本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種抗菌肽BV21及其用途。
背景技術(shù)：
：抗生素在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用已經(jīng)有60-70年歷史，曾對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到了非常大的推動(dòng)作用。然而，隨著抗生素在畜牧業(yè)的廣泛使用，畜牧業(yè)中大量使用抗生素的潛在危害也日益突出。一方面抗生素大量使用引起的畜禽產(chǎn)品藥物殘留可對(duì)人體直接產(chǎn)生毒性及過(guò)敏作用；另一方面抗生素的大量應(yīng)用使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、耐藥菌增加，對(duì)人類安全產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，近年來(lái)不斷出現(xiàn)的“超級(jí)細(xì)菌”就是典型的例子。鑒于此，歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)開始禁止在畜禽飼料中使用抗生素，尋找替代抗生素的飼料添加劑、改善畜禽生產(chǎn)性能是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)課題?？咕氖亲匀唤缟镏袕V泛存在的一種小分子活性多肽，是生物體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有高效廣譜的抗菌作用。且抗菌肽具有熱穩(wěn)定性好和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，在醫(yī)藥衛(wèi)生和畜禽生產(chǎn)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，成為替代抗生素重要的潛在物質(zhì)。大量天然來(lái)源的抗菌肽存在分子量大而存在免疫原性、抗菌活性不高、對(duì)動(dòng)物細(xì)胞具有毒副作用或會(huì)導(dǎo)致溶血等缺陷，在一定程度上限制了抗菌肽的推廣應(yīng)用。通過(guò)分子設(shè)計(jì)和改造獲得分子量小、抗菌活性高和對(duì)動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒副作用的抗菌肽可克服天然來(lái)源抗菌肽的應(yīng)用瓶頸。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種新的抗菌肽的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種抗菌肽BV21，其特征在于：所述抗菌肽BV21的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。具體為：IRVLGILGLLGKALSHL，分子量為1773.24Da，等電點(diǎn)為11.00。本發(fā)明的一個(gè)方面，提供所述抗菌肽BV21及其用途，其特征在于，所述用途為抗菌的用途。進(jìn)一步，所述抗菌為抗大腸桿菌、沙門氏菌和或枯草芽孢桿菌。本發(fā)明的一個(gè)方面，提供所述抗菌肽BV21用于飼養(yǎng)畜禽的用途。進(jìn)一步，所述畜禽為豬、雞、鴨或鵝。進(jìn)一步，所述豬為乳仔豬、斷奶仔豬、生長(zhǎng)豬或種豬。進(jìn)一步，所述雞為肉雞或蛋雞。進(jìn)一步，所屬用途為提高斷奶仔豬日增重和降低料重比。進(jìn)一步，所述用途為降低斷奶仔豬腹瀉率的用途。進(jìn)一步，所述用途為改善斷奶仔豬的腸道健康。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明中的抗菌肽BV21具有分子量小、人工合成方便、殺菌作用強(qiáng)、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，在畜禽飼料中應(yīng)用能夠顯著提高畜禽的生長(zhǎng)性能、改善畜禽腸道健康。本發(fā)明的實(shí)施例通過(guò)測(cè)定抗菌肽BV21最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)來(lái)反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度。結(jié)果表明本發(fā)明的抗菌肽BV21對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌均有非常強(qiáng)的殺傷作用。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)上，即使在300ug/mL的濃度下，抗菌肽BV21對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1也只存在很低(小于15％)的細(xì)胞毒副作用?？咕腂V21能顯著提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，提高斷奶仔豬日增重和降低料重比，改善斷奶仔豬腸道健康、降低斷奶仔豬腹瀉率。附圖說(shuō)明圖1是抗菌肽BV21細(xì)胞毒性分析圖；圖2抗菌肽BV21對(duì)24日齡斷奶仔豬腹瀉率的影響圖。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1：抗菌肽BV21的制備抗菌肽BV21化學(xué)合成方法：根據(jù)
發(fā)明內(nèi)容中所述氨基酸序列，用全自動(dòng)多肽合成儀(ABI433)合成BV21全序列(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院合成)，并通過(guò)HPLC反相柱層析脫鹽純化；純化的抗菌肽BV21分子量采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)測(cè)定,等電點(diǎn)使用等電聚焦電泳測(cè)定，氨基酸序列采用自動(dòng)氨基酸序列測(cè)定儀進(jìn)行解析。抗菌肽BV21含有17個(gè)氨基酸殘基，分子量為1773.24Da，等電點(diǎn)為11.00，氨基酸序列為IRVLGILGLLGKALSHL(SEQIDNO:1)。實(shí)施例2：抗菌肽BV21抑菌實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定抗菌肽BV21最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)來(lái)反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度。采用二倍稀釋法，具體方法如下：受試細(xì)菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，然后于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，用一次性接種環(huán)挑取各受試細(xì)菌單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)菌液OD600，根據(jù)1OD600＝1×109CFU/mL將受試菌菌液用液體LB培養(yǎng)基稀釋至2×105CFU/mL。然后在無(wú)菌96孔板各孔中加入100μLLB液體培養(yǎng)基，然后在A1孔中加入100μL稀釋到一定濃度的抗菌肽BV21樣品(抗菌肽樣品加入前用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌)，混勻后取100μL加入A2孔，A2孔混勻后再取100μL加入A3孔，依次倍比稀釋，最后從A12孔吸出100μL棄去，至此抗菌肽BV21二倍濃度梯度樣制成。向預(yù)先加入抗菌肽BV21的各孔中再依次加入已稀釋好的菌液100μL混勻，于37℃緩慢震蕩培養(yǎng)16h，然后測(cè)定600nm處吸光值。結(jié)果計(jì)算：取檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的孔和與之相鄰的有細(xì)菌生長(zhǎng)的孔中抗菌肽BV21濃度之和的平均值作為抗菌肽BV21最小抑菌濃度。測(cè)試結(jié)果見表1所示。從表1中可以看出抗菌肽BV21對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌(中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供)均有非常強(qiáng)的殺傷作用。表1：抗菌肽BV21對(duì)各菌的最小抑菌濃度表受試菌種BV21MIC(ug/mL)大腸桿菌17.52沙門氏菌4.7枯草芽孢桿菌9.83注：1)其中BV21MIC：即抗菌肽BV21的最小抑菌濃度。2)所述結(jié)果為五次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。實(shí)施例3：抗菌肽BV21的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1(中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供)培養(yǎng)于含有5％太牛血清、200U/mL雙抗(青霉素和鏈霉素各100U/mL)，5ug/L表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的HAM’S/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用磷酸鹽緩沖液(HyClone)清洗三遍后，加入0.25％(2.5g/L)的胰蛋白酶消化至單個(gè)細(xì)胞，加入HAM’S/F12培養(yǎng)基后400g離心4分鐘，棄上清后用新鮮的HAM’S/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整至細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，然后往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中加入200uL，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度抗菌肽BV21，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5％CO2)培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔中加入20uLCCK-8(碧云天)CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)的吸光值。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(其中BV21-300為300ug/mL抗菌肽BV21；BV21-150為150ug/mL抗菌肽BV21；PBS：磷酸鹽緩沖液為對(duì)照組，所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為六次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值)，從圖1中可以看出，即使在300ug/mL的濃度下，抗菌肽BV21對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1存在很低(小于15％)的細(xì)胞毒副作用。。實(shí)施例4：抗菌肽BV21對(duì)斷奶仔豬(24日齡)大腸桿菌攻毒實(shí)驗(yàn)選取24日齡杜洛克×長(zhǎng)白×大白斷奶仔豬200頭，采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按體重和性別隨機(jī)分到2個(gè)處理組，對(duì)照組不添加抗菌肽BV21，實(shí)驗(yàn)組添加50mg/kg抗菌肽BV21，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬，試驗(yàn)期14天。抗菌肽BV21對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響見表2和圖2。從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出抗菌肽BV21可顯著提高斷奶仔豬日增重和降低料重比；顯著提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能。從圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出抗菌肽BV21可改善斷奶仔豬腸道健康、降低斷奶仔豬腹瀉率。表2：抗菌肽BV21對(duì)斷奶仔豬(24日齡)生長(zhǎng)性能的影響表項(xiàng)目對(duì)照組BV21日增重(g/d)279.6324.7日采食量(g/d)371.9386.4料肉比1.331.19盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3