本發(fā)明屬于生物防治植物病害領域。具體而言，本發(fā)明涉及一株能夠高效防治油用牡丹根腐病、紅斑病的哈茨木霉及其用途，以及采用該哈茨木霉菌株制備的生物防治制劑。

背景技術：

油用牡丹是我國獨有植物，原生物種其種子可榨取食用油，研究表明，牡丹平均畝產(chǎn)籽250kg，出油率30％以上，其中α-亞麻酸含量達42.34％，具有極高的經(jīng)濟價值。油用牡丹具有良好的經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益，大力發(fā)展油用牡丹產(chǎn)業(yè)，對于促進我國油料生產(chǎn)、保障糧油安全、優(yōu)化國民膳食結構、提高健康水平、改善生態(tài)環(huán)境、增加農(nóng)民收入、幫助貧困地區(qū)農(nóng)民脫貧致富、建設美麗中國等都有重要意義。隨著油用牡丹集約化種植面積的不斷增加，其田間生態(tài)環(huán)境已發(fā)生較大變化，各種病害發(fā)生日趨嚴重。目前防治手段主要靠化學農(nóng)藥結合優(yōu)化栽培管理?；瘜W農(nóng)藥雖然可以防治油用牡丹主要病害，但是長期使用容易造成農(nóng)藥殘留超標與環(huán)境污染，進而影響農(nóng)民經(jīng)濟效益與群眾身體健康。生物農(nóng)藥具有毒性較小、環(huán)境友好及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，通過研制防治油用牡丹主要病害的生物農(nóng)藥，實現(xiàn)生產(chǎn)過程無公害化，可以在保證較好防治效果同時解決農(nóng)藥殘留超標及抗藥性等問題，符合未來綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨勢。

木霉菌(Trichoderma spp.)在土壤、空氣、枯枝落葉、各種發(fā)酵物、植物根圈、葉片及種子、球莖表面廣泛分布。木霉菌是一種重要的生防菌株，通過產(chǎn)生抗生素、營養(yǎng)競爭、重寄生、細胞壁降解酶以及誘導植物產(chǎn)生抗性等多種機制，達到控制多種植物病害的目的。木霉菌的作用機理是復雜而多樣的，不同的菌株生防機制的側重點不同，菌株間的生防作用效果與菌株類型、病原真菌的類型、作物類型和環(huán)境條件密切相關。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于高效防治油用牡丹根腐病、紅斑病的新的哈茨木霉菌株。本發(fā)明的哈茨木霉菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、抗逆性強，在油用牡丹葉片、根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用前景。

本發(fā)明所提供的菌株為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)SDL Tr35，是從五蓮縣感病蘑菇上分離獲得的，已于2012年10月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No.6693。其具有以下微生物學特性：在PDA平板上25℃培養(yǎng)3天，菌落圓形，直徑約8cm，中央灰白色帶墨綠色，邊緣白色，氣生菌絲較短。分生孢子梗產(chǎn)生側向分枝，分枝上輪生或對生短的產(chǎn)孢瓶體，瓶體與著生它們的分枝大致成直角；分生孢子單胞，球形，光滑。

本發(fā)明哈茨木霉菌菌株SDL Tr35的培養(yǎng)方法或繁殖方法包括：

(1)普通培養(yǎng)保存培養(yǎng)基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀1g，硝酸鉀1g，VB₂ 0.2g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL；

(2)實驗室液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀1g，硝酸鉀1g，VB₂0.2g，蒸餾水1000mL；

(3)固體培養(yǎng)基配方：固料和無機鹽溶液，按質量比1：1.8的比例配制。其中所述固料由質量比為50：35：15的玉米芯、小麥秸稈和牡丹籽殼組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液的組分及含量為：3.5％磷酸二氫鉀，0.05％硫酸鎂，0.5％硫酸鈣，4％硫酸銨，氯霉素0.05％，剩余為水。

(4)大量發(fā)酵培養(yǎng)配方：同(3)中固體培養(yǎng)基配方。

本發(fā)明還提供了一種用于防治油用牡丹主要病害的生物防治制劑，所述生物防治制劑包括所述的哈茨木霉菌株SDL Tr35。

本發(fā)明也提供了上述哈茨木霉菌株SDL Tr35或者上述生物防治制劑在防治油用牡丹病害中的用途，所述牡丹病害為牡丹根腐病、紅斑病。

本發(fā)明所述的生物防治制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備所述哈茨木霉菌株SDL Tr35的種子液；

(2)將步驟(1)制備的種子液接種到固體培養(yǎng)基中，26～30℃下恒溫培養(yǎng)；

(3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物用無菌水按質量比1：12～18的比例混合，過濾，將濾液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫26～30℃、相對濕度85％以上的發(fā)酵室中進行發(fā)酵培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述制備方法包括以下步驟：

(1)將哈茨木霉菌株SDL Tr35的孢子移植到液體培養(yǎng)基中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)2～3d得到種子液；液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀1g，硝酸鉀1g，VB₂0.2g，蒸餾水1000mL；

(2)將步驟(1)制備的種子液按質量比15％的比例接種到固體培養(yǎng)基中，28℃下振蕩培養(yǎng)3～5d；

(3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物用無菌水按質量比1：15的比例混合，過濾，將濾液按體積比15％～30％的比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫28℃、相對濕度85％以上的發(fā)酵室中發(fā)酵培養(yǎng)7～8d。

步驟(2)中的固體培養(yǎng)基由固料和無機鹽溶液組成，所述固料和無機鹽溶液的比例為質量比1：1.8；其中所述固料由質量比為50：35：15的玉米芯、小麥秸稈和牡丹籽殼組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液的組分及含量為：3.5％磷酸二氫鉀，0.05％硫酸鎂，0.5％硫酸鈣，4％硫酸銨，氯霉素0.05％，剩余為水。

步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基同步驟(2)的固體培養(yǎng)基。

并且，本發(fā)明還提供了一種用于防治油用牡丹根腐病、紅斑病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向發(fā)病的油用牡丹根部、葉片施用上述哈茨木霉菌株SDL Tr35或者上述生物防治制劑。

實驗表明，本發(fā)明的哈茨木霉菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、抗逆性強，在油用牡丹葉片、根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用前景。由該哈茨木霉制備的生物防治制劑，不僅能夠高效的防治油用牡丹病害，還能有效提高油用牡丹產(chǎn)量，是一種極具應用前景的生物防治制劑。該微生物制劑可以作為防治油用牡丹病害的生物農(nóng)藥或生物肥料，防治多種油用牡丹紅斑病、根腐病等。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。

實施例1

1、哈茨木霉菌(T.harzianum)SDL Tr35的分離與純化

本發(fā)明的哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35是從五蓮縣蘑菇上采用平板劃線法分離獲得的，分離方法為：

(1)木霉菌株的分離純化：取受害嚴重的蘑菇菌包，先用75％的酒精局部處理1min，再在超凈工作臺上用紫外燈處理20min后，用滅菌刀片切開處理部位，用接種針挑取少量木霉菌孢子，在PDA平板上劃線，定時觀察菌落生長情況。然后采用平板劃線法，純化木霉菌株，轉至PDA試管斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)油用牡丹根腐病、紅斑病高效拮抗木霉菌株的篩選

①初篩：采用對峙培養(yǎng)法，制備PDA平板，用打孔器在木霉菌、油用牡丹根腐病菌、紅斑病菌邊緣打取直徑為5mm的菌餅，分別移植在平板相對的兩側中央，28℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察木霉菌對病原菌的抑制作用。

②復篩：將篩選到的具有高效拮抗活性的木霉菌株進行復篩，主要是經(jīng)過耐溫性、耐酸堿性、耐藥性試驗，篩選到耐性較好的木霉菌株，進行盆栽防治試驗和田間試驗。

本發(fā)明人通過上述大量篩選工作得到一株能夠高效防治油用牡丹根腐病、紅斑病，且耐溫性、耐酸堿性、耐藥性較好的哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35。其實驗結果如下。

初篩實驗結果：對峙培養(yǎng)2d，SDL Tr35菌株和油用牡丹紅斑病菌、根腐病菌菌絲恰好接觸，SDL Tr35菌株以營養(yǎng)競爭為主。5d后，SDL Tr35菌絲已經(jīng)在油用牡丹紅斑病菌、根腐病菌的菌落表面生長，且已經(jīng)到達培養(yǎng)皿邊緣，而油用牡丹紅斑病菌、根腐病菌基本停止生長。

復篩實驗結果如下所示(表1)：

28℃下，72h SDL Tr35菌株已經(jīng)長滿培養(yǎng)皿，菌落直徑為8.53cm。該菌株的耐低溫能力較強，5℃下菌株11d時開始生長；在10℃和35℃下SDL Tr35菌落的特征和28℃下幾乎沒有區(qū)別。

SDL Tr35菌株耐酸性較好，具有一定的耐堿性。pH為5、6時，菌絲生長最快、產(chǎn)孢量最大；pH為4時，SDL Tr35菌株的菌絲生長速度、菌落形態(tài)基本接近于pH為6時；pH為9時，SDL Tr35菌絲生長速度和菌落形態(tài)沒有大的變化，但是pH為10時，菌落形態(tài)特點和菌絲生長規(guī)律有較大的變化。

表1SDL Tr35菌株對溫度、酸堿性和殺菌劑耐性

SDL Tr35菌株屬于中等耐藥性菌株，在含有0.01mg/L、0.1mg/L多菌靈的PDA平板上，菌絲生長速度和菌落形態(tài)影響不大，菌落直徑為8.50cm，在1mg/L的多菌靈平板上，菌株生長非常緩慢，但菌落形態(tài)發(fā)生改變，菌絲稀疏。

實驗證明，該哈茨木霉SDL Tr35在防治油用牡丹病害試驗中，對油用牡丹根腐病和紅斑病都顯示出非常高效的防治效果。因而，本發(fā)明的哈茨木霉是具有廣泛應用前景的哈茨木霉新菌株，可以用于制備防治油用牡丹病害的生物防治制劑。

2、菌株鑒定

(1)微生物學特性：在PDA平板上25℃培養(yǎng)3天，菌落圓形，直徑約8cm，中央灰白色帶墨綠色，邊緣白色，氣生菌絲較短。分生孢子梗產(chǎn)生側向分枝，分枝上輪生或對生短的產(chǎn)孢瓶體，瓶體與著生它們的分枝大致成直角；分生孢子單胞，球形，光滑。

(2)分子生物學特性：

菌株SDL Tr35的rDNA ITS包括18S區(qū)部分，ITS1、5.8S、ITS2的全序列及28S區(qū)部分序列片段(SEQ-1)：

5’-GAAGTAAAAAATCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCGGGTGGCCGTCTCCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAA-3’。

菌株SDL Tr35的分生孢子、產(chǎn)孢結構等特征分別符合Trichoderma harzianum種的描述，菌株SDL Tr35的rDNA ITS序列與GenBank中Trichoderma harzianum的序列HQ608036和序列EU280077相似性均為99％。鑒于以上結果，將菌株SDL Tr35鑒定為哈茨木霉Trichoderma harzianum。此菌株已于2012年10月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No.6693。

其中，PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g(去皮)，葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL。

實施例2

1、哈茨木霉菌發(fā)酵過程

普通培養(yǎng)保存培養(yǎng)基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀1g，硝酸鉀1g，VB₂0.2g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL；

實驗室液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀1g，硝酸鉀1g，VB₂0.2g，蒸餾水1000mL；

固體培養(yǎng)基配方(質量百分含量)：

固料：玉米芯50％，小麥秸稈35％，牡丹籽殼15％。

無機鹽溶液：3.5％磷酸二氫鉀，0.05％硫酸鎂，0.5％硫酸鈣，4％硫酸銨，氯霉素0.05％，剩余為水。

固液比為1:1.8(質量比)。

哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35大量固體發(fā)酵過程：

①菌種種子液培養(yǎng)：將哈茨木霉菌(T.harzianum)SDL Tr35從試管斜面中挑取少量孢子，移至液體培養(yǎng)基中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)2～3d，此為種子液；

②固體生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)：將種子液按15％的質量比接種到固體培養(yǎng)基(500mL三角瓶)中，28℃恒溫培養(yǎng)3～5d，中間多次振蕩；

③大量固體發(fā)酵：將②中固體培養(yǎng)的培養(yǎng)物用無菌水按質量比1:15稀釋，并用滅菌紗布過濾，出去粗渣，即為生產(chǎn)菌液，接種比按體積比20％接種于發(fā)酵培養(yǎng)基。將接種的原料置于發(fā)酵室(28℃和相對濕度85％以上)中發(fā)酵培養(yǎng)7～8d，期間要翻動3～5次，增加氧氣量，即可得到木霉菌原粉，其菌活為≥30億/g。

④制備可濕性粉劑：按質量比，哈茨木霉菌SDL Tr35原粉(菌活為30億/g)7，白炭黑38，葡萄糖41，淀粉10，濕潤劑十二烷基磺酸鈉5，分散劑NNO 2，CMC(羧甲基纖維素鈉)2，將上述原料混合均勻，控制加工溫度0-50℃，在生物質料粉碎機中，粉碎到150篩目以上水分控制在6-8％，得到2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑。

實施例3

本實施例提供了2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑對油用牡丹紅斑病防病增產(chǎn)的相關實驗。

1、供試藥劑

2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑(實施例2中制備)；

50％多菌靈可濕性粉劑(市售)。

2、供試作物與防治對象

供試作物為油用牡丹，品種為鳳丹；

防治對象為紅斑病。

3、試驗地情況

試驗地設在山東省菏澤市牡丹區(qū)牡丹研究所種植基地，該基地油用牡丹紅斑病近幾年發(fā)生嚴重，且防治困難，所有試驗小區(qū)栽培條件及管理措施一致，施藥時紅斑病處于發(fā)病初期。

4、試驗設計及安排

本試驗設2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑300倍、400倍、500倍以及50％多菌靈可濕性粉劑600倍液及不施藥清水作對照共5個處理，重復4次，共20個小區(qū)，各小區(qū)隨機排列，每個小區(qū)60株。施藥時間2015年3月29日，每隔7天施一次藥，共3次施藥，將植株葉片上下噴灑均勻，噴藥時用塑料布遮擋，噴藥器械為工農(nóng)-16型噴霧器。

5、試驗調查及計算方法

(1)氣象條件

第1次施藥(2015年3月29日)當日晴，風力2～3級，最高氣溫為19℃，最低氣溫為11℃，相對濕度為75％。第2次施藥(2015年4月6日)，晴，風力2級，最高氣溫為21℃，最低氣溫為10℃，相對濕度為70％；第3次施藥(2015年4月13日)，當日晴轉多云，風力2級，最高氣溫為20℃，最低氣溫為10℃，相對濕度為75％。

(2)藥效及安全性調查

藥效調查：最后一次施藥后14d進行調查。每小區(qū)采用5點取樣法，每點查2株，調查全部葉片，調查發(fā)病率，記錄病情級數(shù)并計算病情指數(shù)。

安全性調查：于第一次施藥后7d和14d觀察油用牡丹的安全性，如有藥害發(fā)生，詳細描述藥害癥狀并按藥害程度分級標準確定藥害程度。

分級方法(以葉片為單位)：

0級：無病斑

1級：莖基部10cm范圍內斑點數(shù)量在3個以下，上部莖有零星小點，全株25％以下葉片發(fā)病，平均每個復葉上的病斑數(shù)在2個以下，病斑不連成片。

3級：莖基部10cm范圍內有3～5個斑點，上部莖斑點稀疏；25％～50％葉片發(fā)病，平均每個復葉上有3～5個病斑。

5級：莖基部10cm范圍內有6～10個斑點，上部莖斑點較密；50％～75％葉片發(fā)病，平均每個復葉上有6～10個病斑；斑點密集，30％以上葉片枯焦。

7級：莖基部10cm范圍內有10個以上斑點，上部莖斑點密集；75％以上葉片發(fā)病，平均每個復葉上有10個以上病斑；斑點密集并相連成片，50％以上葉片枯焦。；

(3)調查時間和次數(shù)

施藥前調查病情基數(shù)，下次施藥前及末次施藥后10d調查防治結果。

(4)藥效計算方法

藥效按式(1)、(2)計算：

式中：CK₀——空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù)；

CK₁——空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)；

PT₀————藥劑處理后施藥前病情指數(shù)；

PT₁————藥劑處理后施藥后病情指數(shù)；

(5)對作物的直接影響

觀察藥劑對作物有無藥害，記錄藥害的類型和程度。

6、結果

(1)供試藥劑對油用牡丹紅斑病的防治效果

表2結果顯示，2億/g哈茨木霉可濕性粉劑對油用牡丹紅斑病具有較好的防治效果，其中2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑300倍的防治效果為78.25％，500倍的防治效果為74.61％，700倍的防治效果為68.59％，50％多菌靈可濕性粉劑對油用牡丹紅斑病為80.56％。2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑300倍防治效果與50％多菌靈可濕性粉劑600倍的防治效果在P<0.01水平上無顯著性差異，其次為500倍液，防治效果仍在70％以上。

表2各個處理后油用牡丹紅斑病的病情指數(shù)及防治效果

注：處理1為2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑300倍，處理2為500倍，處理3為700倍，處理4為50％多菌靈600倍。

(2)油用牡丹安全性調查：經(jīng)施藥7d和14d觀察，各藥劑處理區(qū)與對照區(qū)相比，油用牡丹生長正常，無藥害產(chǎn)生，說明哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑在供試濃度對油用牡丹安全。

實施例4

本實施例提供了哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑對油用牡丹根腐病防病增產(chǎn)的相關實驗。

1)供試藥劑

2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑；

70％代森錳鋅可濕性粉劑(市售)。

2)供試作物與防治對象：

供試作物為油用牡丹，品種為鳳丹；

防治對象：根腐病。

3)試驗地情況

試驗地設在山東省菏澤市牡丹區(qū)油用牡丹種植基地，該地塊根腐病近幾年發(fā)生嚴重，所有試驗小區(qū)栽培條件及管理措施一致，施藥時根腐病處于發(fā)病初期。

4)試驗設計及安排

本試驗設2億/g哈茨木霉SDL Tr35可濕性粉劑300倍、500倍、700倍、70％代森錳鋅可濕性粉劑700倍液及不施藥清水作對照共4個處理，重復4次，共20個小區(qū)，各小區(qū)隨機排列，每個小區(qū)60株。施藥方法：在牡丹周圍挖10cm深以上的穴，按使用劑量稀釋1000倍，均勻倒入穴中，埋土，共施藥4次，時間為2015年3月31日、4月29日、6月2日、6月30日，9月13日檢查藥效。

5)試驗調查及計算方法

(1)氣象條件

第1次施藥(2015年3月31日)當日晴，風力2級，最高氣溫為19℃，最低氣溫為10℃，相對濕度為75％。第2次施藥(2015年4月29日)，晴，風力2～3級，最高氣溫為21℃，最低氣溫為11℃，相對濕度為70％；第3次施藥(2015年6月2日)，當日晴轉多云，風力3～4級，最高氣溫為24℃，最低氣溫為13℃，相對濕度為65％。第4次施藥(2015年6月30日)，當日多云，風力3級，最高氣溫27℃，最低氣溫16℃，相對濕度75％。

(2)藥效及安全性調查

藥效調查：第1次施藥后第7d和最后一次施藥后14d進行調查。每小區(qū)采用5點取樣法，每點查20株，調查油用牡丹葉片、根部情況，調查發(fā)病率。

分級方法：

0級：根部健康；

1級：有25％以下的根腐爛，主根發(fā)病很輕；

3級：有25％-50％的根腐爛，主根發(fā)病較輕；

5級：有50％-75％的根腐爛，主根發(fā)病較重；

7級：有75％以上的根腐爛，主根腐爛，甚至全株死亡；

安全性調查：于第一次施藥后7d和14d觀察油用牡丹的安全性。

(3)調查時間和次數(shù)

施藥前調查病情基數(shù)，下次施藥前及末次施藥后10d調查防治結果。

(4)藥效計算方法

藥效按式(1)、(2)計算：

式中：CK₀——空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù)；

CK₁——空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)；

PT₀————藥劑處理后施藥前病情指數(shù)；

PT₁————藥劑處理后施藥后病情指數(shù)；

(5)對作物的直接影響

觀察藥劑對作物有無藥害，記錄藥害的類型和程度。并記錄對作物的其他影響。

6)結果

(1)供試藥劑對油用牡丹根腐的防治效果

表3結果顯示，2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑300倍、400倍和500倍對油用牡丹根腐病的防治分別為78.06％、72.96％和71.86％，顯著高于對照處理70％代森錳鋅可濕性粉劑600倍的防治效果。

表3各處理防治油用牡丹根腐病試驗效果表

注：處理1為2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑300倍，處理2為400倍，處理3為500倍，處理4為70％代森錳鋅600倍。

(2)安全性調查：經(jīng)施藥7d和14d觀察，各藥劑處理區(qū)與對照區(qū)相比，油用牡丹生長正常，無藥害產(chǎn)生，說明2億/g哈茨木霉SDL Tr35可濕性粉劑供試濃度對油用牡丹安全。從防治效果來看，發(fā)病初期采用SDL Tr35可濕性粉劑可以有效的控制油用牡丹根腐病的發(fā)生，且對油用牡丹安全性較高，不存在農(nóng)藥殘留問題。建議在油用牡丹根腐病發(fā)病初期采用2億/g哈茨木霉SDL Tr35可濕性粉劑300～500倍進行防治。

(3)哈茨木霉原粉對油用牡丹增產(chǎn)效果

表4 2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑對油用牡丹增產(chǎn)效果分析表

注：小區(qū)面積60株；處理1為哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑300倍，處理2為400倍，處理3為500倍，處理4為對照組。

由表4結果可知，在油用牡丹上穴施2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑，300倍液～400倍液處理區(qū)比對照區(qū)每畝牡丹籽增產(chǎn)分別為18kg、13.78kg，增產(chǎn)率分別為11.04％、8.45％；效果十分明顯。說明2億/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可濕性粉劑的防病增產(chǎn)作用非常明顯。

因此，從病情指數(shù)和防治效果來看，哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35對油用牡丹根腐病具有較好的防治效果，防效可達70％以上，明顯好于對照藥劑，差異顯著。從油用牡丹增產(chǎn)效果看，哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35對油用牡丹具有明顯的促生增產(chǎn)效果，300倍液處理后增產(chǎn)率為11.04％。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省林業(yè)科學研究院

<120> 一株哈茨木霉及其在油用牡丹上的應用

<130> 0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 644

<212> DNA

<213> 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）SDL Tr35的rDNA ITS序列

<400> 1

gaagtaaaaa atcgtaacaa ggtctccgtt ggtgaaccag cggagggatc attaccgagt 60

ttacaactcc caaacccaat gtgaacgtta ccaaactgtt gcctcggcgg gatctctgcc 120

ccgggtgcgt cgcagccccg gaccaaggcg cccgccggag gaccaaccaa aactcttttt 180

gtataccccc tcgcgggttt tttataatct gagccttctc ggcgcctctc gtaggcgttt 240

cgaaaatgaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc 300

agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg 360

cacattgcgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgtcc gagcgtcatt tcaaccctcg 420

aacccctccg gggggtcggc gttggggatc ggccctccct tagcgggtgg ccgtctccta 480

aatacagtgg cggtctcgcc gcagcctctc ctgcgcagta gtttgcacac tcgcatcggg 540

agcgcggcgc gtccacagcc gttaaacacc caacttctga aatgttgacc tcggatcagg 600

taggaatacc cgctgaactt aagcatatca ataagccgga ggaa 644