋白并進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，以期獲得針對(duì)不同血清型和不同流行株的安全高效復(fù)合多表位DNA疫苗，從而為有效預(yù)防FMD提供理論基礎(chǔ)和疫苗儲(chǔ)備。
文檔編號(hào)A61K39/125GK1737144SQ20041001104
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月18日
發(fā)明者金寧一, 尹革芬, 鄭敏, 秦曉冰, 葛淑敏, 李昌, 金擴(kuò)世, 夏志平, 金洪濤 申請(qǐng)人:金寧一