本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體涉及一種人內(nèi)皮素A型受體免疫原性肽段及其載體疫苗。

背景技術(shù)：

肺動脈高壓(PAH)是以肺小動脈增生和重構(gòu)為特征的嚴重慢性疾病，導致肺動脈壓力進行性升高并最終發(fā)生右心衰竭和死亡，其發(fā)病率相對較低，但預后極差，我國5年的生存率20.8％。近20年來治療PAH藥物取得了一定的療效，如內(nèi)皮素受體拮抗劑，使PAH中位生存時間由80年代的2.8年，延長到5年，但該類藥價格昂貴，治療上難以普及，迫切需要尋找方便、有效且價廉的新治療方法。治療性疫苗是針對患者個體的新型免疫學治療手段，為重大慢性疾病的治療提供了新思路。治療性PAH疫苗是PAH治療研究的新領域，如研制成功，與傳統(tǒng)的化學合成藥物相比，其作用時間長，每間隔1～3月甚至更長時間給藥一次且能夠保持長期平穩(wěn)有效的降低肺動脈壓力，從而降低費用、改善治療的依從性。

如何選擇合適的靶點和載體是PAH等治療性疫苗研制成功的關(guān)鍵，因為治療性疫苗主要針對自身抗原或免疫耐受外來抗原，治療性疫苗必須與載體結(jié)合才能打破免疫耐受，產(chǎn)生治療效應，可選擇的靶點理論上有內(nèi)皮素1(Endothelin，ET-1)與人內(nèi)皮素A型受體(ET_AR)，但由于ET-1血循環(huán)濃度極低，絕大多數(shù)通過旁分泌和自分泌發(fā)生作用，在ET-1產(chǎn)生后還未與ET-1疫苗抗體結(jié)合即發(fā)揮效能，因此，ET-1不是理想的PAH治療靶點。在系統(tǒng)性硬化、干燥綜合征等病人中發(fā)現(xiàn)存在ET_AR的自身抗體，提示ET_AR具有抗原性，因此ET_AR是PAH治療性疫苗的理想靶點。因此，研制出有效誘導ET_AR抗體產(chǎn)生并抑制EI-1誘導的激動效應的疫苗是亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供一種有效治療肺動脈高壓的人內(nèi)皮素A型受體免疫原性肽段及其載體疫苗。

本發(fā)明的第一目的是提供一種人內(nèi)皮素A型受體免疫原性肽段，所述人內(nèi)皮素A型受體免疫原性肽段的氨基酸序列為SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9中的一種。

優(yōu)選地，所述人內(nèi)皮素A型受體免疫原性肽段的氨基酸序列為SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7中的一種。

本發(fā)明的第二目的是提供一種人內(nèi)皮素A型受體免疫原性載體疫苗，所述人內(nèi)皮素A型受體免疫原性載體疫苗由人內(nèi)皮素A型受體免疫原性肽段與載體偶聯(lián)制備而成。

優(yōu)選地，所述載體為Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白或鑰孔血藍蛋白，以下鑰孔血藍蛋白簡稱KLH。

更優(yōu)選地，所述Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白內(nèi)包裹有CPG-ODN。

本發(fā)明的第三目的是人內(nèi)皮素A型受體免疫原性載體疫苗應用于制備治療肺動脈高壓藥物。

本發(fā)明的有益效果是：

1、根據(jù)ET_AR的胞外環(huán)氨基酸序列、親水性、抗原性、可及性等特性，綜合生物信息學、藥理學方法，本發(fā)明設計出了針對ET_AR的9條肽段，并通過驗證出這些肽段能有效誘導ET_AR抗體產(chǎn)生并抑制EI-1誘導的激動效應。

2、將設計出的針對ET_AR的9個肽段分別與載體偶聯(lián)成功制備成9種載體疫苗，并將這9種載體疫苗分別免疫雄性新西蘭大白兔，免疫得到血清，利用ELISA法測定血清抗體滴度，篩選出抗體滴度在1：40000以上的ET_AR免疫原性載體疫苗，對應9條肽段中篩選出5條肽段，由這5條肽段制備而成的ET_AR免疫原性載體疫苗的抗體滴度均不小于1：40000。

3、選擇合適的載體是研制疫苗成功的關(guān)鍵。本發(fā)明選用Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白或KLH，選優(yōu)選用Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白包裹佐劑，在Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白內(nèi)部包裹進免疫佐劑，增強免疫應答，從而構(gòu)成一個簡單高效的抗原呈遞系統(tǒng)。

4、將制備得到的載體疫苗免疫大鼠，研究ET_AR免疫原性載體疫苗是否降低肺動脈高壓模型大鼠的肺動脈壓力，實驗結(jié)果表明ET_AR免疫原性載體疫苗能降低肺動脈高壓模型大鼠的肺動脈壓力，因此，此類載體疫苗可以應用于制備治療肺動脈高壓藥物。

附圖說明

圖1為實施例2中載體疫苗ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ的SDS-PAGE凝膠電泳檢測圖；泳道Vaccine1為疫苗ET_AR EC10-Qβ，泳道Vaccine 2為疫苗ET_AR YC9-Qβ、泳道Vaccine 3為疫苗ET_AR RC8-Qβ、泳道VLP為Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白單體、泳道Vaccine 4為疫苗ET_AR EM7-Qβ、泳道Vaccine 5為疫苗ET_AR TF10-Qβ。

圖2為實施例3中抗ET_AR-EC10、抗ET_AR-YC9、抗ET_AR-RC8、抗ET_AR-EM7、抗ET_AR-TF10短肽抗體對ET-1引起細胞外信號蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平影響的免疫印跡結(jié)果圖，其中圖2A為抗ET_AR-EC10短肽抗體的免疫印跡結(jié)果圖；圖2B為抗ET_AR-YC9短肽抗體的免疫印跡結(jié)果圖；圖2C為抗ET_AR-RC8短肽抗體的免疫印跡結(jié)果圖；圖2D為抗ET_AR-EM7短肽抗體的免疫印跡結(jié)果圖；圖2E為抗ET_AR-TF10短肽抗體的免疫印跡結(jié)果圖；圖中EC10、YC9、RC8、EM7、TF10對應代表抗ET_AR-EC10、抗ET_AR-YC9、抗ET_AR-RC8、抗ET_AR-EM7、抗ET_AR-TF10短肽抗體；P-ERK代表磷酸化的ERK1/2；T-ERK代表總的ERK1/2；*P<0.05vs空白對照組，#P<0.05vs ET-1刺激組。

圖3為實施例4中載體疫苗免疫SD大鼠后產(chǎn)生的抗ET_AR-EC10、抗ET_AR-YC9、抗ET_AR-RC8、抗ET_AR-EM7、抗ET_AR-TF10短肽抗體滴度圖，圖中EC10、YC9、RC8、EM7、TF10分別對應代表抗ET_AR-EC10、抗ET_AR-YC9、抗ET_AR-RC8、抗ET_AR-EM7、抗ET_AR-TF10短肽抗體。

圖4為實施例5中測量載體疫苗ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠右心室收縮壓的變化圖。其中，EC10-Qβ、YC9-Qβ、RC8-Qβ、EM7-Qβ、TF10-Qβ分別代表載體疫苗ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ；*P<0.05vs空白對照組，#P<0.05vs單存野百合堿處理組。共分為五組：(1)Con(n＝3)：不做任何處理；(2)MCT組(n＝3)：單次皮下注射野百合堿60mg/Kg；(3)MCT+Bos組(n＝3)：單次皮下注射野百合堿60mg/Kg，第二天給予波生坦灌胃100mg/Kg/day；(4)疫苗組(每種疫苗免疫3只)：載體疫苗ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ，400ug/只，于0,14,21天皮下多點免疫共三次，然后在第三次免疫后第二天單次皮下注射野百合堿60mg/Kg；(5)MCT+VLP組(n＝3)：400μg免疫載體Qβ-2aa-CPG-ODN VLP進行皮下多點免疫，其余同疫苗組一樣。

圖5為肺組織α-SMA免疫組化染色鑒定載體疫苗ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ對野百堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺動脈血管重構(gòu)α-SMA染色圖；其中，圖5A～5I依次為空白對照組動物肺臟α-SMA染色圖、單獨MCT注射組動物肺臟α-SMA染色圖、MCT注射后波生坦灌胃組動物肺臟α-SMA染色圖、疫苗ET_AR EC10-Qβ組動物肺臟α-SMA染色圖、疫苗ET_AR YC9-Qβ組動物肺臟α-SMA染色圖、疫苗ET_AR RC8-Qβ組動物肺臟α-SMA染色圖、疫苗ET_AR EM7-Qβ組動物肺臟α-SMA染色圖、疫苗ET_AR TF10-Qβ組動物肺臟α-SMA染色圖、空載組(Qβ-2aa-CPG-ODN VLP)動物肺臟α-SMA染色圖。圖5J表示肺組織α-SMA免疫組化染色后計算的中膜厚度百分比圖；圖5K表示肺組織α-SMA免疫組化染色后α-SMA陽性面積占血管面積的百分比圖。其中，EC10-Qβ、YC9-Qβ、RC8-Qβ、EM7-Qβ、TF10-Qβ分別對應代表載體疫苗ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ，MT％代表中膜厚度百分比；*P<0.05vs空白對照組，#P<0.05vs單存野百合堿處理組。

具體實施方式

以下結(jié)合說明附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不是限制本發(fā)明。

人內(nèi)皮素A型受體免疫原性載體疫苗以下簡稱ET_AR免疫原性載體疫苗，人內(nèi)皮素A型受體以下簡稱ET_AR。

實施例1：ET_AR免疫原性肽段的制備

根據(jù)生物信息學技術(shù)如氨基酸親水性、空間構(gòu)象、B細胞表位的特點，設計出針對ET_AR胞外氨基酸序列的ET_AR免疫原性肽段9條，分別命名為HI10、RF9、EC10、YC9、RC8、EM7、TF10、CK8、NE9，具體氨基酸序列為，HI10：SEQ ID No.1；RF9：SEQ ID No.2；EC10：SEQ ID No.3；YC9：SEQ ID No.4；RC8：SEQ ID No.5；EM7：SEQ ID No.6；TF10：SEQ ID No.7；CK8：SEQ ID No.8，NE9：SEQ ID No.9。

采用PSSM-8型肽自動合成儀(日本SHIMADZU公司)合成上述的9條肽段，合成的9條肽段經(jīng)高效液相色譜分析9條肽段的純度，經(jīng)檢測9條肽段的純度均達到92％以上。將得到的9條肽段凍干，分裝后置于凍存管中，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：制備ET_AR免疫原性載體疫苗

一、利用Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，制備9種載體疫苗ET_AR RF9-Qβ、ET_AR EC10-Qβ、ET_AR YC9-Qβ、ET_AR RC8-Qβ、ET_AR EM7-Qβ、ET_AR TF10-Qβ、ET_AR CK8-Qβ、ET_AR HI10-Qβ、ET_AR NE9-Qβ。具體制備過程如下：

1)制備Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白：Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白的英文縮寫為：Qβ-2aa VLP，以下均用Qβ-2aa VLP表示Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白。

Qβ-2aa VLP的制備方法為：

1a)獲取表達Qβ-2aa VLP的重組菌株：該重組菌株為大腸桿菌DH5α/pGEXQβ-A1，此重組菌株能誘導產(chǎn)生Qβ-2aa病毒樣顆粒蛋白。大腸桿菌DH5α/pGEXQβ-A1的保藏號為CCTCC NO：M209282，具體的制備過程參見中國專利：一種Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白的制備方法及其用途，授權(quán)公開日為CN 101921733B授權(quán)公告日2013.06.05。

1b)誘導表達Qβ-2aa VLP：首先從液氮罐中取出保藏的大腸桿菌DH5α/pGEXQβ-A1重組菌株，將該重組菌株活化后，涂布至LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫搖床培養(yǎng)5h后，加入0.2M的IPTG誘導重組菌株表達Qβ-2aa VLP，誘導6小時，收集菌液并進行超聲裂解，獲取裂解上清液；

1c)Qβ-2aa VLP的純化：裂解上清液經(jīng)過硫酸銨沉淀，酸化處理，疏水層析，凝膠層析后得到純化后的Qβ-2aa VLP；

1d)Qβ-2aa VLP的鑒定：將純化后的Qβ-2aa VLP用二硫蘇糖醇(DTT)進行解配處理，將解配后的Qβ-2aa VLP凝膠電泳鑒定其分子量，電鏡觀測其形態(tài)大小和粒徑；最后通過試驗結(jié)果確定得到的蛋白即為Qβ-2aa VLP；

2)制備載體：取步驟1c)純化后Qβ-2aa VLP 375μg與佐劑：CPG-ODN 2OD配制成為裝配體系(其中，CPG-ODN購自由上海生工生物工程公司)，室溫放置60小時，Qβ-2aa VLP將進行自組裝，同時包裹裝配體系內(nèi)的CPG-ODN，裝配完成后用凝膠層析純化，得到載體：Qβ-2aa-CPG-ODN VLP；

3)ET_AR免疫原性載體疫苗的制備：將實施例1中得到的9條肽段分別與載體Qβ-2aa-CPG-ODN VLP進行偶聯(lián)反應，偶聯(lián)反應采用異雙功能交聯(lián)劑(Sulfo-SMCC)，得到9種ET_AR免疫原性載體疫苗，分別為ET_AR RF9-Qβ、ET_AR EC10-Qβ、ET_AR YC9-Qβ、ET_AR RC8-Qβ、ET_AR EM7-Qβ、ET_AR TF10-Qβ、ET_AR CK8-Qβ、ET_AR HI10-Qβ、ET_AR NE9-Qβ。

4)將步驟3)得到的載體疫苗ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示。

二、利用載體KLH，制備9種載體疫苗ET_AR RF9-KLH、ET_AR EC10-KLH、ET_AR YC9-KLH、ET_AR RC8-KLH、ET_AR EM7-KLH、ET_AR TF10-KLH、ET_AR CK8-KLH、ET_AR HI10-KLH、ET_AR NE9-KLH，具體的制備過程如下：

1)稱重異雙功能交聯(lián)劑(Sulfo-SMCC)1mg和二甲基亞砜(DMSO)10μl、90μl 50mM PBS(PH：7.4，含1mM EDTA)吹打混勻得到Sulfo-SMCC體系；

2)取KLH 1mg，用50mM PBS定容到200ul得到KLH體系，PBS(PH：7.4，含1mM EDTA)；

3)Sulfo-SMCC體系與KLH體系混勻，37℃溫箱中反應30分鐘，間隔5分鐘上下顛倒輕輕搖晃一次，使KLH活化；

4)將活化后的混合物加入到100KD的TFF濃縮柱(Millipore，美國)中，用50mM PBS(pH 7.0，含1mM EDTA)加滿濃縮柱，離心5,000g 15min，離心后剩余液體量在50-100ul為佳，共離心兩次以洗脫掉未結(jié)合的Sulfo-SMCC；

5)ET_AR免疫原性肽段配制：將實施例1得到9條肽段各取500ug，用50ul ddH₂O溶解后加入活化并洗脫后的體系中，用50mM PBS(pH7.0，含1mM EDTA)補足終體積為500ul，離心1050rpm/min反應2h；

6)最終反應體系即為偶聯(lián)完成的載體疫苗ET_AR RF9-KLH、ET_AR EC10-KLH、ET_AR YC9-KLH、ET_AR RC8-KLH、ET_AR EM7-KLH、ET_AR TF10-KLH、ET_AR CK8-KLH、ET_AR HI10-KLH、ET_AR NE9-KLH。

實施例3ET_AR免疫原性載體疫苗針對性抗體的體外功能研究

一、ET_AR免疫原性肽段的篩選：優(yōu)選ET_AR免疫原性肽段為EC10，YC9，RC8，EM7，TF10。具體試驗過程為：

將實施例2得到的9種ET_AR免疫原性載體疫苗：ET_AR RF9-Qβ、ET_AR EC10-Qβ、ET_AR YC9-Qβ、ET_AR RC8-Qβ、ET_AR EM7-Qβ、ET_AR TF10-Qβ、ET_AR CK8-Qβ、ET_AR HI10-Qβ、ET_AR NE9-Qβ在第1、14、28天皮下多點免疫雄性新西蘭大白兔，其中，作為對照組，2只雄性新西蘭大白兔免疫載體Qβ-2aa-CPG-ODN VLP，每種ET_AR免疫原性載體疫苗免疫2支雄性新西蘭大白兔，一共20只被免疫的雄性新西蘭大白兔，免疫劑量為500ug/只。第7、14、21、28、35天取血用ELISA法測定抗體滴度，篩選出抗體滴度在1：40000以上的ET_AR免疫原性載體疫苗為ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ，因此，優(yōu)選ET_AR免疫原性肽段為EC10，YC9，RC8，EM7，TF10。

二、制備抗體以及中和抗體：抗體為抗ET_AR-EC10、抗ET_AR-YC9、抗ET_AR-RC8、抗ET_AR-EM7、抗ET_AR-TF10，中和抗體為NEC10，NYC9，NRC8，NEM7，NTF10。具體試驗過程為：

將實施例3中免疫載體疫苗ET_AR EC10-Qβ，ET_AR YC9-Qβ，ET_AR RC8-Qβ，ET_AR EM7-Qβ，ET_AR TF10-Qβ后的大白兔在第35天后處死，分別取血，經(jīng)硫酸銨沉淀、疏水、親和、抗肽純化后獲得目的抗體：分別為ET_AR免疫原性載體疫苗免疫大白兔產(chǎn)生的短肽抗體，分別為抗ET_AR-EC10、抗ET_AR-YC9、抗ET_AR-RC8、抗ET_AR-EM7、抗ET_AR-TF10。將抗ET_AR-EC10與過量的肽段EC10中和后形成中和抗體NEC10，將抗ET_AR-YC9與過量的肽段YC9中和后形成中和抗體NYC9，將抗ET_AR-RC8與過量的肽段RC8中和后形成中和抗體NRC8，將抗ET_AR-EM7與過量的肽段EM7中和后形成中和抗體NEM7，將抗ET_AR-TF10與過量的肽段TF10中和后形成中和抗體NTF10。

三、抗ET_AR-EC10、抗ET_AR-YC9、抗ET_AR-RC8、抗ET_AR-EM7、抗ET_AR-TF10短肽抗體對細胞外信號蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平的影響研究，具體試驗過程為：

1)制備過表達ET_AR的CHO細胞系

1a)過表達ET_AR質(zhì)粒的構(gòu)建：以pcDNA3.1為克隆載體，載體長度在5.4kb，載體具有Ampicillin抗性，HindIII/Xhol為克隆位點，將人ET_AR基因插入其中，ET_AR的氨基酸序列如SEQ ID No.10，進行過表達ET_AR質(zhì)粒的構(gòu)建，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ET_AR。

1b)過表達ET_AR的CHO細胞系的構(gòu)建：其中，CHO細胞系購自武漢Procell公司)

首先種板：將CHO細胞系用胰酶消化后用細胞計數(shù)板在倒置顯微鏡下計數(shù)，5×10⁵個細胞/孔，種于24孔板中；

然后轉(zhuǎn)染：將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ET_AR依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟進行；轉(zhuǎn)染試劑盒的名稱為：Attractene Transfection Reagent Lot No.148019994Qiagen。

穩(wěn)轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)染后24小時，將細胞消化并計數(shù)，稀釋后種于96孔板中，使每孔中平均有1～2個細胞，12小時后，培養(yǎng)基換為含有400ug/ml G418的高糖/Ham’s F12完全培養(yǎng)基，每隔三天換液，2周后選擇有單個細胞群落的孔消化至六孔板中，不斷繁殖，即得到單克隆來源的過表達ET_AR的CHO細胞系，以下過表達ET_AR的CHO細胞系命名為CHO-ET_AR；

2)抗ET_AR-EC10、抗ET_AR-YC9、抗ET_AR-RC8、抗ET_AR-EM7、抗ET_AR-TF10短肽抗體對細胞外信號蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平的影響試驗，分為共5組平行試驗，分別為EC10組，YC9組，RC8組，EM7組，TF10組，每組試驗包括一塊6孔板，每組試驗的具體操作如下：

2a)種板：將CHO-ET_AR用胰酶消化計數(shù)后，以2×10⁵個細胞每孔種于6孔板中；

2b)饑餓培養(yǎng)：待細胞形態(tài)完全形成，密度在75％左右后，將培養(yǎng)基吸出，用PBS洗兩遍后，加入0.5％FBS的高糖DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)16小時；

2c)各組所加刺激：細胞饑餓培養(yǎng)16小時后，在對應的孔中吸出培養(yǎng)基后加入含有BQ123(10^-9mmol/L)、ET_AR抗體(1:100)、中和抗體(1:100)0.5％FBS的高糖DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基，溫箱中孵育30min后，加入終濃度為10^-11M的ET-1，溫箱中孵育15min后收細胞；其中，每個孔中加入的物質(zhì)如表1:

表1

2d)細胞總蛋白的提?。杭尤隕T-1刺激15min后，迅速將培養(yǎng)基吸出，用預冷的PBS沖洗兩遍后，加入蛋白裂解液40ul，使之將細胞完全覆蓋冰上孵育30min后用細胞刮刮下并用微量移液槍收集入1.5ml的離心管中，點震10s、間隔30s、共點震10次，4℃12000rpm15min離心，吸取上清移入200ul的EP管中，所取上清即為細胞總蛋白；每個孔中的細胞總蛋白進行免疫印跡實驗。

2e)免疫印跡實驗的具體操作過程為：

制膠：按照SDS-PAGE凝膠配置說明書配置10％的分離膠和5％的濃縮膠，室溫靜置1小時或者4℃過夜后拿出置于電泳槽中，加入電泳內(nèi)液和電泳外液，拔出齒梳，排空各個齒梳孔中的氣泡；

上樣：60V恒壓預電泳30min，細胞總蛋白用微量移液器加于各個上樣孔中；

電泳：先使用70V恒壓電泳，待可見Marker條帶分開后說明已經(jīng)進入分離膠，此時將電壓調(diào)至110V進行恒壓電泳直至溴酚藍移至凝膠的最底部、Marker各條條充分分離，結(jié)束電泳；

轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠取出，切取出目的蛋白位置的凝膠置于濾紙上面，根據(jù)凝膠剪取相應大小的PVDF膜并將PVDF膜置于甲醇中活化后平鋪于凝膠上面，然后往轉(zhuǎn)膜槽中加入預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液后放置于冰浴中，300mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜50min；

封閉：轉(zhuǎn)膜完成后取出膜置于1×麗春紅中浸泡染色用以以判斷轉(zhuǎn)膜是否成功，然后用5％濃度脫脂奶粉的TBST緩沖液，室溫搖床封閉2小時；

孵育一抗：抗P-ERK抗體(CellSignaling，美國)用抗體稀釋液按照1：1000稀釋，將封閉好的PVDF膜取出用ddH₂O漂洗后4℃孵育過夜；

一抗回收：取出PVDF膜用0.15％TBST緩沖液洗3×8min；

二抗孵育：HRP標記的山羊抗兔IgG抗體(Invitrogen，美國)按1：3000用5％濃度脫脂奶粉稀釋，常室溫搖床孵育2小時；

洗膜：棄二抗，取出PVDF膜用0.15％TBST緩沖液洗3次，每次洗8min；

發(fā)光及成像：配制ECL試劑：A液：B液＝1：1混合后孵育PVDF膜，吸出ECL混合液，蛋白凝膠成像系統(tǒng)對目的蛋白進行顯影，儲存并用凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶的灰度值。結(jié)果如圖2A，圖2B，圖2C，圖2D，圖2E所示。

實施例4：ET_AR免疫原性載體疫苗對野百合堿誘導的肺動脈高壓模型大鼠肺動脈壓力的影響。

將載體疫苗ET_AR EC10-Qβ、ET_AR YC9-Qβ、ET_AR RC8-Qβ、ET_AR EM7-Qβ、ET_AR TF10-Qβ免疫正常SD大鼠后用野百合堿(MCT)單次皮下注射進行構(gòu)建肺動脈高壓模型大鼠，探討ET_AR免疫原性載體疫苗是否降低肺動脈高壓模型大鼠的肺動脈壓力。具體試驗過程為：

1)主動免疫和藥物干預，具體分為5組如下：

第一組：空白對照組(Con組)：不給予任何干預措施；

第二組：野百合堿組(MCT組)：給予單次皮下注射MCT 60mg/kg；

第三組：波生坦灌胃組(Bos+MCT組)：給予單次皮下注射MCT60mg/kg后的第二天用波生坦灌胃,波生坦的劑量為每天100mg/kg；

第四組：疫苗組(載體疫苗+MCT組)：載體疫苗ET_AR EC10-Qβ、ET_AR YC9-Qβ、ET_AR RC8-Qβ、ET_AR EM7-Qβ、ET_AR TF10-Qβ在0、2、4周時分別在背部皮下多點免疫，劑量為400ug/只，在疫苗第三次免疫后第二天給予單次皮下注射MCT 60mg/kg；

第五組：空載組(VLP組)：用載體Qβ-2aa-CPG-ODN VLP在0、2、4周時分別在背部皮下多點免疫，劑量為400ug/只，在第三次免疫后第二天給予單次皮下注射MCT 60mg/kg。

2)采血：分別在第-28、-10、7、21、28天(MCT注射記為第1天)鼠尾采血，RT 3000rpm 15min離心取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)ELISA免疫印跡實驗

由于免疫動物時所選用的載體為Qβ-2aa-CPG-ODN VLP，為了避免交叉反應，采用KLH作為載體與短肽偶聯(lián)成疫苗后包板測定相應抗體的滴度，KLH作為載體與短肽偶聯(lián)成疫苗的具體過程見實施例2。

1)包板：將載體疫苗ET_AR KLH-EC10，ET_AR KLH-YC9，ET_AR KLH-RC8，ET_AR KLH-EM7，ET_AR KLH-TF10各取100ug，分別加入到10ml包被稀釋液(PH9.6 0.05M NaCO3-NaHCO3緩沖液)中混勻后加入96孔板中，100ul/孔，4℃濕盒孵育過夜；

2)封閉：第二天棄包被液，加入濃度為1％BSA的PBS緩沖液，100ul/孔，37℃封閉2h；

3)封膜：封閉后棄封閉液，拍干并室溫晾干后，貼上ELISA包被膜；

4)將上述血清取出，冰上解凍后，用ELISA法測定相應抗體滴度，具體步驟如下：

4a)倍比稀釋：將血清上清用濃度為10％FBS的PBS緩沖液作為稀釋液，做1：100，1：1000，1：5000，1：10000的梯度倍比稀釋；

4b)孵育一抗：用移液器將1：1000倍比稀釋后的血清標本加入到步驟1)中的96孔板中，37℃溫箱、孵育2h；

4c)孵育二抗：一抗孵育完成后，棄液體并用洗滌液(0.03％PBST PH7.4)洗3遍，拍干，然后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠的二抗(1：3000稀釋稀釋液為10％FBS的PBS緩沖液)，37℃溫箱中孵育0.5h；

4d)顯色：二抗孵育完成后棄液體并用洗滌液(0.03％PBST PH7.4)洗3遍，拍干，然后加入TMD顯色液，100ul/孔，室溫觀察顏色變化；

4e)終止反應：待空白對照孔顏色開始變綠后，加入終止液(1M稀鹽酸)，100ul/孔；

4f)讀數(shù)：加入終止液后，放在酶標儀上在450nm波長下讀出吸光度(OD)值；

4g)結(jié)果分析：以OD值不小于空白對照組的2.1倍作為待測標本陽性的標準，然后計算出相應標本的抗體滴度值。結(jié)果如圖3，結(jié)果顯示各載體疫苗免疫大鼠后均產(chǎn)生了抗特定人內(nèi)皮素1受體A型免疫原性肽段的抗體。

實施例5肺動脈壓力測定MCT注射后第28天右心導管法測量右心室收縮壓，具體操作如下：

1)麻醉：MCT注射后第28天，用1％戊巴比妥鈉生理鹽水(4ml/kg)腹腔注射麻醉；

2)固定：待動物麻醉成功后，采取仰臥法將動物牙齒、四肢進行固定；

3)分離右側(cè)頸靜脈：將右側(cè)頸部皮膚剪掉，采用頓性性分法分離出右側(cè)頸靜脈，并將其表面的結(jié)締組織剝離；

4)壓力測量：將自制的PE導管(sci美國)插入右側(cè)頸靜脈，然后逆行插入右心室，待感到強烈的心跳時連接壓力傳感器(adinstruments公司，澳大利亞)，觀察壓力記錄儀(adinstruments公司，澳大利亞)上面出現(xiàn)的波形，直至測出右心室壓力波形。結(jié)果如圖4：結(jié)果顯示MCT組和空載組較空白對照組肺動脈壓力明顯升高，人內(nèi)皮素1受體A型免疫原性載體疫苗組肺動脈壓力較空白對照組升高但是和MCT組和空載組比較有所降低，特別是疫苗ET_AR EC10-Qβ、ET_AR YC9-Qβ組肺動脈壓力和波生坦灌胃組肺動脈壓力降低幅度無明顯差異。

5)標本留?。涸谟倚氖沂湛s壓測定后，迅速取出肺臟，在PBS中漂洗兩遍后切勿一小塊肺臟浸泡在4％多聚甲醛中，組織經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟切片，行α-SMA染色，觀察肺細小動脈血管重構(gòu)，如圖5A～5I所示。

6)統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計處理，治療前后比較采用t檢驗，組間差異比較采用方差分析(ANOVA)，以P<0.05具有顯著性差異。結(jié)果如圖5J～5K所示。圖5J表明MCT組和空載組的細小動脈管腔面積占細小動脈橫截面積的百分比較空白對照組明顯降低，而載體疫苗組較MCT組和空載組細小動脈管腔面積占細小動脈橫截面積的百分比升高，特別是疫苗ET_AR EC10-Qβ組和波生坦灌胃組細小動脈管腔面積占細小動脈橫截面積的百分比升高更為明顯。圖5K表明MCT組和空載組細小動脈管壁厚度占細小動脈直徑的百分比較空白對照組明顯增高，而載體疫苗組較MCT組和空載組細小動脈管壁厚度占細小動脈直徑的百分比較空白對照組降低，特別是疫苗ET_AR EC10-Qβ組和波生坦灌胃細小動脈管壁厚度占細小動脈直徑的百分比較空白對照組降低更為明顯。

<110>武漢華紀元生物技術(shù)開發(fā)有限公司

<120>人內(nèi)皮素A型受體免疫原性肽段及其載體疫苗

<160>10

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

His Asn Tyr Cys Pro Gln Gln Thr Lys

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Arg Trp Pro Phe Asp His Asn Asp Phe

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>人工合成

<400>3

Glu Tyr Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人工合成

<400>4

Tyr Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人工合成

<400>5

Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>6

Glu Gln His Lys Thr Cys Met

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>人工合成

<400>7

Thr Cys Met Leu Asn Ala Thr Ser Lys Phe

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>人工合成

<400>8

Cys Met Leu Asn Ala Thr Ser Lys

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>人工合成

<400>9

Asn Glu Met Asp Lys Asn Arg Cys Glu

<210>10

<211>1284

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

atggaaaccc tttgcctcag ggcatccttt tggctggcac tggttggatg tgtaatcagt 60

gataatcctg agagatacag cacaaatcta agcaatcatg tggatgattt caccactttt 120

cgtggcacag agctcagctt cctggttacc actcatcaac ccactaattt ggtcctaccc 180

agcaatggct caatgcacaa ctattgccca cagcagacta aaattacttc agctttcaaa 240

tacattaaca ctgtgatatc ttgtactatt ttcatcgtgg gaatggtggg gaatgcaact 300

ctgctcagga tcatttacca gaacaaatgt atgaggaatg gccccaacgc gctgatagcc 360

agtcttgccc ttggagacct tatctatgtg gtcattgatc tccctatcaa tgtatttaag 420

ctgctggctg ggcgctggcc ttttgatcac aatgactttg gcgtatttct ttgcaagctg 480

ttcccctttt tgcagaagtc ctcggtgggg atcaccgtcc tcaacctctg cgctcttagt 540

gttgacaggt acagagcagt tgcctcctgg agtcgtgttc agggaattgg gattcctttg 600

gtaactgcca ttgaaattgt ctccatctgg atcctgtcct ttatcctggc cattcctgaa 660

gcgattggct tcgtcatggt accctttgaa tataggggtg aacagcataa aacctgtatg 720

ctcaatgcca catcaaaatt catggagttc taccaagatg taaaggactg gtggctcttc 780

gggttctatt tctgtatgcc cttggtgtgc actgcgatct tctacaccct catgacttgt 840

gagatgttga acagaaggaa tggcagcttg agaattgccc tcagtgaaca tcttaagcag 900

cgtcgagaag tggcaaaaac agttttctgc ttggttgtaa tttttgctct ttgctggttc 960

cctcttcatt taagccgtat attgaagaaa actgtgtata acgagatgga caagaaccga 1020

tgtgaattac ttagtttctt actgctcatg gattacatcg gtattaactt ggcaaccatg 1080

aattcatgta taaaccccat agctctgtat tttgtgagca agaaatttaa aaattgtttc 1140

cagtcatgcc tctgctgctg ctgttaccag tccaaaagtc tgatgacctc ggtccccatg 1200

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agccataagg acagcatgaa ctga 1284