專利名稱：人miR-1826反義核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種microRNAOiiiRNA)的用途，尤其是涉及一種用于抑制人micr0RNA-1^6(miR-1826)表達(dá)的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用。該反義寡聚核苷酸可與人miR-1^6互補，從而抑制人miR-1^6的表達(dá)而起到抗腫瘤的作用。 本發(fā)明還涉及含有該miRNA反義寡聚核苷酸的藥物組合物。
背景技術(shù)：
miRNAs是小的非編碼RNA，長度為20-28bp，通常是由RNA聚合酶II(Pol II) 轉(zhuǎn)錄的，一般最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的 pri-miRNA。這些pri_miRNA在RNase III Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成 70個核苷酸組成的pre-miRNA前體產(chǎn)物。RAN-GTP和exportin 5將這種前體分子輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另一個RNaseIII Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個核苷酸長度的雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進入(miRISC)復(fù)合體中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的單鏈miRNA 保留在這一復(fù)合物中。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補的mRNA的位點通過兩種依賴于序列互補性的機制負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達(dá)。然而，最近也有證據(jù)表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種機制的miRNA結(jié)合位點通常在mRNA的3’端非翻譯區(qū)。如果miRNA與靶位點完全互補(或者幾乎完全互補)，那么這些miRNA的結(jié)合往往引起靶分子mRNA的降解。miRNAs在物種進化中相當(dāng)保守，在動物、植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的miRNAs表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時序性。目前，只有很小一部分miRNAs的生物學(xué)功能得到闡明。這些miRNAs調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和組織分化，與生物生長發(fā)育有關(guān)。一系列的研究表明miRNAs在細(xì)胞生長和凋亡、血細(xì)胞分化、同源異形盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生、胚胎后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。例如，miR-273參與線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程；miR-430 參與斑馬魚的大腦發(fā)育；miR-181控制哺乳動物造血細(xì)胞分化為B細(xì)胞；miR-375調(diào)節(jié)哺乳動物胰島細(xì)胞發(fā)育和胰島素分泌；miR-143在脂肪細(xì)胞分化起作用；miR-196參與了哺乳動物四肢形成；miR-1與心臟發(fā)育有關(guān)。另有研究人員發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)系統(tǒng)的miRNAs在大腦皮層培養(yǎng)中受到時序調(diào)節(jié)，表明其可能控制著區(qū)域化的mRNA翻譯。miRNA表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，并且這些基因可能起到腫瘤抑制基因或是癌基因作用。最先在B細(xì)胞慢性淋巴性白血病(CLL)中發(fā)現(xiàn)有miRNA表達(dá)水平的改變，隨后陸續(xù)在各種人類腫瘤中均檢測到miRNA表達(dá)水平的變化。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs與腫瘤形成相關(guān)，既能發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用(如miR-15a和miR-16-l)，又能起到癌基因的作用(如miR-155 和miR-17-92簇)。目前認(rèn)為，在腫瘤細(xì)胞中，有些miRNA成熟體或前體表達(dá)水平異常，而表達(dá)異常的miRNA通過影響靶mRNA翻譯發(fā)揮作用，參與腫瘤形成過程，并起重要作用。如 Ras原癌基因受let-7家族的調(diào)控，BCL2抗凋亡基因受miR-lfe-miR-16-l簇調(diào)控，E2F1轉(zhuǎn)錄因子受miR-17-92簇調(diào)控，BCL6抗凋亡基因受miR-127的調(diào)控等。miRNAs的表達(dá)下調(diào)也和腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，這預(yù)示著miRNA具有癌基因的功能。例如，miR-143和miR-1^6在結(jié)腸癌中明顯下調(diào)。有趣的是，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體分子在腫瘤和正常組織中含量相似，這表明，miRNAs的表達(dá)下調(diào)可能是由于其加工過程受到破壞。但是，miR-143和的腫瘤抑制基因功能可能不僅僅局限于結(jié)腸癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、淋巴癌等細(xì)胞系中其表達(dá)量也明顯下調(diào)。另一個報道表明，miR-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增加。這個基因在腫瘤組織中的表達(dá)量比在正常組織中高5-100倍。miRNAs是天然的反義作用因子，能夠調(diào)控與真核生物生存和增殖相關(guān)的多種基因。在腫瘤治療方面，miRNA的應(yīng)用前景光明。在利用miRNA作為治療靶點方面，已有實驗數(shù)據(jù)支持如在吉西他濱(gemcitabine)治療的過程中，出現(xiàn)miRNA表達(dá)譜的變化；調(diào)控部分miRNA的表達(dá)水平(如使miR-21過表達(dá))，能增進膽管癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。通過引入與具有癌基因特性的miRNA互補的合成的反義寡聚核苷酸——抗miRNA寡聚核苷酸 (AMOs)——可能有效的滅活腫瘤中的miRNAs，延緩其生長。臨床上，可以通過經(jīng)常的或者持續(xù)的2’ -0-甲基化或者鎖核酸(LNA)等修飾的反義寡聚核苷酸給藥使miRNA失活。這些修飾使得寡核苷酸更穩(wěn)定，比其他治療手段毒性更低。使用antagomirs (與膽固醇偶聯(lián)的 AMOs)，注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性，因而可能成為一種有希望的治療藥物。相反的，過表達(dá)那些具有腫瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7家族，也可以用于治療某些特定的腫瘤。反義寡聚核苷酸(Flanagan WM. Antisense comes of age. Cancer&Metastasis Reviews 1998 ;17(幻169-76)是指一段可以與其靶基因的堿基互補的核苷酸。反義寡聚核苷酸可以抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。人microRNA-1^6 (hsa-mir-1826)位于 16 號染色體，前體序列為 AUUGAUCAUCGAC ACUUCGAACGCAAUUGCAGCCCGG⑶UCCUCCCAGGGCUUUGCCU⑶CUGAGC⑶CGCUUGCCGAUCAGUAG，只含有一個成熟 microRNA :hsa-miR-1826 (序列為 AUUGAUCAUCGACACUUCGAACGCAAU)。Zhou等人在利用microarray研究5-FU和oxaliplatin (L-OHP)對結(jié)腸癌細(xì)胞株影響發(fā)現(xiàn)，miR-1^6在給抗癌藥后下調(diào)(Zhou, J. ,Y. Zhou, et al. 2009)。在其他腫瘤中還沒有關(guān)于miR-1^6的功能和表達(dá)水平的研究報道。近三十年，盡管臨床上腫瘤的綜合治療已很普遍，但以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療對腫瘤患者的生存率提高并不明顯，5年總體生存率仍然較低，徘徊在30% 55% 左右，并沒有顯著提高，中晚期患者的5年生存率更低，約為20%。而且這些方法都存在各自的局限性，特別是對中晚期和復(fù)發(fā)患者療效不佳，對伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者療效更差。因此，尋找更安全有效的治療途徑是提高腫瘤患者生存率和生存質(zhì)量所亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的主要問題就是提供一種新的miR-l^e的反義寡聚核苷酸(抑制劑)，用于高效、低毒或無毒地抑制miR-1^6的表達(dá)，進而治療與miR-1^6過度表達(dá)有關(guān)的疾病，包括各種實體腫瘤、各種白血病等。本發(fā)明要解決的另一問題就是提供上述反義寡聚核苷酸在制備治療miR-l^e過度表達(dá)的相關(guān)疾病的藥物中的用途。本發(fā)明要解決的再一問題是提供包含上述反義寡聚核苷酸的藥物組合物。本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，設(shè)計并合成了一種專一性針對miR-1^6的反義寡聚核酸，并在培養(yǎng)細(xì)胞中驗證具有抑制miR-1^6表達(dá)和抑制細(xì)胞生長的效果。研究顯示，這些反義核酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和惡性增殖能力。本發(fā)明設(shè)計了一種可以特異性結(jié)合于HiiR-IS^的反義核酸分子，在培養(yǎng)細(xì)胞 U87/MG中，驗證對miR-1^6表達(dá)特異性抑制的反義核酸對細(xì)胞生長能力、增殖能力的影響。反義核酸分子長度可以包含13 27個核苷酸殘基，均有不同程度的抑制人腫瘤細(xì)胞生長能力、增殖能力的特性，其中最短的反義核酸長度為13個堿基，不同長度的反義核酸均具有良好的腫瘤細(xì)胞生長及增殖抑制活性。因此，上述反義核酸均可用來制備抑制腫瘤細(xì)胞生長能力、增殖能力的制劑，其中優(yōu)選miR-1^6高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明的第一方面，提供了一種miR-l^e的反義寡聚核苷酸，所述反義寡聚核苷酸抑制人細(xì)胞內(nèi)miR-1^6的表達(dá)。通常，所述反義寡聚核苷酸與5’-AUUGAUCAUCGACACUUC GAACGCAAU-3’中連續(xù)13 27個核苷酸序列互補。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述反義寡聚核苷酸的長度為18 23個核苷酸。更佳地，所述反義寡聚核苷酸的序列為5’-AUU GC⑶UCGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3’。從目前來看，核酸雜交中RNA與miRNA的雜交親和力比DNA與miRNA雜交的親和力要高，具有很高的藥用價值。但是人工合成DNA的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)比合成RNA的成本低，也具有很好的市場潛力。而且也可以采用核糖RNA單體與脫氧核糖DNA單體嵌合相連而成的反義核酸作為藥物進行開發(fā)。本發(fā)明設(shè)計的一系列反義寡聚核苷酸分子，既可以是DNA，也可以是RNA，還可以是DNA與RNA的嵌合體。上述分子均具有抑制miR_1^6表達(dá)的活性。本發(fā)明設(shè)計的反義核酸，其序列具有特異性生物學(xué)活性，其對于某一基因互補的位點的反義核酸所互補的長度有很大關(guān)系，如互補的長些，則生物學(xué)活性會更高些，抑制效果也會更好一些，在增加或減少一個至數(shù)個堿基而互補于同一基因位點的反義核酸，同樣也具有不同程度的生物學(xué)活性，也可達(dá)到不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞生長與增殖的作用。本發(fā)明的研究表明，最短可達(dá)13個堿基仍然具有抑制miR-1^6表達(dá)的作用。反義核酸研究中，各種化學(xué)修飾方法很多。本發(fā)明采用選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種組合修飾的反義核酸，硫代、甲氧修飾方式的反義核酸的藥理學(xué)、藥代動力學(xué)、毒理學(xué)等臨床前研究是各種化學(xué)修飾反義核酸中研究最為全面的，修飾的反義核酸在體內(nèi)可以有效地防止人體內(nèi)大量核酸外切酶對反義核酸的酶切而降解，從而避免反義核酸失去應(yīng)有的生物學(xué)活性。此外硫代反義核酸還可激發(fā)RNA酶的活性，降解與其雜交的RNA鏈，因此優(yōu)選這兩種修飾方式的反義核酸在實驗中應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)明確的是，任何能夠增加反義核酸穩(wěn)定性和生物利用度的修飾方法都可以應(yīng)用，如膽固醇修飾、PEG修飾等。優(yōu)選本發(fā)明反義核酸修飾選自硫代修飾、2’ -甲氧基修飾和膽固醇修飾中的一種或幾種。最優(yōu)選采用如下修飾方式所有核苷酸進行2’ -甲氧基修飾，并且5’端兩個核苷酸進行硫代修飾，3’端四個核苷酸進行硫代修飾并且在5’或者3’端連接膽固醇。本發(fā)明的上述反義核酸具有抑制miR-1^6表達(dá)的效果。當(dāng)將上述反義核酸轉(zhuǎn)染到表達(dá)miR-1^6的細(xì)胞株U87/MG中后，能夠有效抑制U87/MG細(xì)胞的生長和惡性增殖能力。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全治療有效量的本發(fā)明寡聚核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類給藥載體包括但不限于各種可用于核酸給藥的載體，如脂質(zhì)體、可降解的高分子化合物、鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性且可被人和/或動物所接
受的量。所述“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明的反義寡聚核苷酸的用途，用于制備治療以下疾病的藥物治療人體與miR-1^6過表達(dá)有關(guān)的疾病，包括各種實體腫瘤(特別是腦膠質(zhì)瘤)、各種白血病等。如本文所用，“反義寡聚核苷酸”指反義的核苷酸寡聚物。反義寡聚核苷酸通過堿基互補(A-T，A-U, G-C)配對與雙鏈DNA形成三鏈(反基因)，或與單鏈RNA形成雜交雙鏈 (反義)，從而阻斷基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后mRNA的加工和翻譯。同時，雙鏈RNA能被細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸酶H(RNaseH)所降解，從而更有效地阻斷靶基因的表達(dá)。由于反義核苷酸只能與反向互補的靶序列結(jié)合，具有專一性高，副作用小的特點。本發(fā)明的反義寡核苷酸的長度沒有特別限制，一般來說，為了達(dá)到雜交的專一性， 反義寡聚核苷酸需要至少13個單體組成的核苷酸。通常反義寡聚核苷酸的長度為13 !35bp，對于miRNA來說，較佳的為18 27bp。


圖1顯示了 miR-1^6反義寡聚核苷酸抑制腫瘤細(xì)胞U87/MG細(xì)胞中miR_1^6的表達(dá)，圖IA D中三線條是重復(fù)試驗的結(jié)果。A為轉(zhuǎn)染miR-1^6反義寡聚核苷酸(5’_AUU GCGUUCGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3’)后的表達(dá)情況，B為轉(zhuǎn)染陰性對照反義寡聚核苷酸(5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)后 miR_1^6 的表達(dá)情況；C 為轉(zhuǎn) miR_1^6 反義寡聚核苷酸后內(nèi)參基因U6的表達(dá)情況；D為轉(zhuǎn)染陰性對照反義寡聚核苷酸后內(nèi)參基因U6的表達(dá)情況；E為miR-1^6在轉(zhuǎn)染反義寡聚核苷酸后抑制效果柱狀圖，橫坐標(biāo)為所檢測的樣品， 其中“抑制劑”表示轉(zhuǎn)染miR-1^6反義寡聚核苷酸后的miR-1^6表達(dá)情況，“陰性對照”表示轉(zhuǎn)染陰性對照后miR-1^6表達(dá)情況。圖2顯示了 miR-1^6反義寡聚核苷酸抑制腫瘤細(xì)胞U87/MG細(xì)胞的生長和增殖， A，B為轉(zhuǎn)染了 FAM標(biāo)記的陰性對照后的U87/MG細(xì)胞；C為轉(zhuǎn)染陰性對照后U87/MG細(xì)胞狀態(tài)；D 為轉(zhuǎn)染 miR-1^6 反義寡聚核苷酸(5，-AUUGC⑶UCGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3，)后 U87/ MG細(xì)胞狀態(tài)。
具體實施例方式本發(fā)明的反義寡聚核苷酸，其序列與5，-AUUGAUCAUCGACACUUCGAACGCAAU-3，中連續(xù)13 27個核苷酸序列互補，并且亦不與其他基因的RNA序列互補。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述反義寡聚核苷酸的序列為5 ’ -AUUGCGUUCGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3 ’。本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸可以為修飾產(chǎn)物，它含有至少兩個，通常至少4個，較佳的至少6個， 更佳的至少8個核苷酸沒有毒性副作用的修飾的核苷酸，所述修飾方式包括2’ -位甲氧基取代、硫代修飾等。為了增加反義寡聚核苷酸的細(xì)胞攝取率，還可以在上述修飾的基礎(chǔ)上對CN 102382825 A
說明書
5/8
反義寡聚核苷酸進行膽固醇修飾或者PEG化修飾。上述修飾后的寡聚核苷酸能繼續(xù)與靶序列有效配對，而且比普通的未經(jīng)修飾的核糖核酸或者脫氧核糖核酸在體內(nèi)具有更長的半衰期。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、反義寡聚核苷酸作用于特異性的靶位點，非特異性結(jié)合的位點很少，專一性尚；2、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，具有毒性低、副作用小和半衰期長等特點；3、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸具有很好的抑制效果，對miR-1^6的表達(dá)的抑制率達(dá)到95%以上，對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率接近40%。下面將結(jié)合實施例及附圖進一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明的范圍。實施例首先，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成反義寡聚核苷酸，序列為5’ -AUUGCGUU CGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3’。在實施例中涉及的所用序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。實施例1、miR-1826反義核酸抑制miR_1^6的表達(dá)進行實時定量熒光檢測，其中涉及的寡聚核苷酸序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，具體實驗步驟包括細(xì)胞培養(yǎng)U87/MG細(xì)胞(購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)，10% FBS-DMEM 培養(yǎng)基(FBS 購自 Hyclone, DMEM 購自 Gibco)培養(yǎng)，37°C ,5% CO2 培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染1)轉(zhuǎn)染前一天，在M孔板中用適量不含抗生素的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的匯合度達(dá)到30 50% ；2)轉(zhuǎn)染樣品按照如下方法準(zhǔn)備寡聚物-Lipofecta mine 2000復(fù)合物a.用50μ 1不含血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基(Gibco)分別稀釋 miR-1826 反義寡聚核苷酸(5，-AUUGC⑶UCGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3，)、陰性對照 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’)、FAM標(biāo)記的陰性對照，終濃度為50nM，輕輕混勻，每個轉(zhuǎn)染設(shè)3個復(fù)孔；b.使用前輕輕混勻 Lipofecta mine 2000 (Invitrogen)，然后取 2 μ 1 稀釋到 50 μ 1的Opti-MEM I培養(yǎng)基中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；c.孵育5min后，稀釋的Lipofecta mine 2000分別與稀釋的反義核苷酸及對照混合，輕輕混勻后在室溫下孵育20min，以允許復(fù)合物的形成；3)將復(fù)合物加入到每一個包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合；4)37°C,5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)Mh?？俁NA 提取1)離心收集細(xì)胞，往離心管中加入500 μ 1 Ezoianvitrogen)，將離心管上下顛倒混勻，室溫放置IOmin。
2)加入200 μ 1 RNA專用的三氯甲烷(上海生工)，劇烈上下顛倒混勻，直至離心管中的液體徹底混勻，成乳白色狀。3)室溫放置 5min，12000rpm 離心 15min。4)小心將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈的1. 5ml離心管中，避免吸動中層蛋白相和下層有機相。5)往上清中加入500 μ 1預(yù)冷的RNA專用的異丙醇(上海生工)，室溫放置5min。 IOOOOrpm 離心 IOmin06)小心棄盡上清，加入Iml RNA專用的75 %的乙醇(上海生工)洗滌沉淀， IOOOOrpm 離心 IOmin07)小心棄盡上清，置于室溫晾干乙醇，每管加入20 μ 1 DEPC水溶解，混勻。RNA 逆轉(zhuǎn)錄將上述抽提得到的RNA分別用U6和hsa-miR-1^6兩種RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA模板。逆轉(zhuǎn)錄中所用的緩沖液和酶均為!Iomega公司產(chǎn)品；引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，miR-1^6RT引物5，-GTCGGGTCCAGAGCAGGGTCCGAGGTACA CGTTCGCTCTGGACCCGACATTGCGTTCG-3’。(i).逆轉(zhuǎn)錄體系
試劑名稱用量/管5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μ1RT Primer Mix1.25μ1(U6，hsa-miR-1826) (ΙμΜ)dNTP (IOmM)0.75μ1RNA2μ1RTase (200/μΙ)0.5μ1DEPC H2O至 20μ1(ii).逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件反應(yīng)條件為26°C30min ；42°C 30min ；85°C IOmin0熒光定量PCR檢測(l).cDNA模板的稀釋將上述逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA稀釋3倍，往20 μ 1的體系中加入40 μ 1無RNase/ DNase 的 ddH20，混勻。(2).熒光定量PCR體系(引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司 ^ ；miR-1826FP ^ 5' -TCCGCATTGATCATCGACA-3 ‘ ；miR-1826RP ^ 5， -CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3’ )
試劑名稱用量/管2XPCR Master Mix10 μ 1F Primer(20 μ Μ)0. 2μ 1R Primer(20 μ Μ)0. 2μ 1模板2μ 1rTaq DNA 聚合酶(5U/ul)0. 2μ 1(WH2O加至20 μ 1(3).反應(yīng)條件(i)95°C 3min ；(ii)95°C 30s ；(iii)62°C 40s ；(iv)72°C 30s ；第i i至第iν步共40個循環(huán)。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明反義寡聚核苷酸具有很好的抑制效果。圖1顯示了 miR-1^6反義寡聚核苷酸抑制腫瘤細(xì)胞U87/MG細(xì)胞中miR-1^6的表達(dá)，圖IA D中三線條是重復(fù)試驗的結(jié)果。A為轉(zhuǎn)染miR-1^6反義寡聚核苷酸(5’ -AUUGCGUUCG AAGU⑶CGAUGAUCAAU-3’ )后的表達(dá)情況，B為轉(zhuǎn)染陰性對照反義寡聚核苷酸 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)后 miR_1^6 的表達(dá)情況；C 為轉(zhuǎn) miR_1^6 反義寡聚核苷酸后內(nèi)參基因U6的表達(dá)情況；D為轉(zhuǎn)染陰性對照反義寡聚核苷酸后內(nèi)參基因U6的表達(dá)情況；E為miR-1^6在轉(zhuǎn)染反義寡聚核苷酸后抑制效果柱狀圖，橫坐標(biāo)為所檢測的樣品，其中“抑制劑”表示轉(zhuǎn)染miR-1^6反義寡聚核苷酸后的miR-1^6表達(dá)情況，“陰性對照”表示轉(zhuǎn)染陰性對照后miR-1^6表達(dá)情況。結(jié)果顯示反義寡聚核苷酸對miR-1^6的表達(dá)具有明顯的抑制作用。實施例2、miR_1^6反義寡聚核苷酸對人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87/MG抑制活性檢測其中涉及的寡聚核苷酸序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。細(xì)胞培養(yǎng)U87/MG細(xì)胞(購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)，10% FBS-DMEM培養(yǎng)基(FBS購自Gibco，DMEM購自Hyclone)培養(yǎng)，37°C，5% CO2培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的 U87/MG細(xì)胞，離心計數(shù)，以2X IO3每孔鋪于96孔板內(nèi)，37°C,5% CO2培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染1)轉(zhuǎn)染前一天，在96孔板中用適量不含抗生素的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的匯合度達(dá)到30 50% ；2)轉(zhuǎn)染樣品按照如下方法準(zhǔn)備寡聚物-Lipofecta mine 2000復(fù)合物
a.用25 μ 1不含血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基(Gibco)分別稀釋 miR-1826 反義寡聚核苷酸(5，-AUUGC⑶UCGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3，)、陰性對照 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)、FAM標(biāo)記的陰性對照，加入孔內(nèi)后終濃度為50nM，輕輕混勻，每個轉(zhuǎn)染設(shè)3個復(fù)孔；b.使用前輕輕混勻 Lipofecta mine 2000 (Invitrogen)，然后取 0. 25 μ 1 稀釋到 25 μ 1的Opti-MEM I培養(yǎng)基，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；c.孵育5min后，稀釋的Lipofecta mine 2000分別與稀釋的反義核苷酸及對照混合，輕輕混勻后在室溫下孵育20min，以允許復(fù)合物的形成；3)將復(fù)合物加入到每一個包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合；反義核苷酸及對照的終濃度為50nM。4) 37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育72小時后，顯微鏡觀察U87/MG細(xì)胞，照相。如圖2所示，轉(zhuǎn)染72小時后，超過80 %的U87/MG細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了 FAM標(biāo)記的陰性對照(圖A，B)；轉(zhuǎn)染陰性對照后，U87/MG細(xì)胞完整，透光性強(圖C)；而轉(zhuǎn)染反義寡聚核苷酸后大部分U87/MG細(xì)胞死亡(圖D)?；贛TT的細(xì)胞毒性實驗向上一步驟中得到的細(xì)胞，加入配制好的MTT(Sigma)5mg/ml(用0.9%的生理鹽水配制)，每孔加入20 μ 1，37°C，5% CO2孵育4小時后吸去培養(yǎng)基及MTT，每孔加入DMSO 100 μ 1并通過酶標(biāo)儀讀取0D570-0D630的吸光度值
權(quán)利要求
1.一種反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸包含與5’ -AUUGAUCAUCGAC A⑶UCGAACGCAAU-3’中連續(xù)13 27個核苷酸序列互補的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸包含序列5 ’ -AUUGC⑶UCGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3’。
3.如權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸進一步被修飾。
5.如權(quán)利要求4所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述修飾選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合。
6.如權(quán)利要求5所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述修飾選自硫代修飾、2’-甲氧基修飾和膽固醇修飾中的一種或幾種。
7.如權(quán)利要求6所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所有核苷酸進行2’-甲氧基修飾，并且5’端兩個核苷酸進行硫代修飾，3’端四個核苷酸進行硫代修飾并且在5’或者3’ 端連接膽固醇。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項所述的反義寡聚核苷酸用于制備治療過度表達(dá)的相關(guān)疾病的藥物的用途。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述miR-1^6過度表達(dá)的相關(guān)疾病為腦膠質(zhì)瘤。
10.一種藥物組合物，其特征在于，含有治療有效量的權(quán)利要求1 7中任一項所述的反義寡聚核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種抑制microRNA-1826表達(dá)的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用。該反義寡聚核苷酸特異性結(jié)合于人miR-1826，包含與5’-AUUGAUCAUCGACACUUCGAACGCAAU-3’核苷酸序列中至少13個連續(xù)核苷酸互補的序列,特別是序列5’-AUUGCGUUCGAAGUGUCGAUGAUCAAU-3’。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸可為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體，并可對鏈中任一核苷酸進行修飾。本發(fā)明的miR-1826反義寡核苷酸能夠有效抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-1826表達(dá)，抑制其生長和增殖，從而有效治療腦膠質(zhì)瘤及其他miR-1826高表達(dá)的腫瘤。
文檔編號C12N15/113GK102382825SQ20101027112
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者丁侃, 東楠, 張佩琢, 李捷, 沈孝坤 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所, 蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司