本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種蛹蟲草菌株及其在制備蟲草素中的應用。
背景技術：
蛹蟲草(Cordyceps militaris)，又名北冬蟲夏草，屬于真菌界，分類學上屬于真菌門，子囊菌亞門，核菌綱，球殼菌目，麥角菌科，蟲草屬，與野生冬蟲夏草為同科同屬，是我國傳統(tǒng)的重要食藥用菌之一。
目前，蛹蟲草已實現(xiàn)大規(guī)模人工栽培，使其資源的研究與開發(fā)在近幾十年取得了很大進展，已逐漸成為野生資源不斷減少、亟需保護的野生冬蟲夏草的替代品；又因其具有極高的營養(yǎng)價值和保健功效，其相關產品已被越來越多的消費者所接受。據研究資料顯示，蛹蟲草含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、腺苷、甾醇、不飽和脂肪酸等多種生物活性物質，具有增強免疫力、調節(jié)內分泌、抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗腫瘤、抗缺氧、鎮(zhèn)靜作用、降血糖、保護肝腎及呼吸系統(tǒng)等多種生理功能。其化學成分和功能與著名的藥用真菌冬蟲夏草極其相似，某些活性成分如蟲草素、腺苷類等物質還顯著高于冬蟲夏草。2005年，國家食品藥品監(jiān)督管理局明確規(guī)定，保健食品的原料使用了冬蟲夏草的，應以人工繁殖的菌絲體予以替換。2009年，蛹蟲草經國家原衛(wèi)生部批準為新資源食品，現(xiàn)在可稱作為食品新原料，允許作為食品直接食用。
現(xiàn)代研究表明，蛹蟲草活性成分中，蟲草素是最重要的一種，其在臨床醫(yī)學與保健中發(fā)揮著重要的作用。近些年來，作為蛹蟲草類產品標志性的有效成分，蟲草素的生理功效及藥理作用的研究，已引起生物學界和醫(yī)藥學界科學工作者的高度關注，科學工作者對蟲草素產品的開發(fā)研究也愈加重視和具體。隨著對蟲草素的活性作用逐步認識以及作用機制揭示，其所表現(xiàn)的抗菌、消炎、抗腫瘤、調節(jié)人體內分泌和增強人體免疫功能等的顯著功能，都會得到進一步的重視。因此開發(fā)高蟲草素含量的蛹蟲草產品，無論是醫(yī)療康復，還是飲食養(yǎng)生，都將會擁有巨大的經濟價值和社會意義。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種蛹蟲草菌株及其在制備蟲草素中的應用。
本發(fā)明提供的蛹蟲草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)，已于2016年4月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC；地址：中國武漢，武漢大學；郵編：430072)，保藏編號為CCTCC NO：M2016220。蛹蟲草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)CCTCC NO：M2016220簡稱為蛹蟲草菌FY1421。
蛹蟲草菌FY1421在生產蟲草素中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明還保護培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法，包括如下步驟：采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421。
采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的條件為：通氣量為15-20L/min，攪拌轉速為150-200rpm，溫度為24-28℃、溶解氧(DO)為25-45％，時間為96-120小時。
采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法具體可為：時間為96小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：300lux)；第0-92小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為20L/min，攪拌轉速為200rpm，溫度為25℃，溶解氧為35％。
采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法具體可為：時間為120小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-120小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：200lux)；第0-115小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為15L/min，攪拌轉速為150rpm，溫度為24℃，溶解氧為25％。
采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法具體可為：時間為96小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：500lux)；第0-92小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為17.5L/min，攪拌轉速為175rpm，溫度為28℃，溶解氧為45％。
本發(fā)明還保護培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法，依次包括如下步驟(a)和步驟(b)：
步驟(a)：采用種子強化培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421；
步驟(b)：將步驟(a)的產物接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
步驟(b)中，所述培養(yǎng)的條件為：通氣量為15-20L/min，攪拌轉速為150-200rpm，溫度為24-28℃、溶解氧(DO)為25-45％，時間為96-120小時。
步驟(b)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為：時間為96小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：300lux)；第0-92小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為20L/min，攪拌轉速為200rpm，溫度為25℃，溶解氧為35％。
步驟(b)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為：時間為120小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-120小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：200lux)；第0-115小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為15L/min，攪拌轉速為150rpm，溫度為24℃，溶解氧為25％。
步驟(b)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為：時間為96小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：500lux)；第0-92小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為17.5L/min，攪拌轉速為175rpm，溫度為28℃，溶解氧為45％。
步驟(a)具體可為：將蛹蟲草菌FY1421接種至種子強化培養(yǎng)基(蛹蟲草菌FY1421在培養(yǎng)體系中的初始濃度為104個/ml)，26℃培養(yǎng)4天，得到強化種子培養(yǎng)物(蛹蟲草菌FY1421在培養(yǎng)體系中的孢子濃度為1012個/克培養(yǎng)物)。
步驟(b)具體可為：將100g步驟(a)的產物接種至35L液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
本發(fā)明還保護一種生產蟲草素的方法，包括如下步驟：培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421。
所述生產蟲草素的方法包括如下步驟：采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421。
采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的條件為：通氣量為15-20L/min，攪拌轉速為150-200rpm，溫度為24-28℃、溶解氧(DO)為25-45％，時間為96-120小時。
采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法具體可為：時間為96小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：300lux)；第0-92小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為20L/min，攪拌轉速為200rpm，溫度為25℃，溶解氧為35％。
采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法具體可為：時間為120小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-120小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：200lux)；第0-115小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為15L/min，攪拌轉速為150rpm，溫度為24℃，溶解氧為25％。
采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法具體可為：時間為96小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：500lux)；第0-92小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為17.5L/min，攪拌轉速為175rpm，溫度為28℃，溶解氧為45％。
所述生產蟲草素的方法包括如下步驟(a)和步驟(b)：
步驟(a)：采用種子強化培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421；
步驟(b)：將步驟(a)的產物接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
步驟(b)中，所述培養(yǎng)的條件為：通氣量為15-20L/min，攪拌轉速為150-200rpm，溫度為24-28℃、溶解氧(D0)為25-45％，時間為96-120小時。
步驟(b)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為：時間為96小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：300lux)；第0-92小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為20L/min，攪拌轉速為200rpm，溫度為25℃，溶解氧為35％。
步驟(b)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為：時間為120小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-120小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：200lux)；第0-115小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為15L/min，攪拌轉速為150rpm，溫度為24℃，溶解氧為25％。
步驟(b)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為：時間為96小時，其中第0-24小時為黑暗培養(yǎng)、第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度具體可為：500lux)；第0-92小時，通過加入70g/100ml葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70g/100ml葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；培養(yǎng)全程參數：通氣量為17.5L/min，攪拌轉速為175rpm，溫度為28℃，溶解氧為45％。
步驟(a)具體可為：將蛹蟲草菌FY1421接種至種子強化培養(yǎng)基(蛹蟲草菌FY1421在培養(yǎng)體系中的初始濃度為104個/ml)，26℃培養(yǎng)4天，得到強化種子培養(yǎng)物(蛹蟲草菌FY1421在培養(yǎng)體系中的孢子濃度為1012個/克培養(yǎng)物)。
步驟(b)具體可為：將100g步驟(a)的產物接種至35L液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
以上任一所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由溶質和溶劑組成；所述溶質及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下：葡萄糖2-4g/100ml、蛋白胨1-2g/100ml、酵母粉1-2g/100ml、玉米粉5-6g/100ml、豆餅粉1-3g/100ml、小麥粉0.4-0.6g/100ml、磷酸二氫鉀0.4-0.6g/100ml、硫酸鎂0.2-0.4g/100ml、維生素B1 1-3mg/100ml、維生素B2 0.5-1.5mg/100ml、甘氨酸0.2-0.4mg/100ml、蘇氨酸0.2-0.3mg/100ml、纈氨酸0.1-0.2mg/100ml、亮氨酸0.04-0.06mg/100ml、異亮氨酸0.05-0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.2-0.3mg/100ml、絲氨酸0.05-0.15mg/100ml、脯氨酸0.04-0.06mg/100ml、羥脯氨酸0.02-0.04mg/100ml、半胱氨酸0.01-0.03mg/100ml、色氨酸0.02-0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.04-0.06mg/100ml、賴氨酸0.05-0.15mg/100ml、谷氨酸0.04-0.06mg/100ml；所述溶劑為水。
所述溶質及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖3g/100ml、蛋白胨1.5g/100ml、酵母粉1.5g/100ml、玉米粉5.5g/100ml、豆餅粉2.0g/100ml、小麥粉0.5g/100ml、磷酸二氫鉀0.5g/100ml、硫酸鎂0.3g/100ml、維生素B1 2mg/100ml、維生素B2 1mg/100ml、甘氨酸0.3mg/100ml、蘇氨酸0.25mg/100ml、纈氨酸0.15mg/100ml、亮氨酸0.05mg/100ml、異亮氨酸0.1mg/100ml、苯丙氨酸0.25mg/100ml、絲氨酸0.1mg/100ml、脯氨酸0.05mg/100ml、羥脯氨酸0.03mg/100ml、半胱氨酸0.02mg/100ml、色氨酸0.025mg/100ml、甲硫氨酸0.05mg/100ml、賴氨酸0.1mg/100ml、谷氨酸0.05mg/100ml。
所述溶質及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖2g/100ml、蛋白胨1.0g/100ml、酵母粉1.0g/100ml、玉米粉5.0g/100ml、豆餅粉1.0g/100ml、小麥粉0.4g/100ml、磷酸二氫鉀0.4g/100ml、硫酸鎂0.2g/100ml、維生素B1 1mg/100ml、維生素B2 0.5mg/100ml、甘氨酸0.2mg/100ml、蘇氨酸0.2mg/100ml、纈氨酸0.1mg/100ml、亮氨酸0.04mg/100ml、異亮氨酸0.05mg/100ml、苯丙氨酸0.2mg/100ml、絲氨酸0.05mg/100ml、脯氨酸0.04mg/100ml、羥脯氨酸0.02mg/100ml、半胱氨酸0.01mg/100ml、色氨酸0.02mg/100ml、甲硫氨酸0.04mg/100ml、賴氨酸0.05mg/100ml、谷氨酸0.04mg/100ml。
所述溶質及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖4g/100ml、蛋白胨2.0g/100ml、酵母粉2.0g/100ml、玉米粉6.0g/100ml、豆餅粉3.0g/100ml、小麥粉0.6g/100ml、磷酸二氫鉀0.6g/100ml、硫酸鎂0.4g/100ml、維生素B1 3mg/100ml、維生素B2 1.5mg/100ml、甘氨酸0.4mg/100ml、蘇氨酸0.3mg/100ml、纈氨酸0.2mg/100ml、亮氨酸0.06mg/100ml、異亮氨酸0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.3mg/100ml、絲氨酸0.15mg/100ml、脯氨酸0.06mg/100ml、羥脯氨酸0.04mg/100ml、半胱氨酸0.03mg/100ml、色氨酸0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.06mg/100ml、賴氨酸0.15mg/100ml、谷氨酸0.06mg/100ml。
以上任一所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH＝6.5-7.0。
以上任一所述種子強化培養(yǎng)基的原料配比為：1L營養(yǎng)液：0.5-1.5kg小米；所述營養(yǎng)液由溶質和溶劑組成；所述溶質及其在所述營養(yǎng)液中的濃度如下：馬鈴薯浸出粉1-3g/100ml、葡萄糖0.5-1.5g/100ml、蛋白胨0.4-0.8g/100ml、磷酸二氫鉀0.05-0.15g/100ml、硫酸鎂0.04-0.06g/100ml、維生素B1 1-3mg/100ml、維生素B2 0.5-1.5mg/100ml、甘氨酸0.2-0.4mg/100ml、蘇氨酸0.2-0.3mg/100ml、纈氨酸0.1-0.2mg/100ml、亮氨酸0.04-0.06mg/100ml、異亮氨酸0.05-0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.2-0.3mg/100ml、絲氨酸0.05-0.15mg/100ml、脯氨酸0.04-0.06mg/100ml、羥脯氨酸0.02-0.04mg/100ml、半胱氨酸0.01-0.03mg/100ml、色氨酸0.02-0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.04-0.06mg/100ml、賴氨酸0.05-0.15mg/100ml、谷氨酸0.04-0.06mg/100ml；所述溶劑為水。
所述溶質及其在所述營養(yǎng)液中的濃度具體可為：馬鈴薯浸出粉2g/100ml、葡萄糖1g/100ml、蛋白胨0.6g/100ml、磷酸二氫鉀0.1g/100ml、硫酸鎂0.05g/100ml、維生素B12mg/100ml、維生素B21mg/100ml、甘氨酸0.3mg/100ml、蘇氨酸0.25mg/100ml、纈氨酸0.15mg/100ml、亮氨酸0.05mg/100ml、異亮氨酸0.1mg/100ml、苯丙氨酸0.25mg/100ml、絲氨酸0.1mg/100ml、脯氨酸0.05mg/100ml、羥脯氨酸0.03mg/100ml、半胱氨酸0.02mg/100ml、色氨酸0.025mg/100ml、甲硫氨酸0.05mg/100ml、賴氨酸0.1mg/100ml、谷氨酸0.05mg/100ml。
所述種子強化培養(yǎng)基的原料配比具體可為：1L營養(yǎng)液：1.0kg小米。
所述種子強化培養(yǎng)基的制備方法具體可為：將營養(yǎng)液與小米混合均勻，隔水蒸(時間具體可為30min)。
本發(fā)明還保護用于培養(yǎng)所述蛹蟲草菌FY1421和/或制備蟲草素的試劑盒，所述試劑盒包括所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
所述試劑盒還包括所述種子強化培養(yǎng)基。
本發(fā)明提供了蛹蟲草菌FY1421以及培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421的方法和通過培養(yǎng)蛹蟲草菌FY1421制備蟲草素的方法。蛹蟲草菌FY1421的菌絲體中的蟲草素含量比現(xiàn)有的出發(fā)菌株提高了近170倍，是一株極具生產蟲草素及富含蟲草素菌絲體應用價值的生產菌株。本發(fā)明提供的制備蟲草素的方法，具有發(fā)酵周期短、蟲草素產量高的優(yōu)點。本發(fā)明具有重大的應用價值和產業(yè)前景。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
蛹蟲草菌株50383：中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心(www.accc.org.cn，簡稱ACCC)，ACCC編號：50383。
溶壁酶：廣東微生物菌種保藏中心。
蝸牛酶：生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號：A600870。
纖維素酶：生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號：A002598。
豆餅粉：淄博坤興糧油有限公司。
PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g，蒸餾水定容至1000mL，自然pH；121℃高壓蒸汽滅菌20-30min。
PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂0.3g，維生素B1 20mg，蒸餾水定容至1000ml，調pH至6.5-7.0；121℃高壓蒸汽滅菌20-30min。
氨基酸營養(yǎng)母液的制備方法為：取甘氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸，絲氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和谷氨酸，加蒸餾水定容至1000ml；4℃存儲，備用。
種子強化培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖10g，蛋白胨6.0g，磷酸二氫鉀1.0g，硫酸鎂0.5g，氨基酸營養(yǎng)母液5ml，維生素B1 20mg，維生素B2 10mg，蒸餾水定容至1000ml，制成營養(yǎng)液；1000ml營養(yǎng)液與1000g小米混合均勻，隔水蒸30min，得到種子強化培養(yǎng)基；121℃高壓滅菌20-30min。各溶質在營養(yǎng)液中的濃度如下：馬鈴薯浸出粉2g/100ml、葡萄糖1g/100ml、蛋白胨0.6g/100ml、磷酸二氫鉀0.1g/100ml、硫酸鎂0.05g/100ml、維生素B1 2mg/100ml、維生素B2 1mg/100ml、甘氨酸0.3mg/100ml、蘇氨酸0.25mg/100ml、纈氨酸0.15mg/100ml、亮氨酸0.05mg/100ml、異亮氨酸0.1mg/100ml、苯丙氨酸0.25mg/100ml、絲氨酸0.1mg/100ml、脯氨酸0.05mg/100ml、羥脯氨酸0.03mg/100ml、半胱氨酸0.02mg/100ml、色氨酸0.025mg/100ml、甲硫氨酸0.05mg/100ml、賴氨酸0.1mg/100ml、谷氨酸0.05mg/100ml。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法(pH＝6.5-7.0)：取葡萄糖，蛋白胨，酵母粉，玉米粉，豆餅粉，小麥粉，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，氨基酸營養(yǎng)母液，維生素B1，維生素B2，加蒸餾水定容至100ml，調pH為6.5-7.0；121℃高壓滅菌25-30min，冷卻至24-28℃，備用。按照上述方法分別制備得到液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲、液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙及液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲中，各溶質的濃度如下：葡萄糖3g/100ml、蛋白胨1.5g/100ml、酵母粉1.5g/100ml、玉米粉5.5g/100ml、豆餅粉2.0g/100ml、小麥粉0.5g/100ml、磷酸二氫鉀0.5g/100ml、硫酸鎂0.3g/100ml、維生素B1 2mg/100ml、維生素B2 1mg/100ml、甘氨酸0.3mg/100ml、蘇氨酸0.25mg/100ml、纈氨酸0.15mg/100ml、亮氨酸0.05mg/100ml、異亮氨酸0.1mg/100ml、苯丙氨酸0.25mg/100ml、絲氨酸0.1mg/100ml、脯氨酸0.05mg/100ml、羥脯氨酸0.03mg/100ml、半胱氨酸0.02mg/100ml、色氨酸0.025mg/100ml、甲硫氨酸0.05mg/100ml、賴氨酸0.1mg/100ml、谷氨酸0.05mg/100ml。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙中，各溶質的濃度如下：葡萄糖2g/100ml、蛋白胨1.0g/100ml、酵母粉1.0g/100ml、玉米粉5.0g/100ml、豆餅粉1.0g/100ml、小麥粉0.4g/100ml、磷酸二氫鉀0.4g/100ml、硫酸鎂0.2g/100ml、維生素B1 1mg/100ml、維生素B2 0.5mg/100ml、甘氨酸0.2mg/100ml、蘇氨酸0.2mg/100ml、纈氨酸0.1mg/100ml、亮氨酸0.04mg/100ml、異亮氨酸0.05mg/100ml、苯丙氨酸0.2mg/100ml、絲氨酸0.05mg/100ml、脯氨酸0.04mg/100ml、羥脯氨酸0.02mg/100ml、半胱氨酸0.01mg/100ml、色氨酸0.02mg/100ml、甲硫氨酸0.04mg/100ml、賴氨酸0.05mg/100ml、谷氨酸0.04mg/100ml。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙中，各溶質的濃度如下：葡萄糖4g/100ml、蛋白胨2.0g/100ml、酵母粉2.0g/100ml、玉米粉6.0g/100ml、豆餅粉3.0g/100ml、小麥粉0.6g/100ml、磷酸二氫鉀0.6g/100ml、硫酸鎂0.4g/100ml、維生素B1 3mg/100ml、維生素B2 1.5mg/100ml、甘氨酸0.4mg/100ml、蘇氨酸0.3mg/100ml、纈氨酸0.2mg/100ml、亮氨酸0.06mg/100ml、異亮氨酸0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.3mg/100ml、絲氨酸0.15mg/100ml、脯氨酸0.06mg/100ml、羥脯氨酸0.04mg/100ml、半胱氨酸0.03mg/100ml、色氨酸0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.06mg/100ml、賴氨酸0.15mg/100ml、谷氨酸0.06mg/100ml。
檢測蟲草素含量的方法：NY/T 2116-2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法。
一、蛹蟲草菌株50383菌絲體的收集
1、將蛹蟲草菌株50383接種至PDA固體斜面培養(yǎng)基，24-28℃培養(yǎng)5-7天。
2、用無菌的生理鹽水將步驟1培養(yǎng)好的PDA固體斜面培養(yǎng)基上的孢子洗脫，并通過無菌濾紙過濾得到孢子懸液，孢子懸液中含孢子濃度為1.8×107個/mL。
3、將步驟2制備的孢子懸液按5-20％接種量轉接于PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(24-28℃，100-150rpm，24-36h)，獲得液體培養(yǎng)物。
4、將步驟3獲得的液體培養(yǎng)物8000rpm離心10min收集菌絲體，用無菌生理鹽水洗滌二次，用無菌濾紙吸干水分，得到菌絲體。
二、蛹蟲草菌株50383原生質體懸液的制備
1、取步驟一得到的菌絲體，采用由溶壁酶、蝸牛酶和纖維素酶混合得到的酶解液對菌絲體進行酶解反應，得到反應后的酶解液。酶解反應中：溶壁酶的使用濃度為0.5％-2.5％，最佳濃度為0.5％-1.0％；蝸牛酶的使用濃度0.5％-2.5％，最佳濃度為0.5％-1.0％；纖維素酶的使用濃度為0.2％-1.5％，最佳濃度為0.5-1.0％％；酶解溫度范圍為24-35℃，最佳酶解溫度為26-30℃；酶解時間為2-8h，最佳酶解時間為3-5h；調節(jié)酶解pH為5.0-7.0，最佳酶解pH為6.2-6.8。
2、采用45g/L的氯化鉀水溶液重懸步驟2得到的原生質體細胞沉淀，得到原生質體懸液。
三、蛹蟲草菌株原生質體的常壓室溫等離子體(ARTP)誘變處理
1、進行預實驗選擇誘變處理時間，方法如下：
取10-20μL的步驟二制備的原生質體懸液，均勻涂布在金屬載片的上表面，干燥后用鑷子將載片轉移至載物臺。采用高純氦氣作為等離子體的工作氣體處理菌物載片，設置電源功率80W，照射距離4mm，等離子體的溫度26-30℃，氣流量10L/min，設置不同的處理組，各組的處理時間分別為0(對照)、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55s，每組設置三次重復。將處理后的載片轉移到裝有1mL再生培養(yǎng)基的EP管中，在振蕩器上再生培養(yǎng)45min，把附著在載片上的微生物洗脫到再生培養(yǎng)基中，形成菌懸液。將菌懸液涂布至再生平板后置于24-28℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2-3天后對平板菌落進行計數，計算致死率，致死率計算方法如下所示：
致死率％＝(未經誘變處理菌落數-經誘變處理菌落數)/未經誘變菌落數×100％
通過統(tǒng)計各處理組的致死率，選擇致死率為75-85％的照射處理時間進行正式實驗，處理時間為20s。
2、根據步驟1的結果，進行正式實驗，方法如下：
取15μL的步驟二制備的原生質體懸液，均勻涂布在金屬載片的上表面，干燥后用鑷子將載片轉移至載物臺。采用高純氦氣作為等離子體的工作氣體處理菌物載片，設置電源功率80W，照射距離4mm，等離子體的溫度26-30℃，氣流量10L/min，處理時間為20s。樣品處理完畢后，用無菌鑷子將載片放至裝有1mL再生培養(yǎng)基的EP管中，在振蕩器上再生培養(yǎng)45min，把附著在載片上的微生物洗脫到再生培養(yǎng)基中，形成新的菌懸液。
四、優(yōu)良高效積累蟲草素蛹蟲草菌株的篩選
1、將步驟三得到的新的菌懸液稀釋1000倍，取100-300μL稀釋液涂布到再生培養(yǎng)基平板置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
2、將步驟1的平板上的生長快速的突變菌株接種到裝有1mL PDA液體培養(yǎng)基的96孔微孔板振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24-28℃，轉速為150-200rpm，培養(yǎng)2天，離心收集菌絲體，檢測菌絲體蟲草素含量。
統(tǒng)計得到4562株突變菌株，其中蟲草素含量提高的正突變菌株為311株，蟲草素含量降低的負突變菌株為4251株。與出發(fā)菌株相比，正突變菌株中的300株的蟲草素含量提高幅度為150％-500％，11株的蟲草素含量提高幅度為500％以上。
3、收集步驟2中蟲草素含量明顯提高的正突變菌株(11株)，繼續(xù)進行搖瓶復篩，250ml搖瓶，裝液量50ml，培養(yǎng)條件為24-28℃，150-200rpm，培養(yǎng)2天，收集菌絲體，檢測其生物量(菌絲體濕重)、蟲草素含量。
11株正突變菌株中，10株的蟲草素含量為“2.5g/kg菌絲體干重”以下，另外1株菌(即編號FY1424的菌株)的蟲草素含量達到“42.3g/kg菌絲體干重”。將編號FY1424的菌株命名為蛹蟲草菌FY1421，進行斜面保存及甘油保種。
五、蛹蟲草菌FY1421的保藏
蛹蟲草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)于2016年4月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC；地址：中國武漢，武漢大學；郵編：430072)，保藏編號為CCTCC NO：M2016220。蛹蟲草菌FY1421(Cordyceps mi1itaria FY1421)CCTCCNO：M2016220簡稱為蛹蟲草菌FY1421。
六、蛹蟲草菌FY1421的遺傳穩(wěn)定性
將蛹蟲草菌FY1421進行傳代培養(yǎng)以考察其遺傳穩(wěn)定性，每3天傳代一次，傳代15代，每隔一代進行搖瓶發(fā)酵測定菌株的蟲草素含量，結果顯示蛹蟲草菌FY1421傳代過程中發(fā)酵蟲草素含量無明顯變化，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
實施例2、蛹蟲草菌FY1421的發(fā)酵應用
一、蛹蟲草菌FY1421的種子強化培養(yǎng)
1、將蛹蟲草菌FY1421接種至PDA固體斜面培養(yǎng)基，24-28℃培養(yǎng)5-7天。
2、用無菌的生理鹽水將步驟1培養(yǎng)好的PDA固體斜面培養(yǎng)基上的分生孢子洗脫，轉接于PDA固體斜面培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中24-28℃避光培養(yǎng)3-5天。
3、用10ml無菌的生理鹽水將步驟2培養(yǎng)好的PDA固體斜面培養(yǎng)基上的分生孢子洗脫，得到菌懸液。
4、將10ml步驟3得到的菌懸液接種至裝有100g種子強化培養(yǎng)基的茄子瓶中(蛹蟲草菌FY1421在培養(yǎng)體系中的初始濃度為104個/ml)，于培養(yǎng)箱中26℃培養(yǎng)4天，得到強化種子培養(yǎng)物(孢子濃度為1012個/克培養(yǎng)物)。
二、蛹蟲草菌FY1421液體深層發(fā)酵培養(yǎng)
取100g步驟一制備的強化種子培養(yǎng)物接種于含有35L液體發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)。
試驗組甲采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲。
試驗組乙采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙。
試驗組丙采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙。
試驗組甲的培養(yǎng)過程(發(fā)酵時間為96小時)：第0-24小時為黑暗培養(yǎng)，第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度：300lux)；實時監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度，第0-92小時，通過加入70％的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；第93小時至發(fā)酵結束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。發(fā)酵結束時，培養(yǎng)體系中的還原糖濃度為0.1g/100ml。培養(yǎng)全程參數為：發(fā)酵罐通氣量為20L/min，攪拌控制為200rpm，溫度控制在25℃，控制溶解氧(DO)為35％。
試驗組乙的培養(yǎng)過程(發(fā)酵時間為120小時)：第0-24小時為黑暗培養(yǎng)，第25-120小時為光照培養(yǎng)(光照強度：200lux)；實時監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度，第0-115小時，通過加入70％的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；第116小時至發(fā)酵結束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。發(fā)酵結束時，培養(yǎng)體系中的還原糖濃度為0.01g/100ml。培養(yǎng)全程參數為：發(fā)酵罐通氣量為15L/min，攪拌控制為150rpm，溫度控制在24℃，控制溶解氧(DO)為25％。
試驗組丙的培養(yǎng)過程(發(fā)酵時間為96小時)：第0-24小時為黑暗培養(yǎng)，第25-96小時為光照培養(yǎng)(光照強度：500lux)；實時監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度，第0-92小時，通過加入70％的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.8-1.5g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.8g/100mL時，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.5g/100mL)；第93小時至發(fā)酵結束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。發(fā)酵結束時，培養(yǎng)體系中的還原糖濃度為0.045g/100ml。培養(yǎng)全程參數為：發(fā)酵罐通氣量為17.5L/min，攪拌控制為175rpm，溫度控制在28℃，控制溶解氧(DO)為45％。
三、蛹蟲草菌FY1421發(fā)酵培養(yǎng)物菌絲體的分離
完成步驟二后，取整個培養(yǎng)體系，收集菌絲體并用水洗滌(通過3000rpm離心30min的方式收集菌絲體)。
試驗組甲的菌絲體濕重得率約80％(即80g/100ml)，干重得率約為8.0％(即8g/100ml)。
試驗組乙的菌絲體濕重得率約50％(即50g/100ml)，干重得率約為4.0％(即4g/100ml)。
試驗組丙的菌絲體濕重得率約65％(即65g/100ml)，干重得率約為6.0％(即6g/100ml)。
試驗組甲得到的菌絲體最多。
四、對照菌株菌絲體的制備
將蛹蟲草菌株50383代替蛹蟲草菌FY1421采用試驗組甲的條件按照步驟一、二、三進行操作，收集蛹蟲草菌株50383菌絲體(對照液菌株菌絲體)。
五、蟲草素含量的測定
將步驟三中采用試驗組甲的蛹蟲草菌FY1421菌絲體和步驟四得到的蛹蟲草菌株50383菌絲體的蟲草素含量進行測定。
檢測結果為：蛹蟲草菌FY1421菌絲體中的蟲草素含量達到42.3g/kg菌絲體干重。蛹蟲草菌株50383菌絲體中的蟲草素含量達到0.25g/kg菌絲體干重。
結果表明：蛹蟲草菌FY1421在種子強化培養(yǎng)的基礎上，其發(fā)酵周期顯著縮短，合成與積累蟲草素的能力顯著增強，具備優(yōu)異的生產蟲草素及高含量蟲草素菌絲體的能力。