本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種植物株系相關(guān)蛋白PROG2及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻，作為世界上最重要的糧食作物之一，養(yǎng)育了世界上超過50％的人口。然而，最近的研究表明，在水稻三大生產(chǎn)國，中國、印度和印度尼西亞分別有78％、37％和81％的水稻生產(chǎn)區(qū)的水稻產(chǎn)量從1961年到2008年一直停滯不前，水稻栽培品種遺傳背景狹窄和育種技術(shù)落后，是造成這一現(xiàn)象的主要原因。普通野生稻是亞洲栽培稻的祖先種，野生稻在演化成栽培稻的過程中，經(jīng)過自然選擇和人工選擇，基因多樣性降低、等位基因數(shù)減少。據(jù)統(tǒng)計，栽培稻的等位基因數(shù)約為野生稻的60％，從而導(dǎo)致當(dāng)前水稻品種選育所面臨的遺傳瓶頸問題。因此從水稻近緣野生種的普通野生稻OryzarufipogonGriff.基因組中發(fā)掘和利用在栽培稻中已丟失或削弱的優(yōu)異馴化基因，并把它們應(yīng)用于水稻育種生產(chǎn)中具有十分重要的理論意義和實踐價值，也是解決當(dāng)前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。水稻株型是影響產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一，塑造理想株型也一直以來都是水稻育種者提高水稻產(chǎn)量的重要途徑。我國野生稻資源豐富，從野生稻中發(fā)掘、定位和克隆水稻株型相關(guān)基因不僅有助于拓寬水稻栽培品種的遺傳多樣性，同時也為水稻現(xiàn)代分子育種提供重要參考和理論基礎(chǔ)，對加強我國野生稻基因資源的保護、將資源優(yōu)勢變成經(jīng)濟優(yōu)勢具有重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高水稻產(chǎn)量。為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種植物株系相關(guān)蛋白。本發(fā)明所提供的植物株系相關(guān)蛋白，名稱為PROG2，來源于江西東鄉(xiāng)野生稻，為如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物株型相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2由188個氨基酸殘基組成。為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a3)中的蛋白質(zhì)PROG2，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白質(zhì)PROG2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述a3)中的蛋白質(zhì)PROG2的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述PROG2的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述編碼所述PROG2的核酸分子可為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；(b2)其編碼序列是序列表中序列1自5’末端起第125-691位核苷酸的DNA分子；(b3)與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子；(b4)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由892個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼PROG2的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的PROG2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼PROG2且與植物株型相關(guān)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。含有所述編碼所述PROG2的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述表達盒包括啟動子、編碼所述PROG2的核酸分子和終止子。所述啟動子具體可為PROG2啟動子(序列3自5’末端起第1至1258位所示)；所述編碼所述PROG2的核酸分子可如序列3自5’末端起第1383至1949位所示；所述終止子具體可為PROG2終止子(序列3自5’末端起第2151至4214位所示)。所述重組載體可為將所述PROG2的編碼基因(即序列表中序列1自5’末端起第125-691位所示的DNA分子)通過含有所述PROG2的編碼基因的表達盒插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為用序列表中序列3所示的DNA分子替換pCAMBIA3301的EcoRI和SmaI識別序列間的片段(pCAMBIA3301被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和SmaI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)，得到的重組質(zhì)粒D81，重組質(zhì)粒D81表達序列表中序列2所示的PROG2。所述pCAMBIA3301與D81的差別僅在于將pCAMBIA3301的EcoRI和SmaI識別序列間的DNA片段(pCAMBIA3301被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和SmaI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為序列表中序列3所示的DNA分子。所述重組微生物可通過將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到。所述出發(fā)微生物可為酵母、細菌、藻類或真菌。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。所述革蘭氏陰性細菌可為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。所述根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)可為根癌農(nóng)桿菌EHA105。所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系均不包括繁殖材料。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述PROG2基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。所述PROG2，或，所述編碼所述PROG2的核酸分子，或，含有所述編碼所述PROG2的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系，在調(diào)控植物株型和/ 或產(chǎn)量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述PROG2，或，所述編碼所述PROG2的核酸分子，或，含有所述編碼所述PROG2的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系，在培育株型改變和/或產(chǎn)量改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)量改變可為單株產(chǎn)量降低。上述應(yīng)用中，所述株型改變可為株高降低和/或分蘗數(shù)增加和/或分蘗角度增大和/或一次枝梗數(shù)減少和/或二次枝梗數(shù)減少和/或主莖穗粒數(shù)減少。上述應(yīng)用中，所述植物可為d1)-d4)中的任一種：d1)單子葉植物；d2)雙子葉植物；d3)水稻；d4)水稻品種ZH17。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將編碼所述PROG2的核酸分子導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比單株產(chǎn)量降低和/或株高降低和/或分蘗數(shù)增加和/或分蘗角度增大和/或一次枝梗數(shù)減少和/或二次枝梗數(shù)減少和/或主莖穗粒數(shù)減少。上述方法中，所述受體植物可為d1)-d4)中的任一種：d1)單子葉植物；d2)雙子葉植物；d3)水稻；d4)水稻品種ZH17。實驗證明，利用本發(fā)明提供的植物株型相關(guān)蛋白PROG2及其編碼基因能調(diào)控植物株型：T0代轉(zhuǎn)PROG2基因陽性植株表現(xiàn)出類似SIL40的表型；與受體植物ZH17相比，T0代轉(zhuǎn)PROG2基因陽性植株株高降低，分蘗數(shù)增加，分蘗角度增大，一次枝梗數(shù)減少，二次枝梗數(shù)減少，主莖穗粒數(shù)減少和單株產(chǎn)量降低?？梢?，植物株型相關(guān)蛋白PROG2對調(diào)控水稻株型和產(chǎn)量具有非常重要的作用，在培育高產(chǎn)水稻新品種中具有廣闊前景。附圖說明圖1為桂朝2號與東鄉(xiāng)普通野生稻滲入系SIL40的表型比較。圖2為PROG2基因的精細定位。圖3為T0代轉(zhuǎn)PROG2基因水稻植株與中花17的表型比較。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。桂朝2號記載于如下文獻中：ZhangX，ZhouSX，F(xiàn)uYC,etal.IdentificationofadroughttolerantintrogressionlinederivedfromDongxiangcommonwild rice(O.rufipogonGriff.).PlantMolBiol，2006，62:247～259，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。桂朝2號在下文中簡稱GC2。江西東鄉(xiāng)野生稻記載于如下文獻中：TianF，LiDJ，F(xiàn)uQ，ZhuZF，F(xiàn)uYC，WangXK，SunCQ.2006.Constructionofintrogressionlinescarryingwildrice(OryzarufipogonGriff.)segmentsincultivatedrice(O.sativaL.)backgroundandcharacterizationofintrogressedsegmentsassociatedwithyield-relatedtraits.TheoreticalandAppliedGenetics，112，570-80.公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。東鄉(xiāng)普通野生稻滲入系SIL40為GC2與江西東鄉(xiāng)野生稻多次雜交和回交的后代，其記載于如下文獻中：TianF，LiDJ，F(xiàn)uQ，ZhuZF，F(xiàn)uYC，WangXK，SunCQ.2006.Constructionofintrogressionlinescarryingwildrice(OryzarufipogonGriff.)segmentsincultivatedrice(O.sativaL.)backgroundandcharacterizationofintrogressedsegmentsassociatedwithyield-relatedtraits.TheoreticalandAppliedGenetics，112，570-80.公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。東鄉(xiāng)普通野生稻滲入系SIL40在下文中簡稱SIL40。ZH17記載于如下文獻中：TanLB,LiXR,LiuFX,SunXY,LiCG,ZhuZF,FuYC,CaiHW,WangXK,XieDXandSunCQ.Controlofakeytransitionfromprostratetoerectgrowthinricedomestication.NatureGenetics,2008,40(11):1360-1364，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實施例中的根癌農(nóng)桿菌EHA105(文獻中的名稱為AgrobacteriumtumefaciensstrainEHA105)記載于如下文獻中：GLUTELINPRECURSORACCUMULATION3encodesaregulatorofpost-Golgivesiculartrafficessentialforvacuolarproteinsortinginriceendosperm.PlantCell.2014Jan；26(1):410-25.公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請實驗。實施例1、株型改變和/或產(chǎn)量改變的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及鑒定一、PROG2基因的發(fā)現(xiàn)將GC2與SIL40的表型進行比較及統(tǒng)計，實驗結(jié)果見圖1(a為分蘗期整體株型對比，b為灌漿期整體株型對比，c為主莖穗對比，d為分蘗數(shù)統(tǒng)計結(jié)果，e為分蘗角度統(tǒng)計結(jié)果，f為一次枝梗數(shù)比較，g為二次枝梗數(shù)比較，h為主莖穗粒數(shù)比較，i為單株產(chǎn)量比較，其中*表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著)。結(jié)果表明，與GC2相比，SIL40傾斜生長，分蘗數(shù)增加，分蘗角度增大，一次枝梗數(shù)減少，二次枝梗數(shù)減少、主莖穗粒數(shù)減少，單株產(chǎn)量減少。SIL40與輪回親本GC2回交，構(gòu)建次級分離群體。利用次級分離群體將PROG2基 因(序列表序列1所示)初步定位于水稻第7染色體短臂SW1與ID52標(biāo)記之間。進一步，利用4000隱性純合單株(直立生長)，將PROG2基因精細定位于F43和ID52兩標(biāo)記之間(見圖2)，實際物理距離為9.2kb。PROG2基因的開放閱讀框如序列表中序列1自5’末端起第125-691位所示，編碼的蛋白命名為PROG2，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，由188個氨基酸殘基組成。二、PROG2基因功能驗證1、重組載體和重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建(1)以江西東鄉(xiāng)野生稻2周苗為實驗材料，提取基因組DNA為模板，采用引物D81-F：5′-CGGAATTCAAGCTTTGGAGAATAAGTCT-3′(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶EcoRI識別位點)和引物D81-R：5′-TCCCCCGGGTCTAGAAAGGGATTTATCCC-3′(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶SmaI識別位點)進行擴增，得到約4200bp的PCR產(chǎn)物。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SmaI雙酶切步驟(1)獲得的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SmaI雙酶切植物表達載體pCAMBIA1300，回收約8.9kb載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒D81。根據(jù)測序結(jié)果，對步驟(4)獲得的重組質(zhì)粒D81進行結(jié)構(gòu)描述如下：向植物表達載體pCAMBIA1300的EcoRI和SmaI酶切位點之間插入核苷酸序列是序列表中的序列3所示的DNA分子。重組質(zhì)粒D81表達序列表中序列2所示的PROG2蛋白。重組質(zhì)粒D81含有一個表達盒，所述表達盒包括PROG2啟動子、PROG2蛋白的編碼基因和PROG2終止子；所述PROG2啟動子如序列3自5’末端起第1至1258位所示，所述PROG2蛋白的編碼基因如序列3自5’末端起第1383至1949位所示，所述PROG2終止子如序列3自5’末端起第2151至4214位所示。將重組質(zhì)粒D81導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，得到含有重組質(zhì)粒D81的重組農(nóng)桿菌EHA105/D81。將空載體質(zhì)粒pCAMBIA1300轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到含有質(zhì)粒pCAMBIA1300的重組農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1300。2、轉(zhuǎn)PROG2基因水稻的獲得(1)將水稻品種ZH17的種子脫殼滅菌，然后采用Hiei等的方法(HieiY,OhtaS,KomariT&KumashiroT.Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ.1994,6:271–282)用重組農(nóng)桿菌EHA105/D81轉(zhuǎn)化ZH17，獲得T0代擬轉(zhuǎn)PROG2基因水稻植株。(2)分別提取T0代擬轉(zhuǎn)PROG2基因水稻植株的基因組DNA并作為模板，采用引物HPT-F：5＇-TACTTCTACACAGCCATC-3＇和引物HPT-R：5＇-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3＇擴增，如果得到947bp的擴增產(chǎn)物，則該T0代擬轉(zhuǎn)PROG2基因水稻植株為T0代轉(zhuǎn)PROG2基因陽性植株。按照上述(1)和(2)的方法，最終獲得56株T0代轉(zhuǎn)PROG2基因陽性植株。隨機選擇3個T0代轉(zhuǎn)PROG2基因陽性植株的株系，分別命名為D81-1、D81-2和D81-3，進行下述實驗。按照上述方法，將重組農(nóng)桿菌EHA105/D81替換為重組農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1300，其他步驟均相同，得到T0代轉(zhuǎn)空載體陽性植株。3、轉(zhuǎn)PROG2基因陽性植株的表型鑒定將水稻品種ZH17、T0代轉(zhuǎn)空載體陽性植株和D81-1的種子分別種植在裝有營養(yǎng)土和蛭石的盆中(營養(yǎng)土和蛭石體積比為1:1)，25℃、光照交替培養(yǎng)，在生長發(fā)育過程中對水稻植株表型進行比較及統(tǒng)計。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)30株。按照上述步驟，將D81-1分別替換為D81-2和D81-3，其它步驟均相同，得到各水稻植株表型的統(tǒng)計結(jié)果。實驗結(jié)果見圖3(a為分蘗期整體株型對比，b為灌漿期整體株型對比，c為主莖穗對比，d為株高統(tǒng)計結(jié)果，e為分蘗數(shù)統(tǒng)計結(jié)果，f為一次枝梗數(shù)比較，g為二次枝梗數(shù)比較，h為主莖穗粒數(shù)比較，i為單株產(chǎn)量比較，其中*表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著)。結(jié)果表明，T0代轉(zhuǎn)PROG2基因陽性植株表現(xiàn)出類似SIL40的表型；與ZH17相比，T0代轉(zhuǎn)PROG2基因陽性植株株高降低約四分之一，分蘗數(shù)增加約一倍，分蘗角度增大，一次枝梗數(shù)減少約四分之一，二次枝梗數(shù)減少約三分之二，主莖穗粒數(shù)減少約二分之一和單株產(chǎn)量降低約三分之一。T0代轉(zhuǎn)空載體陽性植株與ZH17的株高、分蘗數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、主莖穗粒數(shù)和單株產(chǎn)量均無顯著差異。結(jié)果表明，PROG2基因?qū)φ{(diào)控水稻株型和產(chǎn)量具有非常重要的作用。當(dāng)前第1頁1 2 3