專利名稱：產(chǎn)生生淀粉酶的青霉菌及其制備的生淀粉酶制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生生淀粉酶的青霉菌及其制備的生淀粉酶制劑，具體涉及一株 產(chǎn)生生淀粉酶的青霉菌、用該菌株制備的液態(tài)生淀粉酶制劑以及該制劑在生木薯淀粉同步 糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精中的應用。
背景技術(shù)：
淀粉是地球上植物存儲最豐富的多糖物質(zhì)。在食品工業(yè)中，它是一種經(jīng)濟的原 料，可用來生產(chǎn)葡萄糖、麥芽糖、果葡糖漿等甜味劑，也用來生產(chǎn)抗生素、氨基酸、酒精和有 機食用酸等。酒精脫水后變成無水酒精，無水酒精經(jīng)變性處理變成燃料酒精，燃料酒精已 在世界多個國家使用，對緩減世界能源危機、改善環(huán)境、促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等具有重要意 SL (Sanchez 0J,Cardona CA. Trends in biotechnologicalproduction of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology2008，99 :5270_5295)。以淀粉為原料的傳統(tǒng)酒精生產(chǎn)工藝中，原料必須先經(jīng)過約90-110°C的高溫蒸煮， 加入耐高溫α -淀粉酶將糊化原料中的長鏈淀粉切斷成短鏈糊精，使得醪液粘度降低，這 是淀粉的糊化和液化過程；短鏈糊精還不能為酵母菌所利用，需要將液化后的原料降溫至 60°C左右，加入糖化酶將短鏈糊精降解成葡萄糖，這是糖化過程；最后葡萄糖經(jīng)酵母發(fā)酵 產(chǎn)生酒精?；蛘呤菍⒃线M行糊化和液化后，降至30°C左右，同時加入糖化酶和酵母菌， 同步糖化發(fā)酵產(chǎn)生酒精(梁于朝，李開綿，木薯酒精發(fā)酵研究進展，廣西輕工業(yè)，2007,98 16-18)。目前以木薯淀粉和玉米淀粉為原料生產(chǎn)燃料酒精時是用上述酒精生產(chǎn)工藝。由于 原材料價格高和傳統(tǒng)酒精生產(chǎn)工藝中的高溫蒸煮(糊化和液化)是一個十分耗能的過程， 大概需要消耗整個酒精生產(chǎn)過程所需能源的35% (王晨霞，杜風光，里根德，淀粉原料生料 發(fā)酵法生產(chǎn)酒精概述，糧食與油脂，2008，6 :11-13)。燃料酒精生產(chǎn)成本高，無市場競爭力， 生產(chǎn)企業(yè)還需政府補貼才能生存，因此，降低燃料酒精的生產(chǎn)成本非常必要。生淀粉酶指的是一種復合酶，能直接有效作用于未經(jīng)蒸煮或處理的原始狀態(tài)的生 料淀粉顆粒，一般包括 α -淀粉酶(α -1,4-D-Glucanohydrolase ；EC 3. 2. 1. 1)，β -淀粉 酶(β -amylase ；EC 3. 2. 1. 2)和葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase ；EC 3. 2. 1. 3)等。α -淀粉 酶隨機切割淀粉分子內(nèi)部的α-1，4糖苷鍵，生成短鏈糊精；β-淀粉酶從淀粉分子的非還 原性末端水解淀粉分子相間隔的α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)物是麥芽糖，不能水解α_1，6糖苷鍵， 作用于支鏈淀粉時產(chǎn)物還有極限糊精。葡萄糖淀粉酶俗稱糖化酶，不僅能水解α-1，4糖苷 鍵，還能微弱水解α-1，6糖苷鍵，從淀粉分子的非還原性末端逐個切下葡萄糖，最終產(chǎn)物 為葡萄糖(王鏡巖，朱勝庚，徐長法，生物化學上高等教育出版社，北京，2002 :43)。生淀粉酶用于生料淀粉的同步糖化發(fā)酵產(chǎn)酒精，可在低溫下(30-40°C )直接將生 料淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)酵性糖，同時存在的酵母菌將水解產(chǎn)生的可發(fā)酵性糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，這 樣糖化和發(fā)酵在同一反應器中進行，可極大簡化傳統(tǒng)酒精生產(chǎn)工藝，減少設備方面的成本， 提高設備利用率。更重要的是，能節(jié)省高溫蒸煮過程所消耗的大量能量，極大降低能耗。因此，生淀粉酶應用在燃料酒精生產(chǎn)方面有著誘人的發(fā)展前景，研發(fā)生淀粉酶對降低燃料酒 精的生產(chǎn)成本具有重要意義(Li S-Z, Chan-Halbrendt C. Ethanol production in China Potential and technologies. Applied Energy 2009,86:162-169)。能產(chǎn)生生淀粉酶的微生物有很多，已報道的能夠產(chǎn)生生淀粉酶的微生物主要是真 菌，比如Aspergillus sp. , Rhizopus sp.，也有報道說來源于細菌的淀粉酶也能作用生淀 粉(Sun H,Ge X,ffang L,et al. Microbial production of raw starchdigesting enzymes. African Journal of Biotechnology 2009,8 1734-1739)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)生生淀粉酶的青霉菌及其制備的生淀粉酶制劑。
本發(fā)明提供的青霉菌(Peniciilium sp.)，名稱為GXU20，屬于青霉屬 (Penicillium sp.)，分離自廣西十萬大山的森林土壤，已于2010年03月25日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路 1 號院 3 號)，保藏號為 CGMCC No. 3690。青霉(Penicillium sp.)GXU20 CGMCC No. 3690, 簡稱青霉GXU20。青霉GXU20作用生木薯粉后釋放的產(chǎn)物為葡萄糖，能夠有效地提高生淀粉 質(zhì)原料的利用率。本發(fā)明還提供了用于培養(yǎng)青霉GXU20的培養(yǎng)基，是將麥麩、豆餅粉、ΚΗ2Ρ04、 MgSO4 · 7H20、FeSO4 · 7H20、CaCl2和水混合得到的；每升所述培養(yǎng)基中含有麥麩30g，豆餅粉 25g，KH2PO4 3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 025g，CaCl2 0. 13g。該培養(yǎng)基原料廉價， 生產(chǎn)成本低，易于制備。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)生淀粉酶制劑的方法，是發(fā)酵青霉GXU20，得到生淀粉酶 制劑。所述發(fā)酵的條件可為PH4. 0-6. 0、26-34°C，優(yōu)選為pH5. 0、28°C。所述發(fā)酵可包括如下步驟將青霉GXU20的孢子液接種至所述培養(yǎng)基中， pH5. 0-6. 0、26-32°C、180rpm(離心半徑為 4. 5-5. 5cm)培養(yǎng) 10-14 天；所述發(fā)酵具體包括如下步驟(1)將青霉GXU20活化5-7天；(2)將活化的菌種的孢子與水混合，得孢子濃度為IXlOici個/mL的孢子液；(3)將孢子液接入權(quán)利要求2所述培養(yǎng)基中，pH 5. 0,280CUSOrpm(離心半徑為 4. 5-5. 5cm)搖床培養(yǎng)11天。以上任一所述方法制備得到的生淀粉酶制劑也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供的生淀粉酶制劑在pH3. 5-6. 5均有最高酶活力的60%以上活性， 優(yōu)選pH4. 0-6. 0，最適pH值為4. 5 ；在35-60 °C均有最高酶活力的60 %以上活性，優(yōu)選 40-60°C，最適溫度為50°C ；最適作用條件接近耐高溫酵母菌的發(fā)酵條件(pH 4. 0,40°C), 在pH4. 0、40°C下生淀粉酶活力高達216U/mL。青霉GXU20和/或所述生淀粉酶制劑可用于生產(chǎn)酒精?？梢员苊庠系母邷卣?煮，節(jié)省大量能量，減少α-淀粉酶的添加，糖化和發(fā)酵同時在一個容器中進行，減少設備 成本。應用所述生淀粉酶制劑生產(chǎn)酒精時，pH值可為3. 5-6. 5，溫度可為35-60°C ；應用 所述生淀粉酶制劑時，PH值優(yōu)選為4. 5，溫度優(yōu)選為50°C。
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本發(fā)明還保護一種生產(chǎn)酒精的方法，包括如下步驟以生木薯粉為底物，加入所述 生淀粉酶制劑和安琪釀酒酵母，pH4. 0、40°C、150rpm(離心半徑為4. 5-5. 5cm)發(fā)酵，得到酒 Ib ο本發(fā)明提供的青霉GXU20及其生淀粉酶制劑，主要用于生淀粉同步糖化發(fā)酵生產(chǎn) 酒精工藝，可以避免原料的高溫蒸煮，節(jié)省大量能量；不用添加α “淀粉酶，節(jié)約成本；糖化 和發(fā)酵在一個容器中同時進行，減少設備成本。本發(fā)明有望解決因高溫蒸煮淀粉所帶來的 酒精生產(chǎn)高成本的問題。


圖1為青霉GXU20在分離平板上的菌落形態(tài)。圖2為青霉GXU20在分離平板上的淀粉降解圈。圖3為青霉GXU20在PDA平板上的菌落形態(tài)。圖4為青霉GXU20的顯微鏡照片。圖5為pH對青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的影響。圖6為溫度對青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的影響。圖7為不同碳源、氮源對青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的影響；A 不同碳源對青霉 GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的影響；B 不同氮源對青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的影響。圖8為最適青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的麥麩、豆餅粉濃度；A 最適合青霉GXU20產(chǎn) 生生淀粉酶的麥麩濃度；B 最適青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的豆餅粉濃度。圖9為培養(yǎng)基優(yōu)化前后青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶能力的比較。圖10為青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑水解生木薯粉的產(chǎn)物鑒定；A 糖標準品，Gl 為葡萄糖，G2為麥芽糖，G3為麥芽三糖；B 水解5min ；C 水解IOmin ；D 水解30min ；E 水 解4h。圖11為青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑最適作用pH曲線。圖12為青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑最適作用溫度曲線。圖13為青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑對不同濃度生木薯粉的水解作用。圖14為青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑處理后的木薯粉顆粒電鏡照片。圖15為青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑在生木薯粉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)酒精中的測定 結(jié)果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以 下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。以下實施例中的轉(zhuǎn)速，均為 在半徑為4. 5-5. 5cm的離心半徑下的轉(zhuǎn)速?；景l(fā)酵培養(yǎng)基生木薯粉10g、(NH4)2S04 2. 5g、胰蛋白胨2g、K2HPO4 3g， MgSO4 · 7H20 0. 2g、FeSO4 · 7H20 0. 0255g、CaCl2 0. 13g，用蒸餾水定容至 IL ；pH 值用 2M HCl 水溶液或2M NaOH水溶液調(diào)節(jié)；121°C濕熱滅菌20min。
pH4. 0的磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液將7. 71毫升0. 2mol/L Na2HPO4水溶液和 12. 29毫升0. lmol/L檸檬酸水溶液混合。實施例1、實施例2、實施例3中，生淀粉酶活力測定采用3，5- 二硝基水楊酸(3， 5-dinitrosalicylate,DNS)法(Miller GL. Use of dinitrosalicyclic acidreagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistryl959, 31 426-428), Mi^iPW 如下1、將葡萄糖溶于無菌蒸餾水中，制成不同濃度的葡萄糖標準液；在500 μ L葡萄糖 標準液中加入ImL DNS,沸水浴5min顯色，冷卻至室溫，540nm處測定光吸收值；得到光吸 收值和葡萄糖濃度的標準曲線，標準曲線的函數(shù)式為y = 2. 7489X-0. 0168 (R2 = 0. 9994) (y 為光吸收值，χ為葡萄糖濃度)。2、將2g生木薯粉懸于IOOmL pH4. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，得到生木 薯粉懸液；在2mL EP管中加入450 μ L生木薯粉懸液，然后加入50 μ L液態(tài)生淀粉酶制劑， 40°C下反應30min，期間不斷振蕩，使酶與底物充分接觸，反應結(jié)束后加入ImL DNS，沸水浴 5min顯色，冷卻至室溫，1，OOOrpm離心lmin，540nm處測定光吸收值，根據(jù)標準曲線和光吸 收值計算酶活力。酶活力定義PH4. 0，40°C條件下水解生木薯粉，Ih釋放出Img還原糖(相 當于等量的葡萄糖)所需的酶量為一個酶活力單位(IU)。實施例1、青霉GXU20的獲得一、菌株的獲得1、土壤樣品的采集采集中國廣西防城港市十萬大山森林約8-20cm淺土層的土壤。2、菌株的分離篩選(1)用蒸餾水配制分離培養(yǎng)基；每升分離培養(yǎng)基中含有生木薯粉10g，NaNO3 3g， KH2PO4 lg，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. OOlg, MgSO4 · 7H20 0. 5g，瓊脂 15g ；pH5. 5 ；將除木薯粉以外的其 它組分混合后在121°C濕熱滅菌20min，生木薯粉經(jīng)CcT輻照滅菌，滅菌后的木薯粉在滅菌 后的其它組分冷卻至45°C時無菌加入，混勻，倒平板。(2)取Ig 土樣放入150mL錐形瓶，加入19mL無菌水，于磁力攪拌器上攪拌30min， 取懸濁液梯度稀釋(10_2、10_3、10_4和10_5)，各取50yL涂布在分離培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)。(3)3-5天后，觀察菌落生長情況，選擇菌落數(shù)適量的梯度大量涂布在8塊分離平 板上，28 °C培養(yǎng)。(4)5天后，用I2/KI染色，菌落周圍出現(xiàn)透明水解圈則說明該菌株分泌生淀粉酶， 挑取水解圈明顯的真菌，轉(zhuǎn)接至新的分離平板，純化為單菌落。(5)配制ρΗ 5. 5的基本發(fā)酵培養(yǎng)基。(6)將步驟(4)得到的目的菌株接種至基本發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)中，28°C、180rpm 培養(yǎng)5-7天，取上清液進行生淀粉酶活力測定，從中篩選出酶活力最高的菌株GXU20。菌株GXU20在分離培養(yǎng)基上的形態(tài)見圖1，菌株GXU20在分離培養(yǎng)基上的生淀粉降 解圈見圖2。二、菌株的鑒定菌株在PDA平板上的菌落形態(tài)見圖3，該菌株在PDA培養(yǎng)基上生長較快，菌落直徑7天可達4-5cm，菌落生長初期菌絲為白色，分化出分生孢子后菌落顏色為青綠色，培養(yǎng)基 背面無色素。菌株的顯微鏡照片見圖4，光學顯微鏡下觀察可見孢子較多，分生孢子為橢圓形或 者圓形，分生孢子小梗為二輪生，分生孢子梗呈掃帚形狀，菌絲有橫隔。根據(jù)該菌株的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》，將菌株GXU20鑒定為青霉屬 (Penicillium)。將青霉GXU20保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保 藏號為 CGMCC No. 3690。實施例2、青霉GXU20生產(chǎn)生淀粉酶的培養(yǎng)條件的優(yōu)化一、孢子液的制備1、將 PDA 培養(yǎng)基 121°C 滅菌 20min。2、把PDA平板上傳代活化5-7天的青霉GXU20的孢子用無菌水洗后制成孢子懸 液，孢子濃度為IX IOltl個/mL。二、pH值的優(yōu)化1、配制不同pH值(4. 0、4. 5、5. 0、5. 5或6. 0)的基本發(fā)酵培養(yǎng)基。2、將青霉GXU20的孢子液按1 %的接種量(體積百分含量)接種至步驟1的培養(yǎng) 基中，28 °C、180rpm培養(yǎng)5天。3、收集粗酶液作為待測溶液，進行生淀粉酶活力測定。結(jié)果見圖5，青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的最適培養(yǎng)pH值為5. 0。三、溫度的優(yōu)化1、配制pH5. 0的基本發(fā)酵培養(yǎng)基。2、將青霉GXU20的孢子液按的接種量(體積百分含量)接種至步驟1的培養(yǎng) 基中，分別置于不同溫度(26°C、28°C、30°C、32°C或34°C )的搖床180rpm培養(yǎng)5天。3、收集粗酶液作為待測溶液，進行生淀粉酶活力測定。結(jié)果見圖6，青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的最適培養(yǎng)溫度為28°C。四、培養(yǎng)基最適碳源和氮源的確定1、配制各種培養(yǎng)基含各種碳源的培養(yǎng)基(pH5.0)用等質(zhì)量的其它碳源(馬鈴薯粉、紅薯粉、玉米 粉、大米粉、蕎麥粉、可溶性淀粉、糯米粉或麥麩)替換基本發(fā)酵培養(yǎng)基中的生木薯粉，得到 含各種碳源的培養(yǎng)基。含各種氮源的培養(yǎng)基(pH5. 0)生木薯粉10g、氮源(尿素、硝酸鈉、硫酸銨、氯化 銨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或豆餅粉)10g、K2HPO4 3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g、FeSO4 · 7H20 0. 0255g、CaCl2 0. 13g，用蒸餾水定容至IL ；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液調(diào)節(jié)； 121 °C濕熱滅菌20min。2、將青霉GXU20的孢子液按1 %的接種量(體積百分含量)分別接種至步驟1的 各種培養(yǎng)基中，280C、180rpm培養(yǎng)7天。3、收集粗酶液作為待測溶液，進行生淀粉酶活力測定。結(jié)果見圖7。青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的最適碳源是麥麩，最適氮源是豆餅粉。五、麥麩和豆餅粉最適濃度的確定1、麥麩最適濃度的確定
(1)配制各種培養(yǎng)基含各種濃度麥麩的培養(yǎng)基(pH5.0)麥麩(58、1(^、158、2(^、258、3(^、358或408)、 硫酸銨 2. 5g、胰蛋白胨 2g，K2HPO4 3g,MgSO4 ·7Η20 0. 2g、FeS04 ·7Η20 0. 0255g,CaCl2 0. 13g, 用蒸餾水定容至1L;PH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液調(diào)節(jié)；121°C濕熱滅菌20min。(2)將青霉GXU20的孢子液按1 %的接種量(體積百分含量)分別接種至步驟(1) 的各種培養(yǎng)基中，280C、180rpm培養(yǎng)7天。(3)收集粗酶液作為待測溶液，進行生淀粉酶活力測定。結(jié)果見圖8A。青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的最適的麥麩濃度為3% (g/100mL)。2、豆餅粉最適濃度的確定(1)配制各種培養(yǎng)基含各種濃度豆餅粉的培養(yǎng)基(ρΗ5. 0)生木薯粉10g、豆餅粉(10g、15g、20g、25g、 30g 或 35g)、K2HPO4 3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g、FeSO4 · 7H20 0. 0255g、CaCl2 0. 13g，用蒸餾水定 容至IL ；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液調(diào)節(jié)；121°C濕熱滅菌20min。(2)將青霉GXU20的孢子液按1 %的接種量(體積百分含量)分別接種至步驟⑴ 的各種培養(yǎng)基中，280C、180rpm培養(yǎng)7天。(3)收集粗酶液作為待測溶液，進行生淀粉酶活力測定。結(jié)果見圖8B。青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的最適的豆餅粉濃度為2. 5% (g/100mL)。六、青霉GXU20在基本發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)酶情況的比較1、配制各種培養(yǎng)基(1)配制ρΗ5· 0的基本發(fā)酵培養(yǎng)基。(2)配制ρΗ5· 0的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基麥麩30g，豆餅粉25g，KH2PO4 3g， MgSO4 · 7Η200· 2g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 025g, CaCl2 0. 13g 用蒸餾水定容至 IL ；pH 值用 2M HCl 水 溶液或2M NaOH水溶液調(diào)節(jié)；121°C濕熱滅菌20min。2、將青霉GXU20的孢子液按1 %的接種量(體積百分含量)分別接種至步驟1的 各種培養(yǎng)基中，28 0C、180rpm培養(yǎng)。3、培養(yǎng)過程中，每天定時取粗酶液作為待測溶液，進行生淀粉酶活力測定。結(jié)果見圖9。基本發(fā)酵培養(yǎng)基中青霉GXU20產(chǎn)生生淀粉酶的最高峰在第5天，但是 從第6天開始產(chǎn)酶活力就開始下降，而優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)酶最高峰在第11天，且第11-16 天產(chǎn)酶活力保持穩(wěn)定。結(jié)果表明優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基較基本發(fā)酵培養(yǎng)基實用，首先其原料麥麩 和豆餅粉較胰蛋白胨和硫酸銨廉價，其次產(chǎn)酶達到高峰后酶活保持穩(wěn)定不喪失，易于制備 酶制劑。采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基后，青霉GXU20發(fā)酵液的生淀粉酶活力提高到原來的6倍左 右ο優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下麥麩30g，豆餅粉25g，KH2PO4 3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g， FeSO4 ·7Η20 0. 025g, CaCl2 0. 13g 用蒸餾水定容至 IL ；pH 值用 2M HCl 水溶液或 2M NaOH 水 溶液調(diào)節(jié)；121°C濕熱滅菌20min。實施例3、液態(tài)生淀粉酶制劑的制備1、配制優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配制pH5. 0的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。2、孢子液的制備
(1)將 PDA 培養(yǎng)基 121°C 滅菌 20min。(2)把PDA平板上傳代活化5-7天的青霉GXU20的孢子用無菌水洗后制成孢子懸 液，孢子濃度為IX IOltl個/mL。3、液態(tài)生淀粉酶制劑的制備(1)將50mL優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基置于250mL搖瓶中。(2)將青霉GXU20的孢子液按的接種量(體積百分含量)接種至優(yōu)化發(fā)酵培 養(yǎng)基中，28°C、180rpm培養(yǎng)11天。(3) 13，OOOrpm離心培養(yǎng)物，去除菌體，收集上清液作為待測溶液，進行生淀粉酶 活力測定。待測溶液的生淀粉酶活力為216U/mL。該待測溶液即為液態(tài)生淀粉酶制劑，進行實施例4、實施例5和實施例6的實驗。實施例4、液態(tài)生淀粉酶制劑的酶學特性一、液態(tài)生淀粉酶制劑水解生木薯粉產(chǎn)物分析1、制備生木薯粉懸液將2g生木薯粉懸于IOOmL pH4. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，得到生木薯粉懸液。2、產(chǎn)物分析在指形瓶中加入6mL生木薯粉懸液，然后加入2mL液態(tài)生淀粉酶制劑，放置40°C 下，150rpm搖床反應。分別于5min、10min、30min和4h時取500 μ L樣品，沸水煮5min滅活 生淀粉酶，冷卻；12，OOOrpm離心5min，取上清液，HPLC檢測上清液中的糖(標樣為葡萄糖、
麥芽糖、麥芽三糖)。結(jié)果見圖10。結(jié)果表明液態(tài)生淀粉酶制劑作用生木薯粉，即使是在很短的反應 時間(5min內(nèi))，釋放出的產(chǎn)物也只有葡萄糖，且葡萄糖隨時間的延長有增多的趨勢。由此 推斷青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑里主要是生淀粉糖化酶在起水解作用。二、液態(tài)生淀粉酶制劑的最適作用PH值和最適作用溫度1、最適作用pH值檢測不同pH條件下液態(tài)生淀粉酶制劑酶活力的差異分別用不同PH的磷酸氫二 鈉 _ 檸檬酸緩沖液(pH 3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5 或 7. 0)代替 pH4. 0 的磷酸氫 二鈉_檸檬酸緩沖液，其它同實施例3的生淀粉酶活力測定方法；酶活力定義40°C條件下 水解生木薯粉，Ih釋放出Img還原糖(相當于等量的葡萄糖)所需的酶量為一個酶活力單 位(IU)。生淀粉酶活力測定結(jié)果如下85.04U/mL(pH 3. 0) ,164. 30U/mL(pH3. 5) ,216. OOU/ mL(pH4. 0) ,271. 78U/mL(pH4. 5) ,256. 44U/mL(pH5. 0) ,231. 66U/mL(pH5. 5) ,210. 86U/ mL (pH6. 0) ,159. 83U/mL (pH6. 5) ,127. 07U/mL (pH 7. 0)。以最高酶活力為 100%，其它 pH 值 的酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力，以PH值為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作 圖，見圖11。結(jié)果表明，青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑在40°C時的最適作用pH約為4. 5， PH4.0時相對酶活力為79%。2、最適作用溫度檢測不同溫度條件下液態(tài)生淀粉酶制劑酶活力的差異分別采用不同的溫度(20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C或 60°C )，其它同實施例 3 的生淀粉酶活力 測定方法；酶活力定義PH4. 0條件下水解生木薯粉，Ih釋放出Img還原糖(相當于等量的 葡萄糖)所需的酶量為一個酶活力單位(IU)。生淀粉酶活力測定結(jié)果如下:71.64U/mL(20°C)、81. 43U/mL(25 °C )、126. 03U/ mL(30 °C )、168. 87U/mL(35 °C )、216. OOU/mL (40 °C )、235. 27U/mL (45 °C)、248. 70U/ mL(50°C ) >232. 69U/mL(55°C ) >212. 07U/mL(60°C ) 以最高酶活力作為 100%，其它溫度的 酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力，以溫度為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作圖，見 圖12。結(jié)果表明，青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑的在pH4.0時的最適作用溫度約為50°C， 在40°C相對酶活力為87%。三、液態(tài)生淀粉酶制劑的底物特異性檢測不同底物條件下液態(tài)生淀粉酶制劑酶活力的差異分別用相同質(zhì)量的不同底 物(生木薯粉、生玉米粉、生馬鈴薯粉、生紅薯粉、生糯米粉、生大米粉、生蕎麥粉或可溶性 淀粉)代替生木薯粉，其它同實施例3的生淀粉酶活力測定方法；酶活力定義pH4. 0,40°C 條件下水解底物，Ih釋放出Img還原糖(相當于等量的葡萄糖)所需的酶量為一個酶活力 單位(IU)。使用Micro BCA蛋白分析試劑(Pierce，Rockford, IL)檢測液態(tài)生淀粉酶制劑的 蛋白濃度。不同底物條件下液態(tài)生淀粉酶制劑的生淀粉酶活力測定結(jié)果見表1。表1青霉GXU20液態(tài)生淀粉酶制劑的底物特異性
權(quán)利要求
青霉(Penicillium sp.)GXU20，其保藏編號為CGMCC No.3690。
2.用于培養(yǎng)青霉(Penicilliumsp.)GXU20 CGMCC No. 3690的培養(yǎng)基，是將麥麩30g， 豆餅粉 25g, KH2PO4 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 025g 和 CaCl2 0. 13g 與水混合至 總體積為IL得到的。
3.—種生產(chǎn)生淀粉酶制劑的方法，是發(fā)酵青霉(Penicillium sp.)GXU20 CGMCCNo. 3690，得到生淀粉酶制劑。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的條件為pH4.0-6. 0、26-34°C，優(yōu) 選為 pH5. 0、28°C。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵包括如下步驟將青霉 (Penicillium sp.)GXU20 CGMCC No. 3690的孢子液接種至權(quán)利要求2所述培養(yǎng)基中， ρΗ5· 0-6. 0、26-32°C、180rpm 培養(yǎng) 10-14 天。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵包括如下步驟(1)將青霉(Penicilliumsp.)GXU20 CGMCC No. 3690 活化 5-7 天；(2)將活化的菌種的孢子與水混合，得孢子濃度為1X IO10個/mL的孢子液；(3)將孢子液接入權(quán)利要求2所述培養(yǎng)基中，pH5.0、28°C、180rpm搖床培養(yǎng)11天。
7.權(quán)利要求3至6中任一所述方法制備得到的生淀粉酶制劑。
8.青霉(Penicilliumsp.)GXU20 CGMCC No. 3690和/或權(quán)利要求7所述生淀粉酶制 劑在生產(chǎn)酒精中的應用。
9.如權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于應用所述生淀粉酶制劑時，pH值為 3. 5-6. 5，溫度為35-60°C ；應用所述生淀粉酶制劑時，pH值優(yōu)選為4. 5，溫度優(yōu)選為50°C。
10.一種生產(chǎn)酒精的方法，包括如下步驟以生木薯粉為底物，加入權(quán)利要求6所述生 淀粉酶制劑和安琪釀酒酵母，PH4. 0,40°CU50rpm發(fā)酵，得到酒精。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)生生淀粉酶的青霉菌及其制備的生淀粉酶制劑。本發(fā)明提供了青霉(Penicillium sp.)GXU20 CGMCC No.3690。本發(fā)明還提供了發(fā)酵青霉GXU20得到的生淀粉酶制劑。青霉GXU20和生淀粉酶制劑均可用于生產(chǎn)酒精中，可以避免原料的高溫蒸煮，節(jié)省大量能量；不用添加α-淀粉酶，節(jié)約成本；糖化和發(fā)酵在一個容器中同時進行，減少設備成本。本發(fā)明有望解決因高溫蒸煮淀粉所帶來的酒精生產(chǎn)高成本的問題。
文檔編號C12N9/24GK101955887SQ20101027206
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者馮家勛, 冼亮, 劉君梁, 唐紀良, 張秋江, 林海娟, 段承杰, 羅雪梅 申請人:廣西大學