草酸青霉bam-1及其分離純化方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種菌株草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1。該菌株是從林地有機(jī)材料覆蓋雷竹林土壤、長(zhǎng)期堆放的有機(jī)覆蓋物中分離出來的一支純的菌株，該菌株序列與草酸青霉(Penicillium?oxalicum)的26SrRNA基因序列高度同源(99.3%)。本發(fā)明提供了該菌株的培養(yǎng)、產(chǎn)酶、發(fā)酵條件及竹林中應(yīng)用的環(huán)境條件。該菌株能夠有效分解高纖維素含量的林地有機(jī)覆蓋物稻草、礱糠，加速了林地存留有機(jī)覆蓋物的快速生態(tài)腐解，尤其在竹林可持續(xù)經(jīng)營(yíng)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】草酸青霉BAM-1及其分離純化方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種草酸青霉BAM-1及其分離純化方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雷竹是我國(guó)優(yōu)良的筍用竹種，筍味鮮美、產(chǎn)量高、效益好，在我國(guó)南方的浙江、江西等地有規(guī)模栽培，目前我國(guó)雷竹林面積達(dá)20多萬(wàn)hm_2。以雷竹為主栽竹種的竹筍業(yè)已成為區(qū)域農(nóng)村經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民家庭經(jīng)濟(jì)收入的主要來源。自上世紀(jì)90年代初以來，許多筍用竹產(chǎn)區(qū)大面積推廣應(yīng)用有機(jī)材料(主要為礱糠、稻草)林地覆蓋技術(shù)，利用覆蓋物的發(fā)酵增溫、保溫、保濕作用促使筍芽提早分化、萌發(fā)，在秋冬季、早春有竹筍產(chǎn)出，滿足市場(chǎng)對(duì)鮮筍供應(yīng)淡季的大量需求，顯著地提高了筍用竹林的經(jīng)濟(jì)效益，這對(duì)雷竹在許多適生區(qū)的大規(guī)模推廣栽培起到了極大的促進(jìn)作用。然而，林地有機(jī)材料覆蓋過程中大量有機(jī)覆蓋物(39 t.hm_2.a-1稻草和54 t.hm_2.a—1礱糠)的輸入對(duì)雷竹林生態(tài)系統(tǒng)健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，突出表現(xiàn)在覆蓋竹林極易產(chǎn)生立地生產(chǎn)力衰退，僅浙江省臨安市3萬(wàn)hm2的雷竹林中就有1/2以上竹林出現(xiàn)了不同程度的退化，重度退化竹林幾乎無經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出。究其原由，短期內(nèi)難以自然分解的有機(jī)材料覆蓋物的大量林地存留是引起竹林退化的主要原因之一。有機(jī)覆蓋物均為高C/N比材料，特別是礱糠，自然條件下分解需3年以上時(shí)間，覆蓋后林地很難清理徹底，多年覆蓋的竹林地存留覆蓋物厚度至少5cm以上，每年竹林出筍成竹后的林地墾復(fù)使大量有機(jī)覆蓋物充斥于土壤中，導(dǎo)致土壤發(fā)生物理、化學(xué)和生物性劣變。目前針對(duì)雷竹林覆蓋過程中存留的大量的有機(jī)覆蓋物尚無生態(tài)、環(huán)保的處理方法，竹農(nóng)也多采取深翻林地和加客土的方式來減輕有機(jī)覆蓋物存留所帶來的負(fù)面影響，但仍無法很好地解決有機(jī)覆蓋物短期內(nèi)難以有效分解的現(xiàn)實(shí)問題。因此，分離與篩選高C/N比有機(jī)覆蓋材料高效分解微生物，并掌握其培養(yǎng)條件、產(chǎn)酶特性、發(fā)酵方法及覆蓋雷竹林中的應(yīng)用技術(shù)，有利于雷竹林土壤環(huán)境改善，促進(jìn)退化雷竹林恢復(fù)，保障雷竹林健康可持續(xù)經(jīng)營(yíng)和竹筍質(zhì)量安全，也是竹農(nóng)生產(chǎn)中迫切需 要的實(shí)用技術(shù)，推廣應(yīng)用前景巨大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種能高效分解有機(jī)覆蓋物的菌種，尤其是對(duì)竹林地存留的有機(jī)覆蓋物具有高效分解能力的微生物菌株，并提供該菌株的篩選、分離純化、培養(yǎng)等方法，以及該菌株在分解林地有機(jī)覆蓋物上的應(yīng)用技術(shù)，從而解決竹林地有機(jī)覆蓋物大量存留引起竹林退化的現(xiàn)實(shí)問題。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明提供的具有高效分解有機(jī)覆蓋物能力的微生物菌株為草酸青霉ox37icw?)BAM-l，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日:2013年10月10日，保藏號(hào)為CGMCC N0.8315。
[0005]草酸青霉iPeniciIlium oxalicum ) BAM-1的特征為:菌落形態(tài)平坦，質(zhì)地絨狀，菌絲體白色，分生孢子灰綠色，無可溶性色素。顯微鏡下觀察菌株的菌絲體，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝雙輪生，偶有三輪生或單輪生；梗基每輪2-3個(gè)，13-20X3.2-3.7 μ m，彼此通常較緊貼；瓶梗幼齡時(shí)為瓶狀至披針狀，充分成熟時(shí)近圓柱形，梗頸明顯，分生孢子橢圓形，4.5-5.5X3.0-4.0 μ m，壁平滑。該菌株26S rRNA基因序列遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),序列與草酸青霉(Penicillium oxalicum) 26S rRNA基因序列高度同源(99.3%)。
[0006]所述的草酸青霉iPeniciIlium oxalicum ) BAM-1,其分離純化方法包括以下步驟:
1)富集培養(yǎng):取土壤和腐爛有機(jī)覆蓋物樣品，在無菌水中振蕩分散后，取懸濁液接種于馬丁氏孟加拉紅富集培養(yǎng)基中，28 1:下120 PmirT1振蕩培養(yǎng)2 d，反復(fù)培養(yǎng)3次；馬丁氏孟加拉紅富集培養(yǎng)基的配方為:KH2PO4 I g、MgSO4.7Η20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、孟加拉紅3.3 mg、鏈霉素30 μ g、H2O 1000 ml、自然pH值；
2)初篩:取第三次富集培養(yǎng)液，用玻璃涂布棒均勻涂布在剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基上，28 °C下培養(yǎng)，以在平板上出現(xiàn)透明水解圈的時(shí)間以及培養(yǎng)4-5 d后水解圈直徑與菌落直徑的比值大小為基準(zhǔn)，篩選水解圈出現(xiàn)早且直徑較大的菌株。將篩選出的菌株保存在PDA平板培養(yǎng)基上；
剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基配方為:CMC-Na 2.1 g、剛果紅0.39 g、(NH4) SO4 2.1 g、MgSO4*7H20 0.5 g, K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、瓊脂 18 g、H2O 1000 ml、自然 pH 值；
3)復(fù)篩:將初篩獲得的透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，用直徑I cm打孔器在菌落生長(zhǎng)均勻處取菌塊接種到赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，28 °C下120 r.mirT1振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定發(fā)酵液濾紙酶活力，篩選出酶活力最高的菌株，測(cè)序，該菌株的26S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示；赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基配方為:稻草25 g、KH2PO4 1.05 g、NaCl 0.11 g、MgSO4.7Η20 0.29 g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01 g、CaCl2 0.10g、H20 1000 ml、pH 值 6.05。
[0007]尊窗著霉^Penicillium οχ3^7----)ΒΑΜ-1的活化方法如下:配制PDA固體培養(yǎng)基，高壓滅菌，冷卻至50 °C左右，倒平板，冷卻后用粘菌株的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封好培養(yǎng)皿，倒置28 1:靜置培養(yǎng)3-5 d，可重復(fù)復(fù)壯1-2次，整個(gè)接種與培養(yǎng)過程在超凈工作臺(tái)中無菌條件下進(jìn)行；所述的PDA固體培養(yǎng)基的制作方法為:1)取去皮馬鈴薯200g,切碎,加入500 ml蒸懼水煮沸15 min,過濾,得到馬鈴薯汁；2)在該馬鈴薯汁中加入葡萄糖20 g ;3)然后加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05 ;得到液體PDA液體培養(yǎng)基；4)向PDA液體培養(yǎng)基中加入18 g瓊脂，得到固體PDA培養(yǎng)基。
[0008]尊窗著霉^Penicillium οχ3^7----)ΒΑΜ-1的培養(yǎng)方法如下:配制PDA液體培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后，用接種環(huán)從復(fù)壯菌落邊緣取直徑0.5 cm的生長(zhǎng)旺盛且無污染的菌塊2-3塊，接種至PDA液體培養(yǎng)基中，120 r.min-Ι搖瓶培養(yǎng)3_5 d，整個(gè)接種與培養(yǎng)過程在超凈工作臺(tái)中無菌條件下進(jìn)行。
[0009]尊窗著霉^Penicillium (Ora/icw?) BAM-1可用于分解林地有機(jī)覆蓋物。
[0010]駕履"著霉(FeniciIIium oxalicum) BAM-1在分解雷竹林有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用,其特征在于其應(yīng)用方法為:取用草酸青霉BAM-1發(fā)酵菌液,發(fā)酵菌液生物量為38.5 g干菌.L—1，菌液濾紙酶活力為8.65-10.91U，用量為60-90 kg.hm_2，按1:10稀釋后均勻噴灑于土壤表面，并淺鋤表層土壤，使發(fā)酵菌液與土及有機(jī)覆蓋物充分接觸；應(yīng)用季節(jié)為5-6月和9-10月，氣溫以30-35°C為宜，林地土壤體積水分率為50_60%。
[0011]所述的草酸青霉BAM-1在分解雷竹林有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵菌液的制備方法為:采用含1%食用油的改良PDA液體培養(yǎng)基，其組分為:去皮馬鈴薯220 g，葡萄糖21 g，食用油10ml，加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05 ;28 °C下發(fā)酵3 d，溶氧量為73 %，攪拌子轉(zhuǎn)速為20 r.mirT1，消泡劑為非離子型改性聚硅氧燒 。
[0012]上述的草酸青霉oxali cum) BAM_1,是從林地有機(jī)材料覆蓋雷竹林土壤、長(zhǎng)期堆放有機(jī)覆蓋物中分離出來的一支純的菌株，能在以竹葉、稻草、礱糠為唯一碳源的培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)，且生物量與產(chǎn)酶效果明顯優(yōu)于已公布的優(yōu)良纖維素降解菌株哈茨ifMXTrichoderma harziamumy$\綠色Jf.霉 iTrichoderma Kirofe)。本發(fā)明提供了該菌株的分離純化方法并對(duì)其培養(yǎng)、產(chǎn)酶、發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，效果好。該菌株能夠有效分解高纖維素含量的林地有機(jī)覆蓋物稻草、礱糠，加速了林地存留有機(jī)覆蓋物的快速、生態(tài)腐解，尤其是在竹林可持續(xù)經(jīng)營(yíng)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1 % Penicillium oxali cum BAM-1與綠色木霉、哈茨木霉產(chǎn)酶活性比較 圖2為搖'瓶培養(yǎng)Pen i c i 11 i um oxali cum BAM-1生物量積累曲線
圖 3 % Penicillium oxali cum BAM-1 顯微結(jié)構(gòu)圖
圖 4 為 Penicillium oxali cum BAM-1 的系統(tǒng)分類圖
圖5為Penicillium oxali cum BAM-1在發(fā)酵試驗(yàn)中的生物量積累曲線
圖6為Penicillium oxali cum BAM-1對(duì)竹葉、稻草和礱糠的分解效果
圖7為對(duì)照對(duì)竹葉、稻草和礱糠的分解效果
戰(zhàn)込為Penicillium oxali cum BAM-1雷竹林存留有機(jī)覆蓋物分解率曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明。有必要在此指出的是，以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0015]實(shí)施例1:菌株的分離、活化和培養(yǎng)
該菌株分離自浙江省臨安市太湖源鎮(zhèn)高云村長(zhǎng)期堆放的雷竹林地有機(jī)覆蓋物和覆蓋雷竹林土壤，經(jīng)過樣品的富集培養(yǎng)、初篩、復(fù)篩分離得到的一支純的菌株。
[0016]樣品的富集培養(yǎng):各稱取土壤和腐爛有機(jī)覆蓋物樣品10.0 g，加入裝有90 ml無菌水和玻璃珠的250 ml三角瓶中，180 PmirT1振蕩30 min使樣品充分分散，用無菌移液器取懸濁液5 ml接種于45 ml富集培養(yǎng)基中，28 1:下120 PmirT1振蕩培養(yǎng)2 d。再取培養(yǎng)液接種到新鮮無菌富集培養(yǎng)基中，反復(fù)培養(yǎng)3次。
[0017]富集培養(yǎng)基采用改良的馬丁氏孟加拉紅液體培養(yǎng)基，其配方為:KH2PO4 lg、MgSO4.7H20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10g、瓊脂20 g、孟加拉紅3.3mg鏈霉素30 μ g、H2O1000 ml、自然 pH 值。
[0018]初篩:選用剛果紅纖維素培養(yǎng)基進(jìn)行纖維素降解菌的初步篩選。取第三次富集培養(yǎng)液100 μ?，用玻璃涂布棒均勻涂布在剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基上，28 °c下培養(yǎng)，以在平板上出現(xiàn)透明水解圈的時(shí)間以及培養(yǎng)4-5 d后水解圈直徑與菌落直徑的比值大小為基準(zhǔn)，篩選水解圈出現(xiàn)早且直徑較大的菌。將篩選出的菌株保存在PDA平板培養(yǎng)基上。
[0019]剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基配方為:CMC_Na 2.1 g、剛果紅0.39 g、(NH4) SO4 2.1 g、MgSO4*7H20 0.5 g, K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、瓊脂 18 g、H2O 1000 ml、自然 pH 值。
[0020]復(fù)篩:將初篩獲得的透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，用直徑I cm打孔器在菌落生長(zhǎng)均勻處取菌塊接種到以稻草秸桿為唯一碳源的赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基中(配方為:稻草 25g, KH2PO4 1.05g、NaCl 0.llg、MgS04.7H20 0.29 g, NaNO32.51 g、FeCl3 0.01g、CaCl2 0.10g、H2O 1000 ml、pH 值 6.05)，28。。下 120 r.mirT1 振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定發(fā)酵液濾紙酶活，篩選出酶活力高的菌株，觀察菌落特征并測(cè)序。
[0021]該菌株具有如下特征:菌落形態(tài)平坦，質(zhì)地絨狀，菌絲體白色，分生孢子灰綠色，無可溶性色素。顯微鏡下觀察菌株的菌絲體(見圖3)，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝雙輪生，偶有三輪生或單輪生；梗基每輪2-3個(gè)，13-20X3.2-3.7 μ m,彼此通常較緊貼；瓶梗幼齡時(shí)為瓶狀至披針狀，充分成熟時(shí)近圓柱形，梗頸明顯，分生孢子橢圓形，
4.5-5.5X3.0-4.0 μ m，壁平滑。該菌株26S rRNA基因序列遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列見 SEQ ID NO:1 (即 CCCGGGGGTATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGGGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGAGCGGCCCCCATCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAAAATCCCGTCTGGGATGGGGTGTCCGCGCCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGT GGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCACGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCTCGGAATGTAACGCCCCCCGGGGCGTCTTATAGCCGAGGGTGCCATGCGGCCAGCCCAGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCCAA)；該序列與Penicillium oxalicum 26S rRNA基因序列高度同源(99.3%),見圖4,命名為草酸青霉iPeni ci Ilium oxali cum ) BAM-1。
[0022]本發(fā)明所提供的有機(jī)覆蓋物分解菌株均在PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化與培養(yǎng)，具體活化與培養(yǎng)方法為:
菌株活化:配制PDA固體培養(yǎng)基，高壓滅菌，冷卻至50 °C左右，倒平板，冷卻后用粘菌株的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封好培養(yǎng)皿，倒置28 1:靜置培養(yǎng)3-5 d，每天觀察菌落生長(zhǎng)發(fā)育情況，可重復(fù)復(fù)壯1-2次，整個(gè)接種與培養(yǎng)過程需在超凈工作臺(tái)中無菌條件下進(jìn)行。
[0023]菌株培養(yǎng):配制PDA液體培養(yǎng)基，并滅菌，冷卻后，用接種環(huán)從復(fù)壯菌落邊緣取直徑0.5 cm的生長(zhǎng)旺盛且無污染的菌塊2-3塊，接種至PDA液體培養(yǎng)基中，120 r.mirT1搖瓶培養(yǎng)3-5 d,觀察菌落生長(zhǎng)情況(搖瓶培養(yǎng)草酸青霉(Penicillium oxalicum) BAM-1生物量積累曲線見圖2)，整個(gè)接種與培養(yǎng)過程需在超凈工作臺(tái)中無菌條件下進(jìn)行。
[0024]該菌株的活化與培養(yǎng)分別采用固體和液體PDA培養(yǎng)基進(jìn)行。所述液體PDA培養(yǎng)基組分為:去皮馬鈴薯200 g(先用約500 ml蒸餾水煮沸15 min，棄去馬鈴薯并過濾)，葡萄糖20 g，加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05。向液體PDA培養(yǎng)基中加入18 g瓊脂即得到固體PDA培養(yǎng)基，其他組分相同。
[0025]實(shí)施例2:菌株濾紙酶活力
將草酸青霉(Penicillium oxali cum) BAM-1、綠色木霉、哈茨木霉接種于赫奇遜液體培養(yǎng)基(配方為:1 cmX6 cm 新華定量濾紙、KH2PO4 1.05g、NaCl 0.llg、MgSO4.7H20 0.29g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01gXaCl2 0.10g、水 1000 ml、pH值6.05)中，28。。下120 r.rnirT1搖瓶振蕩培養(yǎng)，結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)三菌株濾紙酶活力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高而后降低變化趨勢(shì)，培養(yǎng)5 d時(shí)酶活力最高，分別為9.83 U、3.93 U、4.64 U，草酸青霉oxali cum) BAM-1濾紙酶活力是綠色木霉和哈茨木霉的2倍以上。
[0026]實(shí)施例3:菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4/力正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)含有不同濃度碳源(稻草?οg.L'15 g.L'25 g.L—1)、氮源(牛肉膏 1.5 g.L'2.0 g.L'2.5 g.L—1)與無機(jī)鹽(FeCl3
0.01 g.L'0.015 g.L'0.02 g g.!/1 及 KH2PO4 1.0 g.L'1.5 g.L'2.0 g.L-1)赫奇遜液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，見表1。菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)基因素組合為:稻草25 g.!/1、牛肉膏2.5g.L'FeCl3 0.01 g.L'KH2P04 1.5 g.L'
[0027]表1 L9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.尊窗管霉iPenicilliumBAM-1,保藏號(hào)為 CGMCC N0.8315。
2.如權(quán)利要求1所述的草酸青霉(arayicw?)BAM-1,其特征在于其分離純化方法包括以下步驟: 1)富集培養(yǎng):取土壤和腐爛有機(jī)覆蓋物樣品，在無菌水中振蕩分散后，取懸濁液接種于馬丁氏孟加拉紅富集培養(yǎng)基中，28 1:下120 PmirT1振蕩培養(yǎng)2 d，反復(fù)培養(yǎng)3次； 2)初篩:取第三次富集培養(yǎng)液，用玻璃涂布棒均勻涂布在剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基上，28 °C下培養(yǎng)，以在平板上出現(xiàn)透明水解圈的時(shí)間以及培養(yǎng)4-5 d后水解圈直徑與菌落直徑的比值大小為基準(zhǔn)，篩選水解圈出現(xiàn)早且直徑較大的菌株，將篩選出的菌株保存在PDA平板培養(yǎng)基上； 3)復(fù)篩:將初篩獲得的透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，用直徑I cm打孔器在菌落生長(zhǎng)均勻處取菌塊接種到赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，28 °C下120 r.rniiT1振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定發(fā)酵液濾紙酶活力，篩選出酶活力最高的菌株，測(cè)序，該菌株的26S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如權(quán)利要求2所述的草酸青霉BAM-1,其特征在于:步驟O中所述的馬丁氏孟加拉紅富集培養(yǎng)基的配方為=KH2PO4 I g、MgSO4.7H20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、孟加拉紅3.3 mg、鏈霉素30 μ g> H2O 1000 ml、自然pH值。
4.如權(quán)利要求2所述的草酸青霉(ora/icw?)BAM-1,其特征在于:步驟2)中所述的剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基配方為=CMC-Na 2.1 g、剛果紅0.39 g、(NH4) SO4 2.1g> MgSO4.7Η20 0.5 g、K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、瓊脂 18 g、H20 1000 ml、自然 pH 值。
5.如權(quán)利要求2所述的草酸青霉(ora/icw?)BAM-1,其特征在于:步驟3)中所述的赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基配方為:稻草25 g、KH2PO4 1.05 g、NaCl 0.11 g、MgSO4.7Η20 0.29 g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01 g、CaCl2 0.10 g、H20 1000 ml、pH 值 6.05。
6.如權(quán)利要求1或2所述的草酸青霉οxaIicum、BAM-1,其特征在于其活化方法如下:配制PDA固體培養(yǎng)基，高壓滅菌，冷卻至50 °C，倒平板，冷卻后用粘有菌株的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封好培養(yǎng)皿，倒置28 1:靜置培養(yǎng)3-5 d，可重復(fù)復(fù)壯1-2次，整個(gè)接種與培養(yǎng)過程在超凈工作臺(tái)中無菌條件下進(jìn)行；所述的PDA固體培養(yǎng)基的制作方法為:1)取去皮馬鈴薯200 g，切碎，加入500 ml蒸餾水煮沸15 min，過濾，得到馬鈴薯汁；2)在該馬鈴薯汁中加入葡萄糖20 g ;3)然后加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05，得到液體PDA液體培養(yǎng)基；4)向PDA液體培養(yǎng)基中加入18 g瓊脂，得到固體PDA培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1或2所述的草酸青霉iPenicilliumοχ3^7----)ΒΑΜ-1,其特征在于其培養(yǎng)方法如下:配制PDA液體培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后，用接種環(huán)從復(fù)壯菌落邊緣取直徑0.5 cm的生長(zhǎng)旺盛且無污染的菌塊2-3塊，接種至PDA液體培養(yǎng)基中，120 r.min-Ι搖瓶培養(yǎng)3_5d，整個(gè)接種與培養(yǎng)過程在超凈工作臺(tái)中無菌條件下進(jìn)行；所述的PDA液體培養(yǎng)基的制作方法為:I)取去皮馬鈴薯200 g，切碎，加入500 ml蒸餾水煮沸15 min，過濾，得到馬鈴薯汁；2)在該馬鈴薯汁中加入葡萄糖20 g;3)然后加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05。
8.駕履"著霉(FeniciIIiumBAM-1在分解林地有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用。
9.草酸青霉在分解雷竹林有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用,其特征在于其應(yīng)用方法為:取用草酸青霉BAM-1發(fā)酵菌液,發(fā)酵菌液生物量為38.5 g干菌.L—1，菌液濾紙酶活力為8.65-10.91U，用量為60-90 kg.hm_2，按1:10稀釋后均勻噴灑于土壤表面，并淺鋤表層土壤，使發(fā)酵菌液與土及有機(jī)覆蓋物充分接觸；應(yīng)用季節(jié)為5-6月和9-10月，氣溫以30-35°C為宜，林地土壤體積水分率為50_60%。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的草酸青霉在分解雷竹林有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵菌液的制備方法為:采用含1%食用油的改良PDA液體培養(yǎng)基，其組分為:去皮馬鈴薯220 g，葡萄糖21 g，食用油10ml，加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05;28 °C下發(fā)酵3 d，溶氧量為73 %，攪拌子轉(zhuǎn)速為20 r.mirT1，消泡劑為非離子型改性聚硅氧 烷。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103525710SQ201310497471
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】郭子武, 陳雙林, 李迎春, 楊清平 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所