本發(fā)明涉及水稻抵抗葉片衰老蛋白rls3及其編碼基因與應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：水稻是一種主要的糧食作物，世界上近一半人口，都以稻米為食。中國是世界上水稻栽培的起源國，距今已有14000～18000年的歷史，中國也是世界上最大的稻米生產(chǎn)國家，占全世界35％的產(chǎn)量，而中國又是個人口大國，近年來耕地面積不斷減少，人們對水稻的需求卻越來越大，所以水稻種植生產(chǎn)尤為重要。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，水稻中90％以上的物質(zhì)來自于光合作用，所以葉片的生長發(fā)育直接關(guān)乎作物的產(chǎn)量。植物葉片的衰老是植物體生長發(fā)育的最后階段，被各種環(huán)境條件所誘導(dǎo)的一個植物生存所必需的主動過程。植物葉片衰老的過程中伴隨著一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)：葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；葉綠體內(nèi)的葉綠素、蛋白、脂類和核酸被降解和光合作用能力下降等(noodénld,guiamétjjandjohni,senescencemechanisms.physiolplant,1997,101:746～753；limpo,kimhjandnamhg,leafsenescence.annurevplantbiol,2007,58:115～136；quirinobf,nohys,himelblaue,etal.molecularaspectsofleafsenescence.trendsplantsci,2000,5:278～282)。葉片的快速衰老致使作物光合能力降低，從而嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量。所以研究水稻抵抗葉片衰老的分子機(jī)制，分離鑒定與抗衰老相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因，對水稻的遺傳改良和提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物葉片的衰老。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供一種與植物葉片衰老的相關(guān)蛋白。本發(fā)明提供的與植物葉片衰老的相關(guān)蛋白，將其命名為rls3，為如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列1所示的蛋白質(zhì)；b)在序列1所示的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。其中，序列1由651個氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個)rrrrrpoly-his2-10(通常為6個)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述c)中的蛋白質(zhì)rls3，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)rls3可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)rls3的編碼基因可通過將序列2所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明又提供了與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述a1)至a12)中的任一種：a1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表達(dá)盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；a4)含有a2)所述表達(dá)盒的重組載體；a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；a6)含有a2)所述表達(dá)盒的重組微生物；a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a10)含有a2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a11)含有a3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a12)含有a4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述相關(guān)生物材料中，a1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列2所示的cdna分子或序列3所示的基因組dna分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼rls3的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的rls3的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼rls3且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，a2)所述的含有編碼rls3的核酸分子的表達(dá)盒(rls3基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)rls3的dna，該dna不但可包括啟動rls3轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止rls3轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動子及誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35s：來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(pr1)(由水楊酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羥酸s-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑ii啟動子(pin2)或lap啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動子(美國專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(美國專利5,057,422)；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pf128(cn101063139b(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、 花椰菜花葉病毒camv35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述rls3基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptii基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料的新用途。本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在如下(1)-(4)中至少一種中的應(yīng)用：(1)調(diào)控植物衰老；(2)調(diào)控植物株高和/或穗長和/或結(jié)實(shí)率和/或單株產(chǎn)量；(3)培育抗衰老的轉(zhuǎn)基因植物；(4)培育衰老加快的轉(zhuǎn)基因植物。上述應(yīng)用中，所述衰老為葉片衰老。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高或抑制。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育抗衰老的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育抗衰老的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括將上述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗衰老的能力高于所述受體植物。上述方法中，所述抗衰老為抗葉片衰老；所述蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列是序列2的第43-1998核苷酸分子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因通過含有rls3基因表達(dá)盒的rls3基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中。所述含有rls3基因表達(dá)盒的rls3基因重組表達(dá)載體為pcambia1301-ubi-rls3；所述pcambia1301-ubi-rls3為將上述序列2的第43-1998位核苷酸分子插入植物表達(dá)載體pcambia1301-ubi的酶切位點(diǎn)bamhi和kpni之間，且保持植物表達(dá)載體pcambia1301-ubi的其他序列不變得到的載體。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述rls3基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗衰老的能力高于所述受體植物體現(xiàn)在如下(b1)-(b4)中的任一種：(b1)轉(zhuǎn)基因植物的株高高于所述受體植物；(b2)轉(zhuǎn)基因植物的穗長高于所述受體植物；(b3)轉(zhuǎn)基因植物的結(jié)實(shí)率高于所述受體植物；(b4)轉(zhuǎn)基因植物的單株產(chǎn)量高于所述受體植物。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后提供了一種培育衰老加快的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育衰老加快的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括將抑制上述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗衰老的能力低于所述受體植物。上述方法中，所述抗衰老為抗葉片衰老；所述抑制上述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為如下(c1)-(c4)中的任一種：(c1)序列4或序列5所示的dna分子編碼的rna；(c2)序列4或序列5所示的dna分子；(c3)含有序列4所示的dna分子和序列5所示的dna分子的片段或其編碼的rna；(c4)含有序列4所示的dna分子和序列5所示的dna分子的表達(dá)載體。上述方法中，所述含有序列4所示的dna分子和序列5所示的dna分子的表達(dá)載體為rnai-rls3干擾載體；所述rnai-rls3干擾載體為將序列4所示的dna分子插入ptck303/jl1460載體的spei和saci酶切位點(diǎn)間，且將序列5所示的dna分子插入ptck303/jl1460載體的bamhi和kpni酶切位點(diǎn)間，并保持ptck303/jl1460載體的其他序列不變得到的載體。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗衰老的能力低于所述受體植物體現(xiàn)在如下(d1)-(d4)中的任一種：(d1)轉(zhuǎn)基因植物的株高低于所述受體植物；(d2)轉(zhuǎn)基因植物的穗長低于所述受體植物；(d3)轉(zhuǎn)基因植物的結(jié)實(shí)率低于所述受體植物；(d4)轉(zhuǎn)基因植物的單株產(chǎn)量低于所述受體植物。上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。本發(fā)明以元江野生稻滲入系yil18為原始材料，對其進(jìn)行ems誘變，從中挑選出一個葉片變紅、快速衰老的突變植株rls3，并利用rls3和中花17雜交構(gòu)建的f2群體進(jìn)行基因型和表型鑒定，在第3染色體檢測到一個與抵抗葉片衰老相關(guān)的基因，命名為rls3。通過實(shí)驗(yàn)證明：rls3基因可以調(diào)控植物葉片的衰老，進(jìn)而對水稻的株高、穗長、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量產(chǎn)生影響，對水稻的生產(chǎn)也具有重要意義。附圖說明圖1為yil18與突變體rls3的表型比較。圖2為t2代轉(zhuǎn)rls3rnai水稻(r1)與中花17的表型和重要農(nóng)藝性狀比較。圖3為t2代轉(zhuǎn)rls3rnai水稻(r1)與中花17的表達(dá)量比較。圖4為t2代轉(zhuǎn)rls3水稻(pov1)與突變體rls3的表型和重要農(nóng)藝性狀比較。圖5為t2代轉(zhuǎn)rls3水稻(pov1)與突變體rls3的表達(dá)量比較。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的元江野生稻滲入系yil18在文獻(xiàn)“tanlb,lixr,liufx,etal.controlofakeytransitionfromprostratetoerectgrowthinricedomestication.natgenet,2008,40:1360-4.”中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的載體ptck303/jl1460在文獻(xiàn)“wangz,chencg,xuyy,etal.apracticalvectorforefficientknockdownofgeneexpressioninrice(oryzasatival.).plantmolbiolrep,2004，22:409～417.”中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的載體pcambia1301-ubi在文獻(xiàn)“yubs,linzw，linhx,etal.tac1,amajorquantitativetraitlocuscontrollingtillerangleinrice.plantj,2007,52:891～898.”中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。實(shí)施例1、水稻抵抗葉片衰老基因rls3的獲得以元江野生稻滲入系yil18為原始材料，對其進(jìn)行ems誘變，從中挑選出一個葉片變紅、快速衰老的突變植株(圖1)，將其命名為突變體rls3。以突變體rls3和中花17作為構(gòu)建定位群體的親本材料，雜交構(gòu)建得到f2群體，并從f2分離群體中挑選出160個隱性單株(紅葉表型)作為初步定位的群體，結(jié)合基因型和表型數(shù)據(jù)，將控制葉片快速衰老的基因定位在水稻第3染色體短臂端k64和k87之間約100kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)共有17個有功能的基因。通過基因測序結(jié)果顯示：loc_os03g38990基因的第10個內(nèi)含子和第11個外顯子的剪接位點(diǎn)處有一個snp，進(jìn)而對親本、隱性交換單株及顯性單株進(jìn)行測序，snp的吻合度為100％。同時對區(qū)間內(nèi)的其他基因進(jìn)行測序，結(jié)果表明兩個親本材料都不存在差異，因此初步推測loc_os03g38990基因?yàn)榭刂迫~片快速衰老的基因。和野生稻滲入系yil18相比，突變體rls3為僅在序列3所示的dna分子第4276位的g突變?yōu)閍，其余序列與野生稻滲入系yil18的基因組序列全部相同。序列3所示的dna分子第4276位是一個剪切位點(diǎn)，在剪切為cdna的過程中，由于該位點(diǎn)由g突變?yōu)閍，導(dǎo)致多剪掉了一個g，也就是序列2所示的cdna分子第1234位的g被剪掉。loc_os03g38990基因的核苷酸序列為序列2，將序列2所示的基因命名為rls3基因，其中，序列2的第43-1998位為orf，編碼的蛋白的氨基酸序列為序列1，將序列1所示的氨基酸序列命名為rls3蛋白。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)rls3rnai水稻的獲得及其農(nóng)藝性狀檢測一、轉(zhuǎn)rls3rnai水稻的獲得1、rls3rnai干擾載體的構(gòu)建(1)根據(jù)基因rls3的全長cdna序列(序列2)設(shè)計引物，在引物兩端引入限制性核酸內(nèi)切酶spei、saci和bamhi、kpni識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基，設(shè)計引物序列如下：r3-f:5'-ggggtacctagtaagggcattcaaac-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶kpni識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)；r3-r:5'-cgggatccctgtgcgtcaagagcact-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶bamhi識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)；r4-f:5'-gactagtgcccttcagcaaacctta-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶spei識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)；r4-r:5'-cgagctcgcaatacctgtgcgtcaa-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶saci識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。(2)利用trizol試劑提取元江野生稻滲入系yil18葉片的總rna，以此rna為模板，使用superscriptii反轉(zhuǎn)錄酶(invitrogen,catno.18064-014)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cdna；(3)以步驟(2)獲得的cdna為模板，采用引物r4-f和r4-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到片段1；采用引物r3-f和r3-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到片段2；(4)用限制性內(nèi)切酶spei和saci酶切片段1，得到大小約為350bp的酶切產(chǎn)物1；用限制性內(nèi)切酶bamhi和kpni酶切片段2，得到大小約為350bp的酶切產(chǎn)物2；(5)將序列4所示的酶切產(chǎn)物1插入ptck303/jl1460載體的spei和saci酶切位點(diǎn)間，且將序列5所示的酶切產(chǎn)物2插入ptck303/jl1460載體的bamhi和kpni酶切位點(diǎn)間，并保持ptck303/jl1460載體的其他序列不變，得到含有水稻rls3基因片段的rnai載體，將其命名為rnai-rls3干擾載體。2、轉(zhuǎn)rls3rnai水稻的獲得將rnai-rls3干擾載體轉(zhuǎn)化eha105菌株(該菌株購自上海邁其生物科技有限公司，貨號：ch5002b)，得到重組菌；采用農(nóng)桿菌侵染法用重組菌侵染中花17的成熟胚愈傷組織，并用含50mg/l潮霉素的nb培養(yǎng)基進(jìn)行3輪篩選，每輪篩選20天，分化得到t0代轉(zhuǎn)基因植株，并利用目的序列引物(r3-f：taataacaagatcaaagctc；r3-r：cttctttctccctaccct)和潮霉素引物序列(hpt-f：aagttcgacagcgtctccgac；hpt-r：tctacacagccatcggtccag)進(jìn)行pcr陽性轉(zhuǎn)基因植株的篩選，得到陽性t2代轉(zhuǎn)rls3rnai水稻株系，將其命名為r1。3、轉(zhuǎn)rls3rnai水稻的rls3基因相對表達(dá)量檢測分別提取t2代轉(zhuǎn)rls3rnai水稻(r1)與中花17的基因組dna，采用引物38990e1進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對rls3基因的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，引物序列如下：38990e1-f:tgctctgaagccaaataa；38990e1-r:gtcatcaaaggcaacagt。檢測結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，t2代轉(zhuǎn)rls3rnai水稻(r1)的rls3基因相對表達(dá)量明顯低于中花17的rls3基因相對表達(dá)量。二、轉(zhuǎn)rls3rnai水稻的表型對t2代轉(zhuǎn)rls3rnai水稻(r1)和中花17的農(nóng)藝性狀(株高、穗長、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量)進(jìn)行檢測。兩個材料各取20株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖2所示，與中花17相比，t2代轉(zhuǎn)rls3rnai水稻(r1)株高下降，穗長變短，結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量明顯降低。上述結(jié)果表明：rls3基因被干擾后，和野生型水稻植株相比，明顯加快衰老。說明rls3基因可以調(diào)控植物葉片的衰老，進(jìn)而對水稻的株高、穗長、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量產(chǎn)生影響。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)rls3水稻的獲得及其農(nóng)藝性狀檢測一、轉(zhuǎn)rls3水稻的獲得1、pcambia1301-ubi-rls3載體的構(gòu)建(1)根據(jù)loc_os03g38990的全長cdna序列設(shè)計引物，并在引物兩端分別引入限制性核酸內(nèi)切酶bamhi和kpni識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物序列如下：oex-38990-f：5’-cgggatccatggcggggcggagtggc-3’(帶下劃線堿基為限制性核酸內(nèi)切酶bamhi識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)；oex-38990-r：5’-ggggtacctcagctctggtattctga-3’(帶下劃線堿基為限制性核酸內(nèi)切酶kpni識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。(2)利用trizol試劑提取元江野生稻滲入系yil18葉片的總rna，以此rna為模板，使用superscriptii反轉(zhuǎn)錄酶(invitrogen,catno.18064-014)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cdna；(3)以步驟(2)獲得的cdna為模板，采用引物oex-38990-f和oex-38990-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到大小為1956bp的水稻rls3基因的dna片段；(4)將上述大小為1956bp的dna片段(序列2的第43-1998位核苷酸分子)插入植物表達(dá)載體pcambia1301-ubi的酶切位點(diǎn)bamhi和kpni之間，得到含有水稻rls3基因的超表達(dá)載體，將其命名為pcambia1301-ubi-rls3。2、轉(zhuǎn)rls3水稻的獲得將pcambia1301-ubi-rls3載體轉(zhuǎn)化eha105菌株(該菌株購自上海邁其生物科技有限公司，貨號：ch5002b)，得到重組菌，采用農(nóng)桿菌侵染法用重組菌轉(zhuǎn)化實(shí)施例 2獲得的t2代轉(zhuǎn)rls3水稻(pov1)的成熟胚愈傷組織，用含25mg/l潮霉素的nb培養(yǎng)基進(jìn)行2輪篩選，每輪篩選15天；再用50mg/l潮霉素的nb培養(yǎng)基進(jìn)行1輪篩選，篩選15天；然后經(jīng)預(yù)分化、分化得到t0代轉(zhuǎn)基因植株，并利用目的序列引物(oex-38990-f：atggcggggcggagtggc；oex-38990-r：tcagctctggtattctga)和潮霉素引物序列(hpt-f：aagttcgacagcgtctccgac；hpt-r：tctacacagccatcggtccag)進(jìn)行pcr陽性轉(zhuǎn)基因植株的篩選，得到陽性t2代轉(zhuǎn)rls3水稻株系，將其命名為pov1。3、轉(zhuǎn)rls3水稻的rls3基因的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測分別提取t2代轉(zhuǎn)rls3水稻(pov1)與突變體rls3的基因組dna，采用引物38990e1進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對rls3基因的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，引物序列如下：38990e1-f:tgctctgaagccaaataa；38990e1-r:gtcatcaaaggcaacagt。檢測結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，t2代轉(zhuǎn)rls3水稻(pov1)的rls3基因相對表達(dá)量明顯高于突變體rls3的rls3基因相對表達(dá)量。二、轉(zhuǎn)rls3水稻的農(nóng)藝性狀檢測對t2代轉(zhuǎn)rls3水稻(pov1)和突變體rls3的農(nóng)藝性狀(株高、穗長、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量)進(jìn)行檢測，兩個材料各取20株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖4所示，與突變體rls3相比，t2代轉(zhuǎn)rls3水稻(pov1)株高增加，穗長變長，結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量明顯增加，恢復(fù)到野生型元江野生稻滲入系yil18的水平。上述結(jié)果表明：rls3基因在突變體rls3中過表達(dá)后，明顯恢復(fù)了葉片的衰老表型，株高、穗長、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量也顯著的提高。說明rls3基因可以調(diào)控植物葉片的衰老，進(jìn)而對水稻的株高、穗長、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量產(chǎn)生影響。當(dāng)前第1頁12