專利名稱：一種高產(chǎn)l-丙氨酸的xz-a26菌株及構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)L-丙氨酸的XZ-A26菌株，屬大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，該菌株于2010年7月26日保藏在位于“北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國 科學(xué)院微生物研究所”的“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 4036。本發(fā)明還涉及該菌株的構(gòu)建方法及該菌株在制備L-丙氨酸中的應(yīng)用，屬 于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-丙氨酸在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的用途。在食品領(lǐng)域，L-丙氨酸的添加可明 顯提高食品及飲料中的蛋白質(zhì)利用率，食用后能迅速恢復(fù)疲勞，振奮精神。L-丙氨酸可提高 腌制品的腌制效果并改善風(fēng)味，提高含醇飲料的質(zhì)量等。L-丙氨酸具有獨(dú)特的改善風(fēng)味效 果，它與其它氨基酸配合能加強(qiáng)食品、飲料風(fēng)味。它還可以改善有機(jī)酸的酸味，添加后能使 有機(jī)酸更接近天然果酸的酸味。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-丙氨酸是合成維生素B6的重要原料，同時(shí) 也是營養(yǎng)劑補(bǔ)糖氨基酸營養(yǎng)輸液的主要成分。由L-丙氨酸組成的復(fù)合氨基酸注射液_《14 氨基酸注射液-800》是主治肝腦病新藥，可治療肝功能不全時(shí)氨基酸代謝紊亂，促使肝昏迷 病人蘇醒。L-丙氨酸還是一種很好的利尿藥。目前L-丙氨酸的生產(chǎn)是以天門冬氨酸為原料，通過酶催化技術(shù)(天冬氨酸脫羧 酶)來生產(chǎn)。由于天冬氨酸的生產(chǎn)是以順酐為原料的，因此L-丙氨酸的生產(chǎn)成本及售價(jià)嚴(yán) 重依賴于石油價(jià)格。目前國內(nèi)L-丙氨酸生產(chǎn)廠家均是使用酶催化技術(shù)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸和酶催化技術(shù)相比有諸多優(yōu)點(diǎn)首先，用葡萄糖代替 天冬氨酸作為生產(chǎn)原料。酶催化技術(shù)以天冬氨酸為原材料。目前天冬氨酸的生產(chǎn)是以順 酐為原料，順酐的資源緊張和價(jià)格高漲導(dǎo)致天冬氨酸的供給也存在著巨大的隱患。微生物 發(fā)酵法技術(shù)是以葡萄糖為原料。葡萄糖屬于可再生生物質(zhì)資源，目前主要是通過玉米淀粉 制得，將來可以從木質(zhì)纖維素中提煉，成本可以長期保持在穩(wěn)定的水平。利用葡萄糖為原材 料，既有很大的價(jià)格優(yōu)勢，又能長期維持價(jià)格的穩(wěn)定。其次，用微生物發(fā)酵法技術(shù)代替酶催化技術(shù)。酶催化技術(shù)需要對(duì)菌株進(jìn)行高密度 培養(yǎng)，分泌出生產(chǎn)L-丙氨酸所需的天冬氨酸脫羧酶。該過程對(duì)氧氣的需求量很大；另外，由 于天冬氨酸脫羧酶基因是克隆在質(zhì)粒上進(jìn)行高表達(dá)的，因此在菌株培養(yǎng)過程中，需要添加 抗生素來維持質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳復(fù)制。這些因素導(dǎo)致酶催化生產(chǎn)工藝復(fù)雜。微生物發(fā)酵法生 產(chǎn)工藝簡單，只需在起始階段往發(fā)酵罐中投加葡萄糖和無機(jī)鹽，并接入少量的菌種。另外， 微生物發(fā)酵法和酶催化技術(shù)相比，其最終發(fā)酵液中雜質(zhì)少很多，這既可以節(jié)約L-丙氨酸的 分離提取成本，也可以節(jié)約廢水處理的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過生物發(fā)酵法生產(chǎn)高濃度L-丙氨酸的大腸桿菌 (Escherichia coli)基因工程菌XZ-A26，該菌株保藏號(hào)為CGMCC No. 4036，其具有將糖類原料發(fā)酵產(chǎn)生高濃度L-丙氨酸的能力，其是通過將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨 酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除所得大腸桿 菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和 丙氨酸消旋酶基因，然后在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)而得的基因工程菌(如附

圖1)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述菌株的構(gòu)建方法，其包括下述步驟(I)L-丙氨酸脫氫酶基因的整合將大腸桿菌ATCC 8739的乳酸脫氫酶基因IdhA 擴(kuò)增并克隆到PEASY-Tl克隆載體上，得質(zhì)粒pXZ-AOl ；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗 糖轉(zhuǎn)移酶基因sacB的DNA片段連接至質(zhì)粒pXZ-AOl的DNA擴(kuò)增片段上，得到質(zhì)粒pXZ_A02 ； 將質(zhì)粒PXZ-A02的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC 8739，篩選卡那霉 素抗性的菌落，得菌株XZ-AOl ；將擴(kuò)增的L-丙氨酸脫氫酶基因連接至質(zhì)粒pXZ-AOl的DNA 片段，得到質(zhì)粒PXZ-A03 ；然后將質(zhì)粒pXZ-A03的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的 XZ-A01，培養(yǎng)篩選在蔗糖中不能生長的菌落，得菌株XZ-A02 ；(2)依次敲除上述所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基 因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除將菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因擴(kuò)增并 克隆到pEASY-Tl克隆載體上，得質(zhì)粒PXZ-A04 ；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移 酶基因sacB的DNA片段連接至質(zhì)粒pXZ_A04的DNA擴(kuò)增片段上，得到質(zhì)粒pXZ_A05 ；將質(zhì)粒 PXZ-A05的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有PKD46質(zhì)粒的菌株XZ-A02，篩選卡那霉素抗性的菌落， 得菌株XZ-A03 ；將質(zhì)粒PXZ-A04的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行磷酸化處理后自連得到質(zhì)粒pXZ-A06 ； 然后將質(zhì)粒PXZ-A06的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的XZ-A03，培養(yǎng)篩選在蔗糖中 不能生長的菌落，得菌株XZ-A04 ；乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲 除按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，分別以所得菌株XZ-A04、XZ-A06、XZ-A08和 XZ-AlO為起始原料，進(jìn)行乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋 酶基因的敲除，分別得到菌株XZ-A06、XZ-A08、XZ-AlO和XZ-A12 ；(3)在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)步驟(2)所得菌XZ-A12得到菌株XZ-A26。對(duì)大腸桿菌ATCC 8739的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)分析，設(shè)計(jì)出高效合成L-丙氨酸的 策略。為了使細(xì)胞能夠積累L-丙氨酸，需要進(jìn)行三個(gè)方面的改造(如附圖1)首先，需要 引入L-丙氨酸脫氫酶基因。L-丙氨酸脫氫酶能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化為L-丙氨酸，同時(shí)消耗一 個(gè)NADH。其次，需要敲除丙酮酸競爭途徑基因。由于丙酮酸在大腸桿菌中是一個(gè)關(guān)鍵的中 間代謝節(jié)點(diǎn)，因此需要將丙酮酸天然代謝途徑失活，從而使代謝流全部轉(zhuǎn)入L-丙氨酸的合 成。這些競爭途徑包括乳酸脫氫酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激 酶基因、富馬酸還原酶基因。第三，需要敲除L-丙氨酸降解途徑基因。L-丙氨酸在大腸桿 菌中能夠被丙氨酸消旋酶轉(zhuǎn)化為D-丙氨酸，這會(huì)大大降低L-丙氨酸的手性純度。因此需 要敲除丙氨酸消旋酶，避免D-丙氨酸的積累。L-丙氨酸工程菌株的構(gòu)建根據(jù)上述的設(shè)計(jì)方案，在大腸桿菌ATCC 8739的染色體上進(jìn)行基因的敲除和整
I=I O首先，將嗜熱脂肪地芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處，得到大腸桿菌XZ-A02。本發(fā)明所用到的序列如核苷酸序列表。通過PCR擴(kuò)增的方法，從嗜熱脂肪地芽孢桿菌的基因組DNA中擴(kuò)增出L-丙氨酸脫 氫酶基因。所用引物為alaD-F/alaD-R(序列1和2)。為了使L-丙氨酸脫氫酶基因能夠 在工程菌中高效、穩(wěn)定地表達(dá)，將其整合至大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處?；?因整合采用兩步同源重組的方法(如附圖2)。第一步，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序 列3和4)擴(kuò)增大腸桿菌的乳酸脫氫酶基因(IdhA)，擴(kuò)增產(chǎn)物包含乳酸脫氫酶編碼基因及其 上下游各500個(gè)堿基，并將其克隆到pEASY-Tl克隆載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司) 上，得到質(zhì)粒pXZ-AOl。第二步，以pXZ-AOl質(zhì)粒DNA為模板，使用引物ldhA-l/ldhA-2 (序 列5和6)擴(kuò)增出一段DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物包含pEASY-Tl載體和乳酸脫氫酶編碼基因上下 游的500個(gè)左右堿基。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB) 的DNA片段連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到質(zhì)粒pXZ-A02。第四步，以pXZ_A02質(zhì)粒DNA 為模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)擴(kuò)增出DNA片段I，用于第一次同源重 組。首先將PKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ATCC 8739，然后將DNA片段I電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的 大腸桿菌ATCC 8739，篩選卡那霉素抗性的菌落。經(jīng)過PCR驗(yàn)證，挑選一個(gè)正確的單菌落， 將其命名為XZ-A01。第五步，將L-丙氨酸脫氫酶基因連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到 質(zhì)粒pXZ-A03。第六步，以pXZ-A03質(zhì)粒DNA為模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down (序列3 和4)擴(kuò)增出DNA片段II，用于第二次同源重組。首先將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至XZ-AO1，然后將 DNA片段II電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的XZ-AO1，將其轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24小時(shí)后在含有6%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過PCR驗(yàn)證，挑選一個(gè)正確的單 菌落，將其命名為XZ-A02。本發(fā)明的L-丙氨酸工程菌株的構(gòu)建中所使用的質(zhì)粒及構(gòu)建如下 表1。表1 本發(fā)明的L-丙氨酸工程菌株的構(gòu)建中所使用的質(zhì)粒
權(quán)利要求
一種高產(chǎn)L 丙氨酸的XZ A26菌株，保藏號(hào)為CGMCC No.4036，其具有發(fā)酵產(chǎn)生高濃度L 丙氨酸的能力，其是通過將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L 丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)而得的基因工程菌。
2.權(quán)利要求1的保藏號(hào)為CGMCCNo. 4036的XZ-A26菌株的構(gòu)建方法，包括下述步驟 (I)L-丙氨酸脫氫酶基因的整合將大腸桿菌ATCC 8739的乳酸脫氫酶基因擴(kuò)增并克隆 到pEASY-Tl克隆載體上，得質(zhì)粒pXZ-AOl ；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶 基因sacB的DNA片段連接至質(zhì)粒pXZ-AOl的DNA擴(kuò)增片段上，得到質(zhì)粒pXZ_A02 ；將質(zhì)粒 PXZ-A02的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC 8739，篩選卡那霉素抗性 的菌落，得菌株XZ-AOl ；將擴(kuò)增的L-丙氨酸脫氫酶基因連接至質(zhì)粒pXZ-AOl的DNA片段，得 到質(zhì)粒pXZ-A03 ；然后將質(zhì)粒pXZ-A03的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的XZ-A01，培 養(yǎng)篩選在蔗糖中不能生長的菌落，得菌株XZ-A02 ；其中，乳酸脫氫酶基因IdhA的擴(kuò)增引物、 質(zhì)粒pXZ-A02的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒pXZ_A03的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列3 和序列4，質(zhì)粒pXZ-AOl的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列5和序列6，L-丙氨酸脫氫 酶基因擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列1和序列2 ；(2)依次敲除上述所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙 酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除將菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因擴(kuò)增并克隆 到pEASY-Tl克隆載體上，得質(zhì)粒PXZ-A04 ；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶 基因sacB的DNA片段連接至質(zhì)粒pXZ_A04的DNA擴(kuò)增片段上，得到質(zhì)粒pXZ_A05 ；將質(zhì)粒 PXZ-A05的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有PKD46質(zhì)粒的菌株XZ-A02，篩選卡那霉素抗性的菌落， 得菌株XZ-A03 ；將質(zhì)粒PXZ-A04的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行磷酸化處理后自連得到質(zhì)粒pXZ-A06 ； 然后將質(zhì)粒PXZ-A06的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的XZ-A03，培養(yǎng)篩選在蔗糖中 不能生長的菌落，得菌株XZ-A04;其中，丙酮酸甲酸裂解酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒pXZ-A05 的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒PXZ-A06的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列7和序列8，質(zhì)粒 PXZ-A04的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列9和序列10 ；乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除按 照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，以所得菌株XZ-A04為起始原料進(jìn)行乙醇脫氫酶基 因的敲除，得到菌株XZ-A06 ；然后以XZ-A06為原料進(jìn)行乙酸激酶基因的敲除，得到菌株 XZ-A08 ；再以XZ-A08為原料進(jìn)行富馬酸還原酶基因的敲除，得到菌株XZ-AlO ；再以XZ-AlO 為原料進(jìn)行丙氨酸消旋酶基因的敲除，得到菌株XZ-A12 ；其中，所用乙醇脫氫酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒PXZ-A08的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒 PXZ-A09的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列11和序列12，質(zhì)粒pXZ_A07的DNA擴(kuò)增引 物為核苷酸序列表中序列13和序列14 ；乙酸激酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒pXZ-All的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒pXZ-A12的DNA擴(kuò) 增引物為核苷酸序列表中序列15和序列16，質(zhì)粒ρΧΖ-ΑΙΟ的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表 中序列17和序列18 ；富馬酸還原酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒PXZ-A14的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒pXZ-A15的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列19和序列20，質(zhì)粒pXZ-A13的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列 表中序列21和序列22 ；丙氨酸消旋酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒PXZ-A17的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒pXZ_A18的DNA 擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列23和序列24，質(zhì)粒PXZ-A16的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列 表中序列25和序列26 ；(3)在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)步驟(2)所得菌XZ-A12得到菌株XZ-A26。
3.權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CGMCCNo. 4036的XZ-A26菌株在生產(chǎn)L-丙氨酸中的應(yīng) 用，其特征在于采用厭氧培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度為30-42°C，控制pH在6. 5-7. 5，在培養(yǎng)基中 培養(yǎng)保藏號(hào)為CGMCC No. 4036的XZ-A26菌株，分離提取L-丙氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述培養(yǎng)基中糖類原料包括葡萄糖、蔗 糖、果糖、木糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、木質(zhì)纖維素及其水解物和糖漿中的 一種或多種；氮源為無機(jī)含氮化合物，包括氯化銨、乙酸銨、硫酸銨和磷酸銨中的一種或多 種；微量無機(jī)鹽包括可溶性的鐵鹽、鈷鹽、銅鹽、鋅鹽、錳鹽和鉬酸鹽中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)L-丙氨酸的XZ-A26菌株，保藏號(hào)為CGMCC No.4036，其具有發(fā)酵產(chǎn)生高濃度L-丙氨酸的能力，其是通過將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)而得的基因工程菌。本發(fā)明還涉及該菌株的構(gòu)建方法及該菌株在制備L-丙氨酸中的應(yīng)用。本發(fā)明通過代謝工程的方法，構(gòu)建出能發(fā)酵生產(chǎn)高濃度L-丙氨酸的大腸桿菌CGMCC No.4036，利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的產(chǎn)量高達(dá)115g/L，適合工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101974476SQ20101027130
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者張學(xué)禮 申請人:安徽華恒生物工程有限公司