本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有較高解磷能力的復(fù)合菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
磷是植物生長發(fā)育的重要基礎(chǔ)物質(zhì)之一，是植物體內(nèi)核酸、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)及輔酶等的重要組成成分。作物的生物量和產(chǎn)量與其吸收的磷量呈顯著正相關(guān)，作物缺磷將會導(dǎo)致其生長發(fā)育遲緩，生長量和產(chǎn)量下降。土壤中磷的總量其實(shí)并不低，但絕大部分磷均以植物不能直接吸收的狀態(tài)存在，致使多數(shù)情況下作物缺磷，而使其生長發(fā)育和產(chǎn)量受到限制。長期以來，為了提高作物的產(chǎn)量，人們大量使用含磷化肥，含磷化肥在施用后往往很快就被固定而成為無效態(tài)磷，變得不可利用，最終造成了作物的低吸收和磷元素在土壤中的大量積累，并帶來一系列的環(huán)境問題，如土壤板結(jié)、水體富營養(yǎng)化等。
研究發(fā)現(xiàn)，微生物對土壤中磷的轉(zhuǎn)化作用明顯，專利CN201410794190提供了一種生物有機(jī)茶葉專用肥，包含生物菌液、有機(jī)物、氮磷鉀復(fù)合肥以及微量元素肥料等，該專用肥含有豐富的有機(jī)質(zhì)，多種微量元素，以及大量的固氮、解磷、解鉀、抗病促長、防衰功能的有益微生物，肥效持久穩(wěn)定，在壯苗抗病、提高產(chǎn)量、改善茶葉品質(zhì)的同時(shí)，也改良了土壤結(jié)構(gòu)，解決了土地板結(jié)問題，有效抑制了病蟲害的發(fā)生，提高了茶葉抗逆性。
大量試驗(yàn)證實(shí)，向土壤中施用解磷細(xì)菌，不僅能夠增加作物的磷吸收量，提高作物產(chǎn)量，還能大大提高磷肥利用率，減少農(nóng)業(yè)面源污染。專利CN201510077440.1采用包含解磷細(xì)菌肥在內(nèi)的混合肥料，有效的增加了土壤的肥力，縮短了種植時(shí)間，并得到了植株健壯、生命力強(qiáng)的仙人掌。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用解磷細(xì)菌是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。
巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)為革蘭氏陽性菌及好氧菌，是一種植物根系促生細(xì)菌，也是微生物肥料中的常用菌種。它是一種解磷促鉀細(xì)菌，對卵磷脂、土壤中植物無法直接利用的吸附態(tài)有機(jī)磷、無機(jī)磷有明顯的分解作用，能 提高土壤肥力，促進(jìn)作物的增產(chǎn)。鄭傳進(jìn)，黃林，龔明(巨大芽孢桿菌解磷能力的研究.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002.4)測定了巨大芽孢桿菌ACCC10011對難溶性無機(jī)磷、有機(jī)磷的解磷能力，結(jié)果顯示，ACCC10011菌株具有很強(qiáng)的分解難溶性磷Ca3(PO4)2的能力和分解有機(jī)磷卵磷脂的能力。但是，目前的研究一般僅限于對單種菌株的探索，然而，單種菌株的解磷能力有限，不能根據(jù)土壤中無機(jī)磷與有機(jī)磷的配比，優(yōu)化解磷芽孢桿菌的添加量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明公開了一種便于推廣應(yīng)用，能夠降低生產(chǎn)成本的具有較高解磷能力的復(fù)合菌劑及其制備方法。
本發(fā)明的第一個(gè)方面在于公開一種具有較高解磷能力的復(fù)合菌劑的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
步驟1、將活化的菌株分別接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；
步驟2、將步驟1中獲得的種子液混合，并接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得到所需的復(fù)合菌劑；
其中，步驟1中所述的菌株為解淀粉芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，步驟1中所述的種子培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中的一種或幾種，并優(yōu)選為液體培養(yǎng)基，更優(yōu)選為LB液體培養(yǎng)基。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，所述LB液體培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，121℃條件下滅菌20min。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，步驟1中所述培養(yǎng)條件為：溫度為25-35℃，轉(zhuǎn)速為100-300rpm條件下培養(yǎng)10-30h，連續(xù)增殖2-5代，如3代、4代等。
其中，所述解淀粉芽孢桿菌的保藏號為CCTCC AB2014337。
所述巨大芽孢桿菌由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，保藏號為CICC21695。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，步驟2中所述混合比例為V解：V巨＝0.2：1-5：1，如0.3：1、3.0：1等，優(yōu)選為V解：V巨＝0.5：1-2：1，如0.7：1、 1.9：1，更優(yōu)選為V解：V巨＝1：1-1.75：1，比如1.27：1等，其中，V解：V巨為解淀粉芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌的體積比。
本發(fā)明的第二個(gè)方面在于公開一種具有較高解磷能力的復(fù)合菌劑，所述復(fù)合菌劑均為芽孢桿菌，優(yōu)選為解淀粉芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的復(fù)合菌劑。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，所述復(fù)合菌劑接種到解磷培養(yǎng)基時(shí)的接種比例為1％-20％，更優(yōu)選為5％-10％。
本發(fā)明的第三個(gè)方面在于公開一種具有較高解磷能力的化肥，所述化肥包含所述的復(fù)合菌劑。
本發(fā)明的第四個(gè)方面在于公開一種具有較高解磷能力的復(fù)合菌劑在改良土壤結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，所述復(fù)合菌劑的使用條件為溫度為25-35℃，如26℃，34℃等，pH值為6.0-8.0，如6.3，7.8等。
優(yōu)選地，所述復(fù)合菌劑的使用條件為：溫度為27-32℃，pH值為6.5-7.6，如6.8，7.4等。
優(yōu)選地，所述復(fù)合菌劑的使用條件為：溫度為28-31℃，如29℃，30℃，pH值為6.9-7.2，如7.0，7.1等。
本發(fā)明利用不同種菌株的生理特點(diǎn)混合培養(yǎng)，得到復(fù)合菌劑，該復(fù)合菌劑具有更高的解磷能力，含有該復(fù)合菌劑的化肥，能夠充分利用土壤中原有的磷量，改良土壤結(jié)構(gòu)，解決土地板結(jié)問題；而且該菌劑對土壤無任何毒副作用，對環(huán)境友好，適于大面積推廣使用。
附圖說明
為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚地理解，下面根據(jù)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖,對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中
圖1為本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑的制備方法
具體實(shí)施方式
復(fù)合菌劑的制備
本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑的制備方法如圖1所示，并包括如下步驟：
步驟1、分別將解淀粉芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌接種到LB斜面培養(yǎng)基中活化，得到各自活化的菌株；
步驟2、將步驟1中活化的菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到解淀粉芽孢桿菌種子液和巨大芽孢桿菌種子液；
步驟3、將步驟2中得到的種子液按V解：V巨＝1.27：1混合，得到復(fù)合菌株；
步驟4、將步驟3中得到的復(fù)合菌株按體積比5％的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，即得到需要的復(fù)合菌劑；
其中，步驟1中的培養(yǎng)條件為30℃，190rpm培養(yǎng)20h，連續(xù)增殖3代。
復(fù)合菌劑解磷條件的選擇
將復(fù)合菌劑按5％的體積比接種到解磷培養(yǎng)基中，在溫度(28℃、29℃、30℃、31℃)，轉(zhuǎn)速(170rpm、180rpm、190rpm、200rpm)，pH值為(6.9、7.0、7.1、7.2)，裝料系數(shù)(1/5、3/10、2/5、1/2)的條件下，采用正交實(shí)驗(yàn)法選取16組實(shí)驗(yàn)，搖床培養(yǎng)48h。
采用鉬銻抗比色法分別測定上清液中的可溶性磷和微生物量磷，最終確定在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為190rpm，pH值為7.1，裝料系數(shù)為2/5時(shí)的解磷效果最好，可溶性磷含量和微生物量磷之和為92.09mg/L。
解磷條件對復(fù)合菌劑解磷能力的影響
實(shí)施例一
選取實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組和對照組均為本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑，考察解磷條件對復(fù)合菌劑解磷量的影響。
實(shí)驗(yàn)組和對照組均按體積比5％的比例接種到解磷培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)48h，采用鉬銻抗比色法測定上清液中的可溶性磷含量和微生物量磷。
實(shí)驗(yàn)組的解磷條件為：溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為190rpm，pH值為7.1，裝料 系數(shù)為2/5的250mL三角瓶中。
對照組的解磷條件為：溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為170rpm，pH值為6.9，裝料系數(shù)為1/5的250mL三角瓶中。
分析結(jié)果為：實(shí)驗(yàn)組中可溶性磷含量和微生物量磷之和為92.09mg/L，對照組中可溶性磷含量和微生物量磷之和為55.98mg/L，實(shí)驗(yàn)組比對照組的解磷能力提高了64.51％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同解磷條件下，復(fù)合菌劑的解磷能力相差較大，解磷條件對本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑的解磷能力影響較大。
實(shí)施例二
選取實(shí)驗(yàn)組和對照組，考察本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑的解磷能力。
實(shí)驗(yàn)組為本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑，對照組為解淀粉芽孢桿菌。
選取實(shí)驗(yàn)組和對照組的菌株，分別按體積比5％的比例接種到解磷培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)48h，解磷培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為190rpm，pH值為7.1，裝料系數(shù)為2/5的250mL三角瓶。采用鉬銻抗比色法測定上清液中可溶性磷含量和微生物量磷。
采用鉬銻抗比色法測定可溶性磷和微生物量磷，實(shí)驗(yàn)組可溶性磷含量和微生物量磷之和為92.09mg/L，對照組可溶性磷含量和微生物量磷之和為46.19mg/L，實(shí)驗(yàn)組的解磷能力比對照組提高了99.4％。
實(shí)施例三
選取實(shí)驗(yàn)組和對照組，考察本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑的解磷能力。
實(shí)驗(yàn)組為本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑，對照組為巨大芽孢桿菌。
選取實(shí)驗(yàn)組和對照組的菌株，按體積比5％的比例接種到解磷培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)48h，解磷培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為190rpm，pH值為7.1，裝料系數(shù)為2/5的250mL三角瓶。采用鉬銻抗比色法測定上清液中的可溶性磷含量和微生物量磷。
實(shí)驗(yàn)組上清液中的可溶性磷含量和微生物量磷之和為92.09mg/L，對照組上清液中的可溶性磷含量和微生物量磷之和為52.88mg/L，實(shí)驗(yàn)組的解磷能力比對照組提高了74.15％。
以上所述的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。