本發(fā)明屬于生物技術(shù)中熒光蛋白質(zhì)重組表達(dá)制備領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及高熒光強(qiáng)度的重組藻膽蛋白串聯(lián)體的制備方法。

背景技術(shù)：

藻膽蛋白是藻類重要的色素蛋白，具有光能捕獲和傳遞的作用。每分子的藻膽蛋白含有兩條結(jié)構(gòu)相似的多肽鏈α和β，α亞基和β亞基分別含有約160～180個(gè)氨基酸殘基，二者的比例通常為1:1。亞基中的半胱氨酸殘基通過(guò)硫醚鍵與藻膽色素共價(jià)結(jié)合，藻膽色素的種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定了藻膽蛋白的光譜學(xué)性質(zhì)。根據(jù)吸收光譜的不同，可將藻膽蛋白分為4大類：即藻紅蛋白pe,λmax＝540nm～570nm，藻紅藍(lán)蛋白pec，λmax＝567nm，藻藍(lán)蛋白pc，λmax＝615nm～640nm和別藻藍(lán)蛋白apc，λmax＝650nm～655nm。

藻膽蛋白能發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，其熒光特性最重要的用途是在免疫診斷用熒光標(biāo)記、生物醫(yī)學(xué)研究等方面，可將其與生物素、親和素或各種抗體結(jié)合制成熒光探針，用于免疫熒光分析和檢測(cè)等工作中。在免疫熒光分析中，藻膽蛋白作為熒光標(biāo)記物需要與抗體結(jié)合，即通過(guò)雙功能試劑將藻膽蛋白分子與抗體分子共價(jià)交聯(lián)，或藻膽蛋白通過(guò)交聯(lián)劑與鏈霉親和素交聯(lián)后，在通過(guò)生物素·親和素系統(tǒng)(bas)將藻膽蛋白分子間接耦聯(lián)到抗體分子上。

文獻(xiàn)“functionalbiosynthesisofanallophycocyanbetasubunitinescherichiacoli，journalofbioscienceandbioengineering，107(3),246–249,2009”報(bào)道了一種利用基因工程方法生產(chǎn)重組別藻藍(lán)蛋白的方法，但是該重組別藻藍(lán)蛋白為單亞基，共價(jià)結(jié)合的藻藍(lán)膽素，熒光量子效率低，因而熒光強(qiáng)度較低。中國(guó)專利“結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，專利授權(quán)號(hào)：200810025626.2”，提供了一種基因工程方法生產(chǎn)結(jié)合藻紅膽素的重組別藻藍(lán)蛋白的方法，由于重組蛋白也是單亞基，熒光強(qiáng)度的提升有限。

本發(fā)明提供一種具有生物素結(jié)合能力的重組藻膽蛋白亞基串聯(lián)體的制備方法。相對(duì)于重組藻膽蛋白亞基單體，串聯(lián)體蛋白具有更高的熒光強(qiáng)度，在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中，對(duì)抗原的免疫熒光檢測(cè)中將具有較好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供高熒光強(qiáng)度的重組藻膽蛋白串聯(lián)體的制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種高熒光強(qiáng)度的重組藻膽蛋白串聯(lián)體的制備方法，其特征在于：將鏈霉親和素基因與別藻藍(lán)蛋白α亞基基因，通過(guò)linker序列連接起來(lái)。在此基礎(chǔ)上，再通過(guò)linker序列實(shí)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)別藻藍(lán)蛋白α亞基基因的串聯(lián)，形成融合基因。將該融合基因、藻膽蛋白裂合酶基因和藻紅膽素生物合成酶基因在大腸桿菌中共表達(dá)，獲得共價(jià)結(jié)合藻紅膽素的具有更高熒光強(qiáng)度的重組別藻藍(lán)蛋白串聯(lián)體。

具體是：

1)將鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白α亞基基因通過(guò)linker序列連接形成融合基因，在此基礎(chǔ)上，再通過(guò)linker序列連接一個(gè)或多個(gè)別藻藍(lán)蛋白α亞基 基因。

將該融合基因插入到大腸桿菌表達(dá)載體pcdfduet-1的表達(dá)框中；將裂合酶基因cpcs插入到該表達(dá)載體的另一個(gè)表達(dá)框中；

2)將藻紅膽素生物合成酶基因ho1和pebs，分別插入到另一個(gè)表達(dá)載體prsfduet-1的兩個(gè)表達(dá)框中；

3)將兩個(gè)構(gòu)建好的表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組大腸桿菌；

4)將重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，iptg誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，通過(guò)金屬螯合親和層析純化，得到共價(jià)結(jié)合藻紅膽素的融合熒光蛋白質(zhì)。

所述別藻藍(lán)蛋白α亞基基因是別藻藍(lán)蛋白synechoccuselongatusbp-1別藻藍(lán)蛋白α亞基基因，或其同源基因；藻紅膽素生物合成酶基因ho1是

synechocystissp.pcc6803ho1基因，pebs是prochlorococcusphagep-ssm2的pebs基因，cpcs是指synechoccuselongatusbp-1cpcs基因，所述的linker序列是：

ggatccgccggagcggaagcaaaaggagcggaagcaaaaggagcggaagcaaaaggagcggaagcaaaagcggaattc

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.通過(guò)基因工程的方法，利用本發(fā)明中的linker序列將別藻藍(lán)蛋白α亞基串聯(lián)，避免了相鄰的別藻藍(lán)蛋白α亞基功能上相互干擾，提高了重組藻膽蛋白的熒光強(qiáng)度，在免疫熒光檢測(cè)中具有更強(qiáng)的熒光信號(hào)；

2.大腸桿菌易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)快，生產(chǎn)周期短。本發(fā)明利用大腸桿菌發(fā)酵制備高熒光強(qiáng)度的重組藻膽蛋白串聯(lián)體，具有制備簡(jiǎn)單，成本低等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中構(gòu)建的藻膽蛋白單體和串聯(lián)體表達(dá)載體的酶切圖譜。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例的經(jīng)過(guò)純化后重組藻膽蛋白單體和串聯(lián)體樣品的sds-page電泳。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例的經(jīng)過(guò)純化后重組藻膽蛋白單體和串聯(lián)體樣品的吸收光譜。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例的經(jīng)過(guò)純化后重組藻膽蛋白單體和串聯(lián)體樣品的熒光發(fā)射光譜。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例的經(jīng)過(guò)純化后重組藻膽蛋白單體和串聯(lián)體對(duì)afp免疫熒光檢測(cè)的檢測(cè)曲線

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行闡述，所述的實(shí)施方式僅僅用來(lái)解釋和說(shuō)明本發(fā)明，其并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)公知的知識(shí)和現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)能夠想到的等價(jià)的變體都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

實(shí)施例1

1.基因的克隆

從美國(guó)國(guó)立生物信息中心(nationalcentreforbiotechnologyinformation,ncbi)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取synechococcuselongatusbp-1apca，synechocytissp.pcc6803ho1,prochlorococcusphagep-ssm2pebs,synechococcuselongatusbp-1cpcs和鏈霉親和素的基因sa序列(accessionno.x65082)。由此分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增apca，ho1，cpcs的特異引物(表1)。apca基因以synechococcuselongatusbp-1基因組dna為模板，ho1以 synechocytissp.pcc6803基因組dna為模板，cpcs以synechococcuselongatusbp-1基因組dna為模板，按常規(guī)pcr條件擴(kuò)增獲得。sa基因和linker序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。為了便于融合pcr反應(yīng)，linker序列人工合成過(guò)程中，在其5’端和3’端分別加上sa基因和apca基因的部分序列。

2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白α亞基基因的融合(單體)及其表達(dá)載體的構(gòu)建

以sa、linker和apca為模板，用引物sa-f和引物apcar，通過(guò)融合pcr擴(kuò)增，獲得融合基因sa-linker-apca(簡(jiǎn)稱：sla)。sla片段回收后，利用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切，同時(shí)把載體pcdfduet-1也利用相同的酶進(jìn)行雙酶切。分別回收載體片段和融合基因片段，然后以1:5的摩爾比進(jìn)行連接。16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣進(jìn)行dna測(cè)序，同時(shí)抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切鑒定(圖1)。酶切鑒定以及dna測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的樣品用于保種，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒標(biāo)記為：pcdf-sla。

2.2藻膽蛋白裂合酶cpcs共表達(dá)載體的構(gòu)建

將表達(dá)質(zhì)粒pcdf-sla用bglii和xho雙酶切，將上述pcr擴(kuò)增得到的cpcs片段回收后，用bglii和sali雙酶切。利用膠回收試劑盒分別回收載體片段和cpcs酶切產(chǎn)物，回收后的載體片段和cpcs片段按照摩爾比1:5的比例進(jìn)行連接，16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，挑取陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序，測(cè)序無(wú)誤的樣品用于保種。構(gòu)建好的共表達(dá)質(zhì)粒標(biāo)記為pcdf-sla-cpcs。

2.3藻紅膽素生物合成酶共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述pcr擴(kuò)增得到ho1基因回收后用bglii和sali雙酶切，prsfduet-1載體用bglii和xhoi雙酶切。利用膠回收試劑盒，分別回收載體片段和ho1片段，以1:5摩爾比進(jìn)行連接。16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的克隆用于保種，構(gòu)建成功的質(zhì)粒標(biāo)記為prsf-ho1。

人工合成的基因pebs和質(zhì)粒prsf-ho1均用ncoi和sali酶切，分別回收載體片段和基因片段，以1:5摩爾比進(jìn)行連接。16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的克隆用于保種，構(gòu)建成功的質(zhì)粒標(biāo)記為prsf-ho1-pebs。

3.重組藻膽蛋白單體表達(dá)菌株的構(gòu)建

將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒pcdf-sla-cpcs和prsf-ho1-pebs通過(guò)共轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有100μg/ml卡那霉素和100μg/ml壯觀霉素的lb平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后。從平板上挑取單克隆，分別接種于3mllb培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含有抗生素卡那霉素和壯觀霉素)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素的60mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm條件下培養(yǎng)4小時(shí)，加入終濃度為1mmiptg誘導(dǎo)，培養(yǎng)物置于18℃，160rpm繼續(xù)培養(yǎng)16-20小時(shí)。離心收集菌體，利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，收集上清液，加入loadingbuffer后煮沸處理10分鐘，取樣進(jìn)行sds-page電泳。選擇重組蛋白表達(dá)量高的菌株，保甘油種用于后續(xù)發(fā)酵與重組蛋白的分離純化。

4.重組蛋白的發(fā)酵與分離純化

吸取甘油種200μl，接種于含有卡那霉素和壯觀霉素的15mllb培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后。將過(guò)夜培養(yǎng)物接種于含有卡那霉素和壯觀霉素的300mllb培養(yǎng)基中。37℃，200rpm條件下培養(yǎng)4小時(shí)，加入終濃度為1mmiptg，18℃條件下誘導(dǎo)20小時(shí)。

離心收集菌體，將菌體懸浮于破碎緩液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，20mmol/l咪唑，ph7.4)中，冰浴中超聲破碎30min。破碎液于4℃，8000rpm條件下離心30min，取上清液。用結(jié)合緩沖液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，20mmol/l咪唑，ph7.4)平衡鎳柱(hitrapff，ge)，上清液過(guò)柱后，再用洗滌緩沖液洗滌(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，90mmol/l咪唑，ph7.4)鎳柱，除去雜蛋白。待a280值不再變化時(shí)，用洗脫液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，500mmol/l咪唑，ph7.4)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再過(guò)g25脫鹽柱，除去蛋白樣品中的咪唑，得到重組蛋白溶液。

取純化后的蛋白樣品，加入loadingbuffer后煮沸處理10分鐘，取樣進(jìn)行sds-page電泳，電泳結(jié)果如圖2。重組藻膽蛋白的條帶位于35kda和40kda之間，與重組藻膽蛋白單體的分子量理論值相符。

5.重組蛋白的光譜學(xué)性質(zhì)

取少量純化后的重組藻膽蛋白樣品，用50mm磷酸鈉緩沖液(ph7.4)稀釋至10^-6mol/l，分別用于吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測(cè)定。吸收光譜采用uv1801紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)室溫條件下測(cè)定，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖3，重組藻膽蛋白單體的最大吸收峰為550nm。熒光發(fā)射光譜采用f-4500熒光分光光度計(jì)室溫下測(cè)定，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為500nm，掃描波長(zhǎng)為520-600nm，熒光發(fā)射光譜見(jiàn)圖4，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為562nm。

6.重組藻膽蛋白(單體)對(duì)afp免疫熒光檢測(cè)

取afp捕獲抗體，用包被緩沖液(na2co31.59g/l,nahco32.93g/l,ph9.6)稀釋至終濃度為5μg/ml。取100μl捕獲抗體溶液于熒光酶標(biāo)板微孔中。將酶標(biāo)板置于4℃靜置，過(guò)夜吸附。取出酶標(biāo)板，甩凈孔內(nèi)液體，在面巾紙上拍干。向孔內(nèi)加入200μlpbst(kh2po40.27g/l,na2hpo41.42g/l,nacl8g/l,kcl0.2g/l,tween-200.5ml/l,ph7.4)，400rpm振蕩洗滌3min，甩凈拍干，重復(fù)2次。向反應(yīng)孔中各加入100μl封閉液(10g/l，pbst配制)，置于濕盒上，37℃放置2h，pbst洗滌3次。

取afp蛋白用pbst溶液進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別為51.2ng/ml、16.8ng/ml、3.2ng/ml、0.8ng/ml、0.2ng/ml、0.05ng/ml、0ng/ml。每孔各加afp蛋白溶液100μl，37℃，400rpm振蕩孵育1h，pbst洗滌3次。取生物素化的檢測(cè)抗體，用pbst稀釋至終濃度為5μg/ml。向反應(yīng)孔中各加入100μl，37℃，400rpm振蕩孵育1h，pbst洗滌3次。

取重組藻膽蛋白(單體)樣品，用pbst稀釋至10μg/ml。向反應(yīng)孔中各加入100μl重組藻膽蛋白溶液，400rpm振蕩孵育1h后，用pbst洗滌3次。向反應(yīng)孔中加入100μlpbst，用熒光酶標(biāo)儀以530nm波長(zhǎng)光激發(fā)，測(cè)量562nm處的熒光信號(hào)。afp定量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

表1pcr擴(kuò)增中使用的特異引物

實(shí)施例2

1.基因的克隆

從美國(guó)國(guó)立生物信息中心(nationalcentreforbiotechnologyinformation,ncbi)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取synechococcuselongatusbp-1apca，synechocytissp.pcc6803ho1,prochlorococcusphagep-ssm2pebs,synechococcuselongatusbp-1cpcs和鏈霉親和素的基因sa序列(accessionno.x65082)。由此分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增apca，ho1，cpcs的特異引物(表1)。apca基因以synechococcuselongatusbp-1基因組dna為模板，ho1以synechocytissp.pcc6803基因組dna為模板，cpcs以synechococcuselongatusbp-1基因組dna為模板，按常規(guī)pcr條件擴(kuò)增獲得。sa基因和linker序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。為了便于融合pcr反應(yīng)，linker序列人工合成過(guò)程中，在其5’端和3’端分別加上sa基因和apca基因的部分序列。

2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1別藻藍(lán)蛋白α亞基串聯(lián)體(二體)的融合及其表達(dá)載體的構(gòu)建

以sa、linker和apca為模板，用引物sa-f和引物apcar，通過(guò)融合pcr擴(kuò)增，獲得融合基因sa-linker-apca(簡(jiǎn)稱：sla)。sla片段回收后，利用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切，同時(shí)把載體pcdfduet-1也利用相同的酶進(jìn)行雙酶切。分別回收載體片段和融合基因片段，然后以1:5的摩爾比進(jìn)行連接。16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣進(jìn)行dna測(cè)序，同時(shí)抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切鑒定。酶切鑒定以及dna測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的樣品用于保種，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒標(biāo)記為：pcdf-sla。

用限制性內(nèi)切酶bamhi單酶切質(zhì)粒pcdf-sla；酶切后的載體片段利用膠回收試劑盒回收后，再用堿性磷酸酶ciap處理，再次利用膠回收試劑盒回收載體片段。以質(zhì)粒pcdf-sla為模板，用引物laf和lar做pcr擴(kuò)增，得到包含有l(wèi)inker序列和apca基因序列(簡(jiǎn)寫為：la)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒將la回收后，用限制性內(nèi)切酶bamhi和bglii雙酶切，再次利用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

將上述回收得到的載體片段和酶切產(chǎn)物按照1:5的摩爾比進(jìn)行連接，16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，挑取陽(yáng)性克隆接種于3mllb培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切鑒定。根據(jù)酶切圖譜，挑選出插入方向正確的重組質(zhì)粒(圖1)，并標(biāo)記為pcdf-s(la)2。

2.2藻膽蛋白裂合酶cpcs共表達(dá)載體的構(gòu)建

將表達(dá)質(zhì)粒pcdf-s(la)2用bglii和xho雙酶切，將上述pcr擴(kuò)增得到的cpcs片段回收后，用bglii和sali雙酶切。利用膠回收試劑盒分別回收載體片段和cpcs酶切產(chǎn)物，回收后的載體片段和cpcs片段按照摩爾比1:5的比例進(jìn)行連接，16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，挑取陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序，測(cè)序無(wú)誤的樣品用于保種。構(gòu)建好的共表達(dá)質(zhì)粒標(biāo)記為pcdf-s(la)2-cpcs。

2.3藻紅膽素生物合成酶共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述pcr擴(kuò)增得到ho1基因回收后用bglii和sali雙酶切，prsfduet-1載體用bglii和xhoi雙酶切。利用膠回收試劑盒，分別回收載體片段和ho1片段，以1:5摩爾比進(jìn)行連接。16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的克隆用于保種，構(gòu)建成功的質(zhì)粒標(biāo)記為prsf-ho1。

人工合成的基因pebs和質(zhì)粒prsf-ho1均用ncoi和sali酶切，分別回收載體片段和基因片段，以1:5摩爾比進(jìn)行連接。16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的克隆用于保種，構(gòu)建成功的質(zhì)粒標(biāo)記為prsf-ho1-pebs。

3.重組藻膽蛋白單體表達(dá)菌株的構(gòu)建

將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒pcdf-s(la)2-cpcs和prsf-ho1-pebs通過(guò)共轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有100μg/ml卡那霉素和100μg/ml壯觀霉素的lb平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后。從平板上挑取單克隆，分別接種于3mllb培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含有抗生素卡那霉素和壯觀霉素)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素的60mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm條件下培養(yǎng)4小時(shí)，加入終濃度為1mmiptg誘導(dǎo)，培養(yǎng)物置于18℃，160rpm繼續(xù)培養(yǎng)16-20小時(shí)。離心收集菌體，利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，收集上清液，加入loadingbuffer后煮沸處理10分鐘，取樣進(jìn)行sds-page電泳。選擇重組蛋白表達(dá)量高的菌株，保甘油種用于后續(xù)發(fā)酵與重組蛋白的分離純化。

4.重組蛋白的發(fā)酵與分離純化

吸取甘油種200μl，接種于含有卡那霉素和壯觀霉素的15mllb培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后。將過(guò)夜培養(yǎng)物接種于含有卡那霉素和壯觀霉素的300mllb培養(yǎng)基中。37℃，200rpm條件下培養(yǎng)4小時(shí)，加入終濃度為1mmiptg，18℃條件下誘導(dǎo)20小時(shí)。

離心收集菌體，將菌體懸浮于破碎緩液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，20mmol/l咪唑，ph7.4)中，冰浴中超聲破碎30min。破碎液于4℃，8000rpm條件下離心30min，取上清液。用結(jié)合緩沖液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，20mmol/l咪唑，ph7.4)平衡鎳柱(hitrapff，ge)，上清液過(guò)柱后，再用洗滌緩沖液洗滌(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，90mmol/l咪唑，ph7.4)鎳柱，除去雜蛋白，待a280值不再變化時(shí)，用洗脫液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，500mmol/l咪唑，ph7.4)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再過(guò)g25脫鹽柱，除去蛋白樣品中的咪唑，得到重組蛋白溶液。

取純化后的蛋白樣品，加入loadingbuffer后煮沸處理10分鐘，取樣進(jìn)行sds-page電泳，電泳結(jié)果如圖2。重組藻膽蛋白的條帶在55kda和70kda之間， 與重組藻膽蛋白串聯(lián)體(二體)的分子量理論值相符。

5.重組蛋白的光譜學(xué)性質(zhì)

取少量純化后的重組藻膽蛋白樣品，用50mm磷酸鈉緩沖液(ph7.4)稀釋至10^-6mol/l，分別用于吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測(cè)定。吸收光譜采用uv1801紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)室溫條件下測(cè)定，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖3，重組藻膽蛋白二體的最大吸收峰為550nm，其光吸收值大于單體。熒光發(fā)射光譜采用f-4500熒光分光光度計(jì)室溫下測(cè)定，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為500nm，掃描波長(zhǎng)為520-600nm，熒光發(fā)射光譜見(jiàn)圖4，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為562nm，其熒光值大于單體。

6.重組藻膽蛋白串聯(lián)體(二體)對(duì)afp免疫熒光檢測(cè)

取afp捕獲抗體，用包被緩沖液(na2co31.59g/l,nahco32.93g/l,ph9.6)稀釋至終濃度為5μg/ml。取100μl捕獲抗體溶液于熒光酶標(biāo)板微孔中。將酶標(biāo)板置于4℃靜置，過(guò)夜吸附。取出酶標(biāo)板，甩凈孔內(nèi)液體，在面巾紙上拍干。向孔內(nèi)加入200μlpbst(kh2po40.27g/l,na2hpo41.42g/l,nacl8g/l,kcl0.2g/l,tween-200.5ml/l,ph7.4)，400rpm振蕩洗滌3min，甩凈拍干，重復(fù)2次。向反應(yīng)孔中各加入100μl封閉液(10g/l，pbst配制)，置于濕盒上，37℃放置2h，pbst洗滌3次。

取afp蛋白用pbst溶液進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別為51.2ng/ml、16.8ng/ml、3.2ng/ml、0.8ng/ml、0.2ng/ml、0.05ng/ml、0ng/ml。每孔各加afp蛋白溶液100μl，37℃，400rpm振蕩孵育1h，pbst洗滌3次。取生物素化的檢測(cè)抗體，用pbst稀釋至終濃度為5μg/ml。向反應(yīng)孔中各加入100μl，37℃，400rpm振蕩孵育1h，pbst洗滌3次。

取重組藻膽蛋白串聯(lián)體(二體)，用pbst稀釋至10μg/ml。向反應(yīng)孔中各加入100μl重組藻膽蛋白溶液，400rpm振蕩孵育1h后，用pbst洗滌3次。向反應(yīng)孔中加入100μlpbst，用熒光酶標(biāo)儀以530nm波長(zhǎng)光激發(fā)，測(cè)量562nm處的熒光信號(hào)。afp定量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5，在afp濃度相同的情況下，以重組藻膽蛋白二體為熒光探針的熒光信號(hào)高于單體。

實(shí)施例3

1.基因的克隆

從美國(guó)國(guó)立生物信息中心(nationalcentreforbiotechnologyinformation,ncbi)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取synechococcuselongatusbp-1apca，synechocytissp.pcc6803ho1,prochlorococcusphagep-ssm2pebs,synechococcuselongatusbp-1cpcs和鏈霉親和素的基因sa序列(accessionno.x65082)。由此分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增apca，ho1，cpcs的特異引物(表1)。apca基因以synechococcuselongatusbp-1基因組dna為模板，ho1以synechocytissp.pcc6803基因組dna為模板，cpcs以synechococcuselongatusbp-1基因組dna為模板，按常規(guī)pcr條件擴(kuò)增獲得。sa基因和linker序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。為了便于融合pcr反應(yīng)，linker序列人工合成過(guò)程中，在其5’端和3’端分別加上sa基因和apca基因的部分序列。

2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1別藻藍(lán)蛋白α亞基串聯(lián)體(三體)的融合及其表達(dá)載體的構(gòu)建

以sa、linker和apca為模板，用引物sa-f和引物apcar，通過(guò)融合pcr擴(kuò)增，獲得融合基因sa-linker-apca(簡(jiǎn)稱：sla)。sla片段回收后，利用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切，同時(shí)把載體pcdfduet-1也利用相同的酶進(jìn)行雙酶切。分別回收載體片段和融合基因片段，然后以1:5的摩爾比進(jìn)行連接。16 ℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣進(jìn)行dna測(cè)序，同時(shí)抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切鑒定。酶切鑒定以及dna測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的樣品用于保種，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒標(biāo)記為：pcdf-sla。

用限制性內(nèi)切酶bamhi單酶切質(zhì)粒pcdf-sla；酶切后的載體片段利用膠回收試劑盒回收后，再用堿性磷酸酶ciap處理，再次利用膠回收試劑盒回收載體片段。以質(zhì)粒pcdf-sla為模板，用引物laf和lar做pcr擴(kuò)增，得到包含有l(wèi)inker序列和apca基因序列(簡(jiǎn)寫為：la)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒將la回收后，用限制性內(nèi)切酶bamhi和bglii雙酶切，再次利用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

將上述回收得到的載體片段和la片段酶切產(chǎn)物按照1:5的摩爾比進(jìn)行連接，16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，挑取陽(yáng)性克隆接種于3mllb培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切鑒定。根據(jù)酶切圖譜，挑選出插入方向正確的重組質(zhì)粒(圖1)，并標(biāo)記為pcdf-s(la)2。

用限制性內(nèi)切酶bamhi單酶切質(zhì)粒pcdf-s(la)2；酶切后的載體片段利用膠回收試劑盒回收后，再用堿性磷酸酶ciap處理，再次利用膠回收試劑盒回收載體片段。

將上述回收得到的載體片段和la片段酶切產(chǎn)物按照1:5的摩爾比進(jìn)行連接，16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，挑取陽(yáng)性克隆接種于3mllb培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和saci雙酶切鑒定。根據(jù)酶切圖譜，挑選出插入方向正確的重組質(zhì)粒(圖1)，并標(biāo)記為pcdf-s(la)3。

2.2藻膽蛋白裂合酶cpcs共表達(dá)載體的構(gòu)建

將表達(dá)質(zhì)粒pcdf-s(la)3用bglii和xho雙酶切，將上述pcr擴(kuò)增得到的cpcs片段回收后，用bglii和sali雙酶切。利用膠回收試劑盒分別回收載體片段和cpcs酶切產(chǎn)物，回收后的載體片段和cpcs片段按照摩爾比1:5的比例進(jìn)行連接，16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，挑取陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序，測(cè)序無(wú)誤的樣品用于保種。構(gòu)建好的共表達(dá)質(zhì)粒標(biāo)記為pcdf-s(la)3-cpcs。

2.3藻紅膽素生物合成酶共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述pcr擴(kuò)增得到ho1基因回收后用bglii和sali雙酶切，prsfduet-1載體用bglii和xhoi雙酶切。利用膠回收試劑盒，分別回收載體片段和ho1片段，以1:5摩爾比進(jìn)行連接。16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的克隆用于保種，構(gòu)建成功的質(zhì)粒標(biāo)記為prsf-ho1。

人工合成的基因pebs和質(zhì)粒prsf-ho1均用ncoi和sali酶切，分別回收載體片段和基因片段，以1:5摩爾比進(jìn)行連接。16℃條件下連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10。從轉(zhuǎn)化平板上挑取克隆做菌液pcr，陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的克隆用于保種，構(gòu)建成功的質(zhì)粒標(biāo)記為prsf-ho1-pebs。

3.重組藻膽蛋白單體表達(dá)菌株的構(gòu)建

將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒pcdf-s(la)3-cpcs和prsf-ho1-pebs通過(guò)共轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有100μg/ml卡那霉素和100μg/ml壯觀霉素的lb平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后。從平板上挑取單克隆， 分別接種于3mllb培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含有抗生素卡那霉素和壯觀霉素)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素的60mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm條件下培養(yǎng)4小時(shí)，加入終濃度為1mmiptg誘導(dǎo)，培養(yǎng)物置于18℃，160rpm繼續(xù)培養(yǎng)16-20小時(shí)。離心收集菌體，利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，收集上清液，加入loadingbuffer后煮沸處理10分鐘，取樣進(jìn)行sds-page電泳。選擇重組蛋白表達(dá)量高的菌株，保甘油種用于后續(xù)發(fā)酵與重組蛋白的分離純化。

4.重組蛋白的發(fā)酵與分離純化

吸取甘油種200μl，接種于含有卡那霉素和壯觀霉素的15mllb培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后。將過(guò)夜培養(yǎng)物接種于含有卡那霉素和壯觀霉素的300mllb培養(yǎng)基中。37℃，200rpm條件下培養(yǎng)4小時(shí)，加入終濃度為1mmiptg，18℃條件下誘導(dǎo)20小時(shí)。

離心收集菌體，將菌體懸浮于破碎緩液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，20mmol/l咪唑，ph7.4)中，冰浴中超聲破碎30min。破碎液于4℃，8000rpm條件下離心30min，取上清液。用結(jié)合緩沖液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，20mmol/l咪唑，ph7.4)平衡鎳柱(hitrapff，ge)，上清液過(guò)柱后，再用洗滌緩沖液洗滌(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，90mmol/l咪唑，ph7.4)鎳柱，除去雜蛋白，待a280值不再變化時(shí)，用洗脫液(500mmol/lnacl，15.5mmol/lna2hpo4，4.5mmol/lnah2po4，500mmol/l咪唑，ph7.4)進(jìn)行洗脫，收集流出液，再過(guò)g25脫鹽柱，除去蛋白樣品中的咪唑，得到重組蛋白溶液。

取純化后的蛋白樣品，加入loadingbuffer后煮沸處理10分鐘，取樣進(jìn)行sds-page電泳，電泳結(jié)果如圖2。重組藻膽蛋白的條帶位于70kda和100kda之間，與重組藻膽蛋白三體的分子量理論值相符。

5.重組蛋白的光譜學(xué)性質(zhì)

取少量純化后的重組藻膽蛋白樣品，用50mm磷酸鈉緩沖液(ph7.4)稀釋至10^-6mol/l，分別用于吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測(cè)定。吸收光譜采用uv1801紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)室溫條件下測(cè)定，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖3，重組藻膽蛋白單體的最大吸收峰為550nm，其光吸收值高于單體和二體。熒光發(fā)射光譜采用f-4500熒光分光光度計(jì)室溫下測(cè)定，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為500nm，掃描波長(zhǎng)為520-600nm，熒光發(fā)射光譜見(jiàn)圖4，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為562nm，其熒光值高于單體和二體。

6.重組藻膽蛋白串聯(lián)體(三體)對(duì)afp免疫熒光檢測(cè)

取afp捕獲抗體，用包被緩沖液(na2co31.59g/l,nahco32.93g/l,ph9.6)稀釋至終濃度為5μg/ml。取100μl單抗溶液于熒光酶標(biāo)板微孔中。將酶標(biāo)板置于4℃靜置，過(guò)夜吸附。取出酶標(biāo)板，甩凈孔內(nèi)液體，在面巾紙上拍干。向孔內(nèi)加入200μlpbst(kh2po40.27g/l,na2hpo41.42g/l,nacl8g/l,kcl0.2g/l,tween-200.5ml/l,ph7.4)，400rpm振蕩洗滌3min，甩凈拍干，重復(fù)2次。向反應(yīng)孔中各加入100μl封閉液(10g/l，pbst配制)，置于濕盒上，37℃放置2h，pbst洗滌3次。

取afp蛋白用pbst溶液進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別為51.2ng/ml、16.8ng/ml、3.2ng/ml、0.8ng/ml、0.2ng/ml、0.05ng/ml、0ng/ml。每孔各加afp蛋白溶液100μl，37℃，400rpm振蕩孵育1h，pbst洗滌3次。取生物素化的檢測(cè)抗體，用pbst稀釋至終濃度為5μg/ml。向反應(yīng)孔中各加入100μl，37℃， 400rpm振蕩孵育1h，pbst洗滌3次。

取重組藻膽蛋白串聯(lián)體(三體)，用pbst稀釋至10μg/ml。向反應(yīng)孔中各加入100μl重組藻膽蛋白溶液，400rpm振蕩孵育1h后，用pbst洗滌3次。向反應(yīng)孔中加入100μlpbst，用熒光酶標(biāo)儀以530nm波長(zhǎng)光激發(fā)，測(cè)量562nm處的熒光信號(hào)。afp定量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5，在afp濃度相同的情況下，以重組藻膽蛋白三體為熒光探針的熒光信號(hào)高于單體和二體。