本發(fā)明涉及抑制磷脂酶A2提高飼料轉(zhuǎn)化率的新方法，更具體地說(shuō)，涉及一種利用基因工程重組抗磷脂酶A2單抗的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：最新的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，畜禽和水生動(dòng)物體內(nèi)分泌的一種磷脂酶A2會(huì)水解膽汁中磷脂，破壞消化系統(tǒng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成份的吸收過(guò)程；同時(shí)，會(huì)攻擊細(xì)胞膜磷脂，破壞脂質(zhì)細(xì)胞膜而使細(xì)胞壞死，直接阻礙了畜禽和水生動(dòng)物的生長(zhǎng)速度。造成飼料轉(zhuǎn)化率不高，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。采用傳統(tǒng)的方法制備磷脂酶A2抗原免疫產(chǎn)蛋雞，再?gòu)漠a(chǎn)蛋雞所產(chǎn)蛋之蛋黃中提取抗磷脂酶A2-IgY，然后用這種IgY抗體來(lái)抑制磷脂酶A2；從而，達(dá)到提高飼料轉(zhuǎn)化率的目的，是一種有效途徑。但是這種傳統(tǒng)方法工序繁復(fù)，效率低；難于滿足飼料業(yè)和養(yǎng)殖界對(duì)抗磷脂酶A2抗體的巨大需求。本發(fā)明提供了一種可特異性中和及抑制磷脂酶A2的單抗Ig，并且以基因工程菌發(fā)酵的方法制備這種抗磷脂酶A2單抗。傳統(tǒng)制備抗體有單抗和多抗之分，單抗的特異性強(qiáng)，純度高，重復(fù)性好，免疫效果比多抗好；但單抗制備過(guò)程繁瑣，缺乏簡(jiǎn)便性和易操作性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，提供一種抗磷脂酶A2單抗的制備方法及應(yīng)用，解決現(xiàn)有技術(shù)中單抗制備過(guò)程繁瑣、生產(chǎn)規(guī)模受限等問(wèn)題。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的方案在于，提供一種抗磷脂酶A2單抗的制備方法，包括如下步驟：S100、將磷脂酶A2與載體蛋白連接，制備免疫用抗原；S200、進(jìn)行免疫和細(xì)胞融合，制得雜交瘤細(xì)胞；S300、構(gòu)建抗磷脂酶A2單鏈抗體基因，并將所述抗磷脂酶A2單鏈抗體基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入工程菌，制得重組工程菌；S400、將所述重組工程菌發(fā)酵放大，收集菌體、抗體蛋白、抗體包容體中的至少一種。在本發(fā)明提供的抗磷脂酶A2單抗的制備方法中，所述步驟S100中，所述載體蛋白包括牛血清蛋白、卵清白蛋白、多聚氨基酸中的至少一種；磷脂酶A2與載體蛋白連接的方法包括：碳化二亞胺法、戊二醛法、混和酸酐法、過(guò)碘酸氧化法、琥珀酸酐法、羧甲基羥胺法、重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法、一氯醋酸鈉法。在本發(fā)明提供的抗磷脂酶A2單抗的制備方法中，所述步驟S200具體包括如下步驟：S201、使用所述免疫用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫注射，分離獲得免疫細(xì)胞；所述動(dòng)物免疫注射為小劑量長(zhǎng)周期免疫注射、腹腔超強(qiáng)免疫注射中的至少一種；S201、將所述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，制得雜交瘤細(xì)胞。在本發(fā)明提供的抗磷脂酶A2單抗的制備方法中，所述步驟S300具體包括如下步驟：S301、擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因；S302、VH、VL可變區(qū)基因的克?。籗303、ScFv基因的擴(kuò)增及pMAL-ScFv重組質(zhì)粒的構(gòu)建；S304、ScFv蛋白的表達(dá)。在本發(fā)明提供的抗磷脂酶A2單抗的制備方法中，所述步驟S301中，使用的兼并引物包括：①5′-ACGTTTKATTTCCAGCTTGG-3′；②5′-GAYATTGTGYTRACACAGTC-3′；③5′-CGCAGAGACAGTGACCAGAGT-3′；④5′-CAGGTGCAGCTGAAGSARTC-3′；所述步驟S304中，使用的工程菌為大腸桿菌、畢赤酵母、假絲酵母、多 型漢遜酵母、乳酸克魯維酵母中的至少一種。在本發(fā)明提供的抗磷脂酶A2單抗的制備方法中，所述步驟S400中，收集抗體蛋白或抗體包容體時(shí)，破碎菌體使用酶解-超聲法破碎、高壓勻漿破碎中的至少一種。在本發(fā)明提供的抗磷脂酶A2單抗的制備方法中，所述步驟S400中，收集重組工程菌的菌體后干燥，或者將含有重組工程菌菌體的發(fā)酵液干燥，制成抗磷脂酶A2單抗的菌體干粉；或者，將破碎菌體得到的菌體液使用離心、超濾、凝膠層析、親和層析中的任意一種方法進(jìn)行純化，細(xì)菌病毒濾除處理后直接使用或者冷凍干燥或低溫噴霧干燥制成高純度抗磷脂酶A2單抗的蛋白干粉；或者，將破碎菌體得到的菌體液直接干燥制成抗磷脂酶A2單抗的菌體液干粉。在本發(fā)明提供的抗磷脂酶A2單抗的制備方法中，所述步驟S400之后還包括：S500、抗磷脂酶A2單抗的納米化；S600、抗磷脂酶A2單抗的包被。在本發(fā)明提供的抗磷脂酶A2單抗的制備方法中，所述步驟S500中，抗磷脂酶A2單抗的菌體干粉、蛋白干粉、菌體液干粉，經(jīng)過(guò)納米化后，大小在1-100nm之間、粒度超過(guò)15000目；所述步驟S600中，使用抗酸材料包被抗磷脂酶A2單抗。本發(fā)明還提供一種上述制備方法所制備的所述抗磷脂酶A2單抗，在畜類、禽類和水生動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用。實(shí)施本發(fā)明，具有如下有益效果：本發(fā)明在制得優(yōu)質(zhì)的高活性單抗的基礎(chǔ)上，采用基因技術(shù)克隆工程菌，然后通過(guò)將基因工程菌發(fā)酵來(lái)大量復(fù)制的方式大規(guī)模擴(kuò)增生產(chǎn)所需要的抗體；制備的抗磷脂酶A2單抗在畜類、禽類和水生動(dòng)物養(yǎng)殖中應(yīng)用時(shí)，就會(huì)在胃腸道有效抑制磷脂酶A2，改善飼料轉(zhuǎn)化效率，增加營(yíng)養(yǎng)吸收，降低料肉比，提升養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明抗磷脂酶A2單抗的制備方法較佳實(shí)施例的流程圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式，闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施方式僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。圖1示出了本發(fā)明抗磷脂酶A2單抗的制備方法較佳實(shí)施例的流程圖，如圖1所示，本實(shí)施例的抗磷脂酶A2單抗的制備方法，包括如下步驟：S100、將磷脂酶A2與載體蛋白連接，制備免疫用抗原；S200、進(jìn)行免疫和細(xì)胞融合，制得雜交瘤細(xì)胞；S300、構(gòu)建抗磷脂酶A2單鏈抗體基因，并將所述抗磷脂酶A2單鏈抗體基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入工程菌，制得重組工程菌；S400、將所述重組工程菌發(fā)酵放大，收集菌體、抗體蛋白、抗體包容體中的至少一種?，F(xiàn)就本發(fā)明抗磷脂酶A2單抗的制備方法，分步描述如下：一、制備并純化磷脂酶A2二、制備免疫用抗原由于磷脂酶A2分子量很小，是小分子物質(zhì)，只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OV)、多聚氨基酸(通常為多聚賴氨酸PL)等載體蛋白連接后，才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生較高活性的抗體。本發(fā)明選擇蛋白質(zhì)類、多肽聚合物、大分子聚合物等作為偶聯(lián)載體，選擇如小分子肽類、雙功能的亞氨酸酯等作為偶聯(lián)試劑。連接方法有很多種，如碳化二亞胺法、戊二醛法、混和酸酐法、過(guò) 碘酸氧化法、琥珀酸酐法、羧甲基羥胺法、重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法、一氯醋酸鈉法等，其中最主要的有兩種：活性酯法和酸酐法。鑒于磷脂酶A2性質(zhì)不活潑，不具有能和蛋白質(zhì)連接的活性基團(tuán)；因此，首先要將活性基團(tuán)引入磷脂酶A2中，然以活性基團(tuán)作為“橋梁”才能將磷脂酶A2與載體蛋白連接起來(lái)。本發(fā)明以其中一種方法為例說(shuō)明，但不限于這種方法。具體做法如下：將磷脂酶A2溶于毗陡(催化劑)、甲醇、水混合液中，再加入(氨氧基)乙酸半鹽酸，然后回流，室溫條件下放靜置過(guò)夜；次日取出抽真空干燥，將所得沉淀物以少量甲醇或氯仿溶解，再以氯仿、甲醇混合液為展開(kāi)劑，進(jìn)行薄層層析展開(kāi)，收集組份，必要時(shí)可進(jìn)行第二次薄層層析。將引入活性基團(tuán)的磷脂酶A2和等摩爾數(shù)量的“N、N′-二環(huán)已基碳酰亞胺”與“N-羥基唬珀酰亞胺”溶于無(wú)水四氫呋喃，在30℃溫度下振蕩60min，再以4000轉(zhuǎn)/min離心15min，用無(wú)水四氫吠喃洗滌沉淀2-3次，合并上清液；待上清中四氫呋喃揮發(fā)后，殘留物溶于二甲基甲酰胺，將此溶液滴加于10％BSA溶液中，緩慢搖勻30min，用0.lmol/L的NaHCO3溶液透析72h，去除沒(méi)有結(jié)合的磷脂酶A2，冷凍干燥后即為獲得可用于免疫的磷脂酶A2與BSA的連接物。三、免疫和細(xì)胞融合可采用多種方法進(jìn)行免疫和細(xì)胞融合，本發(fā)明以其中兩種方法說(shuō)明，但不限于這兩種方法。方法一：小劑量長(zhǎng)周期免疫注射。6～8周齡的雌性BALB/c小鼠(體重18～20g)，首次免疫用50-100μg磷脂酶A2與BSA的連接物，與等量完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。2周后，再用50-100μg磷脂酶A2與BSA的連接物，與等量不完全福氏佐劑混勻后，腹腔注射。此后每隔2周用50-100μg磷脂酶A2與BSA的連接物，與等量不完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。8周后脾內(nèi)免疫，50-100μg磷脂酶A2與BSA的連接物作為加強(qiáng)免疫，3d后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)以(10-1：1-10)體積比混合，用 50％聚乙二醇(PEG)作融合劑，融合細(xì)胞懸于含20％小牛血清的選擇培養(yǎng)基內(nèi)，分種于加有BALB/c小鼠腹腔滲出細(xì)胞作滋養(yǎng)層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置5％CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)鏡檢雜交瘤克隆生長(zhǎng)達(dá)1/3～1/2視野時(shí)，取上清進(jìn)行篩選。方法二：腹腔超強(qiáng)免疫注射。取高壓PBS溶解磷脂酶A2與BSA的連接物至50-100μg/mL，與等量FCA混合，充分乳化后免疫6周齡BALB/c小鼠3只/組，免疫2組，免疫劑量為每只0.1-0.5mL，免疫方式為背部皮下6點(diǎn)注射。然后，以間接ELISA、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA挑選效價(jià)最高、IC50最低的小鼠為細(xì)胞融合備用鼠，采用50ug/只的免疫劑量進(jìn)行腹腔注射式超強(qiáng)免疫。融合后待細(xì)胞，通過(guò)間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高的雜交瘤細(xì)胞克隆化，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、建株、反復(fù)凍存與復(fù)蘇。采用上述方法進(jìn)行免疫和細(xì)胞融合后，就可制得磷脂酶A2雜交瘤細(xì)胞。四、抗磷脂酶A2單鏈抗體基因的構(gòu)建及其在工程菌中表達(dá)可選擇大腸桿菌以及各種酵母菌【如畢赤酵母(Pichia)、假絲酵母(Candida)、多型漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)等“甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母”以及“裂殖酵母”、乳酸克魯維酵母等】和其他適合的優(yōu)質(zhì)菌作為重組工程菌。必須根據(jù)不同的工程菌采用不同的常規(guī)方法進(jìn)行表達(dá)。以下分別以大腸桿菌(E.coli)和酵母菌(yeast)作重組工程菌為例說(shuō)明，但不限于這兩種菌。選用其它工程菌表達(dá)時(shí)，可對(duì)照以下程序和方法采用適合該種工程菌的具體表達(dá)方法操作，本文就不贅述。(一)抗磷脂酶A2單鏈抗體基因的構(gòu)建及其在大腸桿菌中表達(dá)1.PCR引物擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。根據(jù)GenBank公布BALB/c鼠源性單克隆抗體可變區(qū)序列設(shè)計(jì)框架區(qū)序列兼并引物:①5′-ACGTTTKATTTCCAGCTTGG-3′；②5′-GAYATTGTGYTRACACAGTC-3′；③5′-CGCAGAGACAGTGACCAGAGT-3′；④5′-CAGGTGCAGCTGAAGSARTC-3′。SOE-PCR擴(kuò)增引物:1,5′-GAATTCGACATTGTGTTGACACAGTC-3′；2,5′-GGATCCACCACCACCTGAGCCGCCGCCGCCACGTTTGATTTCCAGCTTGG-3′；3,5′-GGTGGTGGTGGATCCGGAGGAGGAGGCTCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3′；4,5′-AAGCTTTTATCACGCAGAGACAGTGACCAGAGT-3′。2.VH、VL可變區(qū)基因的克隆分別取生長(zhǎng)良好，能持續(xù)分泌McAb的磷脂酶A2雜交瘤細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，凍存?zhèn)溆?。用兼并引物①、②和③、④分別擴(kuò)增抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因。回收輕、重鏈可變區(qū)基因的PCR產(chǎn)物，將其與pMD18-TSimple載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒T-VL、T-VH，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取克隆質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。3.ScFv基因的擴(kuò)增及pMAL-ScFv重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)正確擴(kuò)增出的輕、重鏈可變區(qū)基因，按5′VL-Linker-VH3′的方向設(shè)計(jì)并合成了SOE-PCR引物。其中Linker為(Gly4Ser)3，引物1含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，引物4含有HindⅢ酶切位點(diǎn)。以SOE-PCR擴(kuò)增引物1、2和3、4為引物分別從重組質(zhì)粒T-VL、T-VH擴(kuò)增加入Linker片段的VL、VH基因，將克隆的VL、VH基因經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化后，以回收產(chǎn)物互為模板，利用引物1和4擴(kuò)增全長(zhǎng)單鏈抗體(single-chainantibodyfragment，ScFv)的基因片段。瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。將上述純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-TSimple載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取重組質(zhì)粒，以重組質(zhì)粒為模板，1、4為引物進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的陽(yáng)性菌種進(jìn)行 測(cè)序。將重組質(zhì)粒用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，膠回收約750bp目的片段，連接經(jīng)同樣雙酶切、膠回收后的pMAL-p2X表達(dá)載體4℃過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒后，做EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切及PCR鑒定。4.ScFv可溶性蛋白的表達(dá)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1感受態(tài)，轉(zhuǎn)化菌涂布于含Amp+的LB瓊脂板，挑取單克隆菌落接種于4mL(含100mg/L氨芐青霉素)LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)6h后，以1∶100接種于LB培養(yǎng)基中，待D600nm值在0.6～0.8之間時(shí)，加入IPTG，使其終濃度達(dá)到0.2mmol/L，18℃繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜后，4℃12000r/min離心5min收集菌體液。就可得到克隆了抗磷脂酶A2抗體Ig的大腸桿菌菌體液。(二)抗磷脂酶A2單鏈抗體基因的構(gòu)建及其在酵母菌中表達(dá)以下以酵母菌中一種—巴氏畢赤酵母為例說(shuō)明：1.PCR引物擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因根據(jù)GenBank公布BALB/c鼠源性單克隆抗體可變區(qū)序列設(shè)計(jì)框架區(qū)序列兼并引物:④5′-ACGTTTKATTTCCAGCTTGG-3′；⑤5′-GAYATTGTGYTRACACAGTC-3′；⑥5′-CGCAGAGACAGTGACCAGAGT-3′；④5′-CAGGTGCAGCTGAAGSARTC-3′。SOE-PCR擴(kuò)增引物:1,5′-GAATTCGACATTGTGTTGACACAGTC-3′；2,5′-GGATCCACCACCACCTGAGCCGCCGCCGCCACGTTTGATTTCCAGCTTGG-3′；3,5′-GGTGGTGGTGGATCCGGAGGAGGAGGCTCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3′；4,5′-AAGCTTTTATCACGCAGAGACAGTGACCAGAGT-3′。2.VH、VL可變區(qū)基因的克隆分別取生長(zhǎng)良好，能持續(xù)分泌McAb的磷脂酶A2雜交瘤細(xì)胞，用Trizol 法提取總RNA。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，凍存?zhèn)溆?。用兼并引物①、②和③、④分別擴(kuò)增抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因?；厥蛰p、重鏈可變區(qū)基因的PCR產(chǎn)物，將其與pMD18-TSimple載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒T-VL、T-VH，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取克隆質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。3.ScFv基因的擴(kuò)增及pMAL-ScFv重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)正確擴(kuò)增出的輕、重鏈可變區(qū)基因，按5′VL-Linker-VH3′的方向設(shè)計(jì)并合成了SOE-PCR引物。其中Linker為(Gly4Ser)3，引物1含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，引物4含有HindⅢ酶切位點(diǎn)。以1、2和3、4為引物分別從重組質(zhì)粒T-VL、T-VH擴(kuò)增加入Linker片段的VL、VH基因，將克隆的VL、VH基因經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化后，以回收產(chǎn)物互為模板，利用引物1和4擴(kuò)增全長(zhǎng)基因片段。瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。將回收的基因片段用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后，克隆至酵母整合型表達(dá)載體pGAPZαA相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliTop10F′后，在抗ZeocinTM的平板上篩選，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。4.巴氏畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及鑒定將測(cè)序分析正確的重組表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ線性化后，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴氏畢赤酵母GS115。在YPD固體培養(yǎng)基(含100μg/mlZeocinTM)中培養(yǎng)2～3d，挑取陽(yáng)性克隆，提取重組酵母基因組DNA，以其為模板，P3、P4為引物，進(jìn)行PCR鑒定。以空載體轉(zhuǎn)化菌作為對(duì)照。5.制備重組巴氏畢赤酵母菌菌體液。將陽(yáng)性重組酵母菌在常規(guī)條件下培養(yǎng)5～6d，收集培養(yǎng)液，離心取上清；就可得到克隆了抗磷脂酶A2-Ig的酵母菌菌體液。采用以上方法但不限于以上方法，在大腸桿菌以及各種酵母菌【如畢赤酵母(Pichia)、假絲酵母(Candida)、多型漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)等“甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母”以及“裂殖酵母”等】和其他適合的優(yōu)質(zhì)菌中進(jìn)行功能性表達(dá)，就可得到克隆了抗磷脂酶A2抗體Ig的大腸桿菌或者各種酵母菌(如“甲 醇營(yíng)養(yǎng)型酵母”和“裂殖酵母”等)和其他適合的優(yōu)質(zhì)菌之菌體液。五、重組工程菌發(fā)酵放大(一)重組大腸桿菌發(fā)酵放大以下以150L發(fā)酵罐為例說(shuō)明。實(shí)際生產(chǎn)可參照下例根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模調(diào)整種子液的數(shù)量以及前發(fā)酵罐和后發(fā)酵罐的大小。具體生產(chǎn)工藝條件也可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整。1.選擇培養(yǎng)基：可用LB培養(yǎng)基，也可甘油培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基或其他適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。2.制備發(fā)酵種子液：挑取克隆了抗磷脂酶A2抗體Ig的E.coli菌體液，接種到LB培養(yǎng)基中，37℃下200r/min培養(yǎng)8h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，再轉(zhuǎn)接于1000mL(可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整)LB培養(yǎng)液，37℃下200r/min培養(yǎng)12～14h作為種子液。3.發(fā)酵條件：分別將9和90L(可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整)培養(yǎng)基及消泡劑加入到15L前發(fā)酵罐(可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整)和150L(可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整)后發(fā)酵罐中，調(diào)通氣量為4L/min、罐壓為0.02～0.04MPa。將1000mL種子液(可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整)加入到15L前發(fā)酵罐(可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整)中，使其濃度為100mL/L。初始攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，在發(fā)酵過(guò)程中，每隔1h無(wú)菌取樣1次，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將前發(fā)酵罐發(fā)酵菌液壓入到后發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵，再繼續(xù)培養(yǎng)8h，取上清液，就大量獲得重組大腸桿菌發(fā)酵制備的抗磷脂酶A2抗體Ig的菌體液。(二)重組酵母菌發(fā)酵放大將克隆了抗磷脂酶A2抗體Ig的酵母菌菌體液接種于YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，次日按5％的接種量接種于裝有培養(yǎng)基的中間發(fā)酵罐中，30℃，250r/min培養(yǎng)至A600值為2～6。按10％的接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的大型發(fā)酵罐中發(fā)酵168h。發(fā)酵罐溫度控制在30℃，攪拌速率為550r/min，溶氧控制在30％，流加氨水控制在pH5～7。取上清液，就大量獲得重組酵母菌發(fā)酵制備的抗磷脂酶A2抗體Ig的菌體液。如選擇“甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母”作為重組工程菌，則最好采用三步發(fā)酵法對(duì)重組酵母菌進(jìn)行發(fā)酵及誘導(dǎo)。具體步驟如下：(1)甘油分批培養(yǎng)：按5％的接種量將二級(jí)種子液接種于滅菌的盛有200L發(fā)酵培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，設(shè)定初始發(fā)酵參數(shù)：攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min，通氣量為45L/min，罐壓為0.05MPa，溫度為30℃，控制恒定pH值，通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量及罐壓等措施使DO值維持在20％～35％，共20h。(2)甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)：當(dāng)DO值陡然上升至100％時(shí)，轉(zhuǎn)入短時(shí)間的甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段，以進(jìn)一步提高菌體密度。以18.15ml/(h·L)的速率流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，維持4h，在此階段同樣采取提高攪拌速度、增加通氣量、增加罐壓等措施維持DO值在20％～35％，停止補(bǔ)加甘油后，DO值上升至100％后，繼續(xù)維持“甘油饑餓”狀態(tài)1h。菌體培養(yǎng)階段每2h取樣1次，測(cè)定菌體A600值及菌體濕重。(3)甲醇補(bǔ)料分批誘導(dǎo)表達(dá)階段：將溫度調(diào)至最適誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的流加速率先以3.6ml(h·L)維持4h，再以7.2ml(h·L)流加2h，然后以11.7ml/(h·L)流加至誘導(dǎo)結(jié)束，通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量、罐壓和甲醇流加速率等措施使DO值維持在20％～35％。誘導(dǎo)階段共48h，取上清液，就大量獲得重組酵母菌發(fā)酵制備的抗磷脂酶A2抗體Ig的菌體液。采用以上方法但不限于以上方法，通過(guò)采用各種相對(duì)應(yīng)的方法將克隆了抗磷脂酶A2抗體Ig的大腸桿菌或者各種酵母菌【如畢赤酵母(Pichia)、假絲酵母(Candida)、多型漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)等“甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母”以及“裂殖酵母”等】和其他適合的優(yōu)質(zhì)菌之單菌落進(jìn)行無(wú)限次發(fā)酵放大，就可分別大量得到含克隆了抗磷脂酶A2抗體Ig的大腸桿菌或者各種酵母菌(如“甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母”和“裂殖酵母”等)和其他適合的優(yōu)質(zhì)菌之菌體液。六、菌體收集發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，用管式連續(xù)流式離心機(jī)或其他離心機(jī)對(duì)上清液進(jìn)行離心，從上清液中離心收集表達(dá)有抗磷脂酶A2抗體Ig的重組大腸桿菌菌體或重組酵母菌菌體，分裝后于20℃以下保存。七、抗磷脂酶A2單抗Ig的組合和重組工程菌菌體液除菌和干燥加工將離心收集的表達(dá)有抗磷脂酶A2單抗Ig的重組大腸桿菌菌體(或重組酵母菌體)采用巴氏消毒和超高溫瞬時(shí)殺菌法以及其他不會(huì)影響抗體活性的消毒方法除菌(如果整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌條件下完成，則可不經(jīng)除菌工序)；最后，采用冷凍干燥機(jī)或中低溫噴霧干燥機(jī)或者流化床干燥機(jī)以及其他形式的干燥設(shè)備進(jìn)行干燥，除去水份?；蛘?，將這重組大腸桿菌菌體液(或重組酵母菌體)置入攪拌機(jī)中充分混合均勻；然后，采用巴氏消毒和超高溫瞬時(shí)殺菌法以及其他不會(huì)影響抗體活性的消毒方法除菌(如果整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌條件下完成，則可不經(jīng)除菌工序)；最后，采用冷凍干燥機(jī)或中低溫噴霧干燥機(jī)或者流化床干燥機(jī)以及其他形式的干燥設(shè)備進(jìn)行干燥，除去水份。即制得基因重組的抗磷脂酶A2單抗Ig的菌體干粉。八、抗磷脂酶A2單抗Ig菌體破碎制備以及可溶性抗體由于工程菌中表達(dá)的抗磷脂酶A2單抗Ig是胞內(nèi)物質(zhì)，而且還有不少是不溶性的包含體；為了獲得更高純度的抗體，必須將把細(xì)胞破碎，才能將這些細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗磷脂酶A2單抗Ig釋放出來(lái)進(jìn)行后續(xù)分離純化。本發(fā)明采用以下兩種方法進(jìn)行細(xì)胞破碎，但不限于這兩種方法：(一)酶解-超聲法破碎1.酶解將離心收集的抗磷脂酶A2單抗Ig的重組大腸桿菌菌體液或重組酵母菌體液用生理鹽水洗滌，再加入5-10倍體積的SolutionA和適量的溶菌酶，混合均勻。2.超聲波破碎將酶解后重組大腸桿菌菌體液或重組酵母菌體置于冰浴中，分別在一定功率(400W，500W，600W)下進(jìn)行超聲波破碎處理0～120次(每次超聲4s，間隔8s)。(二)高壓勻漿破碎將離心收集的抗磷脂酶A2單抗Ig的重組大腸桿菌菌體液或重組酵母菌體液用去離子水懸浮，采用細(xì)胞高壓勻漿機(jī)在60-100MPa壓力下，連續(xù)高壓 勻漿2-5次，每次通過(guò)勻漿機(jī)的裂解液用冰浴冷卻，使得勻漿器出口溫度不超過(guò)40℃。另外，還可采用化學(xué)滲透法和凍融法以及單純超聲法等方法破碎抗磷脂酶A2單抗Ig的重組大腸桿菌菌體或重組酵母菌體。經(jīng)破碎處理后，將細(xì)胞裂解液高速離心，即獲得抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白的上清和包含體。九、抗磷脂酶A2單抗Ig菌體和可溶性抗體蛋白的純化1.菌體液的純化和干燥：將離心收集的抗磷脂酶A2單抗Ig的重組大腸桿菌菌體液(或重組酵母菌體液)經(jīng)任何常規(guī)方法離心、任何常規(guī)方法超濾和任何常規(guī)方法凝膠層析以及任何常規(guī)方法親和層析進(jìn)行純化，可將純化后的菌體液直接使用，也可將其再經(jīng)過(guò)冷凍干燥或低溫噴霧干燥制成高純度的菌體液干粉使用。也可將抗磷脂酶A2單抗Ig的重組大腸桿菌菌體液(或重組酵母菌體液)置入攪拌機(jī)中充分混合均勻；然后經(jīng)任何常規(guī)方法離心、任何常規(guī)方法超濾和任何常規(guī)方法凝膠層析以及任何常規(guī)方法親和層析進(jìn)行純化；可將純化后的菌體液直接使用，也可將其再經(jīng)過(guò)冷凍干燥或低溫噴霧干燥制成高純度抗體的菌體液干粉使用。2.菌體破碎后的可溶性抗體蛋白的純化和干燥：將離心收集的抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白的上清和包含體溶液經(jīng)任何常規(guī)方法離心、超濾和凝膠層析以及親和層析進(jìn)行純化，可將純化后的可溶性抗體蛋白液經(jīng)過(guò)細(xì)菌病毒濾除處理后直接使用；也可將其經(jīng)過(guò)細(xì)菌病毒濾除處理后再冷凍干燥或低溫噴霧干燥制成高純度可溶性抗體蛋白干粉使用。細(xì)菌病毒濾除處理設(shè)備可采用美國(guó)PallUltrafineFiltrationCompany制造的或其他公司制造的細(xì)菌病毒濾除裝置，其第一道細(xì)菌濾除裝置是用0.22μm膜除菌過(guò)濾器除去沙門(mén)菌(Salmonella)等細(xì)菌，第二道支原體濾除裝置是用0.1μm膜除支原體過(guò)濾器除去支原體，第三道病毒濾除裝置是用UltiporVFTMDV50除病毒過(guò)濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。用于生產(chǎn)飼料和飼料添加劑以及一般獸藥，離心收集的抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白的上清和包含體溶液可不必經(jīng)過(guò)離心、超濾和層析等純化以及除菌和除病毒工序而直接干燥制成可溶性抗體蛋白干粉使用。十、抗磷脂酶A2單抗Ig納米化取所制得的基因重組的抗磷脂酶A2單抗Ig菌體干粉、菌體液干粉或抗體蛋白干粉加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之間、粒度超過(guò)≥15000目的超微粒子，制得抗磷脂酶A2單抗Ig納米菌體干粉、納米菌體液干粉或抗體蛋白干粉。以上是納米化的其中一種方法，實(shí)際應(yīng)用中不限于這種方法。十一、抗磷脂酶A2單抗Ig的包被為了使抗磷脂酶A2單抗Ig不被胃酸破壞而到達(dá)腸道產(chǎn)生作用并通過(guò)腸道粘膜進(jìn)入體內(nèi)發(fā)產(chǎn)生作用，最好將所制成的抗磷脂酶A2單抗Ig用脂質(zhì)體或其他抗酸材料包被。其中脂質(zhì)體包被的方法如下：把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將抗磷脂酶A2單抗Ig納米菌體干粉或納米抗體蛋白干粉或納米抗體菌體液干粉加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成溶液，超聲處理2min(每處理0.5min，間歇.0.5min)，立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的菌體或抗體蛋白，將其中沉淀物進(jìn)行水洗，再離心得最終沉淀物，將最終沉淀物冷凍干燥，即制得抗磷脂酶A2單抗Ig納米脂質(zhì)體菌體干粉或納米脂質(zhì)體抗體蛋白干粉。以上是脂質(zhì)體化的其中一種方法，實(shí)際應(yīng)用中不限于這種方法。本發(fā)明把按上述方法制備的以下基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig之菌體液或干粉以及抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白的上清和干粉及包含體溶液和干粉(包括將其納米脂質(zhì)體化和包被后的產(chǎn)品)配以玉米蛋白粉或小麥粉或氨基酸粉或工業(yè)葡萄糖等載體成份或輔料或溶劑，制成各種畜禽和水生動(dòng)物用飼料和飼料添加劑或預(yù)配料或水劑或者水產(chǎn)養(yǎng)殖專用的浸浴劑和潑灑劑。具體復(fù)配比例可根據(jù)實(shí)際情況確定?？梢园?.01—100％的基因工程重 組單抗或復(fù)合單抗配以99.99—0％的玉米蛋白粉或小麥粉等載體成份或輔料或溶劑。本發(fā)明畜禽或水生動(dòng)物食用含有這些基因工程重組單抗的飼料、飼料添加劑或預(yù)配料和水劑后，或者水生動(dòng)物采用含有這些基因工程重組單抗的專用浸浴劑浸浴和潑灑劑潑灑后，其中所含基因工程重組單抗就會(huì)在胃腸道有效抑制磷脂酶A2，改善飼料轉(zhuǎn)化效率，增加營(yíng)養(yǎng)吸收，降低料肉比，提升養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。另外，本發(fā)明中所提及的飼料包括生物飼料和發(fā)酵飼料等。以下結(jié)合具體實(shí)施例1-3，對(duì)本發(fā)明抗體結(jié)合效價(jià)作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig菌體液對(duì)磷脂酶A2的抗體結(jié)合效價(jià)檢測(cè)檢測(cè)基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig菌體液對(duì)磷脂酶A2抗原的抗體結(jié)合效價(jià)：采用磷脂酶A2作為檢測(cè)抗原，用“ELISA”方法(酶聯(lián)免疫法)檢測(cè)所制得的基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig的抗體效價(jià)，結(jié)果如下表所示。注：測(cè)試樣本中的抗多種霉菌毒素復(fù)合單抗IgC菌體液濃度均為1mg/mL。從以上檢測(cè)結(jié)果可看出，所制備的基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig菌體液對(duì)磷脂酶A2有很高的抗體結(jié)合效價(jià)。實(shí)施例2基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白的上清液對(duì)磷脂酶A2的抗體結(jié)合效價(jià)檢測(cè)檢測(cè)基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig對(duì)磷脂酶A2抗原的抗體結(jié)合效價(jià)：采用磷脂酶A2作為檢測(cè)抗原，用“ELISA”方法(酶聯(lián)免疫法)檢測(cè)所制得的基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白的抗體效價(jià)，結(jié)果如下表所示。注：測(cè)試樣本中的抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白上清液濃度均為1mg/mL。從以上檢測(cè)結(jié)果可看出，所制備的基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白對(duì)磷脂酶A2有更高的抗體結(jié)合效價(jià)。實(shí)施例3基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性包含體溶液對(duì)磷脂酶A2的抗體結(jié)合效價(jià)檢測(cè)檢測(cè)基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性包含體對(duì)磷脂酶A2抗原的抗體結(jié)合效價(jià)：采用磷脂酶A2作為檢測(cè)抗原，用“ELISA”方法(酶聯(lián)免疫法)檢測(cè)所制得的基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性包含體的抗體效價(jià)，結(jié)果如下表所示。注：測(cè)試樣本中的抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性包含體溶液濃度均為1mg/mL。從以上檢測(cè)結(jié)果可看出，所制備的基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性包含體對(duì)磷脂酶A2有更高的抗體結(jié)合效價(jià)。下面通過(guò)具體實(shí)施例的配方和工藝對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：實(shí)施例4生產(chǎn)基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig微囊飼料添加劑。配方和工藝如下：表1.配方工藝：1、一邊攪拌一邊先后將海藻酸鈉加入配方量大豆油中，高速攪拌(轉(zhuǎn)速為8000r/min)，得到乳化液A。2、將配方量殼聚糖加入去離子水中，攪拌15min，得到溶液B。3、將配方量基因工程重組抗磷脂酶A2抗磷脂酶A2單抗Ig菌體液加入溶液B中，攪拌均勻，得到溶液C。4、一邊攪拌一邊將溶液C加入乳化液A中，攪拌10min，得到乳化液D。5、將溶液D置入分液漏斗，分取下層微囊。6、將微囊加入低溫高速干燥機(jī)干燥，即制成抗磷脂酶A2和豬腸道病原體復(fù)合單抗IgC微囊飼料添加劑。7、把微囊飼料添加劑按500g用鋁箔袋分裝，裝箱；抽樣檢驗(yàn)合格后出廠。實(shí)施例5脂質(zhì)體抗磷脂酶A2單抗Ig菌體干粉的生產(chǎn)。具體實(shí)施步驟如下：1、把卵磷脂和膽固醇按1:1比例混合均勻，得卵磷脂和膽固醇混合物；2、把卵磷脂和膽固醇混合物按重量比1：5比例溶于乙醚中，制成卵磷 脂和膽固醇乙醚溶液；3、將所制得的抗磷脂酶A2單抗Ig菌體液按重量比1：100比例加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成濃度1％的IgC溶液；4、將卵磷脂和膽固醇乙醚溶液和單抗Ig菌體液按重量比3：1比例混合均勻；5、超聲處理2min(每處理0.5min，間歇0.5min)；6、在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚；7、超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgC；8、沉淀物用水洗二次，再置入高速離心機(jī)離心，得最終沉淀物；9、將所得的最終沉淀物用10mmol/LPBS稀釋，即制得脂質(zhì)體抗磷脂酶A2和豬腸道病原體復(fù)合單抗IgC的基礎(chǔ)溶液；10、將脂質(zhì)體抗磷脂酶A2單抗Ig菌體的基礎(chǔ)溶液冷凍干燥即制得脂質(zhì)體抗磷脂酶A2單抗Ig菌體干粉。實(shí)施例6配制脂質(zhì)體抗磷脂酶A2單抗Ig菌體干粉預(yù)混料采用制備的脂質(zhì)體抗磷脂酶A2單抗Ig菌體干粉200kg作為主要原料制成一種可提升豬營(yíng)養(yǎng)吸收功能的高效安全的綠色預(yù)配料。表2.配方把兩個(gè)成份加入混料機(jī)中充分?jǐn)噭?。然后用包裝機(jī)按1000g分裝，再裝箱。抽樣檢驗(yàn)合格后出廠。實(shí)施例7生產(chǎn)含基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig的香甜可口的果凍型乳豬料。配方和工藝如下：表3.配方工藝：1、將配方量蒸餾水采用高壓蒸氣滅菌，加熱到121-126℃，壓力升至102.9kPa(1.05kg/cm2)，停留60min，冷卻到95℃，然后保持溫度在95℃。2、將配方量果凍粉加入占配方量90％的95℃的蒸餾水中溶解，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成果凍水溶液A。3、將配方量糖液加熱至95℃，然后加入到果汁果凍水溶液A中，再用大火迅速煮沸濃縮，邊煮邊攪拌，在20分鐘內(nèi)使混合液上升達(dá)106℃，這時(shí)即為濃縮終點(diǎn)，制成果凍濃漿B。4、把占配方量10％的95℃的蒸餾水冷卻到室溫，再將配方量抗磷脂酶A2單抗Ig菌體液加入冷卻到室溫的蒸餾水中溶解，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成IgY水溶液C。5、將果凍濃漿B冷卻到室溫，然后一邊攪拌一邊緩慢地將IgY水溶液C滴加入到果凍濃漿B中，高速(3000r/min)攪拌60min以上，即制成凝膠狀的具有促生長(zhǎng)功效的香甜可口的果凍型乳豬料。實(shí)施例8魚(yú)蝦用促生長(zhǎng)綠色飼料配制：表4.配方制備工藝如下：先將配方中除Ig菌體干粉和混合維生素以外成份依次加入攪拌機(jī)中充分混合均勻，80℃干燥2小時(shí)，冷至室溫；再按等量遞加法與Ig菌體干粉、維生素混合，然后加入粘合劑混勻制粒。最后，按每袋500克分袋包裝密封，打碼。抽樣檢測(cè)合格后出廠。實(shí)施例9水生動(dòng)物用浸浴液和水塘潑灑劑的配制。表5.配方原料名稱比例(％)基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig菌體液0.01純凈水99.99將配方量基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig菌體液加入配方量純凈水稀釋，充分?jǐn)嚢杈鶆蚺渲瞥商烊话踩木G色浸浴液和水塘潑灑劑。采用這種“無(wú)藥殘，又無(wú)污染”的復(fù)合單抗IgC浸浴液浸浴魚(yú)蝦等水生動(dòng)物，或定期在水塘潑灑；可提高水生動(dòng)物生長(zhǎng)速度，達(dá)到提升水生動(dòng)物養(yǎng)殖效益的目的。實(shí)施例10基因工程重組抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白預(yù)配料的配制。將配方量抗磷脂酶A2單抗Ig可溶性抗體蛋白干粉與工業(yè)用葡萄糖在混合機(jī)中充分?jǐn)嚢杈鶆颍涂芍频每沽字窤2單抗Ig可溶性抗體蛋白預(yù)配料。由于Ig可溶性抗體蛋白的生物活性比菌體高，可達(dá)到更好的效果。表6.配方把兩個(gè)成份加入混料機(jī)中充分?jǐn)噭?。然后用包裝機(jī)按每袋20kg分裝，再裝箱。抽樣檢驗(yàn)合格后出廠。實(shí)施例11在仔豬飼料中添加抗磷脂酶A2單抗菌體干粉飼料添加劑的效果試驗(yàn)。1.實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：養(yǎng)豬場(chǎng)2.試驗(yàn)材料：抗磷脂酶A2單抗菌體干粉飼料添加劑3.試驗(yàn)動(dòng)物的選擇與設(shè)計(jì)試驗(yàn)豬選擇遺傳背景相同、將弱小豬剔除后以平均初始體重為6-7千克左右，體質(zhì)健康，同批轉(zhuǎn)群的杜長(zhǎng)大生長(zhǎng)豬4欄，按原欄以體重相近將試驗(yàn)豬分為試驗(yàn)組和對(duì)照組9兩個(gè)處理，每處理2個(gè)重復(fù)，每重復(fù)16頭，共64頭生長(zhǎng)育肥進(jìn)行16天的飼養(yǎng)試驗(yàn)。4.飼養(yǎng)管理該試驗(yàn)豬按現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際管理為基礎(chǔ)，專人管理，各組在相同的飼養(yǎng)管理和環(huán)境條件下進(jìn)行，保持飼料新鮮，保持豬舍環(huán)境衛(wèi)生，每天觀察試驗(yàn)豬采食、健康及活動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)病豬后為該豬作標(biāo)記號(hào)，跟蹤記錄發(fā)病日期、持續(xù)時(shí)間、治療方案、康復(fù)情況；嚴(yán)重發(fā)病要剔除試驗(yàn)欄，并稱取病豬的體重，做好日期和體重的記錄。5.結(jié)果與分析5.1試驗(yàn)對(duì)豬群體健康狀況的觀察此批教槽試驗(yàn)從斷奶到保育，豬群健康狀況較好，僅B3欄在受臺(tái)風(fēng)天氣影響有點(diǎn)腹瀉。5.2此次試驗(yàn)中不曾添加其他藥物5.3生長(zhǎng)性能及效益見(jiàn)下表表7.增重效果、飼料利用率、效益表本次試驗(yàn)兩個(gè)處理健康狀況都較為理想。從試驗(yàn)的結(jié)果看，在采食量、日增重、料肉比方面相比較試驗(yàn)組都要優(yōu)于對(duì)照組處理，而在毛色膚色方面兩處理相差不大，試驗(yàn)組處理是(3.30、3.40)，對(duì)照組處理是(3.16、3.27)。綜合以上情況，試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)論：試驗(yàn)結(jié)果表明，按本發(fā)明的方法制備的抗磷脂酶A2單抗能明顯提高飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)，增幅達(dá)到20％，遠(yuǎn)超目前采用的提高飼料轉(zhuǎn)化率的方法(一般為2-3％)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明的技術(shù)范圍作任何限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)上面的實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3