還原六價鉻的草酸青霉及其篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株能還原Cr (VI)的草酸青霉SL2及其篩選方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉻污染是當前我國面臨的嚴重環(huán)境問題。我國是世界上最大的鉻渣生產(chǎn)國，未處 理鉻渣經(jīng)過多年的雨水沖淋、滲透，嚴重污染了堆存場地環(huán)境；鋼鐵、電鍍、皮革等涉鉻行業(yè) 污水和廢物未經(jīng)妥善處理也嚴重影響相關(guān)區(qū)域的水土環(huán)境。嚴重的鉻污染引發(fā)了云南曲靖 鉻污染等惡性環(huán)境事件，引起了政府和社會各界的高度關(guān)注。因此，鉻污染的修復治理已刻 不容緩。
[0003] 自然界中鉻主要以Cr(VI)和Cr(III)兩種價態(tài)存在。Cr(III)有很高的有機物親 和性，是人體必需的營養(yǎng)元素，影響糖類和脂肪的新陳代謝；而Cr (VI)易溶于水，是國際癌 癥研究機構(gòu)（IARQ)及美國政府工業(yè)衛(wèi)生學家協(xié)會（ACGIH)確認的致癌物質(zhì)，被美國EPA認 定為對人體危害最大的17種化學物之一。因此，將Cr(VI)還原成Cr(III)是Cr(VI)污染 修復的基本思路。
[0004] Cr(VI)污染還原修復有多種方法。目前常用的修復方法主要是物理化學方法， 需要大量的化學試劑和人力，成本高，易產(chǎn)生二次污染，因而實際應(yīng)用受到了限制。Cr(VI) 污染微生物修復技術(shù)具有成本低、操作簡單、可原地處理、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點，因而受 到廣泛的重視。自1977年首次發(fā)現(xiàn)Cr (VI)還原菌以來，大量Cr (VI)還原菌得到分離，如 Achromobacter sp.OA~\^ Leucobacter sp. CRBI> Pseudochrobactrumsaccharolyticum. 1^10、乂6?/，0?0/7<3>5 577.1^-14等，但國內(nèi)外尚未見報道能還原〇(￥1)的草酸青霉菌株。已 分離的大部分Cr(VI)還原菌適應(yīng)性不強，難以耐受實際污染條件下的高鹽條件，限制了其 在實際Cr(VI)污染修復中的應(yīng)用。因此，Cr (VI)污染修復需要獲取新的、能滿足實際應(yīng)用 要求的微生物資源，為實施微生物修復提供技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一株還原六價鉻的草酸青霉及其篩選方法。該菌對 Cr (VI)、鹽具有很高的耐受能力，能將高毒的Cr (VI)還原成低毒的Cr (III)，為Cr (VI)污染 的微生物修復提供新的資源。
[0006] 一株還原六價鉻的草酸青霉，能在Cr (VI)濃度為2000mg/L的PDA培養(yǎng)基中生長， 耐受超過l〇〇g/L的NaCl鹽溶液，5天時間內(nèi)能完全還原培養(yǎng)基中357. 9mg/L的Cr (VI)，可 以應(yīng)用于處理環(huán)境中的Cr(VI)污染，將其命名為草酸青霉oxa/icw? SL2， 現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物菌種保藏管理中心，保藏號為CCTCC NO: M 2014505,保藏時間為 2014年10月22日，地址為：武漢市武昌珞珈山，郵編：430072。
[0007] -種還原六價鉻的草酸青霉的篩選方法，包括以下步驟： 1)收集：將含Cr (VI)的PDA平板敞開蓋子置于空氣中5-15天，讓空氣中真菌孢子在 上面長出菌斑；所述含Cr (VI) PDA平板的制作方法為：20g馬鈴薯加 IOOml水煮沸過濾，濾 液加水至IOOml后加 Ig葡萄糖，I. 5g瓊脂，115°C滅菌20min，冷卻到不燙手時加經(jīng)0. 22μ m 無菌濾頭滅菌的Cr(VI)溶液，使Cr (VI)終濃度為300mg/L，倒平板； 2) 馴化：將長勢良好的真菌接種到含Cr(VI)液體培養(yǎng)基中，在30°C、250rpm振蕩培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，使其長成菌絲小球；所述含Cr(VI)液體培養(yǎng)基的制作方法為：20g馬鈴 薯加 IOOml水煮沸過濾，濾液加水至IOOml后加 Ig葡萄糖，115°C滅菌20min，冷卻后加經(jīng) 0. 22 μ m無菌濾頭滅菌的Cr (VI)溶液，使Cr (VI)終濃度為300mg/L ; 3) 分離：將步驟2)中長勢良好的菌絲小球接種到含Cr(VI)的PDA平板上，在30°C培 養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5-15天，使其長出孢子，用無菌水沖洗平板，配制濃度約為IO 6個/mL的孢 子懸浮液，按10'10'10'10'KT5稀釋孢子懸浮液，各吸取〇. Iml涂在含Cr (VI)濃度為 300mg/L的PDA平板上，30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1-3天； 4) 純化：挑取單菌落接種到含Cr (VI)的PDA平板上，在30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5-15 天，使其長出孢子，用無菌水沖洗平板，配制濃度約為IO6個/mL的孢子懸浮液，按10'10' 10_ 3、10_4、10_5稀釋孢子液，各吸取0.11111涂在含〇(￥1)的？04平板上，301：培養(yǎng)箱中倒置 培養(yǎng)1-3天，得到具有高濃度Cr(VI)耐受能力的菌株。
[0008] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明所提供的〇(￥1)還原菌株為草酸青霉/^/?/<^777^/?〇^377<^/?51^2，該菌株能 在Cr (VI)濃度為2000mg/L的PDA培養(yǎng)基中生長，耐受超過100g/L的NaCl鹽溶液，5天時 間內(nèi)能完全還原培養(yǎng)基中357. 9mg/L的Cr(VI)，可以應(yīng)用于處理環(huán)境中的Cr(VI)污染。
【附圖說明】
[0009] 附圖1是SL2平板菌落觀察照片； 附圖2是SL2顯微鏡（400X)觀察照片； 附圖3是SL2在含NaCl濃度為0、20、100g/L培養(yǎng)基中生長的生物量； 附圖4是SL2在含Cr (VI)濃度為2000mg/L培養(yǎng)基中生長的生物量； 附圖5是SL2對Cr (VI)的還原作用。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1:一株還原Cr(VI)的草酸青霉的篩選方法 I. 1制作含Cr (VI)的PDA平板：稱取20g馬鈴薯加入IOOml水中，煮30min，雙層紗 布過濾，補水至100ml，加 Ig葡萄糖，I. 5g瓊脂，11511C滅菌20min，冷卻到不燙手，加入經(jīng) 0. 22 μ m無菌濾頭滅菌的重鉻酸鉀溶液，使培養(yǎng)基中含300mg/L的Cr (VI)，在無菌操作臺內(nèi) 倒平板。
[0011] 1.2制作含Cr (VI)的液體培養(yǎng)基：稱取20g馬鈴薯加入IOOml水中，煮30min，雙 層紗布過濾，補水至100ml，加 Ig葡萄糖，115°C滅菌20min，冷卻到不燙手，加入經(jīng)0. 22μπι 無菌濾頭滅菌的重鉻酸鉀溶液，使培養(yǎng)基中含300mg/L的Cr(VI)。
[0012] 1.3收集：將含Cr(VI)的PDA平板敞開蓋子置于空氣中5-15天，讓空氣中真菌孢 子在上面長出菌斑。
[0013] 1. 4馴化：在無菌操作臺中將長勢良好的真菌接種到含Cr(VI)液體培養(yǎng)基中，在 30°C、250rpm振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，使其長成菌絲小球。
[0014] 1. 5分離：將步驟1. 4馴化好的菌絲小球接種到含Cr (VI)的PDA平板上，在30°C 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)10天，使其長出孢子，用無菌水沖洗平板，配制濃度約為IO6個/mL的孢 子懸浮液，按KT 1、10'10'10'KT5稀釋孢子懸浮液，各吸取〇. Iml涂在含Cr (VI) PDA平 板上，30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1-3天。
[0015] 1. 6純化：挑取單菌落接種到含Cr (VI)的PDA平板上，在30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 5-15天，使其長出孢子，用無菌水沖洗平板，配制濃度約為IO6個/mL的孢子懸浮液，按ΚΓ 1、 10_2、10_3、10_4、10_ 5稀釋孢子液，各吸取0.11111涂在含〇(￥1)的？04平板上，301：培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng)1-3天，重復3次，得到具有高濃度Cr (VI)耐受能力的菌株，命名為SL2。
[0016] 實施例2:菌株SL2的形態(tài)、碳源利用、分子生物學鑒定 菌株SL2的檢測鑒定委托中國典型培養(yǎng)物保藏中心實施，結(jié)果如下： 2. 1形態(tài)學特征 菌株SL2菌落開展，絨狀。暗綠色（圖1)。分生孢子鏈集成圓柱形，分生孢子橢圓形P (圖 2)。
[0017] 2. 2碳源利用特征 用biolog FF板檢測SL2對95種碳源的利用情況，結(jié)果表明其能利用其中的56種。
[0018] 表I SL2菌株的碳源利用
【主權(quán)項】
1. 一株還原六價鉻的草酸青霉，其特征在于，能在Cr (VI)濃度為2000mg/L的PDA培 養(yǎng)基中生長，耐受超過l〇〇g/L的NaCl鹽溶液，5天時間內(nèi)能完全還原培養(yǎng)基中357. 9mg/ L的Cr(VI)，可以應(yīng)用于處理環(huán)境中的Cr(VI)污染，將其命名為草酸青霉 oxa/ic? SL2,現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物菌種保藏管理中心，保藏號為CCTCC NO: M 2014505。
2. -種還原六價鉻的草酸青霉的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 收集：將含Cr (VI)的PDA平板敞開蓋子置于空氣中5-15天，讓空氣中真菌孢子在 上面長出菌斑；所述含Cr (VI) PDA平板的制作方法為：20g馬鈴薯加 IOOml水煮沸過濾，濾 液加水至IOOml后加 Ig葡萄糖，I. 5g瓊脂，115°C滅菌20min，冷卻到不燙手時加經(jīng)0. 22μ m 無菌濾頭滅菌的Cr(VI)溶液，使Cr (VI)終濃度為300mg/L，倒平板； 2) 馴化：將長勢良好的真菌接種到含Cr(VI)液體培養(yǎng)基中，在30°C、250rpm振蕩培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，使其長成菌絲小球；所述含Cr(VI)液體培養(yǎng)基的制作方法為：20g馬鈴 薯加 IOOml水煮沸過濾，濾液加水至IOOml后加 Ig葡萄糖，115°C滅菌20min，冷卻后加經(jīng) 0. 22 μ m無菌濾頭滅菌的Cr (VI)溶液，使Cr (VI)終濃度為300mg/L ; 3) 分離：將步驟2)中長勢良好的菌絲小球接種到含Cr(VI)的PDA平板上，在30°C培 養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5-15天，使其長出孢子，用無菌水沖洗平板，配制濃度約為IO 6個/mL的孢 子懸浮液，按10'10'10'10'KT5稀釋孢子懸浮液，各吸取〇. Iml涂在含Cr (VI)濃度為 300mg/L的PDA平板上，30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1-3天； 4) 純化：挑取單菌落接種到含Cr (VI)的PDA平板上，在30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5-15 天，使其長出孢子，用無菌水沖洗平板，配制濃度約為IO6個/mL的孢子懸浮液，按10'10' 10_ 3、10_4、10_5稀釋孢子液，各吸取0.11111涂在含〇(￥1)的？04平板上，301：培養(yǎng)箱中倒置 培養(yǎng)1-3天，得到具有高濃度Cr(VI)耐受能力的菌株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株還原六價鉻的草酸青霉及其篩選方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。根據(jù)菌株的形態(tài)、代謝及分子生物學特征，將其命名為草酸青霉<i>Penicillium</i><i>？oxalicum</i>？SL2，并于2014年10月22日保存于中國典型培養(yǎng)物菌種保藏管理中心，保存號為CCTCC？M？2014505。該菌株能在Cr(VI)濃度為2000mg/L的PDA培養(yǎng)基中生長，耐受超過100g/L的NaCl鹽溶液，5天時間內(nèi)能完全還原培養(yǎng)基中357.9mg/L的Cr(VI)，可以應(yīng)用于處理環(huán)境中的Cr(VI)污染。CCTCC NO: M 201450520141022
【IPC分類】C12R1-80, C12N1-14
【公開號】CN104560738
【申請?zhí)枴緾N201510017900
【發(fā)明人】施積炎, 龍碧波, 何俊昱, 葉基恩, 葉斌暉, 張舒, 徐辰, 鄒麗娜
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月14日