本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及gsha12蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土地鹽堿化嚴(yán)重威脅我國乃至世界農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的正常發(fā)展，全世界約20％的可耕種地和50％的灌溉地受鹽堿化影響。中國東北地域的松嫩平原是世界三大鹽堿地之一，約有鹽堿地373.33萬hm²，這嚴(yán)重制約我國東北地區(qū)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的正常發(fā)展，限制糧食產(chǎn)量。然而，隨著我國人口的持續(xù)增長和可耕種土壤的退化，合理開發(fā)利用鹽堿地是增加我國糧食產(chǎn)量的重要舉措之一，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。隨著功能基因組學(xué)、分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)日新月異的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因分子育種改良作物耐鹽堿性，已成為改良和合理開發(fā)利用鹽堿地的手段之一。然而，其關(guān)鍵在于挖掘功能顯著的耐鹽堿關(guān)鍵調(diào)控基因。

在生命有機(jī)體的生長發(fā)育過程中，一系列的生理生化反應(yīng)都需要在特定ph條件下進(jìn)行，如細(xì)胞質(zhì)ph維持在7-8。質(zhì)膜h⁺-atpase在植物和真菌中通過偶聯(lián)atp的水解對質(zhì)子進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，產(chǎn)生的ph梯度為次級轉(zhuǎn)運(yùn)器提供驅(qū)動力。植物質(zhì)膜h⁺-atpase是一類質(zhì)子泵，在植物營養(yǎng)吸收、細(xì)胞內(nèi)ph調(diào)節(jié)、氣孔開閉和細(xì)胞生長等生理過程中是不可或缺的。除此之外，在植物應(yīng)對外界不利因素也具有重要作用，如鹽堿、低溫、干旱、重金屬毒害、光脅迫、化學(xué)脅迫和激素脅迫等非生物脅迫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物耐逆性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了與植物耐逆性相關(guān)蛋白質(zhì)gsha12的新用途。

本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)gsha12在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。

本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)gsha12是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；

b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；

d)與序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

其中，序列2由888個氨基酸殘基組成。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與蛋白質(zhì)gsha12相關(guān)的生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了與蛋白質(zhì)gsha12相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。

所述與蛋白質(zhì)gsha12相關(guān)的生物材料為下述a1)至a12)中的任一種：

a1)編碼蛋白質(zhì)gsha12的核酸分子；

a2)含有a1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；

a4)含有a2)所述表達(dá)盒的重組載體；

a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；

a6)含有a2)所述表達(dá)盒的重組微生物；

a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；

a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物；

a9)含有a1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

a10)含有a2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

a11)含有a3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

a12)含有a4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。

上述應(yīng)用中，a1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其編碼序列是序列1所示的cdna分子或基因組dna分子；

2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼蛋白質(zhì)gsha12的cdna分子或基因組dna分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼蛋白質(zhì)gsha12的cdna分子或基因組dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

其中，序列1由2667個核苷酸組成，編碼序列2所示的氨基酸序列。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)gsha12的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有編碼蛋白質(zhì)gsha12的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼蛋白質(zhì)gsha12且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述應(yīng)用中，所述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述應(yīng)用中，a2)所述的含有編碼蛋白質(zhì)gsha12的核酸分子的表達(dá)盒(gsha12基因表達(dá)盒)是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)gsha12的dna，該dna不但可包括啟動gsha12轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止gsha12轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動子及誘導(dǎo)型啟動子。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、花椰菜花葉病毒camv35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子。

可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述gsha12基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptii基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

上述應(yīng)用中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。

上述應(yīng)用中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。

上述應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了蛋白質(zhì)gsha12或上述相關(guān)生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)gsha12或上述相關(guān)生物材料在培育耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了蛋白質(zhì)gsha12或上述相關(guān)生物材料在植物育種中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述耐逆性為耐堿性；所述耐堿性具體為耐碳酸鹽脅迫；所述耐碳酸鹽脅迫具體為耐nahco3脅迫。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高。

上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜?；蛩S皮；所述十字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述擬南芥可為擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后提供了一種培育耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的培育耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括提高受體植物中蛋白質(zhì)gsha12的表達(dá)量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述受體植物。

上述方法中，所述耐逆性為耐堿性；所述耐堿性具體為耐碳酸鹽脅迫。

上述方法中，所述耐碳酸鹽脅迫為耐nahco3脅迫，具體體現(xiàn)為在nahco3脅迫的條件下：轉(zhuǎn)基因植物的種子萌發(fā)速率高于受體植物和/或轉(zhuǎn)基因植物的地上部分的鮮重高于受體植物和/或轉(zhuǎn)基因植物的長勢優(yōu)于野生型。所述nahco3的濃度具體可為6mmnahco3或8mmnahco3或150mmnahco3。

上述方法中，所述提高受體植物中蛋白質(zhì)gsha12的表達(dá)量和/或活性的方法為在受體植物中過表達(dá)蛋白質(zhì)gsha12。所述過表達(dá)的方法為將蛋白質(zhì)gsha12的編碼基因?qū)胧荏w植物。

上述方法中，所述蛋白質(zhì)gsha12的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)gsha12的編碼基因(即序列表中序列1所示的dna分子)通過重組載體pcambia330035su-gsha12導(dǎo)入所述受體植物中，所述重組載體pcambia330035su-gsha12為在pcambia330035su載體中插入如序列表中序列1所示的gsha12基因。gsha12基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜蓿或水黃皮；所述十字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述擬南芥可為擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)。

上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述gsha12基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。

擴(kuò)增編碼上述蛋白質(zhì)gsha12的核酸分子全長或其片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明將gsha12基因超表達(dá)于擬南芥中，得到轉(zhuǎn)gsha12擬南芥。通過實(shí)驗(yàn)證明：在碳酸鹽脅迫下，轉(zhuǎn)gsha12擬南芥的種子萌發(fā)速率和地上部分的鮮重均高于受體植物。說明gsha12基因可增強(qiáng)擬南芥對碳酸鹽脅迫的耐性，gsha12蛋白可以為培育具有碳酸鹽脅迫耐性的轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為gsha12基因在碳酸鹽脅迫下的表達(dá)模式分析。

圖2為轉(zhuǎn)gsha12擬南芥植株的pcr檢測。

圖3為轉(zhuǎn)gsha12擬南芥植株的rt-pcr檢測。

圖4為轉(zhuǎn)gsha12擬南芥植株萌發(fā)期的耐碳酸鹽脅迫分析。

圖5為轉(zhuǎn)gsha12擬南芥植株幼苗期的耐碳酸鹽脅迫分析。

圖6為轉(zhuǎn)gsha12擬南芥植株成苗期的耐碳酸鹽脅迫分析。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的野生型大豆g07256記載于如下文獻(xiàn)：mingzhesun,xiaolisun,yangzhao,huacai,chaoyuezhao,weiji,huiziduanmu,yangyu,yanmingzhu.ectopicexpressionofgsppck3andscmrpinmedicagosativaenhancesplantalkalinestresstoleranceandmethioninecontent.plosone2014,9(2):e89578，公眾可從申請人(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué))處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的pcambia330035su記載于如下文獻(xiàn)：xiaolisun,weiji,xiaodongding,xibai,huacai,shanshanyang,xueqian,mingzhesun,yanmingzhu.gsvamp72,anovelglycinesojar-snareprotein,isinvolvedinregulatingplantsalttoleranceandabasensitivity.plantcelltissorgancult2013,113:199–215，公眾可從申請人(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué))處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的根癌農(nóng)桿菌gv3101記載于如下文獻(xiàn)：leecw,etal.agrobacteriumtumefacienspromotestumorinductionbymodulatingpathogendefenseinarabidopsisthaliana,plantcell,2009,21(9),2948-62，公眾可從申請人(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué))處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)記載于如下文獻(xiàn)：luox,sunx,liub,etal.ectopicexpressionofawrkyhomologfromglycinesojaaltersfloweringtimeinarabidopsis[j].plosone,2013,8(8):e73295，公眾可從申請人(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué))處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

實(shí)施例1、野生大豆gsha12全長基因的克隆

1、總rna的提取

選取飽滿的野生大豆g07256種子，用濃h2so4處理10min，無菌水沖洗3-4次，25℃暗培養(yǎng)2-3d催芽。待芽長到1-2cm時，將其轉(zhuǎn)移至1/4hogland營養(yǎng)液中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。取3周齡野生大豆g07256幼苗的根，采用rnapreppure試劑盒(tiangen)提取總rna。

2、cdna的獲得

以oligodt為引物進(jìn)行cdna第一條鏈的合成，方法參見invitrogen公司superscript^tmiiireversetranscriptase說明書，得到野生大豆總cdna。

3、pcr擴(kuò)增

以野生大豆總cdna為模板，采用引物gsha12-s和gsha12-as進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下：

gsha12-s：5'-atgtggaatcctctttcatgggtca-3'；

gsha12-as：5'-ctagacagtgtatgcttgctgtattgtgtc-3'；

4、gsha12基因的克隆載體構(gòu)建及測序

將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與peasy-t載體連接，構(gòu)建peasy-gsha12克隆載體。并對其進(jìn)行測序。

測序結(jié)果表明：pcr擴(kuò)增得到的大小為2667bp的dna片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為gsha12基因，自5’端第1-2667位為orf，gsha12基因編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)，將序列2所示的氨基酸序列命名為gsha12蛋白。

實(shí)施例2、gsha12基因在碳酸鹽脅迫條件下的表達(dá)模式分析

1、對3周齡的野生大豆g07256幼苗進(jìn)行50mmnahco3碳酸鹽脅迫處理，分別在處理0h、1h、3h、6h、12h、24h時取根尖組織。

2、采用rna提取試劑盒rneasyplantminikit(qiagen，hilden，germany)提取總rna，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript^tmiiireversetranscriptasekit(invitrogen，carlsbad，ca，usa)反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。

3、采用sybr定量試劑盒sybrpremixextaq^tmiimix(takara,shiga,japan)于熒光定量pcr儀abi7500(appliedbiosystems,usa)上進(jìn)行real-timepcr檢測基因表達(dá)量。定量分析采用比較ct法(△△ct)，以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參，未經(jīng)處理的樣品作為對照。經(jīng)gapdh基因均一化處理后，通過2^-△△ct法計算gsha12基因表達(dá)量變化差異，以處理樣本相對于未處理樣本的倍數(shù)表示。gsha12基因特異引物為5’-aggcaagggctggtattcaagag-3’和5’-gagaccgtaatcctcgctctgca-3’，gapdh基因特異引物為5’-gactggtatggcattccgtgt-3’和5’-gccctctgattcctccttga-3’。

定量real-timepcr結(jié)果顯示碳酸鹽脅迫處理后，gsha12基因表達(dá)量呈上升趨勢，并在碳酸鹽脅迫處理12h后達(dá)到頂峰(圖1)，表明gsha12基因的表達(dá)受碳酸鹽脅迫誘導(dǎo)。

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)gsha12擬南芥的獲得及耐碳酸鹽分析

一、轉(zhuǎn)gsha12擬南芥的獲得

1、以peasy-gsha12克隆載體質(zhì)粒為模板，采用基因特異引物gsha12-u-f和gsha12-u-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到gsha12基因全長cds區(qū)。引物序列如下(下劃線代表載體構(gòu)建時所需的接頭序列，其中u為user酶切位點(diǎn))：

gsha12-u-f:5’-ggcttaauatgtggaatcctctttcat-3’；

gsha12-u-r:5’-ggtttaauctagacagtgtatgcttgctg-3’。

2、用限制性內(nèi)切酶paci和nt.bbvci對pcambia330035su載體進(jìn)行雙酶切，得到載體酶切產(chǎn)物。將獲得的載體酶切產(chǎn)物、user酶(neb，m5505s)和步驟1獲得的gsha12基因在37℃下孵育20min，利用user酶對gsha12基因片段的尿嘧啶處進(jìn)行切割，形成可與pcambia330035su載體互補(bǔ)的粘性末端，接著25℃下孵育20min，得到重組表達(dá)載體pcambia330035su-gsha12，并送交測序。

測序結(jié)果表明：重組表達(dá)載體pcambia330035su-gsha12為在pcambia330035su載體中插入如序列表中序列1所示的gsha12基因，其保持pcambia330035su載體的其他序列不變后得到的載體。重組表達(dá)載體pcambia330035su-gsha12表達(dá)的gsha12蛋白。

3、采用凍融法，將pcambia330035su-gsha12載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌gv3101，獲得重組農(nóng)桿菌，并經(jīng)pcr鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子(含有序列表中序列1所示的gsha12轉(zhuǎn)化子)，用于侵染擬南芥植株。

4、轉(zhuǎn)gsha12擬南芥的獲得及鑒定

將上述重組農(nóng)桿菌通過floral-dip法侵染野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)。并將t0代種子表面消毒后，播種于含25mg/l固殺草的1/2ms培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。將t1代抗性苗移栽至營養(yǎng)缽中培養(yǎng)，提取基因組dna，進(jìn)行pcr鑒定和rt-pcr鑒定。

(1)pcr鑒定

采用easypureplantgenomicdnakit基因組提取試劑盒(全式金，ee111-01)，提取野生型擬南芥植株和固殺草抗性植株的基因組dna，以獲得的基因組dna為模板，并采用5'-atgtggaatcctctttcatgggtca-3'和5'-ctagacagtgtatgcttgctgtattgtgtc-3'引物進(jìn)行pcr鑒定。結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出：抗性植株gsha12-u-1、gsha12-u-2、gsha12-u-3、gsha12-u-4、gsha12-u-5、gsha12-u-6和gsha12-u-7均擴(kuò)增得到目的條帶，而野生型擬南芥植株沒有擴(kuò)增得到的目的條帶。

(2)rt-pcr鑒定

對pcr鑒定陽性的植株，提取總rna，利用實(shí)施例1中的real-timepcr引物(5’-aggcaagggctggtattcaagag-3’和5’-gagaccgtaatcctcgctctgca-3’)進(jìn)行半定量rt-pcr，以擬南芥actin2基因?yàn)閮?nèi)參，檢測gsha12基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量。actin2基因特異引物序列如下：actin2-rt-f：5’-ttacccgatgggcaagtc-3’；actin2-rt-r：5’-gctcatacggtcagcgatac-3’。

結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出：野生型擬南芥植株的rt-pcr無擴(kuò)增產(chǎn)物，而轉(zhuǎn)gsha12擬南芥均可以擴(kuò)增出目的條帶，表明外源基因gsha12不但已順利整合到擬南芥的基因組上，而且能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥中正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

將rt-pcr陽性的t1代轉(zhuǎn)gsha12擬南芥單株收種子，并分別播種于含25mg/l固殺草的1/2ms培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，觀察t2代分離情況。如此重復(fù)，直至得到t3代轉(zhuǎn)gsha12擬南芥純合體株系。選取t3代轉(zhuǎn)gsha12擬南芥純合體株系(#1)和(#2)用于下述耐碳酸鹽分析。

二、轉(zhuǎn)gsha12擬南芥的耐碳酸鹽分析

1、轉(zhuǎn)gsha12擬南芥萌發(fā)期的耐碳酸鹽分析

選取飽滿的野生型擬南芥、t3代轉(zhuǎn)gsha12擬南芥純合體株系(#1)和(#2)種子，用5％naclo處理6-8min，滅菌ddh2o沖洗5-7次，4℃春化3d，一部分播種于正常的1/2ms培養(yǎng)基，一部分播種于含6mmnahco3的1/2ms培養(yǎng)基，22℃培養(yǎng)3d，統(tǒng)計種子萌發(fā)率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每種處理各株系采用30株植株。

結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出：碳酸鹽脅迫嚴(yán)重抑制了野生型與轉(zhuǎn)gsha12擬南芥種子的萌發(fā)，但轉(zhuǎn)gsha12擬南芥純合體株系(#1)和(#2)的種子萌發(fā)率高于野生型。

2、轉(zhuǎn)gsha12擬南芥幼苗期的耐碳酸鹽分析

選取飽滿的野生型擬南芥、t3代轉(zhuǎn)gsha12擬南芥純合體株系(#1)和(#2)種子，春化后播種于正常的1/2ms培養(yǎng)基，22℃培養(yǎng)11d。待擬南芥長至六葉期，將幼苗移至正常、或含8mmnahco3的1/2ms培養(yǎng)基豎直培養(yǎng)7d。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每種處理各株系采用15株植株。

結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出：碳酸鹽脅迫抑制了野生型和轉(zhuǎn)gsha12擬南芥根的伸長和地上部分的生長，并且t3代轉(zhuǎn)gsha12擬南芥純合體株系(#1)和(#2)地上部分的鮮重也顯著高于野生型。

3、轉(zhuǎn)gsha12擬南芥成苗期的耐碳酸鹽分析

選取飽滿的野生型擬南芥、t3代轉(zhuǎn)gsha12擬南芥純合體株系(#1)和(#2)種子，春化后播種于營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土：君子蘭土：蛭石1：1：1)，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取長勢一致的4周齡擬南芥植株，每3d澆灌1次150mmnahco3(ph9.0)溶液進(jìn)行碳酸鹽脅迫處理，觀察脅迫處理后植株長勢。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每種處理各株系采用30株植株。

結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出：碳酸鹽脅迫處理后野生型和轉(zhuǎn)gsha12擬南芥都逐漸失綠發(fā)黃，變紫甚至死亡，但是t3代轉(zhuǎn)gsha12擬南芥純合體株系(#1)和(#2)的長勢明顯優(yōu)于野生型。

上述結(jié)果表明gsha12基因超量表達(dá)顯著提高了植物的耐逆性，尤其是碳酸鹽脅迫耐性。

序列表

<110>黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

<120>gsha12蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用

<160>2

<210>1

<211>2667bp

<212>dna

<213>野生大豆（glycinesoja）

<400>1

atgtggaatcctctttcatgggtcatggaagctgcagcaatcatggccattgctttggcc60

aatggaggaggaaaacctcctgattggcaagactttgttgggattatcacactccttatt120

atcaattcaacaataagtttcattgaggagaacaatgctggtaatgctgcggcagctctg180

atggctcgtttagcacctaaagctaagttccttcgagatgggaaatggattgaggaggat240

gctagcattcttgttcctggtgatataattagtgttaagctaggggatattatccctgcg300

gatgctcgtctacttgaaggtgatccactgaagattgatcagtctgcacttacaggcgag360

tctcttcctgtcacaaaaggccctggtgatagtgtttattcaggctccacatgcaagcag420

ggagagatcaatgcagttgttattgccacaggagttcataccttctttggcaaagctgct480

catcttgtggactccacaaatcaagttggtcatttccagaaggtcctgactgcaattggg540

aacttctgcatatgttccattgctgtgggaatgatagtagagataattgtcatgtaccca600

attcaacaccgggaatatcgtcctgggattgacaatctgcttgtgcttcttattggagga660

attcctattgccatgcctactgttttgtcagtgacaatggcaattggatcccatcgctta720

gctcagcagggtgctattactaaaagaatgacagcaatagaagagatggcaggaatggat780

gtattatgtagtgacaaaactggaactttgactttgaataaactgacagttgacaagaat840

cttattgagatttttgctaaaggagttgacgtagatactgttgttctcatggccgctcgg900

gctgcacgattggaaaaccaagatgctatagatgccgctattgtagggatgttgggtgat960

ccaaaagaggcaagggctggtattcaagaggttcacttcctacccttcaatccaactgac1020

aagcgaactgcaatcacttatatagacggtgaaagtaaaatgcatcgtgtcagcaaagga1080

gcaccagagcagattttgaatcttgcacgcaataaatcagagatagaacgcagagttcat1140

tctgtcattgataagtttgcagagcgaggattacggtctcttgcagtagcttaccaggaa1200

gttcctgatggaaagaaagaaagccaaggagggccttggcaatttattggactgttgcct1260

ttatttgacccacctagacatgatagtgctgagacaatacgaagggcattaaatcttgga1320

gtaaatgttaaaatgataacaggtgatcaactagcaataggaaaagaaacaggacgccgt1380

ctggggatgggaaccaacatgtacccttcatcggctttattgggccaaaacaaggatgaa1440

gcaattgctaccttgccagttgatgagttgattgaaaaagcagatggatttgctggtgtt1500

tttcctgaacacaaatatgagatcgtgaaacgtttacaagctaggaaacacatatgtgga1560

atgactggtgatggggttaacgatgctcctgctcttaaaaaggcagatattggaatagct1620

gtcgccgatgctactgatgcagctcgtagtgcttctgatattgttctgactgaacctggt1680

ctcagtgttatcatcagtgctgtactgaccagtcgagcaatattccaaaggatgaagaat1740

tacacaatctatgcagtttccatcacaatccgtattgtgcttggtttcatgttactggcc1800

ctcatatggcattttgattttccaccattcatggtgctgattattgctattcttaatgac1860

ggtaccattatgacgatatcaaaggacagggtgaaaccatctccatatccagatagctgg1920

aagttggccgagatctttaccactggaataattcttggtggttatttggctatgatgaca1980

gttattttcttttgggcagcatataaaacagattttttccctcaaacatttggagtctca2040

agtcttcagaaaaaggatagggatgactttagaaagcttgcctcagcaatatacctacaa2100

gttagcacaattagtcaggccctcatattcattacacgggctcggagttggtcttatgtt2160

gaacgtccgggtttgttacttgttgcagcttttgttatcgcccagctgatagctacctta2220

attgcagtttatgcaaattggagtttcgctgctattgaagggattggatggggttgggct2280

ggtgttgtttggctttacaacctcatcttttatatcccacttgactttatcaagttcata2340

attcgatatgccttgagtggaagggcttgggatcttgttattgaacaaaggattgctttt2400

acaaggaaaaaagattttggaaaggaagaacgtgaacttaaatgggcacatgcacagagg2460

acgcttcacggccttcacccaccagagactaagatgttcaatgaacgtacaagttacaca2520

gaacttaatcagatggctgaagaggctagaagacgagcagaaattgcaaggctgagagaa2580

ctgcatacacttaagggtcgtgttgagtctgtggttagactgaagggtcttaacattgac2640

acaatacagcaagcatacactgtctag2667

<210>2

<211>888

<212>prt

<213>野生大豆（glycinesoja）

<400>2

mettrpasnproleusertrpvalmetglualaalaalailemetala

151015

ilealaleualaasnglyglyglylysproproasptrpglnaspphe

202530

valglyileilethrleuleuileileasnserthrileserpheile

354045

glugluasnasnalaglyasnalaalaalaalaleumetalaargleu

505560

alaprolysalalyspheleuargaspglylystrpileglugluasp

65707580

alaserileleuvalproglyaspileileservallysleuglyasp

859095

ileileproalaaspalaargleuleugluglyaspproleulysile

100105110

aspglnseralaleuthrglygluserleuprovalthrlysglypro

115120125

glyaspservaltyrserglyserthrcyslysglnglygluileasn

130135140

alavalvalilealathrglyvalhisthrphepheglylysalaala

145150155160

hisleuvalaspserthrasnglnvalglyhispheglnlysvalleu

165170175

thralaileglyasnphecysilecysserilealavalglymetile

180185190

valgluileilevalmettyrproileglnhisargglutyrargpro

195200205

glyileaspasnleuleuvalleuleuileglyglyileproileala

210215220

metprothrvalleuservalthrmetalaileglyserhisargleu

225230235240

alaglnglnglyalailethrlysargmetthralailegluglumet

245250255

alaglymetaspvalleucysserasplysthrglythrleuthrleu

260265270

asnlysleuthrvalasplysasnleuilegluilephealalysgly

275280285

valaspvalaspthrvalvalleumetalaalaargalaalaargleu

290295300

gluasnglnaspalaileaspalaalailevalglymetleuglyasp

305310315320

prolysglualaargalaglyileglngluvalhispheleuprophe

325330335

asnprothrasplysargthralailethrtyrileaspglygluser

340345350

lysmethisargvalserlysglyalaprogluglnileleuasnleu

355360365

alaargasnlyssergluilegluargargvalhisservalileasp

370375380

lysphealagluargglyleuargserleualavalalatyrglnglu

385390395400

valproaspglylyslysgluserglnglyglyprotrpglnpheile

405410415

glyleuleuproleupheaspproproarghisaspseralagluthr

420425430

ileargargalaleuasnleuglyvalasnvallysmetilethrgly

435440445

aspglnleualaileglylysgluthrglyargargleuglymetgly

450455460

thrasnmettyrproserseralaleuleuglyglnasnlysaspglu

465470475480

alailealathrleuprovalaspgluleuileglulysalaaspgly

485490495

phealaglyvalpheprogluhislystyrgluilevallysargleu

500505510

glnalaarglyshisilecysglymetthrglyaspglyvalasnasp

515520525

alaproalaleulyslysalaaspileglyilealavalalaaspala

530535540

thraspalaalaargseralaseraspilevalleuthrgluprogly

545550555560

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565570575

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580585590

valleuglyphemetleuleualaleuiletrphispheaspphepro

595600605

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610615620

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625630635640

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645650655

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660665670

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675680685

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690695700

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705710715720

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725730735

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740745750

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755760765

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770775780

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785790795800

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805810815

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820825830

pheasngluargthrsertyrthrgluleuasnglnmetalagluglu

835840845

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850855860

lysglyargvalgluservalvalargleulysglyleuasnileasp

865870875880

thrileglnglnalatyrthrval

885