本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及一種抗菌肽BV21。
背景技術(shù)：
：抗生素在動物生產(chǎn)中應用已經(jīng)有60-70年歷史，曾對畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到了非常大的推動作用。然而，隨著抗生素在畜牧業(yè)的廣泛使用，畜牧業(yè)中大量使用抗生素的潛在危害也日益突出。一方面抗生素大量使用引起的畜禽產(chǎn)品藥物殘留可對人體直接產(chǎn)生毒性及過敏作用；另一方面抗生素的大量應用使細菌耐藥性增強、耐藥菌增加，對人類安全產(chǎn)生嚴重威脅，近年來不斷出現(xiàn)的“超級細菌”就是典型的例子。鑒于此，歐盟等發(fā)達國家已經(jīng)開始禁止在畜禽飼料中使用抗生素，尋找替代抗生素的飼料添加劑、改善畜禽生產(chǎn)性能是當前研究的熱點課題?？咕氖亲匀唤缟镏袕V泛存在的一種小分子活性多肽，是生物體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有高效廣譜的抗菌作用。且抗菌肽具有熱穩(wěn)定性好和不易產(chǎn)生耐藥性等特點，在醫(yī)藥衛(wèi)生和畜禽生產(chǎn)等領域具有廣泛的應用前景，成為替代抗生素重要的潛在物質(zhì)。大量天然來源的抗菌肽存在分子量大而存在免疫原性、抗菌活性不高、對動物細胞具有毒副作用或會導致溶血等缺陷，在一定程度上限制了抗菌肽的推廣應用。通過分子設計和改造獲得分子量小、抗菌活性高和對動物細胞無毒副作用的抗菌肽可克服天然來源抗菌肽的應用瓶頸。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種新的抗菌肽。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種抗菌肽BV21，其特征在于：所述抗菌肽BV21的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。具體為：IRVLGILGLLGKALSHL，分子量為1773.24Da，等電點為11.00。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：本發(fā)明中的抗菌肽BV21具有分子量小、人工合成方便、殺菌作用強、細胞毒性低等優(yōu)點，在畜禽飼料中應用能夠顯著提高畜禽的生長性能、改善畜禽腸道健康。本發(fā)明的實施例通過測定抗菌肽BV21最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)來反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測不到細菌生長的最低樣品濃度。結(jié)果表明本發(fā)明的抗菌肽BV21對大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌均有非常強的殺傷作用。在細胞毒性實驗上，即使在300ug/mL的濃度下，抗菌肽BV21對豬小腸上皮細胞IPEC-1也只存在很低(小于15％)的細胞毒副作用?？咕腂V21能夠顯著提高斷奶仔豬的生長性能，提高斷奶仔豬日增重和降低料重比，改善斷奶仔豬腸道健康、降低斷奶仔豬腹瀉率。附圖說明圖1是抗菌肽BV21細胞毒性分析圖；圖2抗菌肽BV21對24日齡斷奶仔豬腹瀉率的影響圖。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：抗菌肽BV21的制備抗菌肽BV21化學合成方法：根據(jù)
發(fā)明內(nèi)容中所述氨基酸序列，用全自動多肽合成儀(ABI433)合成BV21全序列(湖南師范大學生命科學學院合成)，并通過HPLC反相柱層析脫鹽純化；純化的抗菌肽BV21分子量采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)測定,等電點使用等電聚焦電泳測定，氨基酸序列采用自動氨基酸序列測定儀進行解析。抗菌肽BV21含有17個氨基酸殘基，分子量為1773.24Da，等電點為11.00，氨基酸序列為IRVLGILGLLGKALSHL(SEQIDNO:1)。實施例2：抗菌肽BV21抑菌實驗通過測定抗菌肽BV21最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)來反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測不到細菌生長的最低樣品濃度。采用二倍稀釋法，具體方法如下：受試細菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，然后于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，用一次性接種環(huán)挑取各受試細菌單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。紫外分光光度計上檢測菌液OD600，根據(jù)1OD600＝1×109CFU/mL將受試菌菌液用液體LB培養(yǎng)基稀釋至2×105CFU/mL。然后在無菌96孔板各孔中加入100μLLB液體培養(yǎng)基，然后在A1孔中加入100μL稀釋到一定濃度的抗菌肽BV21樣品(抗菌肽樣品加入前用0.22μm微孔濾膜過濾除菌)，混勻后取100μL加入A2孔，A2孔混勻后再取100μL加入A3孔，依次倍比稀釋，最后從A12孔吸出100μL棄去，至此抗菌肽BV21二倍濃度梯度樣制成。向預先加入抗菌肽BV21的各孔中再依次加入已稀釋好的菌液100μL混勻，于37℃緩慢震蕩培養(yǎng)16h，然后測定600nm處吸光值。結(jié)果計算：取檢測不到細菌生長的孔和與之相鄰的有細菌生長的孔中抗菌肽BV21濃度之和的平均值作為抗菌肽BV21最小抑菌濃度。測試結(jié)果見表1所示。從表1中可以看出抗菌肽BV21對大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌(中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供)均有非常強的殺傷作用。表1：抗菌肽BV21對各菌的最小抑菌濃度表受試菌種BV21MIC(ug/mL)大腸桿菌17.52沙門氏菌4.7枯草芽孢桿菌9.83注：1)其中BV21MIC：即抗菌肽BV21的最小抑菌濃度。2)所述結(jié)果為五次獨立重復實驗結(jié)果的平均值。實施例3：抗菌肽BV21的細胞毒性實驗豬小腸上皮細胞IPEC-1(中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供)培養(yǎng)于含有5％太牛血清、200U/mL雙抗(青霉素和鏈霉素各100U/mL)，5ug/L表皮生長因子(EGF)的HAM’S/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，用磷酸鹽緩沖液(HyClone)清洗三遍后，加入0.25％(2.5g/L)的胰蛋白酶消化至單個細胞，加入HAM’S/F12培養(yǎng)基后400g離心4分鐘，棄上清后用新鮮的HAM’S/F12培養(yǎng)基懸浮細胞，調(diào)整至細胞密度為1×106個/mL，然后往96孔細胞培養(yǎng)板每孔中加入200uL，待細胞貼壁后加入不同濃度抗菌肽BV21，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5％CO2)培養(yǎng)24小時后，每孔中加入20uLCCK-8(碧云天)CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時，然后用酶標儀檢測450nm波長的吸光值。檢測結(jié)果如圖1所示(其中BV21-300為300ug/mL抗菌肽BV21；BV21-150為150ug/mL抗菌肽BV21；PBS：磷酸鹽 緩沖液為對照組，所述實驗結(jié)果為六次獨立實驗結(jié)果的平均值)，從圖1中可以看出，即使在300ug/mL的濃度下，抗菌肽BV21對豬小腸上皮細胞IPEC-1仍然存在很低(小于15％)的細胞毒副作用。。實施例4：抗菌肽BV21對斷奶仔豬(24日齡)大腸桿菌攻毒實驗選取24日齡杜洛克×長白×大白斷奶仔豬_200頭，采用單因子試驗設計，按體重和性別隨機分到2個處理組，對照組不添加抗菌肽BV21，實驗組添加50mg/kg抗菌肽BV21，每組10個重復，每個重復10頭豬，試驗期14天?？咕腂V21對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響見表2和圖2。從表2的實驗結(jié)果可以看出抗菌肽PD22可顯著提高斷奶仔豬日增重和降低料重比；顯著提高斷奶仔豬的生長性能。從圖2的實驗結(jié)果可以看出抗菌肽BV21可改善斷奶仔豬腸道健康、降低斷奶仔豬腹瀉率。表2：抗菌肽BV21對斷奶仔豬(24日齡)生長性能的影響表項目對照組BV21日增重(g/d)279.6324.7日采食量(g/d)371.9386.4料肉比1.331.19盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁1 2 3