專利名稱：蛭弧菌混合體作為殺菌劑在清洗水果中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛭弧菌混合體的應(yīng)用，特別是一種在消除水果表面及其加工環(huán)境中攜 帶的致病菌的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水果含有人類生存所必須的豐富營(yíng)養(yǎng)。雖然食用蔬菜在很大程度上可以代替水 果，但始終不能夠完全代替，因?yàn)樗麪I(yíng)養(yǎng)成分畢竟與蔬菜不盡相同。所以說水果的食用對(duì) 人體營(yíng)養(yǎng)的全面攝入十分重要。經(jīng)常食用各種水果是保證人體營(yíng)養(yǎng)良好和體內(nèi)物質(zhì)平衡的 重要手段之一。隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)水果的食用，不再僅僅滿足于原始的食用方法， 對(duì)水果的深加工產(chǎn)品，如果汁、果醬、果酒、蜜餞，的使用數(shù)量及質(zhì)量的要求也越來越高。然而水果在栽培、采收、整理加工、運(yùn)輸過程易受到細(xì)菌的污染，因此在進(jìn)行水果 的加工中，如何將大量的水果清洗干凈，快速輸送于下步加工工序中，是保證產(chǎn)品質(zhì)量、生 產(chǎn)效率的關(guān)鍵一步。目前，水果的工業(yè)化清洗過程，主要是采用物理清洗和化學(xué)殺菌劑配合的方式進(jìn) 行，首先根據(jù)水果的不同類型選擇不同的清洗設(shè)備，比如DT5A1型清洗機(jī)、鼓風(fēng)式清洗機(jī)、 XGJ-2型清洗機(jī)，主要原理是水果與清洗水之間的摩擦與相互作用，同時(shí)輔助于刷輥，將水 果表面污物洗凈；其次選擇適合的清洗劑，現(xiàn)市場(chǎng)上銷售的清洗劑種類很多，有洗滌、去污 作用的，有殺菌功能的，傳統(tǒng)的清洗方法對(duì)除去果蔬中的泥土效果雖好，但對(duì)微生物清除效 果不明顯。目前使用的水果殺菌劑多為氯系殺菌劑，但此類不僅不能殺滅水果表面存在微 生物比如大腸桿菌、沙門氏菌、單核李斯特菌、金黃色葡萄球菌等而且還會(huì)與食品中某些成 份反應(yīng)生成氯化物，對(duì)人體產(chǎn)生危害，清洗過后的廢水中含有由于氯的殘留與水中有機(jī)物 反應(yīng)生成的三氯甲烷，不僅污染水體、大氣，還會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生致癌作用。因此研發(fā)一種新型殺菌劑用于水果的清洗，以保證水果加工與食用的安全，是十 分必要的。蛭弧菌(Bdellovibrio sp)是由Stolp和Petzhold從菜豆葉燒病假單胞菌 ATCC11355中分離發(fā)現(xiàn)的一類以攻擊和裂解其它細(xì)菌來完成自身生長(zhǎng)和繁殖的寄生菌。蛭 弧菌具有類似噬菌體的功能，由于其廣泛的宿主范圍、較強(qiáng)的致病菌裂解活性以及幾乎無 抗蛭弧菌的細(xì)菌突變株存在等因素。已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無論是 在食品工業(yè)還是在(海洋)水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，蛭弧菌的應(yīng)用均是安全的。例如在國外， Lenz and Hespell (1978)研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌及對(duì)動(dòng)物及人的細(xì)胞不具侵染性[Lenz R. ff., Hespell R. B. Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells. ArchivesofMicrobiology, 1978,119 (3) :245_248]。在國內(nèi)，林茂等(2006)研究了 蛭弧菌對(duì)魚類細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)它對(duì)魚類細(xì)菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬， 邱軍強(qiáng)。蛭弧菌BDH2102對(duì)魚類細(xì)胞及病原菌的作用。微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(1) :7_11]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種蛭弧菌混合體菌液在消除 水果表面及其加工環(huán)境中攜帶的致病菌的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種蛭弧菌，該菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDM01，由中國典型培養(yǎng)物保藏 中心保藏，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M208066，保藏日期為2008年4月28日。所述蛭弧菌BDM01 (CCTCC M208066)由蛭弧菌 BDJ01 (CCTCCM208011)進(jìn)行紫外 誘變得到，對(duì)其進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察該蛭弧菌呈單細(xì)胞，弧形，大小為 1.7X1.0U m，端生鞭毛，鞭毛長(zhǎng)度為3. 5 y m ；將其以雙層平板法于28°C培養(yǎng)三天可形成直 徑3-4mm的透明圓形噬菌斑。蛭弧菌BDM0混合體1作為殺菌劑在清洗水果中的應(yīng)用，將蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體 的混合體菌液作為殺菌劑添加在清洗用水中，然后對(duì)水果進(jìn)行清洗。優(yōu)選地，所述蛭弧菌混合體菌液在清洗用水中的濃度至少為10pfu/mL。所述的蛭弧菌混合體菌液為蛭弧菌游泳體與蛭質(zhì)體的混合優(yōu)選采用發(fā)酵方法進(jìn) 行制備，具體步驟如下(1)所述蛭弧菌蛭質(zhì)體為蛭弧菌存在于宿主菌內(nèi)的狀態(tài)，通過以下方法制備在 含有10mL 10lclcfu/mL嗜水氣單胞菌的100mL DNB(dilute nutrientbroth)液體培養(yǎng)基(營(yíng) 養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于1000mL蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6)中接入 10mL 103pfu/mL 蛭弧菌 BDM01，于 25 35°C、150 300rpm 培養(yǎng) 36 48h， 得到含蛭弧菌蛭質(zhì)體和蛭弧菌游泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液經(jīng)4°C 6000 8000rpm離心15 20min后，去除含蛭弧菌游泳體的上清，得到的沉淀即是蛭弧菌蛭質(zhì)體；(2)所述蛭弧菌游泳體為蛭弧菌游離在宿主菌外部的狀態(tài)，通過以下方法制備 將蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳體；(3)將得到的蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體分別用5mL DNB液體培養(yǎng)基、無菌水、生理鹽 水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮后混合，得到蛭弧菌混合體菌液。優(yōu)選地，所述步驟(3)中蛭弧菌游泳體和蛭弧菌蛭質(zhì)體按細(xì)菌數(shù)1 1的比例混
口 O優(yōu)選地，所述蛭弧菌混合體菌液在清洗用水中的濃度為101 106pfu/mL。優(yōu)選地，將蛭弧菌混合體菌液加入清洗用水中，所述蛭弧菌混合菌的濃度范圍為 101 106pfu/mL。優(yōu)選地，清洗時(shí)先將水果放入蛭弧菌混合體菌液中浸泡20 40min，以消除水果 中的致病菌。蛭弧菌BDM01作為殺菌劑在清洗水果加工環(huán)境中的應(yīng)用，將蛭弧菌混合體菌液 作為殺菌劑噴灑在水果加工環(huán)境中，使蛭弧菌混合菌的濃度至少達(dá)到10pfU/mL，使用量為 30-50mL/m2;水果加工環(huán)境包括水果的加工車間、清洗設(shè)備及水果的傳送帶及水果加工設(shè)備等。所述致病菌為大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡 萄球菌(Staphylococcus aureus)、單核李其jf特菌(Listeriamonocytogenes)等。所述沙門氏菌包括鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)和豬霍亂沙門氏菌(Salmonella cholerae-suis)。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果1、本發(fā)明蛭弧菌混合體菌液(游泳體蛭質(zhì)體=1 1)在消除水果攜帶的致病 菌上效果顯著，如圖1，對(duì)致病菌的消除率達(dá)到95 %以上。2、在水果加工前用蛭弧菌混合體菌液消除水果表面致病菌安全性好蛭弧菌消除水果攜帶的致病菌的方法是生物的方法，蛭弧菌可侵染、裂解宿主細(xì) 菌的特性使之適合作為抑止或清除生物體及其環(huán)境中致病菌的生物凈化因子，且其在裂解 完宿主細(xì)菌后，會(huì)因饑餓而自動(dòng)消亡，因此對(duì)人和動(dòng)物無毒副作用。不僅可提高消費(fèi)者生食 水果的安全系數(shù)，保護(hù)消費(fèi)者的健康，也為水果的綠色加工生產(chǎn)提供保障。3、本發(fā)明為消除水果所攜帶的食源性致病菌提供一種新的方法，并適合推廣應(yīng)用 于水果的從農(nóng)田到餐桌的整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈，特別有利于減少或消除化學(xué)藥物如殺菌劑的殘留， 確保水果的優(yōu)質(zhì)，從根本上避免水果食物中毒事件的發(fā)生，保證消費(fèi)者的健康。4、用蛭弧菌混合體菌液作為殺菌劑來對(duì)水果進(jìn)行清洗，兼具游泳體起效快，活力 強(qiáng)和蛭質(zhì)體制備、保存容易，殺菌作用時(shí)間更久和環(huán)境耐受力更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為蛭弧菌游泳體，蛭質(zhì)體及其不同比例組合的混合菌在10pfu/mL的濃度時(shí)消 除葡萄表面攜帶五種致病菌的試驗(yàn)效果比較圖。圖2為蛭弧菌游泳體，蛭質(zhì)體及其不同比例組合的混合菌在10、102、103、105pfu/ mL，消除葡萄表面致病菌效果比較圖。圖3為蛭弧菌游泳體，蛭質(zhì)體及其不同比例組合的混合菌在10pfu/mL的濃度時(shí)消 除新鮮紅棗表面攜帶五種致病菌的試驗(yàn)效果比較圖。圖4為蛭弧菌游泳體，蛭質(zhì)體及其不同比例組合的混合菌在10、102、103、105pfu/ mL，消除新鮮紅棗表面致病菌效果比較圖。圖5為清洗用水中加入不同的殺菌劑后殺菌效果比較圖。圖6為lObfii/ mL蛭弧菌混合體菌液對(duì)加工環(huán)境、加工與清洗設(shè)備的殺菌效果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。所述方法對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、志賀菌、單核李斯特菌、金黃色葡萄球菌等致病 菌均有效，但為實(shí)驗(yàn)結(jié)果及圖表數(shù)據(jù)表達(dá)清晰，致病菌以大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃 色葡萄球菌、單核李斯特菌為例。實(shí)施例1葡萄表面常見致病菌的消除(1)消除葡萄表面致病菌的蛭弧菌混合體菌液的制備所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDM01于2008年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M208066 ；
所述蛭弧菌BDM01由蛭弧菌BDJ01進(jìn)行紫外誘變得到，對(duì)其進(jìn)行負(fù)染后于電子顯 微鏡下形態(tài)觀察蛭弧菌BDM01呈單細(xì)胞，弧形，大小為1. 7 XL Oil m，端生鞭毛，鞭毛長(zhǎng)度 為3. 5 y m ；將其以雙層平板法于28°C培養(yǎng)三天可形成直徑3_4mm的透明圓形噬菌斑。蛭弧菌蛭質(zhì)體的制備在1個(gè)裝有l(wèi)OOmL NB(Nutrient broth)液體培養(yǎng)基的錐 形瓶中接種10mL 101Qcfu/mL嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，購于廣東省微生物所 菌種保藏中心，編號(hào)GIM1. 172)，200rpm、28°C搖床培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)液于4°C、5000rpm離 心15min，棄上清。沉淀菌體用5mL無菌水重新懸浮，之后加入到1個(gè)裝有100mL DNB液體 培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于1000mL蒸餾水中， pH值為7. 2 7. 6)的錐形瓶中，再加入濃度為10mL 103pfu/mL蛭弧菌BDM01菌液。恒溫 搖床250rpm、28°C培養(yǎng)36h。培養(yǎng)液于4°C 6000rpm離心20min，去除含蛭弧菌游泳體的上 清，保留沉淀(即蛭弧菌蛭質(zhì)體)，加入5mL生理鹽水懸浮蛭弧菌蛭質(zhì)體，得到濃度在105 108pfu/mL ；蛭弧菌游泳體的制備將蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng) 16000rpm離心20min后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳體，加入5mL DNB液體培養(yǎng)基懸浮蛭弧 菌游泳體，制得濃度105 1012pfu/mL。A、B、C、D、E以下五組實(shí)驗(yàn)菌液菌液A為濃度為10xpfu/mL的蛭弧菌BDM01蛭質(zhì)體菌液，X = 1、2、3、5。菌液B為濃度為10x pfu/mL的蛭弧菌BDM01游泳體菌液，X = 1、2、3、5。菌液C由菌液A和菌液B按細(xì)菌數(shù)1 1混合組成；菌液D由菌液A和菌液B按細(xì)菌數(shù)1 2混合組成；菌液E由菌液A和菌液B按細(xì)菌數(shù)2 1混合組成；(2)葡萄攜帶的常見致病菌的制備于4瓶各含100mL普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分別接種10mL X 1010cfu/mL大腸 桿菌(Escherichia coli，購于廣東省微生物研究所，編號(hào)GIM1. 137)、鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium,購于廣東省微生物研究所，編號(hào)GIM1. 237)、單核李斯特菌 (Listeria monocytogenes，購于廣東省微生物研究所，編號(hào)GIM1. 228)和金黃色葡萄球 菌(Staphylococcusaureus，購于廣東省微生物研究所，編號(hào)GIM1. 142)，搖床培養(yǎng)，160rpm 28°C，培養(yǎng)12-16h。增殖培養(yǎng)液經(jīng)6000rpm、4°C離心20min，棄上清液，沉淀菌體用5mL無菌 PH7. 2的PBS (磷酸鹽緩沖溶液)懸浮，得到濃度為109cfu/ml的原液，最后制備上述四種菌 的混合液，使混合液中每種菌的終濃度為103cfu/ml。(3)將蛭弧菌作為殺菌劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)殺菌劑加入加工前清洗水果的水體中用于消除 水果攜帶的致病菌。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。所有對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的葡萄先經(jīng)75%酒精殺菌后浸泡到步驟(2)制備好的混合 體菌液中l(wèi)min，取出后浙干，然后對(duì)照組取三個(gè)平行樣，25g/樣，將葡萄浸泡在中清洗用水中，浸泡30min ；實(shí)驗(yàn)組將葡萄浸泡在清洗用水中，水中添加作為殺菌劑的蛭弧菌混合體菌液，并 使?jié)舛冗_(dá)到10pfu/mL(即上述X= 1)，浸泡30min，每小組設(shè)三個(gè)平行樣，25g/樣。然后檢 測(cè)菌落總數(shù)，致病菌的數(shù)目。
102、103、105pfu/mL的蛭弧菌混合體菌液依照上述方案添加殺菌。檢測(cè)方法取葡萄，放入無菌絞碎機(jī)中，同時(shí)加入50mL的無菌磷酸鹽緩沖液，攪 碎，葡萄攪碎后取出10mL混合液放于無菌離心管中。根據(jù)國標(biāo)4789. 38-2008大腸桿菌用 VRB-MUG(中性紅-膽鹽培養(yǎng)基)培養(yǎng)基檢測(cè)、根據(jù)國標(biāo)4789. 4-2010沙門氏菌用BS (亞硫 酸鉍瓊脂)培養(yǎng)基檢測(cè)、根據(jù)國標(biāo)4789. 30-2010單核李斯特菌用李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基檢 測(cè)、根據(jù)國標(biāo)4789. 10-2010金黃色葡萄球菌用Baird-Parker瓊脂平板檢測(cè)。由圖1可知，蛭弧菌在10pfu/mL濃度，致病菌消除率均可達(dá)到95%以上，但是不同 的組合消除效果也是有差別的，30min實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，菌液C作用組致病菌幾乎檢測(cè)不到，即 完全消除，而D、E組仍可檢測(cè)到致病菌的數(shù)目為2-3cfu/mL，A、B組則要更高一點(diǎn)，上述實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明蛭弧菌游泳體與蛭質(zhì)體1 1的混合液對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核李斯 特菌、金黃色葡萄球菌消除率均可達(dá)到99%以上。由圖2所示，圖中1、2、3、5分別代表10、102、103、105pfu/mL(即上述X分別為1、2、 3、5)，因此可知致病菌的消除率隨著蛭弧菌濃度的提高而增大，而且消除效果最好的仍然 是蛭弧菌游泳體與蛭質(zhì)體11的混合液。蛭弧菌在水果表面通過裂解、消除病原菌，不僅不會(huì)對(duì)水果的質(zhì)量產(chǎn)生影響，也不 會(huì)導(dǎo)致殺菌劑在水果中的殘留。而且隨著蛭弧菌混合菌濃度的提高，殺菌效果更加顯著。蛭 弧菌在消除水果攜帶的致病菌方面應(yīng)用潛力巨大，將其做為一種水果的新型的殺菌劑，既 能達(dá)到有效殺菌的目的，也能達(dá)到徹底清洗的目的。實(shí)施例2新鮮紅棗表面常見致病菌的消除步驟(1)、⑵及(3)均同實(shí)施例1檢測(cè)結(jié)果如圖3、4所示由圖3可知，蛭弧菌在10pfu/mL濃度，致病菌消除率均可達(dá)到97%以上，但是不同 的組合消除效果也是有差別的，30min實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，菌液C作用組致病菌幾乎檢測(cè)不到，即 完全消除，而D、E組仍可檢測(cè)到致病菌的數(shù)目為3-4cfu/mL，A、B組則要更高一點(diǎn)，上述實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明蛭弧菌游泳體與蛭質(zhì)體1 1的混合液對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核李斯 特菌、金黃色葡萄球菌消除率均可達(dá)到99%以上。由圖4所示，圖中1、2、3、5分別代表10、102、103、105pfu/mL(即上述X分別為1、2、 3、5)，因此可知致病菌的消除率隨著蛭弧菌濃度的提高而增大，而且消除效果最好的仍然 是蛭弧菌游泳體與蛭質(zhì)體11的混合液。蛭弧菌在水果表面通過裂解、消除病原菌，不僅不會(huì)對(duì)水果的質(zhì)量產(chǎn)生影響，也不 會(huì)導(dǎo)致殺菌劑在水果中的殘留，且隨著蛭弧菌混合物濃度的提高，殺菌效果更加顯著。實(shí)施例3新型殺菌劑與傳統(tǒng)殺菌劑殺菌效果的比較步驟(1)及(2)均同實(shí)施例1步驟(3)不同殺菌劑對(duì)致病菌的消除試驗(yàn)所有對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的枇杷先經(jīng)75%酒精殺菌后浸泡到步驟(2)制備好的混合 體菌液中l(wèi)min，取出后浙干，然后采用不同殺菌劑進(jìn)行殺菌處理。選用枇杷作為作用水果，分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組枇杷5顆約100g。
對(duì)照組取三個(gè)枇杷，為三個(gè)平行樣，將枇杷浸泡在自來水中，30min ；實(shí)驗(yàn)組分四組，每小組取三個(gè)枇杷，為三個(gè)平行樣(1)將枇杷浸泡在含有濃度為10pfu/mL混合體菌液D的自來水(2)將枇杷浸泡在加入過氧化氫的自來水，濃度達(dá)到5% ；(3)將枇杷浸泡在通入臭氧的自來水中，濃度達(dá)到0. 8mg/L ；(4)將枇杷浸泡在加入次氯酸鈉的自來水，濃度達(dá)到80mg/L ；浸泡30min后取出浙干，然后每lOmin檢測(cè)枇杷表面殘留的致病菌和總菌數(shù)。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示過氧化氫，臭氧，過氧乙酸的殺菌效果起初非常明顯，但持 續(xù)性較差，很快致病菌又滋生，而且過氧化氫的強(qiáng)氧化性有損水果的品質(zhì)，臭氧殺菌裝置耗 費(fèi)過大而次氯酸鈉則對(duì)熱不穩(wěn)定且容易與有機(jī)物反應(yīng)生成氯化物殘留，蛭弧菌混合體菌液 通過菌裂解消除致病菌需要一個(gè)過程，所以起效慢，但是較為持久，在濃度10pfU/mL的消 除率可以達(dá)到80%以上，根據(jù)實(shí)施例1可知，隨著蛭弧菌混合菌濃度增加，消除效果更加顯 著，因此蛭弧菌混合菌做殺菌劑完全可以預(yù)防致病菌的再次寄居和繁殖。蛭弧菌混合菌通 過裂解消除致病菌屬于生物防治，使用安全不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，也不會(huì)對(duì)水果品質(zhì)造成 影響。實(shí)施例4蛭弧菌在消除水果的加工環(huán)境、清洗設(shè)備攜帶的常見致病菌的應(yīng)用試驗(yàn)試驗(yàn)包括以下具體步驟及其條件步驟(1)及⑵均同實(shí)施例1步驟(3)致病菌的消除試驗(yàn)采用本發(fā)明的應(yīng)用方法，分成多個(gè)不同試驗(yàn)組，對(duì)水果加工車間地面和墻體、運(yùn)輸 水果的傳送帶及水果清洗設(shè)備的表面，均勻噴灑自來水和最低濃度10pfU/mL的蛭弧菌游 泳體，噴灑使用量則按試驗(yàn)組的不同分別為10mL/m2、30mL/m2、、50mL/m2、70mL/m2、或lOOmL/ m2，每天噴灑一次，連續(xù)噴灑兩天，在隨后的環(huán)境病菌檢測(cè)中顯示，如圖6，僅在噴灑量為 10mL/m2試驗(yàn)組中檢測(cè)到少量的大腸桿菌，其他噴灑量的試驗(yàn)組沒有檢測(cè)到沙門氏菌，單 核李斯特菌，金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等常見致病菌。本試用研究的結(jié)果表明蛭弧菌在 較低濃度消除水果加工過程中致病菌方面的效果十分顯著，同時(shí)考慮到清洗水果的成本， 30-50mL/m2可以作為最適宜的噴灑范圍。由此可見，蛭弧菌作為殺菌劑可以廣泛地推廣應(yīng) 用于水果的清洗加工過程中。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
蛭弧菌混合體作為殺菌劑在清洗水果中的應(yīng)用，其特征在于，制備蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體的混合體菌液，將該混合體菌液作為殺菌劑添加在清洗用水中，然后對(duì)水果進(jìn)行清洗；所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCCNOM208066，保藏日期為2008年4月28日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合菌在清洗用水中的濃度 至少為10pfu/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合體菌液的制備步驟如下(1)蛭弧菌蛭質(zhì)體的制備在含有嗜水氣單胞菌的DNB液體培養(yǎng)基中接入蛭弧菌，于 25 35°C、150 300rpm培養(yǎng)36 48h，得到含蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液 經(jīng)4°C、6000 8000rpm離心、15 20min后，去除含蛭弧菌游泳體的上清，得到的沉淀即是 蛭弧菌蛭質(zhì)體；(2)蛭弧菌游泳體的制備將步驟1中含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離 心15 20min后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳體；(3)混合體菌液的制備將步驟(1)、(2)得到的蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體分別用5mLDNB 液體培養(yǎng)基、無菌水、生理鹽水和0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液中的一種進(jìn) 行懸浮，得到兩種菌液混合，即得到蛭弧菌混合體菌液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)中蛭弧菌游泳體和蛭弧菌蛭 質(zhì)體按細(xì)菌數(shù)11的比例混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合菌在清洗用 水中的濃度為101 106pfu/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述清洗時(shí)先將水果放入蛭 弧菌混合體菌液中浸泡20 40min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，制備蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體的混合體菌 液，將該混合體菌液作為殺菌劑噴灑在水果加工環(huán)境中，使蛭弧菌混合菌在清洗用水中的 濃度至少達(dá)到10pfu/mL，使用量為30-50mL/m2。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合菌在清洗用水中的濃度 為 101 106pfu/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合體菌液的制備步驟如下(1)蛭弧菌蛭質(zhì)體的制備在含有l(wèi)OmLX1010cfu/mL嗜水氣單胞菌的100mL DNB液體 培養(yǎng)基中接入10mL103pfu/mL蛭弧菌BDM01，于25 35°C、150 300rpm培養(yǎng)36 48h， 得到含蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液經(jīng)4°C、6000 8000rpm離心、15 20min 后，去除含蛭弧菌游泳體的上清，得到的沉淀即是蛭弧菌蛭質(zhì)體；(2)蛭弧菌游泳體的制備將步驟1中含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離 心15 20min后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳體；(3)混合體菌液的制備將步驟(1)、(2)得到的蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體用5mLDNB液 體培養(yǎng)基、無菌水、生理鹽水和0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液中的一種分別 進(jìn)行懸浮，得到兩種菌液，再將兩種菌液按游泳體和蛭質(zhì)體細(xì)菌數(shù)1 1的比例混合，即制 得混合體菌液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛭弧菌混合體作為殺菌劑在清洗水果中的應(yīng)用，其特征在于，將蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體的混合體菌液作為殺菌劑添加在清洗用水中，然后對(duì)水果進(jìn)行清洗；或者將上述蛭弧菌混合體菌液噴灑在水果加工環(huán)境中，對(duì)加工環(huán)境進(jìn)行清洗；所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NOM208066，保藏日期為2008年4月28日。利用上述混合菌作為殺菌劑對(duì)水果進(jìn)行清洗，可以殺滅水果表面95％的致病菌。而且混合菌兼具游泳體起效快，活力強(qiáng)和蛭質(zhì)體制備、保存容易，殺菌作用時(shí)間更久和環(huán)境耐受力更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A23L1/015GK101978860SQ201010270768
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者蔡俊鵬, 陳麗蕓 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)