一種產酸性α-淀粉酶的酵母菌株及其發(fā)酵產酶方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種野生型酵母菌SH3 iRhodotorula sp.SH3)產酸性α -淀粉酶的菌種及其優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]α-淀粉酶可從淀粉分子內部切開α-1，4糖苷鍵，生成糊精和還原糖，廣泛應用于食品、釀造、制藥、紡織及石油開采等諸多方面，在工業(yè)生產中占有極其重要的地位，是目前用途較廣泛的一種酶制劑。據不完全統(tǒng)計，全球酶制劑產業(yè)不斷發(fā)展，其中淀粉酶制劑已占30%左右。目前工業(yè)生產應用的α-淀粉酶耐熱溫度在95°C左右，pH多為中性偏酸性，而工業(yè)生產過程中自然淀粉漿的pH在3.2-4.5之間，因此需要在酸性條件下依然具有高酶活的α-淀粉酶。開發(fā)酸性淀粉酶將有助于解決液化酶和糖化酶適用pH值差異的難題。
[0003]微生物發(fā)酵是目前酸性α-淀粉酶生產的核心途徑。國外對微生物發(fā)酵產酸性α_淀粉酶的研宄起步較早，1963年發(fā)現(xiàn)可用真菌生產酸性α-淀粉酶。我國對產α_淀粉酶菌株的研宄起步較晚，尤其是產耐酸性α-淀粉酶菌種，長期被國外壟斷。開發(fā)具有自主知識產權的生產菌株，提高耐酸性α -淀粉酶的產量和性能，對滿足國內市場需求、調整我國酶制劑工業(yè)結構、拓寬市場、帶動相關食品或發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展等具有重要意義，在我國現(xiàn)代工業(yè)酶制劑中占有顯著地位。
[0004]隨著分子生物學的發(fā)展，利用基因工程手段獲得優(yōu)良基因工程菌株是一種主要手段，能夠從理性設計的角度來達到菌種優(yōu)化的目的。但具有自主產權的菌種的篩選，以及其發(fā)酵工藝的確定，仍然是相關領域技術開發(fā)和行業(yè)發(fā)展的關鍵。目前產酸性α -淀粉酶的菌種主要有芽孢桿菌、酵母、絲狀真菌等。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明解決的技術問題之一是提供的一種產酸性α -淀粉酶的酵母菌株及其發(fā)酵產酶方法，該菌株為紅酵母sp.) SH3，于2015年2月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研宄所，菌種保藏號為CGMCC N0.10503。為從面粉廠污水排出口附近土壤中分離篩選的一株酵母菌SH3 (Rhodotorula sp.SH3)。
[0006]酵母菌SH3的篩選方法是從面粉廠周邊土壤中經平板菌落特征并比較透明圈大小初篩，采用搖瓶發(fā)酵復篩，經酶活測定，比較酸性α -淀粉酶的活性大小而得到。
[0007]初篩培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，瓊脂粉15 g/L ο使用前將pH調至5.0o
[0008]復篩培養(yǎng)基:胰蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉 10 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L，KH2PO4 3 g/L，CaCl2 0.2 g/L, pH 調至 5.0。
[0009]所述菌株為野生型菌株，該菌株的18S ITS序列已提交GenBank數據庫，登錄號為KM875707。
[0010]本發(fā)明解決的另一技術問題是利用酵母菌SH3 iRhodotorula sp.SH3)產酸性α -淀粉酶的工藝方法，包括培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵條件優(yōu)化，其具體步驟如下:
(I)種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基為胰蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L, KH2PO4 3 g/L, CaCl2 0.2 g/L，pH 調至 0，滅菌使用；菌種接入后于 37°C、200 r/min 培養(yǎng)12 h，即得種子液；基礎發(fā)酵繪制產酶曲線(如圖1)。
[0011](2)對發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源進行優(yōu)化，確定最佳碳源為可溶性淀粉，對其他成分如有機氮源、無機氮源、Ca2+濃度等完成優(yōu)化。
[0012]優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨30 g/L，可溶性淀粉15 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L,KH2PO4 3 g/L，CaCl2 0.2 g/L, pH 4.5。121°C滅菌 25 min ；
(3)發(fā)酵條件:對發(fā)酵培養(yǎng)條件如初始pH、溫度、裝液量、發(fā)酵時間進行優(yōu)化，500 mL三角瓶裝液200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按照10%的接種比例接入種子液，初始pH4.5、發(fā)酵溫度37°C、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，發(fā)酵14h，酶活為96.8 U/mg。
[0013]本發(fā)明解決的技術問題之三是獲得酵母菌株SH3 (TfeoWorWa sp.SH3)發(fā)酵產品最適酶解淀粉的酶反應條件:
該酶耐受pH范圍較廣，為3.8-8.0，最適作用pH 5.0，具有很好的耐酸性(如附圖2)；該酶最適作用溫度50°C，于80°C下仍有酶活。
[0014]本發(fā)明的有益效果:自采集的面粉廠土壤中篩選獲得一種產酸性α -淀粉酶的酵母菌株SH3 1.Rhodotorula sp.SH3)，獲得了最佳的發(fā)酵產酶條件和方法，所產酸性α-淀粉酶使用PH范圍廣并具有很好的耐酸性和一定的耐高溫性。
[0015]
【附圖說明】
[0016]圖1酵母菌株SH3在基礎培養(yǎng)基中的產酶曲線。
[0017]圖2不同反應pH下酵母菌株SH3的酸性α -淀粉酶活力。
【具體實施方式】
[0018]以下通過具體實施例對本發(fā)明技術方案做進一步的說明，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。
[0019]實施例1:產酸性α -淀粉酶菌株的篩選
初篩:自面粉廠污水排出口附近采集土壤樣品，十倍梯度稀釋制備菌懸液，涂布初篩培養(yǎng)基平板，28°C恒溫培養(yǎng)2-3d，測量水解圈直徑/菌落直徑的值，選取比值較大的點接傳代于初篩培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)24h后，淋撒碘液，測量透明圈/菌落直徑比，將比值大的菌株接種于初篩培養(yǎng)基，凍存管_80°C保存。
[0020]復篩:將初篩酶活較高的菌株經初篩培養(yǎng)基活化后，轉接于復篩培養(yǎng)基中，37°C、200 r/min培養(yǎng)12 h，測定發(fā)酵液酶活，獲得酶活最高的菌株命名為SH3。
[0021]實施例2:酸性α -淀粉酶活性的測定
一個酸性α -淀粉酶酶活單位(IU)定義為:50°C、pH5.0條件下，10 min水解I mg淀粉所需的酶量。
[0022]酶活測定采用Yoo改良法:2.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液與2.5 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)50°C恒溫水浴鍋預熱10 min，加入酶液0.5 mL，55°C下準確反應10 min,加入5 mL 0.1 mol/L的鹽酸終止反應，取上述混合液0.5 mL與5 mL碘液混勻，660 nm測定吸光度值R(以2.5 mL蒸餾水代替可溶性淀粉溶液，其余條件相同作為空白)。在上述反應條件下，以0.5 mL的緩沖液代替0.5 mL酶液，測定吸光度值Rtl值。
[0023]酶活公式:待測酶活(U/mg) =100*D* (R0-R) /R，其中D:稀釋倍數，Rtl:對照吸光值，R:酶液的吸光值，100:轉換系數。
[0024]實施例3:酵母菌株SH3產酸性α -淀粉酶的發(fā)酵條件及方法
保藏菌種接入種子培養(yǎng)基，制得種子液10 mL接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，從3h開始每小時測定酶活，以培養(yǎng)時間為橫坐標，酶活力為縱坐標繪制產酶曲線。
[0025]培養(yǎng)基優(yōu)化:以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，設置0.5%葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為碳源，5%的接種量至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、200 r/min培養(yǎng)，在產酶高峰期測定酶活，比較確定出最佳碳源為可溶性淀粉；同樣通過以0.5%蛋白胨、棉籽餅、黃豆餅、牛肉膏作為氮源等，確定出最佳氮源為蛋白胨。
[0026]發(fā)酵條件的優(yōu)化:設置初始發(fā)酵pH梯度4.5,5.0,5.5,6.0，設置500 mL三角瓶中裝液量分別50、100、150、200 1^，設置發(fā)酵溫度28、37、40°0振蕩培養(yǎng)，以5%的接種量，產酶高峰期測定酶活，分別確定產酶發(fā)酵最佳初始PH4.5，最佳發(fā)酵溫度37°C，500 mL搖瓶中最佳裝液量200 mL。
[0027]對影響較大的四因素即碳源、氮源、初始pH和發(fā)酵溫度，設計4因素3水平表，正交實驗確定最佳發(fā)酵參數為:可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37°C、pH4.5。
[0028]從而獲得酵母菌株SH3最佳發(fā)酵方法:發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨30 g/L，可溶性淀粉15 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L, KH2PO4 3 g/L, CaCl2 0.2 g/L, pH 4.5 ;發(fā)酵最佳條件:初始pH4.5、發(fā)酵溫度37°C、500 mL三角瓶裝液量200 mL、發(fā)酵14h ;對應條件下酸性α-淀粉酶發(fā)酵酶活力為96.8 U/mg ο
[0029]實施例四:酸性α-淀粉酶酶學性質
37°C,200 r/min培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液上清作為粗酶，相同反應體系，pH 3.8、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖條件，分別測定酶活以確定pH作用范圍，結果如附圖2所示，所產酸性α -淀粉酶耐受pH范圍較廣，為3.8-8.0，最適作用pH 5.0，具有很好的耐酸性。
[0030]37°C,200 r/min培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液上清作為粗酶，相同反應體系，設置30~80°C溫度條件測定酶活以確定溫度耐受性，結果顯示，所產酸性α -淀粉酶最適作用溫度50°C，80°C下保留良好的酶活力。
【主權項】
1.一種產酸性α -淀粉酶的菌株，其特征在于:該菌株為紅酵母(Rhodotorula sp.)SH3，該菌株于2015年2月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.10503。
2.根據權利要求1所述的產酸性α-淀粉酶的菌株，其特征在于:所述菌株為野生型菌株，該菌株的18S ITS序列已提交GenBank數據庫，登錄號為ΚΜ875707。
3.根據權利要求1所述的產酸性α-淀粉酶的菌株，其特征在于:所產α -淀粉酶耐受pH范圍3.8-8.0，最適作用pH5.0，具有很好的耐酸性；最適作用溫度50°C，于80°C下仍有酶活。
4.根據權利要求1所述的產酸性α-淀粉酶的菌株，其特征在于:所述菌株的篩選培養(yǎng)基為牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，瓊脂粉15 g/L，使用前將pH調至5.0。
5.一種利用權利要求1所述菌株的發(fā)酵產酶方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基為胰蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L, KH2PO4 3 g/L, CaCl2 0.2 g/L，pH 調至 0，滅菌使用；菌種接入后于 37°C、200 r/min 培養(yǎng)12 h，即得種子液； (2)發(fā)酵培養(yǎng)基:優(yōu)化后的產酶發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨30g/L，可溶性淀粉15 g/L,(NH4)2SO4 2.5 g/L，KH2PO4 3 g/L，CaCl2 0.2 g/L，pH 調至 4.5，121°C滅菌 25 min ； (3)發(fā)酵條件:500mL三角瓶裝液200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按照10%的接種比例接入種子液，于37°C、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，發(fā)酵1處，酶活為96.8 U/mg。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種產酸性α-淀粉酶的菌株及其發(fā)酵產酶方法，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明菌種為一株自主分離自土壤的紅酵母（Rhodotorula sp.）SH3，并將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.10503，該菌株的18S ITS序列已提交GenBank數據庫，登錄號為KM875707。該菌產酶最優(yōu)碳源可溶性淀粉15 g/L、最優(yōu)氮源蛋白胨30g/L、最適溫度37℃、最適pH4.5，該條件下酸性α-淀粉酶的酶活力為96.8 U/mg。所產的酸性α-淀粉酶最適作用pH5.0，耐受pH范圍3.8-8.0，最適作用溫度50℃，80℃下仍有酶活。CGMCC No. 1050320150202
【IPC分類】C12R1-645, C12N1-16, C12N9-30
【公開號】CN104651244
【申請?zhí)枴緾N201510126887
【發(fā)明人】屈建航, 李海峰, 翟丹丹, 胡元森, 王金水, 賈峰, 張帥兵, 蔡靜平, 尹伊, 屈凌波, 劉仲敏
【申請人】河南工業(yè)大學
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年3月23日