本發(fā)明涉及新的吡啶并嘧啶化合物及其藥物組合物、特別是作為CDK4/6 抑制劑的吡啶并嘧啶化合物及其藥物組合物。本發(fā)明還涉及這些化合物和組合物在治療CDK4/6過(guò)度增殖性紊亂，如癌癥中的用途。
背景技術(shù)：
細(xì)胞的生命始于細(xì)胞周期，細(xì)胞周期的正常運(yùn)行依賴(lài)于精細(xì)的調(diào)控機(jī)制。已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（cyclin-dependent kinase, CDK）是細(xì)胞周期調(diào)控的核心。CDKs是一類(lèi)絲氨酸（Ser）/蘇氨酸（Thr）激酶，作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，和周期素（cyclin）形成的CDK-cyclin復(fù)合物，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、休眠或者進(jìn)入凋亡。
研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控中CDKs的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。約 90% 的腫瘤存在CDKs活性增強(qiáng)，因此，CDKs的調(diào)控異常成為腫瘤發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志。小分子CDK抑制劑可以有效的抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。也可以用于治療心血管障礙以及多種感染劑導(dǎo)致的疾病，包括真菌、原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)和DNA與RNA病毒。同時(shí)，選擇性CDK小分子抑制劑能夠改善各種自身免疫障礙的后果等。因此，靶向CDK4/6蛋白激酶藥物的研發(fā)是意義重大的領(lǐng)域。
關(guān)于細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶小分子抑制劑已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道[Mol Cancer Ther, 2004, 3, 1427-38; Breast Cancer Res, 2009, 11, R77; Oncol Lett, 2014, 7, 1673-1678]。本發(fā)明是在已有發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成的靶向CDK激酶的小分子抑制劑，該系列化合物具有治療多種疾病的潛力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的化合物是CDK4/6 抑制劑，可用于治療受CDK4/6 介導(dǎo)的疾病和紊亂，例如癌癥、包括套細(xì)胞淋巴瘤、脂肉瘤、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、鱗狀細(xì)胞食管癌和乳癌。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的化合物或包含本發(fā)明的化合物的藥物組合物來(lái)治療與其有關(guān)的紊亂。
本發(fā)明涉及新的具有式(I) 的吡啶并嘧啶化合物及其鹽、包括可藥用鹽：
其中：
虛線代表任選的鍵；
X1、X2和X3各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷氧基烷基、CN、NO2、OR5、NR5R6、CO2R5、COR5、S(O)nR5、CONR5R6、NR5COR6、NR5SO2R6、SO2NR5R6和P(O)(OR5)(OR6)；其條件是X1、X2和X3至少有一個(gè)必須是氫；
n＝0-2；
R1選自H、 F、 Cl、 -CH3、 -CFH2、CF2H 、CF3、C1-C6 烷基、C1-C6 鹵代烷基、C1-C6羥基烷基或C3-C7 環(huán)烷基；
R2 選自H、鹵素、 C1-C6 烷基、 C3-C7 環(huán)烷基、 C1-C8 烷氧基、C1-C8 烷氧基烷基、C1-C8 鹵代烷基、-CN、COR5、 CONR5R6、-B(OR5)2 ；
R3 選自C1-C6 烷基、 C3-C7 環(huán)烷基、C3-C7 雜環(huán)烷基；
R4 選自NR5R6, C1-C6烷基、C3-C7 環(huán)烷基、 C1-C8 烷氧基、C1-C8烷氧基烷基、C1-C8鹵代烷基、烷氨基；
R1和R2可以構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)基團(tuán)，含有3-7個(gè)環(huán)成員，優(yōu)選5-6個(gè)環(huán)成員，其中至多四個(gè)可以任選地被獨(dú)立選自氧、硫和氮的雜原子代替，其中該碳環(huán)基團(tuán)是未取代的或者被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)基團(tuán)取代，取代基獨(dú)立地選自鹵素、羥基、羥基烷基、腈、低級(jí)C1-C8烷基、低級(jí)C1-C8烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、三氟甲基、N-羥基乙酰胺、三氟甲基烷基、氨基及單或二烷基氨基、(CH2)mC(O)NR5R6和O(CH2)mC(O)OR5，條件是碳環(huán)中有至少一個(gè)碳原子，并且如果有兩個(gè)或多個(gè)環(huán)氧原子，那么該環(huán)氧原子不是彼此相鄰的；
R4和X1、X2與X3之一可以構(gòu)成一個(gè)芳族環(huán)，含有至多三個(gè)獨(dú)立選自氧、硫和氮的雜原子，并且任選地被至多4個(gè)基團(tuán)取代，取代基獨(dú)立地選自鹵素、羥基、羥基烷基、烷基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、氨基烷基羰基、三氟甲基、三氟甲基烷基、三氟甲基烷基氨基烷基、氨基、單或二烷基氨基、N-羥基乙酰氨基、芳基、雜芳基、羧基烷基、腈、NR7SO2R8、C(O)NR7R8、NR7C(O)R8、C(O)OR7、C(O)NR7SO2R8、(CH2)mS(O)nR7、(CH2)m-雜芳基、O(CH2)m-雜芳基、(CH2)mC(O)NR7R8、O(CH2)mC(O)OR7、(CH2)mSO2NR7R8和C(O)R7；
R5和R6獨(dú)立地是氫、C1-C8烷基、C2-C8鏈烯基、C2-C8炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基或雜芳基烷基；或者 R5和R6當(dāng)附著于同一氮原子時(shí)，與它們所附著的氮一起構(gòu)成一個(gè)雜環(huán)的環(huán)，含有3-8個(gè)環(huán)成員，其中至多四個(gè)成員可以任選地被獨(dú)立選自氧、硫、S(O)、S(O)2和氮的雜原子代替，條件是雜環(huán)中至少有一個(gè)碳原子，并且如果有兩個(gè)或多個(gè)環(huán)氧原子，該環(huán)氧原子不是彼此相鄰的，其中該雜環(huán)基團(tuán)是未取代的或者被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)基團(tuán)取代，取代基獨(dú)立地選自鹵素、羥基、羥基烷基、烷基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、氨基烷基羰基、三氟甲基、三氟甲基烷基、三氟甲基烷基氨基烷基、氨基、腈、單或二烷基氨基、N-羥基乙酰氨基、芳基、雜芳基、羧基烷基、NR7SO2R8、C(O)NR7R8、NR7C(O)R8、C(O)OR7、C(O)NR7SO2R8、(CH2)mS(O)nR7、(CH2)m-雜芳基、O(CH2)m-雜芳基、(CH2)mC(O)NR7R8、O(CH2)mC(O)OR7和(CH2)SO2NR7R8；
R7和R8獨(dú)立地是氫、C1-C8烷基、C2-C8鏈烯基、C2-C8炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基或雜芳基烷基；或者 R7和R8當(dāng)附著于同一氮原子時(shí)，可以與它們所附著的氮一起構(gòu)成一個(gè)雜環(huán)的環(huán)，含有3-8個(gè)環(huán)成員，其中至多四個(gè)成員任選地是獨(dú)立選自氧、硫、S(O)、S(O)2和氮的雜原子，條件是雜環(huán)中至少有一個(gè)碳原子，并且如果有兩個(gè)或多個(gè)環(huán)氧原子，該環(huán)氧原子不是彼此相鄰的，其中該雜環(huán)基團(tuán)是未取代的或者被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)基團(tuán)取代，取代基獨(dú)立地選自鹵素、羥基、羥基烷基、烷基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、氨基烷基羰基、三氟甲基、三氟甲基烷基、三氟甲基烷基氨基烷基、氨基、腈、單或二烷基氨基、N-羥基乙酰氨基、芳基、雜芳基、羧基烷基；及其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酰胺和前體藥物。
式（I）化合物可能含有手性中心，因此可能存在不同的對(duì)映體和非對(duì)映體形式。本發(fā)明涉及式（I）化合物的所有光學(xué)異構(gòu)體和所有立體異構(gòu)體，包括這類(lèi)化合物的外消旋混合物和個(gè)別的對(duì)映體及非對(duì)映體，及其混合物，以及分別含有或者采用它們的如上所定義的所有藥物組合和治療方法。
在上述化合物的定義中，所用術(shù)語(yǔ)不論單獨(dú)使用還是用在復(fù)合詞中，代表如下取代基：
鹵素為氟、氯、溴或碘。
烷基為1至10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。
鏈烯基為具有2至8個(gè)碳原子并可在任何位置上存在至少一條雙鍵的直鏈與支鏈烴基。術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”包括環(huán)烯基和雜鏈烯基，其中1至3個(gè)選自O(shè)、S、N或取代的氮原子可以代替碳原子。
炔基為具有2至8個(gè)碳原子并可在任何位置上存在至少一條三鍵的直鏈與支鏈烴基。
環(huán)烷基為3至8個(gè)碳原子的單環(huán)或多環(huán)烴基。這類(lèi)基團(tuán)可以被諸如氟、氯、溴、碘、羥基、酮基、氨基、烷基和二烷基氨基等基團(tuán)取代。
雜環(huán)基為攜帶至少一個(gè)選自O(shè)、S、N或取代的氮原子的環(huán)烷基。這類(lèi)基團(tuán)可以被諸如氟、氯、溴、碘、羥基、酮基、氨基、烷基和二烷基氨基等基團(tuán)取代。
烷氧基為1至10個(gè)碳原子并且通過(guò)氧原子連接的直鏈或支鏈烷基。
鹵代烷基為1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，在這些烷基上的氫原子可部分或全部被鹵原子取代。
酰基為通過(guò)羰基連接的具有1至10個(gè)碳原子的烷基或芳基，其中烷基可以部分被NR4R5或者羧基或雜環(huán)基取代。
雜芳基表示一個(gè)或多個(gè)5-、6-或7-元的芳香族環(huán)系，至少含有一個(gè)至多含有四個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子。優(yōu)選的雜芳基是吡啶。
芳基表示芳基碳環(huán)基團(tuán)，具有單一環(huán)、多個(gè)環(huán)或多個(gè)稠環(huán)，其中至少一個(gè)是芳族的，它們可以被鹵素、烷基、烷氧基、烷硫基、三氟甲基、酰氧基、芳基、雜芳基、和羥基單-、二-、三-取代。優(yōu)選苯基。
癌癥包括但不限于下列癌癥：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮頸癌、食道癌、睪丸癌、胃癌、皮膚癌、肺癌、骨癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、膽道癌、小腸癌、結(jié)腸-直腸癌、大腸癌、直腸癌、腦與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌癥、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、大細(xì)胞癌、腺癌、腺瘤、濾泡癌、表皮樣癌、精原細(xì)胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌、腎癌、骨髓障礙、淋巴障礙、何杰金氏病、毛發(fā)細(xì)胞癌和白血病。
優(yōu)選地，X1、X2或X3之一是氫、鹵素、烷基。
最優(yōu)選地，X1、X2和X3都是氫。
優(yōu)選地R1是氫、鹵素、烷基。
更優(yōu)選地，R1是烷基。
最優(yōu)選地，R1是甲基。
優(yōu)選地，R2是H、鹵素、 C1-C6 烷基、 C3-C7 環(huán)烷基、 C1-C8 烷氧基、C1-C8 烷氧基烷基、C1-C8 鹵代烷基、-CN、COR5、 CONR5R6、-B(OR5)2。
更優(yōu)選地，R2是H、鹵素、 C1-C6 烷基、COR5、 CONR5R6。
最優(yōu)選地，R2是C(O)CH3和B(OH)2。
優(yōu)選地，R3是C1-C6 烷基、 C3-C7 環(huán)烷基、C3-C7 雜環(huán)烷基。
更優(yōu)選地，R3是C3-C7 環(huán)烷基。
最優(yōu)選地，R3是環(huán)戊基。
優(yōu)選地，R4是NR5R6, C1-C6烷基、C3-C7 環(huán)烷基、 C1-C8 烷氧基、C1-C8烷氧基烷基、C1-C8 鹵代烷基。
更優(yōu)選地，R4是NR5R6、C1-C8 烷氧基。
最優(yōu)選地，R4是而取代的胺。
優(yōu)選地，R5和R6是氫、C1-C8烷基、C2-C8鏈烯基、C2-C8炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基或雜芳基烷基。
進(jìn)一步優(yōu)選地，R5和R6與它們附著的氮原子一起構(gòu)成一個(gè)含有3至8個(gè)成員的碳環(huán)，至多四個(gè)成員是雜原子。
更優(yōu)選地，R5和R6與它們附著的氮原子一起構(gòu)成一個(gè)含有5或6個(gè)成員的碳環(huán)，至多兩個(gè)成員是雜原子。
最優(yōu)選地，R5和R6與它們附著的氮原子一起構(gòu)成哌嗪環(huán)。
優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方式包括但不限于下面列舉的化合物：
2-(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5-（哌嗪-1-基）吡啶 1-氧化物；
2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基]-5-（4-甲基哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物；
2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-[2-（二甲基氨基）乙氧基]吡啶-1-氧化物；
2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-甲氧基吡啶-1-氧化物；
2-((6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5-（哌嗪-1-基）吡啶 1-氧化物鹽酸鹽；
2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基]-5-（4-甲基哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物鹽酸鹽；
2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-[2-（二甲基氨基）乙氧基]吡啶-1-氧化物鹽酸鹽；
2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-甲氧基吡啶-1-氧化物鹽酸鹽；
2-[(6-二羥硼基-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-（哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物；
2-[(6-二羥硼基-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-（哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物鹽酸鹽。
本發(fā)明所述2-( N-氧化吡啶-2基氨基)-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮類(lèi)化合物可以根據(jù)常規(guī)藥物配制技術(shù)與藥物載體或賦形劑(例如藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑)混合形成藥物制劑。可以將所述吡啶并嘧啶化合物作為活性成分混合在任何常用的口服劑型中，所述口服劑型包括片劑、膠囊劑和液體制劑(例如酏劑和混懸劑)，其中包含著色劑、矯味劑、穩(wěn)定劑和掩蓋味道的物質(zhì)。對(duì)于混合口服劑型來(lái)說(shuō)，所述吡啶并嘧啶化合物作為活性成分可以與各種普通片劑材料(例如淀粉、碳酸鈣、乳糖、蔗糖和磷酸二鈣)混合以助于壓片和裝入膠囊?？梢詫⑺鲞拎げ⑧奏せ衔镌谒帉W(xué)上可接受的無(wú)菌液體載體例如無(wú)菌水、無(wú)菌有機(jī)溶劑或者兩者的混合物中溶解或混懸。液體載體可以是適合注射劑的載體，比如生理鹽水、丙二醇或者聚乙二醇水溶液。在其他情況下，還可以將微粉化的活性成分分散在淀粉或羧甲基纖維素鈉的水溶液中或分散在適當(dāng)?shù)挠?例如花生油)中來(lái)制得。液體藥物制劑(指無(wú)菌溶液或混懸劑)可以用于靜脈注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射或者皮下注射。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含至少一種作為活性成分的本發(fā)明所述吡啶并嘧啶化合物。除此之外，所述藥物組合物還可以包含一種或多種無(wú)機(jī)或有機(jī)、固體或液體的藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)給藥至動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi))時(shí)生理學(xué)上可耐受且通常不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏或類(lèi)似的不良反應(yīng)(例如頭暈等)的添加劑或組合物。藥物載體和賦形劑可以包括但不限于稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、甘露糖和/或甘油；潤(rùn)滑劑；聚乙二醇；粘合劑，例如硅酸鋁鎂、淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且，如果需要的話(huà)，還包括崩解劑，例如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鹽如海藻酸鈉；和/或吸附劑、著色劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、矯味劑和甜味劑。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。
本文所用的縮略語(yǔ)通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，或者可以是根據(jù)基礎(chǔ)知識(shí)易于理解的。
在本發(fā)明化合物的制備中所采用的起始原料是已知的、能夠根據(jù)已知方法制備的或者可商購(gòu)獲得的。
本發(fā)明還涉及新的中間體和/或起始原料。特別優(yōu)選與實(shí)施例中提到的那些相同或者相似的反應(yīng)條件和新中間體。
中間體和終產(chǎn)物都可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行后處理和/或純化，所述常規(guī)方法包括調(diào)節(jié) pH、萃取、過(guò)濾、干燥、濃縮、色譜法、研磨、結(jié)晶等。
另外，本發(fā)明化合物還可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法或者本文所述方法的變通方法進(jìn)行制備。
下列實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，不以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例1 2-((6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5-（哌嗪-1-基）吡啶 1-氧化物的制備。
步驟1.1：2-[（6-溴-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-（4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物的制備。
在50mL兩口瓶中加入2-氨基-5-（4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物（429mg，1.46mmol）和15mL 1,4-二氧六環(huán)，滴加LHMDS四氫呋喃后攪拌15分鐘。加入6-溴-2-氯-8-環(huán)戊基-5-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮（500mg, 1.46mmol）后升溫至80度攪拌4小時(shí)。1M 碳酸氫鈉淬滅反應(yīng)，濃縮后柱層析得470mg黃色固體，產(chǎn)率53% 。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.60 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.62 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 4.91 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 3.57 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.02 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.52 (s, 3H), 2.45-2.34 (m, 2H), 2.13-2.03 (m, 2H), 2.03-1.92 (m, 2H), 1.91-1.77 (m, 2H), 1.47 (s, 9H)。
步驟1.2：5-（4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基）-2-{[6-(1-丁氧烯基）-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}吡啶-1-氧化物的制備。
在50mL兩口瓶中加入2-[（6-溴-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-（4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物（470 mg，0.78 mmol）抽真空充氬氣。加入正丁醇8mL、丁基乙烯基醚（305μL，2.35mmol）、DIPEA（337μL，1.96mmol）、醋酸鈀（7mg, 0.03mmol）、雙(2-二苯基磷苯基)醚（21mg, 0.04mmol）后升溫至100度攪拌過(guò)夜。低壓蒸干溶劑后硅膠柱層析得470mg 5-（4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基）-2-{[6-(1-丁氧烯基）-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}吡啶-1-氧化物為黃色固體，產(chǎn)率96%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.62 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.98- 6.85 (m, 2H), 6.62 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.89 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.14-3.94 (m, 3H), 3.86 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 3.57 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.02 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.51 (s, 3H), 2.39 (dd, J = 12.9, 6.8 Hz, 2H), 2.14-2.01 (m, 2H), 2.02-1.89 (m, 2H), 1.84 (td, J = 7.0, 6.5, 4.8 Hz, 2H), 1.74-1.55 (m, 2H), 1.47 (s, 12H), 0.98 (t, J = 8.0 Hz, 3H)。
步驟1.3：2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基]-5-（哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物的制備。
在25mL單口瓶中加入5-（4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基）-2-{[6-(1-丁烯基）-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}吡啶-1-氧化物（470mg, 0.76mmol）及三氯甲烷15mL，滴加濃鹽酸10mL，完畢后60度攪拌過(guò)夜。反應(yīng)完畢后，濃縮，硅膠柱層析純化，得200mg 2-[(6-乙酰基-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基]-5-（哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物，產(chǎn)率=56.9%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.66 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.86 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.87 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 3.57 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.89 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.14- 2.01 (m, 2H), 2.02-1.89 (m, 2H), 1.89-1.75 (m, 2H)。
實(shí)施例2 2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基]-5-（4-甲基哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物的制備。
在25mL兩口瓶中加入 2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基]-5-（哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物(20mg, 0.04mmol)，甲酸3mL和甲醛水溶液（30-40%）200μL。升溫至80度攪拌5小時(shí)，減壓除去溶劑，硅膠柱層析純化，得15mg 2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基]-5-（4-甲基哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物，產(chǎn)率=72.8%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.66 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.87 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.87 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 3.20 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.95 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.60 (s, 3H), 2.52-2.31 (m, 8H), 2.15-2.02 (m, 2H), 2.01-1.89 (m, 2H), 1.89-1.74 (m, 2H)。
實(shí)施例3 2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-甲氧基吡啶-1-氧化物的制備。
步驟3.1：2-[(6-溴-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-甲氧基吡啶-1-氧化物的制備。
參照步驟1.1，產(chǎn)率61%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.64 (s, 1H), 7.59 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.91 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.87 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 4.17 (s, 3H), 2.52 (s, 3H), 2.43-2.21 (m, 2H), 2.14 -1.83 (m, 4H), 1.79-1.53 (m, 2H)。
步驟3.2：2-{[6-(丁氧烯基)-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}-5-甲氧基吡啶-1-氧化物的制備。
參照步驟1.2，產(chǎn)率90%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.63 (s, 1H), 7.59 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.83 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.89 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 4.17 (s, 3H), 4.12-3.96 (m, 3H), 3.87 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.51 (s, 3H), 2.49- 2.33 (m, 2H), 2.16 -1.93 (m, 4H), 1.93-1.76 (m, 2H), 1.64 (p, J = 7.4 Hz, 2H), 1.55-1.37 (m, 2H), 0.98 (t, J = 8.0 Hz, 3H)。
步驟3.3：2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-甲氧基吡啶-1-氧化物的制備。
參照步驟1.3，產(chǎn)率61%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.71 (s, 1H), 7.59 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.92 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.86 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 4.17 (s, 3H), 2.43 (d, J = 3.4 Hz, 6H), 2.39-2.18 (m, 2H), 2.08-1.85 (m, 4H), 1.70 (dddd, J = 11.5, 6.9, 4.9, 2.6 Hz, 2H)。
實(shí)施例4：2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-[2-（二甲基氨基）乙氧基]吡啶-1-氧化物的制備。
步驟4.1：2-[(6-溴-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-[2-（二甲基氨基）乙氧基]吡啶-1-氧化物的制備。
參照步驟1.1，產(chǎn)率55%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.60 (s, 1H), 7.59 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.84 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.91 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.03 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 3.08 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 2.52 (s, 3H), 2.45 (s, 6H), 2.43-2.35 (m, 2H), 2.17-1.94 (m, 4H), 1.92-1.76 (m, 2H)。
步驟4.2：2-{[6-(丁烯氧基)-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}-5-[2-（二甲基氨基）乙氧基]吡啶-1-氧化物的制備。
參照步驟1.2，產(chǎn)率90%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.62 (s, 1H), 7.59 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.83 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.89 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.18-3.97 (m, 6H), 3.87 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 3.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.51 (s, 3H), 2.45 (s, 8H), 2.18-1.95 (m, 4H), 1.84 (s, 2H), 1.64 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.55-1.38 (m, 2H), 0.98 (t, J = 8.0 Hz, 3H)。
步驟4.3：2-[(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-[2-（二甲基氨基）乙氧基]吡啶-1-氧化物的制備。
參照步驟1.3，產(chǎn)率62%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.67 (s, 1H), 7.59 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 6.84 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.88 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 4.03 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.52-2.30 (m, 14H), 2.18-1.94 (m, 4H), 1.94-1.75 (m, 2H)。
實(shí)施例5：2-[(6-二羥硼基-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-（哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物的制備。
步驟5.1：5-[4-(叔丁氧羰基）哌嗪-1-基]-2-{[8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環(huán)-2-基）-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}吡啶-1-氧化物的制備。
將2-[（6-溴-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-（4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物（0.15g, 0.26mmol）、聯(lián)硼酸頻那醇酯（0.09g, 0.38mmol）、醋酸鉀（0.08g, 077mmol）加入到25 mL雙口瓶中抽真空充氬氣三次。氬氣保護(hù)下加入DMSO（10mL）和[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物（20.96mg, 0.01mmol）后升溫至100攝氏度攪拌過(guò)夜。冷卻至室溫加水稀釋?zhuān)宜嵋阴ポ腿∪危喜⒂袡C(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得粗品。硅膠柱層析得63mg 5-[4-(叔丁氧羰基）哌嗪-1-基]-2-{[8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環(huán)-2-基）-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}吡啶-1-氧化物為黃色固體，產(chǎn)率38.9%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.11 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.27 (s, 1H), 5.97 – 5.85 (m, 1H), 3.53 (t, 4H), 3.06 (t, 4H), 2.54 (s, 3H), 2.27 – 2.17 (m, 2H), 2.09 – 1.98 (m, 2H), 1.87 – 1.75 (m, 2H), 1.66 – 1.54 (m, 2H), 1.41 (s, 9H), 1.22 – 1.09 (m, 12H)。
步驟5.2：2-[(6-二羥硼基-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-（哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物的制備。
將5-[4-(叔丁氧羰基）哌嗪-1-基]-2-{[8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環(huán)-2-基）-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}吡啶-1-氧化物（63mg, 0.10mmol）溶于20mL 二氯甲烷中，加入4mL濃鹽酸室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。減壓除去溶劑，加入飽和碳酸氫鈉溶液攪拌15分鐘，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑得2-[(6-二羥硼基-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基）氨基]-5-（哌嗪-1-基）吡啶-1-氧化物42mg為黃色固體，產(chǎn)率92.8%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.06 (s, 1H), 8.96 (s, 1H), 8.02 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 9.1, 3.1 Hz, 1H), 6.03 – 5.81 (m, 1H), 3.07 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.87 (t, 4H), 2.57 (s, 3H), 2.27 – 2.11 (m, 3H), 1.97 – 1.84 (m, 3H), 1.83 – 1.70 (m, 2H), 1.66 – 1.49 (m, 3H)。
生物學(xué)測(cè)定。
CDK4/6 酶活性測(cè)定。
采用Caliper Mobility Shift Assay方法測(cè)試化合物對(duì)CDK4/6酶的抑制活性，該技術(shù)將毛細(xì)管電泳的基本理念應(yīng)用到微流體環(huán)境中，在不加入中止試劑的情況下檢測(cè)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的底物是帶有熒光標(biāo)記的多肽，在反應(yīng)體系中酶的作用下，底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其所帶的電荷也發(fā)生了相應(yīng)的變化， Mobility-Shift Assay利用底物和產(chǎn)物所帶電荷的不同，將二者進(jìn)行分離，并分別進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)材料：CDK4/CycD3 (Carna, Cat.No 04-105, Lot. No 10CBS-0429 C, GST-CDK4(1-303end)/GSTCycD3(1-292end)); Peptide FAM-P8 (GL Biochem, Cat. No. 112396, Lot. No. P100804-XZ112396); ATP (Sigma, Cat. No. A7699-1G, CAS No. 987-65-5); DMSO (Sigma, Cat. No. D2650, Lot. No. 474382)；EDTA (Sigma, Cat. No. E5134, CAS No. 60-00-4); 96-well plate (Corning, Cat. No. 3365, Lot. No. 22008026); 384-well plate (Corning, Cat. No. 3573, Lot. No. 12608008)。
實(shí)驗(yàn)方法：測(cè)定Mobility Shift上的ATP表觀Km， 384微孔板中加入5μL/孔的2× enzyme & peptide混合液。加入5μL/孔三倍梯度稀釋的2×ATP溶液，啟動(dòng)反應(yīng)。室溫離心1min，放入23°C培養(yǎng)箱反應(yīng)60min后，加入5 uL/孔3×stop buffer（100 mM HEPES, pH 7.5；0.015% Brij-35；0.2% Coating Reagent #3；50 mM EDTA）終止反應(yīng)，置于Caliper EZ Reader I上進(jìn)行檢測(cè)；在96微孔板中對(duì)化合物在5μM濃度進(jìn)行4倍梯度稀釋, 加入100μL ,100％DMSO作為無(wú)化合物無(wú)激酶對(duì)照組，取10μL化合物加入到一個(gè)新的96孔微孔板，再加入90μL, 1×kinase base buffer (20 mM HEPES, pH 7.5 ; 0.01% Triton X-100; 10 mM MgCl2; 2 mM DTT )，將該板放置在搖床上10分鐘以將化合物混勻；每孔取5μL混合液加入到384孔微孔板中。384孔微孔板各孔中加10μL，2.5×enzyme solution。室溫下孵育10分鐘后再在各孔中再加10μL, 2.5×的多肽溶液(1×kinase base buffer中加入FAM-labeled peptide 和 ATP）。激酶反應(yīng)，指定時(shí)間停止，孵育30℃。加25μL stop buffer終止反應(yīng)。置于Caliper EZ Reader I上進(jìn)行檢測(cè)。
表1為化合物對(duì)CDK4激酶的抑制效力。
表2為化合物對(duì)CDK6激酶的抑制效力。
表1
表2