專利名稱：耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及噬菌體的制備方法。
背景技術(shù)：
在臨床上由于抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增長(zhǎng)，使得細(xì)菌感染性疾病特 別是耐藥性細(xì)菌的感染問(wèn)題成為臨床治療的全球性難題。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa. PA)又稱綠膿桿菌是臨床上獲得性感染中重要的條件致病菌之一。我國(guó)全國(guó)性 醫(yī)院內(nèi)病原菌耐藥性監(jiān)測(cè)(NPRS)數(shù)據(jù)顯示銅綠假單胞菌在所有院內(nèi)感染革蘭陰性菌中 排第1位，隨著抗生素的應(yīng)用日益廣泛，臨床上出現(xiàn)了大量多重耐藥的PA菌株，這對(duì)臨床治 療PA感染造成極大的困難。噬菌體是專性寄生物，所以自然界中凡有細(xì)菌分布的地方，均可發(fā)現(xiàn)其特異的噬 菌體的存在，亦即噬菌體是伴隨著宿主細(xì)菌的分布而分布的，例如糞便、陰溝污水及醫(yī)院污 水中含有大量綠膿桿菌，故也能很容易地分離到綠膿桿菌噬菌體。噬菌體是以特定的細(xì)菌 菌株為靶標(biāo)，可使患者免受因正常菌群被破壞而引起的副作用.噬菌體的另一優(yōu)點(diǎn)是它們 能夠以指數(shù)生長(zhǎng)，會(huì)緊隨細(xì)菌增殖而生長(zhǎng)、隨細(xì)菌消失而消失.并且噬菌體還能在細(xì)菌進(jìn) 化的同時(shí)發(fā)生突變，即使細(xì)菌對(duì)一種噬菌體產(chǎn)生耐受，自然界還存在著大量的甚至能進(jìn)行 更新的耐受菌的噬菌體種類.由于噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，噬菌體即從中釋放出來(lái)， 所以，(a)在液體培養(yǎng)基內(nèi)可使混濁的菌懸液變?yōu)槌吻?，此現(xiàn)象可指示有噬菌體存在；也可 利用這一特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，使噬菌體增殖、釋放，從而 可分離到特異的噬菌體；(b)在有宿主細(xì)菌生長(zhǎng)的固體瓊脂平板上，噬菌體可裂解細(xì)菌而 形成透明的空斑，稱噬菌斑，一個(gè)噬菌體產(chǎn)生一個(gè)噬菌斑，利用這一現(xiàn)象可將分離到的噬菌 體進(jìn)行純化與測(cè)定噬菌體的效價(jià)。對(duì)于分離到的綠膿桿菌噬菌體，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選，應(yīng)用 綠膿桿菌的11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)型，對(duì)噬菌體進(jìn)行寬噬篩選，為下一步研究綠膿桿菌噬菌體外用制劑 奠定基礎(chǔ)，綠膿桿菌噬菌體只是外用制劑中幾種成分之一。目前，有關(guān)噬菌體方面的科研工作，開展的比較多，主要集中在噬菌體的性質(zhì)及分 類方法方面，在實(shí)際應(yīng)用的分離方法方面，特別是針對(duì)某一種噬菌體，例如綠膿桿菌噬菌體 的分離方法多種多樣，參差不齊，分離純化效果不理想(離心條件控制不精確，將導(dǎo)致分離 的噬菌體斷裂等)，使后續(xù)科研工作困難重重。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有綠膿桿菌噬菌體的分離方法存在分離純化效果差 的問(wèn)題，而提供耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法。耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法按以下步驟進(jìn)行一、取IL醫(yī)院污水，紗布 過(guò)濾后加入CaCl2至濃度為lmmol/L，攪拌后離心并取上清液，得污水樣品；二、向500ml三 角瓶中加IOOml三倍濃縮的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、200ml污水樣品和2ml綠膿桿菌菌懸液，然后在37°C搖床160r/min震蕩增殖培養(yǎng)12 24h，離心后取上清液并過(guò)濾，再在37°C 下培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)無(wú)菌檢查合格，得裂解液；三、取一環(huán)裂解液接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后 加入0. Iml濃度為IO7 108pfu/ml的綠膿桿菌宿主菌懸液，室溫下混合15min，得混合液； 四、取LB培養(yǎng)基溶化并冷卻至48°C，然后加入0. 2ml混合液并混勻，再倒入LB固體培養(yǎng)基 上并于37°C下培養(yǎng)24h，得單個(gè)噬菌斑；五、用接種針在單個(gè)噬菌斑中刺一下，取噬菌體，然 后接入含有綠膿桿菌的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C下培養(yǎng)至綠膿桿菌完全溶解，過(guò)濾后，即 完成耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備。本發(fā)明中綠膿桿菌噬菌體的制備方法簡(jiǎn)單，且分離純化效果好，無(wú)噬菌體斷裂的 現(xiàn)象。本發(fā)明制備所得耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體，用于制作自身(疫苗)生物制劑，治療耐 藥綠膿桿菌感染引起的疾病，尤其是表皮感染性疾患，作為外用噴劑使用，可避免由于使用 抗生素而產(chǎn)生的耐藥性綠膿桿菌。


圖1為具體實(shí)施方式
中一噬菌體的透視電鏡圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法按以下步驟進(jìn) 行一、取IL醫(yī)院污水，紗布過(guò)濾后加入CaCl2至濃度為lmmol/L，攪拌后離心并取上清液， 得污水樣品；二、向500ml三角瓶中加IOOml三倍濃縮的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、200ml 污水樣品和2ml綠膿桿菌菌懸液，然后在37°C搖床160r/min震蕩增殖培養(yǎng)12 24h，離心 后取上清液并過(guò)濾，再在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)無(wú)菌檢查合格，得裂解液；三、取一環(huán)裂解液 接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后加入0. Iml濃度為IO7 108pfU/ml的綠膿桿菌宿主菌懸液， 室溫下混合15min，得混合液；四、取LB培養(yǎng)基溶化并冷卻至48°C，然后加入0. 2ml混合液 并混勻，再倒入LB固體培養(yǎng)基上并于37°C下培養(yǎng)24h，得單個(gè)噬菌斑；五、用接種針在單個(gè) 噬菌斑中刺一下，取噬菌體，然后接入含有綠膿桿菌的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C下培養(yǎng)至 綠膿桿菌完全溶解，過(guò)濾后，即完成耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備。本實(shí)施方式步驟一中醫(yī)院污水為消毒處理前的醫(yī)院污水。本實(shí)施方式步驟二中LB固體培養(yǎng)基在121°C下滅菌15 30min后使用。本實(shí)施方式步驟三中LB液體培養(yǎng)基在121°C下滅菌15 30min后使用。本實(shí)施方式中制備所得耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體，進(jìn)行增殖后即可得到高效價(jià)的 耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體，具體步驟為將具體實(shí)施方式
一步驟五中過(guò)濾后所得濾液與LB 液體培養(yǎng)基按1 10的比例混合，再加入綠膿桿菌菌懸液與濾液等量或1/2的量)，37°C下 增殖培養(yǎng)，并重復(fù)移種2 8次，過(guò)濾后，得高效價(jià)的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體制品。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中離心采用 5000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二不同的是步驟二中綠膿桿菌 菌懸液的制備綠膿桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，37°C下培養(yǎng)17 26h，取單菌落接種于5ml無(wú)菌水中，即完成。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是步驟二中離心 采用5000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟二中過(guò)濾 采用孔徑為0. 22 μ m的濾菌器。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟二中無(wú)菌 檢查的過(guò)程在LB固體培養(yǎng)基上涂布50ul濃度為IO7 108pfu/ml的綠膿桿菌宿主菌懸 液，待綠膿桿菌宿主菌懸液干后，在上面分散滴加裂解液，然后在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜，若形成 無(wú)菌生長(zhǎng)的透明噬菌斑，則裂解液中含有綠膿桿菌噬菌體，即完成；其中LB固體培養(yǎng)基為 每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、12. 5g的瓊脂、IOg的NaCl和余量的水組 成，PH值為7. 5。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟三中綠膿 桿菌宿主菌懸液的制備取綠膿桿菌宿主菌單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床 160r/min培養(yǎng)8 18h，即完成。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。本實(shí)施方式中綠膿桿菌宿主菌單菌落，為耐藥臨床綠膿桿菌菌株，共有30株。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至七之一不同的是步驟三中LB 液體培養(yǎng)基為每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、IOg的NaCl和余量的水組成， PH值為7. 5。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟三中LB 培養(yǎng)基為每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0. 7g的瓊脂、IOg的NaCl和余量 的水組成，PH值為7. 5。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法按以下步驟進(jìn) 行一、取IL醫(yī)院污水，紗布過(guò)濾后加入CaCl2至濃度為lmmol/L，攪拌后離心并取上清液， 得污水樣品；二、向500ml三角瓶中加IOOml三倍濃縮的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、200ml 污水樣品和2ml綠膿桿菌菌懸液，然后在37°C搖床160r/min震蕩增殖培養(yǎng)18h，離心后取 上清液并過(guò)濾，再在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)無(wú)菌檢查合格，得裂解液；三、取一環(huán)裂解液接種 于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后加入0. Iml濃度為108pfu/ml的綠膿桿菌宿主菌懸液，室溫下混合 15min，得混合液；四、取LB培養(yǎng)基溶化并冷卻至48°C，然后加入0. 2ml混合液并混勻，再倒 入LB固體培養(yǎng)基上并于37°C下培養(yǎng)24h，得單個(gè)噬菌斑；五、用接種針在單個(gè)噬菌斑中刺一 下，取噬菌體，然后接入含有綠膿桿菌的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C下培養(yǎng)至綠膿桿菌完全 溶解，過(guò)濾后，即完成耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備。本實(shí)施方式步驟一中醫(yī)院污水為消毒處理前的醫(yī)院污水。1、噬菌體滴度的測(cè)定挑取單個(gè)噬斑，接種到綠膿桿菌宿主菌中，37°C搖床160r/min震蕩培養(yǎng)6h以擴(kuò)增 噬菌體，8000r/min離心lOmin，收集上清既為噬菌體原液；可凍干保存或加無(wú)菌甘油30% 后液氮保存?zhèn)溆?；滴度測(cè)定(終點(diǎn)滴定法)，即將噬菌體原液用LB液體培養(yǎng)基作10倍稀釋后，每稀 釋度取IOul，加入到0. 2ml綠膿桿菌宿主菌中，做噬斑測(cè)定；滴度(pfu/ml)結(jié)果=密度適當(dāng)?shù)钠桨迳系氖砂邤?shù)X稀釋度X 100 = 108_9
2、寬噬噬菌體篩選用綠膿桿菌宿主菌分別涂平板各2塊(做好標(biāo)記)，在平板背面劃格，每個(gè)空格內(nèi) 做好標(biāo)記并滴加噬菌體，37°C培養(yǎng)18 24h，觀察噬菌斑情況；統(tǒng)計(jì)各個(gè)噬菌體的寬噬情 況，反復(fù)3次，確認(rèn)寬噬噬菌體。3、寬噬噬菌體生化性質(zhì)檢測(cè)1)、噬菌體核酸提取挑取單個(gè)綠膿桿菌菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)6h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；2)、挑噬菌體單個(gè)噬菌斑接種到對(duì)應(yīng)宿主菌中，37°C振蕩培養(yǎng)6h ；3)、培養(yǎng)物加DNaseI及RNaseA至終濃度各lug/ml，37°C X30min,降解宿主來(lái)源 地 DNA 及 RNA ；4)、按 5. 84g/100ml 加入 NaCI，混勻溶解，冰浴 lh，10000r/min 離心 lOmin，收集上
清備用；5)、加入固體PEG8000至終濃度10% (w/v)，充分震蕩溶解，冰浴lh，使噬菌體顆粒 形成沉淀，4°C 10000r/min離心lOmin，棄上清，使上清蒸發(fā)干凈；6)、用2ml，TM液混懸沉淀(取樣做電鏡觀察)；7)、加等體積氯仿抽提，振蕩30sec，6000r/min離心lOmin，取上層水相；8)、加DNaseI至終濃度5ug/ml，RNaseA至lug/ml，置37°C溫育Ih再次降解宿主 菌來(lái)源的DNA及RNA ；9)、加入 EDTA (ρΗ8. 0)至終濃度 20mmol/L，終止 DNaseI 活性；10)、加蛋白酶K至終濃度50ug/ml，加SDS至終濃度0. 5%，混勻，56°C X lh，此步 為破噬菌體衣殼，釋放出噬菌體核酸，同時(shí)也降解DNaseI ；11)、加等體積平衡酚(ρΗ8. 0)抽提，6000r/min離心lOmin，收集上清；12)、加等體積氯仿再抽提一次，6000r/min離心lOmin，收集上清；13)、加入1/10體積3m0l/LNaAC (pH5. 2)，再加入兩倍體積的無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醇 沉淀核酸，-200C Ih或過(guò)夜，4°C lOOOOr/min離心lOmin，沉淀用70%乙醇和無(wú)水乙醇各洗 滌一次，去乙醇，空氣中干燥沉淀；14)、適量TE混懸沉淀，在核酸定量?jī)x上粗略定量，按dsDNA設(shè)置參數(shù)，-20°C保 存；15)、在0. 8%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定純度，IXTAE緩沖液，IOOvXlh ；檢測(cè)結(jié)果 為，只要電泳圖是一條帶即可。4、各噬菌體核酸EcoRV酶切分析取上述純化的噬菌體核酸溶液，用EcoRV按常規(guī)酶切，反應(yīng)體系如下EcoRVIuL(IOU)IOX 緩沖液 IuL核算樣品IuL (約lug)ddH207uL37°CX2h 反應(yīng)于lXTAE、0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，100VX2h，觀察結(jié)果；將電泳各條帶相加，可 粗略知道噬菌體基因組的大小。
5、噬菌體電鏡觀察取噬菌體培養(yǎng)物上清或?qū)捠墒删w生化性質(zhì)檢測(cè)6)中懸液作電鏡觀察；取20uL 樣本滴于銅網(wǎng)上，待其自然沉淀15min，用濾紙從側(cè)面吸收多余液體，加1滴2%磷鎢酸 (PTA)于銅網(wǎng)上，染色lOmin，用濾紙從側(cè)面吸去染液，干燥后做電鏡觀察；結(jié)果如圖1所示， 通過(guò)透射電鏡可見耐藥銅綠假單胞菌噬菌體為有一個(gè)多面體立體對(duì)稱的顆粒，無(wú)囊膜，直 徑為50nm，有一個(gè)短尾，與綠膿桿菌噬菌體標(biāo)準(zhǔn)圖一致。
權(quán)利要求
耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法按以下步驟進(jìn)行一、取1L醫(yī)院污水，紗布過(guò)濾后加入CaCl2至濃度為1mmol/L，攪拌后離心并取上清液，得污水樣品；二、向500ml三角瓶中加100ml三倍濃縮的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、200ml污水樣品和2ml綠膿桿菌菌懸液，然后在37℃搖床160r/min震蕩增殖培養(yǎng)12～24h，離心后取上清液并過(guò)濾，再在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)無(wú)菌檢查合格，得裂解液；三、取一環(huán)裂解液接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后加入0.1ml濃度為107～108pfu/ml的綠膿桿菌宿主菌懸液，室溫下混合15min，得混合液；四、取LB培養(yǎng)基溶化并冷卻至48℃，然后加入0.2ml混合液并混勻，再倒入LB固體培養(yǎng)基上并于37℃下培養(yǎng)24h，得單個(gè)噬菌斑；五、用接種針在單個(gè)噬菌斑中刺一下，取噬菌體，然后接入含有綠膿桿菌的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃下培養(yǎng)至綠膿桿菌完全溶解，過(guò)濾后，即完成耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟一中 離心采用5000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟 二中綠膿桿菌菌懸液的制備綠膿桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，37°C下培養(yǎng)17 26h，取 單菌落接種于5ml無(wú)菌水中，即完成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟二中 離心采用5000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟二中 過(guò)濾采用孔徑為0. 22 μ m的濾菌器。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟二中 無(wú)菌檢查的過(guò)程在LB固體培養(yǎng)基上涂布50u 1濃度為IO7 108pfu/ml的綠膿桿菌宿主 菌懸液，待綠膿桿菌宿主菌懸液干后，在上面分散滴加裂解液，然后在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜，若 形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明噬菌斑，則裂解液中含有綠膿桿菌噬菌體，即完成；其中LB固體培養(yǎng) 基為每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、12. 5g的瓊脂、IOg的NaCl和余量的水 組成，PH值為7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟三中 綠膿桿菌宿主菌懸液的制備取綠膿桿菌宿主菌單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C 搖床160r/min培養(yǎng)8 18h，即完成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟三中 LB液體培養(yǎng)基為每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、IOg的NaCl和余量的水組 成，PH值為7.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，其特征在于步驟三中 LB培養(yǎng)基為每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0. 7g的瓊脂、IOg的NaCl和余 量的水組成，PH值為7.5。
全文摘要
耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體的制備方法，它涉及噬菌體的制備方法。它解決了現(xiàn)有解決現(xiàn)有綠膿桿菌噬菌體的分離方法存在分離純化效果差的問(wèn)題。方法一、取污水樣品；二、制備裂解液；三、裂解液與綠膿桿菌宿主菌懸液混合1培養(yǎng)，得混合液；四、制備單個(gè)噬菌斑；五、取噬菌體接入含有綠膿桿菌的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)至綠膿桿菌完全溶解，過(guò)濾后即完成。本發(fā)明中綠膿桿菌噬菌體的制備方法簡(jiǎn)單，且分離純化效果好，無(wú)噬菌體斷裂的現(xiàn)象。本發(fā)明制備所得耐藥綠膿桿菌寬噬噬菌體，用于制作自身(疫苗)生物制劑，治療耐藥綠膿桿菌感染引起的疾病，尤其是表皮感染性疾患，作為外用噴劑使用，可避免由于使用抗生素而產(chǎn)生的耐藥性綠膿桿菌。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101962631SQ20101027145
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者于沖, 佟忠山, 夏海華, 孫建華, 曲曉軍, 王金英, 郭薇媛, 齊桂云 申請(qǐng)人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所