專利名稱：一種高穩(wěn)定性藻藍蛋白類融合熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中熒光蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種高穩(wěn)定性藻藍蛋白類 融合熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白主要存在于原核的藍藻、真核的紅藻、隱藻和甲藻(Pyrrophyta)中。 根據(jù)吸收光譜的不同，可將藻膽蛋白分為4大類即藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)， 藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin, PEC),藻藍蛋白(phycocyanin, PC)禾口另U藻藍蛋白 (allophycocyanin，APC)。藻膽蛋白脫輔基蛋白含有α和β亞基。藻膽蛋白中的色基稱 為藻膽素(Phycobilin)，藻膽素的A或D環(huán)，或A、D兩環(huán)同時與脫輔基蛋白的半胱氨酸殘基 通過硫醚鍵共價連接。藻膽素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得不同種類的藻 膽蛋白呈現(xiàn)不同的光學(xué)特性。藻紅蛋白主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射光約580nm的熒 光；藻紅藍蛋白吸收約570nm的可見光，發(fā)射光約630nm的熒光；藻藍蛋白吸收約620nm的 可見光，發(fā)射光約640nm的熒光；別藻藍蛋白吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射光約660 670nm的熒光。藻膽蛋白具有提高人體免疫力，促進動物細(xì)胞再生的功能；可以抑制癌細(xì)胞 生長，減輕腫瘤化療的副作用；同時也是一種無毒副作用的理想的光敏劑；藻膽蛋白作為 一種天然色素，也可以應(yīng)用于食品和化妝品中。由于有強烈的熒光特性，藻膽蛋白還可以制 備成熒光探針，在免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。目前使用的藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋 白的分離方法，CN1344723,2002. 04. 17 ；一種水華藍藻制備藻藍蛋白的方法，CN1563083, 2005.01. 12)；由于天然的藍藻和紅藻亞基存在著單聚體、三聚體和六聚體等多種形 式，不利于對其功能的研究和利用。專利“一種制備別藻藍蛋白熒光蛋白質(zhì)的方法， 200710029673. X, 2007. 8. 9，提供了一種利用基因工程方法生產(chǎn)重組藻藍蛋白的方法，得到 的熒光類蛋白質(zhì)具有結(jié)構(gòu)單一的特點，但是利用此種方法表達的重組熒光類藻藍蛋白，易 形成大量包涵體，得率低；更重要的是得到的重組熒光類藻藍蛋白水溶性和穩(wěn)定性差，不利 于進一步的開發(fā)研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述不足，本發(fā)明通過脫輔基藻藍蛋白和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合，提高了重組蛋白的穩(wěn)定性和水溶性。所采用技術(shù)路線為1)將藻藍蛋白脫輔基蛋白基因和麥芽糖結(jié)合蛋白融合，并與色基裂合酶基因 (cpcE和cpcF)克隆到表達載體的第一個表達框，藻膽素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)克 隆到同一載體的第二個表達框，得到一個含有多個相關(guān)基因的表達質(zhì)粒；2)將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選得到高產(chǎn)菌，應(yīng)用此工程菌發(fā)酵，經(jīng)蛋白 的分離純化，得到熒光類融合藻藍蛋白；
所述藻藍蛋白脫輔基蛋白基因是指Synechocystis PCC6803或與其同源的基因。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點1.通過脫輔基藻藍蛋白和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合，提高了重組熒光蛋白的水溶性 和穩(wěn)定性；在大腸桿菌中表達時包涵體少，目的蛋白表達量高，有利于純化，目的蛋白得率高.2.不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)新型重組光活性蛋白，大腸桿菌易于 培養(yǎng)，生長快，可以大大縮短生產(chǎn)周期；與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁易于破碎，純化過程可 以節(jié)約能源，利用率高。3.只使用一種抗生素的選擇壓力，菌種較穩(wěn)定。得到的重組蛋白含有His-tag標(biāo) 記，體系中沒有類似蛋白，通過離子螯合色譜一步純化便可獲得目的蛋白，且純度較高。4.本發(fā)明簡化了質(zhì)粒構(gòu)建過程，構(gòu)建單一質(zhì)粒，菌種較穩(wěn)定，可以規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn) 一種新型重組光活性蛋白，最大吸收波長為621nm，最大激發(fā)光波長650nm，具有優(yōu)良的熒 光性質(zhì)用于新型熒光探針領(lǐng)域；具有生物學(xué)活性，主要體現(xiàn)在抗氧化方面，為藻膽蛋白類色 素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域提供了一種簡單有效的新方 法。


圖1重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意2重組蛋白的表達SDS-PAGE和鋅電泳圖3重組蛋白純化的SDS-PAGE和鋅電泳圖4重組蛋白溶解性比較SDS-PAGE電泳5重組蛋白和天然藻藍蛋白的吸收光譜圖6重組蛋白和天然藻藍蛋白的激發(fā)光譜
具體實施例方式下面通過實施例具體說明本發(fā)明a.基因的克隆從美國國立生物信息中心(National Center for Biotechnologylnformation, NCBI)數(shù)據(jù)庫(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/)獲取 Synechocystis sp. PCC6803 的 cpcA、 cpcE、cpcF、hol、pcyA基因的序列，序列長分別為 0. 49kb、0. 88kb、0. 62kb、0. 72kb 和 0. 75kb 由此設(shè)計引物，所用的引物和反應(yīng)條件如表1，以Synechocystis sp. PCC6803基因組DNA為 模板，PCR克隆對應(yīng)的基因。b.重組質(zhì)粒的構(gòu)建將Synechocystis sp. PCC6803中脫輔基藻藍蛋白cpcA基因克隆于Novagen公司 的ρ⑶FDuet載體中，基因插入載體的步驟為把上一步經(jīng)過PCR擴增得到的cpcA基因片 段進行電泳(120V，40分鐘)，回收cpcA的PCR產(chǎn)物片段；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶 BamH I和Sac I進行雙酶切，同時把載體pCDFDuet用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別 回收酶切后cpcAPCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體ρ⑶FDuet ；酶切后的cpcA PCR產(chǎn)物片段和酶 切后的載體ρ⑶FDuet按3 μ 1 1μ 1混合，在Τ4連接酶作用下連接一定時間(16°C下16小時)，即得到質(zhì)粒pCDFDuet-cpcA ；把質(zhì)粒pCDFDuet-cpcA轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含有抗 生素的平板篩選出圓形單菌落，挑取單克隆，SDS-PAGE電泳和測序驗證。將克隆的色基裂合酶(cpcE和cpcF)按上述程序依次連接于pCDFDuet-cpcA載體 的第一個表達框中，并將麥芽糖結(jié)合蛋白基因(mbp)連接于cpcA基因的5'-端；將藻膽 素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)依次連接于pCDFDuet-cpcA-cpcE-cpcF載體的第二個表 達框中，所得質(zhì)粒叫做pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF，hol-pcyA，如圖1所示。c.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與重組菌的篩選 將質(zhì)粒pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF，hol-pcyA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21的單菌落，接種于 5mlLB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)過夜；取100 μ 1飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5ml LB液體培 養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)至OD600為0. 6左右，冰上放置IOmin ；，離心5min (5000g, 4°C )棄去上 清，收集沉淀菌體；用lmllmo 1/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s (10000g，4°C )棄去 上清，菌體沉淀用100 μ 1預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸，加入步驟2)所得質(zhì)粒，混勻后冰浴 30min, 42°C熱激90s，冰浴5min后加入400 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C低速震蕩培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速 梯度增加至正常，涂布菌液在含有相應(yīng)抗生素的LB固體平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成 可見的單克隆菌斑。挑取單克隆，經(jīng)測序驗證即得到大腸桿菌工程菌。挑取20個菌落，分別接種于5ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng) 至飽和；分別從中取出100 μ 1轉(zhuǎn)接至5ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中；37°C震蕩培養(yǎng) 至OD600為0. 8-1. 0，加入IPTG誘導(dǎo)表達，避光280C 120轉(zhuǎn)/分，表達8-10小時。離心收集 細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測定熒光量(參見圖5)，選取熒光量較高的菌株保 種。d.重組菌的5L規(guī)模發(fā)酵5L發(fā)酵罐表達別藻蛋白類新型重組光活性蛋白的程序如下取保存的菌種 100 μ 1無菌接種于5ml液體LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)12小時，然后轉(zhuǎn)接于含200ml液體 LB培養(yǎng)基的三角瓶，37°C震蕩培養(yǎng)6小時。工程菌的發(fā)酵在5L自動發(fā)酵罐中進行，體積比 5 %的接種量，誘導(dǎo)前培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時間由300-500rpm遞增，pH均自動控 制；發(fā)酵開始4h后，菌體生長至對數(shù)期，原培養(yǎng)基中的碳源接近耗盡時，以0. 08g/(L.min) 葡萄糖的速率進行補料。發(fā)酵開始約7h時，先將罐內(nèi)溫度緩慢降至25°C，然后加入誘導(dǎo)劑 IPTG至終濃度lmmol/L，降低轉(zhuǎn)速至150rpm，誘導(dǎo)培養(yǎng)IOh以上。e.重組蛋白的分離純化按照每升結(jié)合緩沖液(20mmol/L磷酸鈉，0. 5mol/L氯化鈉，20mmol/L咪唑，pH7. 4) 加入濕菌體50g的比例將菌體重懸，超聲破碎細(xì)胞30min，12000rpm，4°C條件下離心，收集 上清液，上樣于M2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液 (20mmol/L磷酸鈉，0. 5mol/L氯化鈉，500mmOl/L咪唑，pH 7. 4)洗脫，洗脫液經(jīng)G-25脫鹽柱 脫鹽后即得到目的蛋白。表 1 重組蛋白的表達形式分析圖2為重組蛋白的表達SDS-PAGE和鋅電泳；圖3為重組蛋白純化的SDS-PAGE和鋅電泳；如圖4所示，重組蛋白菌體加入適量破碎緩沖液，經(jīng)超聲波破碎后，取50 μ 1破碎 液加入等體積2XSDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸l(wèi)Omin，離心后取上清為總蛋白(T)；另取破碎 液離心，取上清加入等體積2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸l(wèi)Omin，離心后取上清為可溶性 蛋白(S)。每樣上樣15 μ 1。電泳采用12%分離膠。箭頭所示為目的蛋白條帶。M為蛋白Marker，左邊數(shù)字為蛋白分子量。T為總蛋白條帶；M為可溶性蛋白條帶?？偟鞍着c可溶性 蛋白亮度基本一致(圖4)，證明重組蛋白是以可溶性蛋白形式表達，而非包涵體形式表達。重組蛋白與天然藻藍蛋白的光譜學(xué)性質(zhì)比較如圖5所示，重組蛋白(a)與天然藻藍蛋白(b)在500-800nm波長的吸收圖譜。兩 者的最大吸收波長一致，為623nm。如圖6所示，重組蛋白(a)與天然藻藍蛋白(b)在400-800nm波長的熒光發(fā)射圖 譜，激發(fā)波長為620nm。兩者的最大發(fā)射波長一致，為650nm。如圖5和6所示，光譜學(xué)試驗結(jié)果表明，重組蛋白與天然蛋白有相似的光譜學(xué)特 征。序列表SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院海洋研究所<120> 一種高穩(wěn)定性藻藍蛋白類融合熒光蛋白質(zhì)的制備方法<130><140>200910019914· 1<141>2009-03-14<160>12<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工合成<220><221>gene<222>(1). . (29)<223><400>1tgtgtggatc cgatgaaaac ccccctaac29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工合成<220><221>gene<222>(1). . (29)<223><400>2 acaaggagct caactagctt agggcgttg29<210>3
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一種熒光類融合藻藍蛋白的生物合成方法，其特征包括以下步驟1)將藻藍蛋白脫輔基蛋白基因和麥芽糖結(jié)合蛋白融合，并與色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表達載體的第一個表達框，藻膽素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克隆到同一載體的第二個表達框，得到一個含有多個相關(guān)基因的表達質(zhì)粒；2)將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選得到高產(chǎn)菌，應(yīng)用此工程菌發(fā)酵，經(jīng)蛋白的分離純化，得到熒光類融合藻藍蛋白。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述藻藍蛋白脫輔基蛋白基因是指 Synechocystis PCC6803或與其同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高穩(wěn)定性藻藍蛋白類融合熒光蛋白質(zhì)的制備方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。包括以下步驟1)將藻藍蛋白脫輔基蛋白基因和麥芽糖結(jié)合蛋白融合，并與色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表達載體的第一個表達框，藻膽素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克隆到同一載體的第二個表達框，得到一個含有多個相關(guān)基因的表達質(zhì)粒；2)將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選得到高產(chǎn)菌，應(yīng)用此工程菌發(fā)酵，經(jīng)蛋白的分離純化，得到熒光類融合藻藍蛋白。本發(fā)明有以下優(yōu)點1.提高了重組熒光蛋白的水溶性和穩(wěn)定性；2.縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約能源，利用率高。
文檔編號C12R1/89GK101838661SQ20091001991
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月14日
發(fā)明者劉少芳, 秦松, 陳華新 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所