本發(fā)明屬于生物技術微生物領域，涉及1株液體發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin的草酸青霉（Penicillium oxalicum）Po-25菌株、用途和發(fā)酵生產(chǎn)方法。

背景技術：

洛伐他?。↙ovastatin）是各國公認的降低膽固醇的理想藥劑，具有高效、低毒、安全的特點，它能選擇性抑制羥甲基戊二酸輔酶A（HMG-CoA）還原酶活性，并阻斷膽固醇生物合成，近年來在臨床治療方面應用十分廣泛。從1979年，日本學者遠滕章（Akira Endo）教授從紅色紅曲霉（Monascus ruber）的培養(yǎng)液中分離出一種能夠強力抑制膽固醇合成的活性物質，命名為Monacolin K（莫納可林K）開始，時隔1年，美國Albert等從土曲霉（Aspergillus terrers）中發(fā)現(xiàn)了相似的物質，并命名為Mevinolin，現(xiàn)稱Lovastatin。此后發(fā)現(xiàn)Lovastatin存在于包括側耳屬（Pleurotus）、莖點菌屬（Phoma）、青霉屬（Penicillium）、發(fā)光類臍菇 （Omphalotus olearius）在內的多種真菌中。這一連串的發(fā)現(xiàn)引起了世界的轟動，掀起了真菌產(chǎn)Lovastatin的研究熱潮。

青霉（Penicillium）通常在柑桔及其他水果上，冷藏的干酪及被它們的孢子污染的其他食物上均可找到，其分生孢子在土壤內，空氣中及腐爛的物質上也到處存在。青霉營腐生生活，其營養(yǎng)來源極為廣泛，是一類雜食性真菌，可生長在任何含有機物的基質上。青霉（Penicillium）是我國重要的工業(yè)微生物資源，在人類生活中的使用廣泛。自從1929年弗萊明（Fleming），發(fā)現(xiàn)點青霉（Penicillium notatum）產(chǎn)生抑制細菌生長抗生素青霉素以來，已對該屬菌的很多種進行了深入研究。常見的青霉種類有：點青霉（Penicillium notatum）、產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum ）、草酸青霉（P. oxalicum）、桔青霉（P.citrinum ）、斑點青霉（P. meleagrinum）、灰黃青霉（P. griseofulvum）等。青霉（Penicillium）在生長過程中會產(chǎn)生多種有用代謝產(chǎn)物，如Lovastatin，可抑制膽固醇合成；纖維素酶、果膠酶、糖化酶、等多種酶，可用于制備酶制劑；有機酸如檸檬酸、葡萄糖酸等，可用于工業(yè)生產(chǎn)等，均引起了國內外研究學者的廣泛關注。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述的技術問題，本發(fā)明的第一個目的是提供草酸青霉（Penicillium oxalicum）Po-25菌株，具有高產(chǎn)Lovastatin、生長快、產(chǎn)孢量大、培養(yǎng)簡單等優(yōu)良特性。本發(fā)明的第二個目的是提供上述的草酸青霉（Penicillium oxalicum）Po-25菌株在制備洛伐他汀的應用。

為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：

草酸青霉（Penicillium oxalicum）Po-25菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2016381，保藏日期為：2016年7月7日。

本發(fā)明從浙江省各地不同生境收集的自然發(fā)酵樣品（食品、土壤、空氣、有機質等）中分離純化獲163株青霉純菌株；經(jīng)篩選獲1株高產(chǎn)Lovastatin的編號為Po-25優(yōu)質菌株，該菌株分離自腐爛的桔子；根據(jù)的形態(tài)特征和18S rDNA基因序列，鑒定Po-25菌株為草酸青霉（Penicillium oxalicum）；Po-25菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2016381，保藏日期為：2016年7月7日。

Po-25菌株的形態(tài)特征：在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d即形成較典型的菌落。菌落初期為白色絨毛狀，2 d后中心菌絲開始變綠，培養(yǎng)3 d后逐漸變?yōu)榘稻G色；菌落平坦，質地絨狀，氣生菌絲密而短小，分生孢子結構大量產(chǎn)生，呈深橄欖綠色，易脫落（附圖1）；顯微鏡觀察菌絲細胞絲狀交織，具隔膜，直徑6 ~ 8 μm；分生孢子梗發(fā)生于基質，有橫隔，壁平滑，基部無足細胞，經(jīng)過分枝后，產(chǎn)生二輪不對稱的小梗，形如掃帚，稱為帚狀體；帚狀體通常雙輪生，?；枯? ~ 3 個，13 ~ 20 μm × 3.2 ~ 3.7 μm，彼此通常較緊貼；瓶梗每輪5~8個或更多，10~15 μm×2.5~3.2 μm，幼齡時呈現(xiàn)瓶狀或披針狀，充分成熟時近圓柱狀（附圖2）；瓶梗頂端產(chǎn)生鏈狀的分生孢子，分生孢子橢圓形、大小4.5~5.5 μm×3.0~4.0 μm，壁光滑，呈藍綠色（附圖3）。

18S rDNA基因序列分析結果表明，其長度為1231 bp（附圖4），與草酸青霉（Penicillium oxalicum）的進化距離最近（附圖5）。根據(jù)Po-25菌株的形態(tài)特征，結合青霉屬（Penicillium）分種檢索表，將Po-25菌株鑒定為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：

一種洛伐他汀的制備方法，該方法包括以下的步驟：

1）用接種針挑取少量權利要求1所述的草酸青霉Po-25菌株菌絲，轉接于PDA培養(yǎng)基平皿中，活化培養(yǎng)3 d；

2）取2菌餅接種于一級種子培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)2 d，制得一級種子液；

3）在二級種子培養(yǎng)液中，按10%加入一級種子液，200 r/min搖床培養(yǎng)1 d成二級種子液；

在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)液中按20%接入二級種子液，發(fā)酵培養(yǎng)液初始pH為5.0~5.5，培養(yǎng)溫度為28℃條件下，發(fā)酵時間為81 h~105 h。

作為優(yōu)選，所述的PDA培養(yǎng)基由以下的組分構成：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂粉2.0%、水1 L、pH 5.0~5.5。

作為優(yōu)選，所述的一級種子培養(yǎng)液由以下的組分構成：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、水1 L、pH 5.0~5.5。

作為優(yōu)選，所述的二級種子培養(yǎng)液由以下的組分構成：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1 L、pH 5.0~5.5。

作為優(yōu)選，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液由以下的組分構成：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、NaCl 0. 2%、水1 L、pH 5.0~5.5。

青霉Po-25菌株具有高產(chǎn)Lovastatin、生長速度快、產(chǎn)孢量多、培養(yǎng)簡單等優(yōu)良特性。在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5.0~5.5，培養(yǎng)溫度為28℃條件下，青霉Po-25菌株通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后，發(fā)酵81 h~105 h，Lovastatin產(chǎn)量可達260 mg/L以上（附圖6）；用液相色譜-質譜聯(lián)用技術分離檢測發(fā)酵液中的Lovastatin，結果表明分離物的結構、分子量與Lovastatin準品一致（附圖7）。青霉Po-25菌株可為Lovastatin的生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種。

附圖說明

圖1 青霉Po-25菌株PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d菌落正面。

圖2 青霉Po-25菌株分生孢子頭顯微特征（400 X）。

圖3 青霉Po-25菌株分生孢子顯微特征（400 X）。

圖4 青霉Po-25菌株18S rDNA基因序列（1231 bp）。

圖5 基于18S rDNA基因序列建立的青霉Po-25菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖6 青霉Po-25菌株在5 L發(fā)酵罐中的生物量和Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時間變化曲線。

圖7 青霉Po-25菌株發(fā)酵液Lovastatin 液相色譜-質譜聯(lián)用檢測圖。

圖8 50株代表性青霉菌株發(fā)酵液中Lovastatin的產(chǎn)量。

具體實施方式

下面對本發(fā)明具體實施方式做一個詳細的說明。

實施例1 草酸青霉（Penicillium oxalicum）Po-25菌株的分離、篩選和鑒定

1 培養(yǎng)基

① PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂粉2.0%，水1 L，pH 5.5~6.0。用于青霉菌株的分離純化和鑒定。

② PD培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1 L，pH 5.5~6.0。用于高產(chǎn)Lovastatin青霉菌株的篩選。

2實驗方法

2.1 青霉菌株的分離純化

從不同生境收集的自然發(fā)酵樣品（食品、土壤、水果、有機質等）表面挑取少量菌絲接入PDA培養(yǎng)基平板表面，28℃培養(yǎng)24 h，待白色絨毛狀菌絲長出后，取少許菌絲轉接于另一PDA培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培養(yǎng)3 d產(chǎn)生孢子后，顯微鏡觀察具有青霉的典型特征，挑取少許邊緣菌絲純化3次，得性狀均一的青霉純菌株。將分離純化獲得的青霉菌株編號保存于25%甘油中，置于4 ℃冰箱備用。

2.2 高產(chǎn)Lovastatin青霉菌株的篩選

用高效液相色譜法（HPLC）檢測163株青霉純菌株發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量進行篩選。青霉各保存菌株28℃ PDA平板培養(yǎng)3 d后，用打孔器取1菌餅（直徑0.8 mm）轉接種于PD培養(yǎng)液中，28℃、200 r/min搖床培養(yǎng)5 d。取發(fā)酵液1 mL，加甲醇4 mL（按1:4的比例），超聲處理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min 離心3 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，利用HPLC法檢測Lovastatin產(chǎn)量，篩選高產(chǎn)Lovastatin的青霉菌株。

2.3 Po-25菌株的鑒定

用鑷子挑取少量該菌株菌絲，轉接于PDA培養(yǎng)基平板中，活化培養(yǎng)3 d；取平皿中1菌餅（直徑0.8 mm）接種于新的PDA培養(yǎng)基平板上，28℃，培養(yǎng)3 d，顯微鏡觀察Po-25菌株的菌絲、分生孢子頭、分生孢子梗、分生孢子等的形態(tài)特征，并拍照。提取Po-25菌株的基因組DNA，擴增18S rDNA基因序列，送上海生物工程公司測序。

3實驗結果

3.1青霉菌株的分離純化和高產(chǎn)Lovastatin青霉菌株的篩選

通過分離純化從浙江省各地不同生境收集的自然發(fā)酵樣品（食品、土壤、水果、有機質等）中分離純化共獲163株青霉純菌株。

利用高效液相（HPLC）法對163株青霉純菌株發(fā)酵液進行Lovastatin產(chǎn)量檢測，結果表明不同曲霉菌株Lovastatin產(chǎn)量存在顯著差異（附圖8）。經(jīng)篩選獲1株Lovastatin產(chǎn)量較高的青霉菌株，編號為Po-25菌株，Lovastatin產(chǎn)量為186.5 mg/L，Po-25菌株分離自腐爛的桔子。

3.2 Po-25青霉菌株的鑒定結果

Po-25菌株的形態(tài)特征：在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d即形成較典型的菌落。菌落初期為白色絨毛狀，2 d后中心菌絲開始變綠，培養(yǎng)3 d后逐漸變?yōu)榘稻G色；菌落平坦，質地絨狀，氣生菌絲密而短小，分生孢子結構大量產(chǎn)生，呈深橄欖綠色，易脫落（附圖1）；顯微鏡觀察菌絲細胞絲狀交織，具隔膜，直徑6~8 μm；分生孢子梗發(fā)生于基質，有橫隔，壁平滑，基部無足細胞，經(jīng)過分枝后，產(chǎn)生二輪不對稱的小梗，形如掃帚，稱為帚狀體；帚狀體通常雙輪生，?；枯? ~ 3 個，13 ~ 20 μm × 3.2 ~ 3.7 μm，彼此通常較緊貼；瓶梗每輪5~8個或更多，10~15 μm×2.5~3.2 μm，幼齡時呈現(xiàn)瓶狀或披針狀，充分成熟時近圓柱狀（附圖2）；瓶梗頂端產(chǎn)生鏈狀的分生孢子，分生孢子橢圓形、大小4.5~5.5 μm×3.0~4.0 μm，壁光滑，呈藍綠色（附圖3）。

Po-25菌株的18S rDNA基因序列：分析結果表明，Po-25菌株的18S rDNA基因序列長度為1231 bp（附圖4），基于18S rDNA基因序列建立的青霉（Penicillium）系統(tǒng)發(fā)育樹表明，與草酸青霉（Penicillium oxalicum）的進化距離最近（附圖5）。根據(jù)Po-25菌株的形態(tài)特征和18S rDNA基因序列，將Po-25菌株鑒定為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

實施例2 草酸青霉（Penicillium oxalicum）Po-25菌株在5 L發(fā)酵罐中的生長曲線和Lovastatin產(chǎn)生規(guī)律

1 菌株：草酸青霉（Penicillium oxalicum）Po-25菌株。

2 培養(yǎng)基

① PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂粉2.0%、水1 L、pH 5.0~5.5。用于青霉菌株的活化培養(yǎng)。

② 一級種子培養(yǎng)液：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、水1 L、pH 5.0~5.5。用于草酸青霉Po-25菌株的一級種子培養(yǎng)。

③ 二級種子培養(yǎng)液：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1 L、pH 5.0~5.5。用于草酸青霉Po-25菌株的二級種子培養(yǎng)。

④ 發(fā)酵培養(yǎng)液：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、NaCl 0. 2%、水1 L、pH 5.0~5.5。用于草酸青霉Po-25菌株發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin。

3實驗方法

3.1 青霉Po-25菌株的培養(yǎng)

用接種針挑少量Po-25菌株菌絲，轉接于PDA培養(yǎng)基平皿中，活化培養(yǎng)3 d；取平皿中2菌餅（直徑8 mm）接種于一級種子培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)2 d，制得一級種子液；在二級種子培養(yǎng)液中，按10%接入一級種子液，200 r/min搖床培養(yǎng)1 d成二級種子液；在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)液中按20%接入二級種子液進行發(fā)酵培養(yǎng)。

3.2青霉Po-25菌株菌絲干重的測定

1.5 mL空離心管放于在85℃的烘箱中烘干，稱取空離心管質量為m；每管吸取1 mL培養(yǎng)液，在4 ℃，10000 r/min離心10 min，棄上清；加無菌蒸餾水洗3次，10000 r/min離心10 min，棄上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，稱取質量為M；菌絲干重質量為M-m。每隔3 h取1 mL Po-25菌株發(fā)酵液測定菌絲干重。以發(fā)酵時間為橫坐標，Po-25菌株菌絲干重為縱坐標繪制生長曲線。

3.3青霉Po-25菌株發(fā)酵過程中Lovastatin產(chǎn)量分析

每隔3 h取發(fā)酵液1 mL，加甲醇4 mL（按1:4的比例），超聲處理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min 離心3 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，HPLC法檢測Lovastatin產(chǎn)量，以發(fā)酵時間為橫坐標，Po-25菌株的Lovastatin產(chǎn)量為縱坐標，繪制Po-25菌株Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時間變化曲線。

3.4青霉Po-25菌株發(fā)酵液中Lovastatin的鑒定

用液相色譜-質譜聯(lián)用技術分離檢測發(fā)酵液中的Lovastatin結構、分子量等。

4 實驗結果

4.1青霉Po-25菌株的生長曲線

每隔3 h取樣測定菌絲干重，青霉Po-25菌株生長曲線見圖6。青霉Po-25菌株0 ~18 h生長速度慢，為遲緩期；18 h~51 h快速生長，菌體量大增，為對數(shù)生長期；發(fā)酵至54 h后，長勢趨于平緩，菌體量達到最高，為穩(wěn)定生長期，菌絲干重達240.5 g/L；90 h后出現(xiàn)泡沫，進入衰亡期。

4.2青霉Po-25菌株發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時間變化曲線

每隔3 h取樣用HPLC法測定青霉Po-25菌株發(fā)酵液Lovastatin產(chǎn)量，Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的變化曲線見圖6，發(fā)酵至81 h后，發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量基本穩(wěn)定，最大值為263.9 mg/L。

4.3青霉Po-25菌株發(fā)酵液中Lovastatin的鑒定

用液相色譜-質譜聯(lián)用技術分離檢測發(fā)酵液中的Lovastatin，結果表明分離物結構、分子量與Lovastatin準品一致，分子式為C₂₄H₃₆O₅，分子量為404.45（附圖7）。