專利名稱：巣式pcr法擴增egfr基因外顯子19片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體為巣式PCR法擴增DNA的技術(shù)，尤其是用巣式 PCR法擴增中EGFR基因外顯子19片段的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤，特別是惡性腫瘤對人類產(chǎn)生的危害日益增大，目前臨床上對癌癥尚無十分 有效的治療方案。這除了與腫瘤本身的特性有關(guān)外，腫瘤診斷學(xué)也存在一些不足之處，如腫 瘤早期診斷效率低，確診時已發(fā)展到晚期的概率高；另外癌組織活檢也極大的增加了病人 的痛苦；對于一些缺乏可靠診斷方法的實體瘤，就更不大可能取腫瘤組織進行化驗，故急需 尋找新型腫瘤標記物以客服實體腫瘤取材困難并指導(dǎo)個性化用藥等問題。循環(huán)DNA (circulating DNA)是指存在于血液(血漿或血清)、滑膜液、腦脊液等體 液中的細胞外DNA。對其來源，現(xiàn)在還未有一致的定論，但越來越多的研究顯示循環(huán)DNA來 自腫瘤細胞。因此對血漿DNA作為一種新型的腫瘤臨床標記物的研究備受關(guān)注。表皮生長因子受體(EGFR)在細胞生理過程中發(fā)揮著重要作用。吉非替尼 (Gefitinib)是表皮生長因子受體的特異性靶向藥物，能夠通過抑制EGFR激酶活化及阻斷 受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響腫瘤細胞的生長，吉非替尼已被用于如肺癌、胃癌、乳腺癌 等癌癥的臨床治療中。2004年6月，美國科學(xué)家Lynch和Paez等人發(fā)現(xiàn)，并不是所有的 病人對該藥都達到預(yù)期的效果，研究發(fā)現(xiàn)該藥對EGFR編碼區(qū)基因突變型腫瘤的治療有效 率可高達80%以上，而對無突變的野生型腫瘤的治療效果不盡如人意。于是推測在非小細 胞癌中表皮生長因子受體EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是吉非替尼湊效的一個重要條 件。可見對EGFR基因突變的檢測，可以間接實現(xiàn)對一些癌癥患者的個性化治療，是臨床治 療達到最優(yōu)結(jié)果。迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的EGFR突變多發(fā)生于外顯子19號和21號，其中外顯子19為堿 基缺失突變，外顯子21為單位點突變。研究者本人前期在對血漿中EGFR基因兩個常見突 變熱點片段進行常規(guī)PCR發(fā)現(xiàn)，以血漿DNA作模板，由于其中DNA含量少，因此比以血液或 腫瘤組織基因組作模板的PCR擴增效率低，若隨即進行二次PCR，更容易出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，從 而總結(jié)模板的質(zhì)量較大程度地制約了 PCR的擴增效率。為了能更好的解決這一弊端，本研 究采用巢式PCR實現(xiàn)對血漿DNA中EGFR基因外顯子19和21的擴增，提高了檢測靈敏度和 特異性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種利用巣式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法。本發(fā)明公開了一種方法，用巢式PCR法實現(xiàn)對血漿DNA、石蠟切片DNA等微量基因 組樣本中EGFR外顯子19的擴增，便于后續(xù)突變的檢測。其技術(shù)方案為，用巢式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法，包括如下步 驟(ι)第一輪PCR擴增，以血漿DNA或石蠟切片DNA為模板，擴增25 35個循環(huán)，所用的 引物為
C19F 5'-TATCAGCCTTAGGTGCGG-3'，
C19R 5' -GGATGTGGAGATGAGCAGG-3‘；
優(yōu)選的，每種引物的濃度分別為0. 1 1 μ M ；
反應(yīng)體系中包括四種脫氧核苷酸，每一種濃度分別為100 400μΜ ；
DNA聚合酶，濃度為；10 100U/ml ；
血漿DNA或石蠟切片DNA，濃度為20 100ng/ml ；
(2)第二輪PCR擴增，以步驟(1)的第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，擴增25 35個循環(huán)， 所用的引物為
19F 5'-AACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA -3，，
19R 5' -CCACACAGCAAAGCAGAAACT- 3'；
優(yōu)選的，每種引物的濃度分別為0. 1 1 μ M ；
反應(yīng)體系中包括四種脫氧核苷酸，每一種濃度分別為100 400μΜ ；
DNA聚合酶，濃度為；10 100U/ml ；
第二輪PCR擴增的反應(yīng)體系中，步驟(1)第一輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋10 25倍。上述兩輪PCR反應(yīng)的條件和步驟為A. 94 96°C預(yù)變性3 6min ； B. 93 95°C變性20 60s，59 61°C退火20 60s，71 73°C延伸20 60s，25 35個循環(huán)； C.然后71 73°C延伸3 6min。PCR反應(yīng)的條件和步驟優(yōu)選為A. 94 96°C預(yù)變性5min ； B. 93 95°C變性 30s, 59 61°C退火30s, 71 73°C延伸30s，25 35個循環(huán)；C.然后71 73°C延伸3 6min。本發(fā)明中EGFR基因外顯子的待測模板來源包括血漿DNA或石蠟切片DNA。血漿 DNA可用常規(guī)技術(shù)手段或商品化試劑盒從外周血的血漿樣本中提取。經(jīng)過上述方法擴增所得到的DNA片段可滿足測序的要求；擴增的產(chǎn)物經(jīng)過序列分 析，判斷突變情況。本發(fā)明通過巢式PCR法，提供了一種擴增EGFR基因外顯子19的巢式PCR方法；通 過第一輪擴增，提高了含有目的片段的模板DNA濃度，以提高EGFR基因外顯子19的擴增效 率。同時此方法亦可用于其他微量基因組樣本中對該片段的PCR擴增，提高檢測的特異性。


圖1為本發(fā)明巢式PCR法擴增EGFR基因外顯子19的示意圖。
具體實施例方式(1)樣本處理
取外周血5ml于EDTA抗凝管中，于Ih之內(nèi)，用5000rpm離心3min后取血漿，-80°C保存。(2)血漿DNA提取
采用 Genomic DNA Purification Kit (Ferments, K0512)完成血菜 DNA 的抽提，具體步驟如下
A.取200ul血漿，加入400ul裂解液混勻，65°C水浴20min；
B.加入600ul三氯甲烷，顛倒試管混勻數(shù)次，IOOOOrpm離心2min；
C.取上清于另一潔凈離心管中，加SOOul新鮮配置的8X的沉淀液(precipitation solution)，顛倒數(shù)次，室溫放置2min后IOOOOrpm離心2min ；
D.倒去上清，加入IOOul1.2M NaCl，振蕩至小團塊完全溶解;
E.加入300ul無水冰乙醇，振蕩混勻后，至_20°C放置過夜；
F.IOOOOrpm離心lOmin，棄去上清，室溫放置10-15min，以確保無乙醇殘留；向離心管 中加入30ul滅菌的ddH20(雙蒸水)，得到血漿DNA，其中DNA模板含量約為150ng/ml，_20°C 保存?zhèn)溆谩?3)第一輪 PCR 擴增
C19F 的序列為5，-TATCAGCCTTAGGTGCGG-3，， C19R 的序列為5，-GGATGTGGAGATGAGCAGG-3，；
反應(yīng)體系以血漿DNA為模板，C19F和C19R為引物，采用2XPCR擴增MIX (上海捷瑞生 物工程有限公司，GK8002)，加入引物、血漿DNA和無菌水； 第一輪反應(yīng)體系
2 X PCR 擴增 MIXIOul
C19F (10 μ Μ)0. 5 ul
C19R (10 μ Μ)0. 5 ul
血漿 DNA (150ng/ml) 5ul 無菌水4ul
總反應(yīng)體系20ul
總反應(yīng)體系中，DNA聚合酶的濃度為50U/ml，每種脫氧核苷酸的濃度分別為200 μ Μ。第一輪PCR擴增的條件和步驟為A. 95°C預(yù)變性5min; B. 94°C變性30s，60°C 退火30s，72°C延30s，30個循環(huán)；C. 72°C延伸5min ；得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物。如圖1所示。(4)第二輪 PCR 擴增
19F 的序列為5’ -AACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA -3， 19R 的序列為5’ -CCACACAGCAAAGCAGAAACT -3，
如圖1所示，反應(yīng)體系以第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，21F和21R為引物，采用2XPCR 擴增MIX (上海捷瑞生物工程有限公司，GK8002)，加入引物、第一輪PCR產(chǎn)物和無菌水； 第二輪反應(yīng)體系 2 X PCR 擴增 MIX10 ul
19F (10 μ Μ)0. 5 ul
19R (10 μ Μ)0. 5 ul
第一輪PCR擴增產(chǎn)物 Iul 無菌水8 ul總體系20ul
總反應(yīng)體系中，DNA聚合酶的濃度為50U/ml，每種脫氧核苷酸的濃度為200 μ Μ。第二輪PCR擴增的條件和步驟為A. 95°C預(yù)變性5min ；B. 94°C變性30s，60°C退 火30s，72°C延30s，30個循環(huán)；C. 72°C延伸5min ；以等量滅菌水為模板進行陰性對照。(5)電泳檢測
配0. 1%瓊脂糖凝膠，取7ul步驟(4)所得到PCR產(chǎn)物與2ul 40%蔗糖溶液混勻后上樣， 130V電泳20min，紫外檢測判斷PCR結(jié)果。其中EGFR基因外顯子19片段第二輪PCR產(chǎn)物 片段大小為150bp。(6)送樣測序，分析結(jié)果
經(jīng)電泳確認有目的條帶后，取lOulPCR產(chǎn)物送至專業(yè)測序公司進行檢測，以19F作為測 序引物，查看測序峰圖，判別突變情況。
權(quán)利要求
巣式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)第一輪PCR擴增，以血漿DNA或石蠟切片DNA為模板，擴增25～35個循環(huán)，所用的引物為C19F5' TATCAGCCTTAGGTGCGG 3'，C19R5' GGATGTGGAGATGAGCAGG 3'；(2) 第二輪PCR擴增，以步驟(1)的第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，擴增25～35個循環(huán)，所用的引物為19F5' AACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA 3'，19R 5' CCACACAGCAAAGCAGAAACT 3'；且上述步驟(1)和(2)中，兩輪PCR擴增的反應(yīng)條件和步驟為A. 94～96℃預(yù)變性3～6min； B. 93～95℃變性20～40s，59～61℃退火20～40s，71～73℃延伸20～40s，25～35個循環(huán)；C. 然后71～73℃延伸3～6min。
2.權(quán)利要求1所述巣式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法，其特征在于，所 述的PCR擴增的反應(yīng)條件和步驟為A. 94 96°C預(yù)變性5min ； B. 93 95°C變性30s， 59 61°C退火30s, 71 73°C延伸30s，25 35個循環(huán)；C.然后71 73°C延伸5min。
3.權(quán)利要求1所述巣式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法，其特征在于，步驟(1)中每種引物的濃度分別為0.1 1 μ M ；血漿DNA或石蠟切片DNA的濃度為20 IOOng/ ml ；反應(yīng)體系中還包括四種脫氧核苷酸，每一種濃度分別為100 400 μ M ； DNA聚合酶，濃度為；10 100U/ml。
4.權(quán)利要求1所述巣式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法，其特征在于，步驟(2)中每種引物的濃度分別為0.1 1μM ；將步驟(1)第一輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋10 25 倍；反應(yīng)體系中還包括四種脫氧核苷酸，每一種濃度分別為100 400 μ M ； DNA聚合酶，濃度為；10 100U/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種用巣式PCR法擴增中EGFR基因外顯子19片段的方法。步驟包括(1)第一輪PCR擴增，以血漿DNA或石蠟切片DNA為模板，擴增25～35個循環(huán)，所用的引物為C19F和C19R；(2)第二輪PCR擴增，以步驟(1)的第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，擴增25～35個循環(huán)，所用的引物為19F和19R。經(jīng)過上述方法擴增所得到的DNA片段可滿足測序的要求；擴增的產(chǎn)物經(jīng)過序列分析，判斷突變情況。本發(fā)明通過第一輪擴增，提高了含有目的片段的模板DNA濃度，可提高EGFR基因外顯子19的擴增效率。
文檔編號C12Q1/68GK101988124SQ20101027163
公開日2011年3月23日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者吳奇涵, 蔡燕燕, 顧海英 申請人:華東師范大學(xué)