本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種波賽鏈霉菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蒽環(huán)類抗生素是應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤抗生素。其中表柔紅霉素是重要的抗腫瘤藥物，同時也是工業(yè)生產(chǎn)表阿霉素的重要前體。表阿霉素與阿霉素相比較，抗腫瘤活性相當(dāng)，但是心臟毒性和骨髓毒性比阿霉素低，并且隨著新劑型的發(fā)展、同其它抗腫瘤藥物新組合的應(yīng)用使得表阿霉素在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。工業(yè)生產(chǎn)表阿霉素一般以柔紅霉素為原料，采用化學(xué)半合成的方法生產(chǎn)。專利US5874550披露了一種表阿霉素的合成方法，首先通過發(fā)酵得到柔紅霉素，然后將柔紅霉素4號位的羥基氧化成酮基，再將這個酮基立體特異性地還原得到表柔紅霉素，通過表柔紅霉素最終合成得到表阿霉素。從柔紅霉素到表柔紅霉素再到表阿霉素，需要經(jīng)過多步條件要求苛刻的反應(yīng)過程，工藝復(fù)雜，技術(shù)難度大，環(huán)保成本高。如果采用微生物發(fā)酵方法直接生產(chǎn)表柔紅霉素可簡化表阿霉素的合成步驟，大大節(jié)約成本，提高效率。

表柔紅霉素結(jié)構(gòu)如下：

目前已有報道表柔紅霉素的產(chǎn)生菌種。國際專利申請WO 2006111561中公開了通過對鏈霉菌屬中波賽鏈霉菌的菌株進行誘變處理，獲得一株表柔紅霉素生產(chǎn)菌株，其發(fā)酵液中表柔紅霉素產(chǎn)量在100mg/L以上。德國的W.C.賀利氏有限公司在美國專利申請US20100143977中公開了一種由波賽鏈霉菌經(jīng)遺傳修飾的基因工程菌株，其發(fā)酵液中表柔紅霉素產(chǎn)量在500mg/L以上。但這些菌株大多為通過基因工程手段構(gòu)建的新菌種，對實驗條件和技術(shù)人員的水平要求高， 菌種不夠穩(wěn)定，而且菌種發(fā)酵產(chǎn)量普遍較低，基本上還停留在實驗室階段，不利于形成產(chǎn)業(yè)化。因此，尋找能夠產(chǎn)生表柔紅霉素的新微生物菌種和新的制備方法的工作仍在繼續(xù)進行中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)表柔紅霉素的新菌株，以解決上述問題。

本發(fā)明的一個方面在于提供一種能生產(chǎn)表柔紅霉素的微生物菌株。該菌株為波賽鏈霉菌(Streptomyces peucetius)HS1402001，于2014年12月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC NO.10159，并登記入冊，證明存活。

本發(fā)明的另一方面是提供波賽鏈霉菌HS1402001在生產(chǎn)表柔紅霉素或含有表柔紅霉素的藥物組合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一方面是提供一種利用波賽鏈霉菌HS1402001生產(chǎn)表柔紅霉素的方法，該方法包括將波賽鏈霉菌HS1402001在含有可同化的碳源、氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基里進行有氧發(fā)酵。

優(yōu)選地，上述可同化的碳源為淀粉、糊精、葡萄糖、工業(yè)糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇中的一種或幾種；其中，所述糊精為麥芽糊精和玉米糊精中的一種或幾種，所述淀粉為玉米淀粉、土豆淀粉和紅薯淀粉中的一種或幾種，所述淀粉可以制成可溶性淀粉。

優(yōu)選地，上述可同化的氮源為酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、蛋白胨(如胰蛋白胨)、黃豆餅粉、棉籽餅粉、花生餅粉、麩質(zhì)粉、玉米漿干粉、麩皮、尿素、銨鹽、硝酸鹽中的一種或幾種；其中，所述酵母抽提物包括酵母抽提粉和/或酵母膏。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20℃-40℃，優(yōu)選為25℃-30℃；pH為6.5-7.5，優(yōu)選為6.8左右；培養(yǎng)時間為120-240小時；通氣量為0.5-1.0vvm。

所述發(fā)酵方式為液體深層發(fā)酵。

本發(fā)明中，表柔紅霉素可通過以下HPLC方法進行檢測：

色譜柱為C18柱，5μm，4.6×250mm；

流動相為，緩沖液∶乙腈∶甲醇＝500∶500∶60；

緩沖液：取十二烷基硫酸鈉1.44g和磷酸0.68ml溶于500ml超純水中制備得到；

流速：1.35ml/min；

檢測波長：254nm；

進樣量：10μl。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

1、簡化生產(chǎn)工藝。本發(fā)明所述菌種能夠通過直接發(fā)酵方法生產(chǎn)表柔紅霉素或其類似物，簡化了從柔紅霉素經(jīng)化學(xué)合成得到表阿霉素的工藝，有利于降低生產(chǎn)成本和減少環(huán)境污染。

2、提高發(fā)酵單位。跟現(xiàn)有技術(shù)中的表柔紅霉素生產(chǎn)菌相比，利用本發(fā)明的波賽鏈霉菌生產(chǎn)表柔紅霉素的產(chǎn)量有了大幅度提高，達到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

3、發(fā)酵產(chǎn)量高且菌種穩(wěn)定?，F(xiàn)有表柔紅霉素生產(chǎn)菌種多為基因工程菌，本發(fā)明所述菌為通過等離子體誘變而來，發(fā)酵產(chǎn)量高，較基因工程菌更為穩(wěn)定，且操作簡便、安全無毒。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明的波賽鏈霉菌HS1402001在ISP2培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；

圖2為柔紅霉素與表柔紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品混合物的HPLC圖譜；

圖3為本發(fā)明的波賽鏈霉菌HS1402001在實施例1中產(chǎn)生的發(fā)酵液的HPLC圖譜；

圖4為本發(fā)明的波賽鏈霉菌HS1402001在實施例1中產(chǎn)生的表柔紅霉素的MS圖譜；

圖5為本發(fā)明的波賽鏈霉菌HS1402001在實施例1中產(chǎn)生的表柔紅霉素的1H-NMR圖譜；

圖6為本發(fā)明的波賽鏈霉菌HS1402001在實施例1中產(chǎn)生的表柔紅霉素的13C-NMR圖譜。

具體實施方式

在本發(fā)明中，波賽鏈霉菌HS1402001、菌株HS1402001以及HS1402001均表示本發(fā)明提供的表柔紅霉素生產(chǎn)菌，即，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC NO.10159的菌株。

如未有特殊說明，以下實施例中涉及的培養(yǎng)基、制備方法、培養(yǎng)方法、檢測方法等均為本領(lǐng)域公知的，使用的各種試劑均可以從普通生化試劑商店或供應(yīng)商處購得。

本申請中，“通氣量”表示通入經(jīng)過濾除菌的無菌空氣的量。

實施例1：菌株制備和篩選

本發(fā)明的菌株HS1402001為將購自美國菌種保藏中心(ATCC)的柔紅霉素生產(chǎn)菌Streptomyces peucetius ATCC29050通過等離子體誘變而得到的表柔紅霉素生產(chǎn)菌株。

將柔紅霉素的生產(chǎn)菌Streptomyces peucetius ATCC29050涂布于ISP2平皿培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)8-10天，用接種鏟挑取菌落，制得孢子懸液，供等離子體誘變處理。

取待處理的菌懸液10μL均勻涂布在載片表面，用無菌鑷子將載片放到等離子誘變托盤的對應(yīng)孔位。調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)定位臺旋鈕，使載片與等離子體發(fā)生器(無錫源清天木生物科技有限公司；型號：ARTP-II)射流出口間距約為2mm，并固定升降臺。保持氣體流量為10SLM，入射功率為120W，設(shè)置處理時間為50s。處理完畢后，將載片放入盛有1mL生理鹽水的EP管中震蕩洗脫1min。

將洗脫后的菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于ISP2平板，并以未經(jīng)誘變處理的菌懸液同樣經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于ISP2平板作為對照。置于30℃培養(yǎng)8-10天后，檢查菌落數(shù)，并計算致死率。

隨機挑選經(jīng)過等離子體誘變后的單菌落25000株，進行搖瓶發(fā)酵，HPLC檢測是否產(chǎn)表柔紅霉素以及產(chǎn)生的表柔紅霉素的量。從而篩選出突變菌株HS1402001，此突變菌株發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果見圖3，以圖2的柔紅霉素和表柔紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品混合物的HPLC圖譜作為對照，可見，此突變菌株只產(chǎn)表柔紅霉素，不產(chǎn)柔紅霉素。

進一步做該表柔紅霉素的MS、1H-NMR和13C-NMR圖譜，結(jié)果分別見圖4-圖6。

實施例2：菌株HS1402001的生物學(xué)和培養(yǎng)學(xué)特征

該菌株的主要生物學(xué)特征為：此菌株菌落形態(tài)相對出發(fā)菌株(即柔紅霉素生產(chǎn)菌Streptomyces peucetius ATCC29050)發(fā)生了明顯改變：本發(fā)明的菌株HS1402001不產(chǎn)孢子，菌落大致呈圓形，皺褶狀，紫紅色，中間凸起，邊緣不平整，具體菌落形態(tài)如圖1所示。

采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一號、蘋果酸鈣、營養(yǎng)瓊脂、YMS和查氏培養(yǎng)基10種固體培養(yǎng)基表征菌株的培養(yǎng)學(xué)特征。28℃培養(yǎng)7～10天后，觀察菌絲體的顏色及色素情況，結(jié)果見表1。

表1：菌株HS1402001在10種固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

實施例3：菌株HS1402001的生理生化特征

生理生化試驗1-4：除溫度實驗外，均為28℃培養(yǎng)7～10天。

1、碳源的利用：采用ISP9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各種碳源的濃度均為1.0％(質(zhì)量百分濃度)，結(jié)果見表2。

2、無機氮源的利用：采用ISP9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，硝酸鉀和硫酸銨的濃度均為0.1％(質(zhì)量百分濃度)，結(jié)果見表2。

3、降解試驗和NaCl耐受實驗采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基GYEA(pH6.8)，其中，降解試驗結(jié)果見表3，NaCl耐受試驗結(jié)果見表4。

4、其它生理生化特征試驗(結(jié)果見表5)、pH試驗和溫度試驗(結(jié)果分別見表6和表7)均采用YMS培養(yǎng)基。

表2：菌株HS1402001的碳源和氮源的利用情況

表3：菌株HS1402001的降解試驗結(jié)果

表4：菌株HS1402001對NaCl的耐受性

表5：菌株HS1402001的其它生理生化特征

表6：菌株HS1402001生長的pH試驗

表7：菌株HS1402001生長的溫度試驗

注：表1-7中各試驗結(jié)果所表示的數(shù)字和符號分別代表：0，無生長；1，生長很弱；2，能生長；3，生長良好；4，生長最好；+，陽性；-，陰性。

實施例4：16S rDNA序列分析及菌種鑒定

收集待測菌株HS1402001的新鮮菌體，采用溶液菌酶法改進的Pitcher法(Pitcher等，1989)提取總DNA作為模板，采用通用引物(27F(序列為：

GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1495R(序列為：

CTACGGCTACCTTGTTACGA))進行16S rRNA基因擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測純化后，直接進行序列測定，PCR產(chǎn)物測序由南京金斯瑞生物科技有限公司進行。所測的16S rDNA序列經(jīng)校對后與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種、屬的序列進行同源序列BLAST比較，以確定該菌株的分類地位。

菌株HS1402001的16S rDNA序列與GenBank中相關(guān)序列進行BLAST比較，結(jié)果見表8(表中只列出同源性較高的菌株)。

通過對菌株HS1402001表觀特征的試驗發(fā)現(xiàn)該菌株和波賽鏈霉菌(Streptomyces peucetius)分類相關(guān)參數(shù)非常接近，同時對菌株HS1402001的16S rDNA測序結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)其和Streptomyces peucetius strain NBRC 100596的同源性達到了99.8％，故將菌株HS1402001鑒定為波賽鏈霉菌(Streptomyces peucetius)的菌株。

表8：菌株HS1402001和相關(guān)菌株的同源性比較

菌株HS1402001的16S rDNA的部分序列：

TTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCTACGGCTACCTTGTT

ACGACTTCGTCCCAATCGCCAGTCCCACCTTCGACAGCTCCCTCCCACAAG

GGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGC

GGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCG

ATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGA

ACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCGCCTCACGGCTTCGCAGCTCTT

TGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGAT

GACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGT

GAGTCCCCATCACCCCGAAGGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGC

GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGC

CATGCACCACCTGTATACCGACCACAAGGGGGGCACCATCTCTGATGCTT

TCCGGTATATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAG

CCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAG

CCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCA

CCGACGACGTGGAATGTCGCCAACACCTAGTTTCCAACGTTTACGGCGTG

GACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGC

GTCAGTAATGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATAT

CTGCGCATCTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCACACTCT

AGCCTGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACA

TCCGACGCGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGAC

AACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGG

CGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGT

TTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTT

CGCCCACTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCG

TGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGT

CGCCTTGGTAGGCCATCACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCA

TCCTTCACCGCCGGAGCTTTCAACCGCAGACCATGCGATCCGCAGTGTTAT

CCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGATT

GCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCTCCCGAAGGAGGTTC

ATCGTTCGACTTGCATGTGTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCA

GGATCAAACTCTCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCA

菌株HS1402001與Streptomyces peucetius strain NBRC 100596(GenBank登錄號:NR_112574.1)的16S rDNA序列的比較(Query＝菌株HS1402001，sbjct＝Streptomyces peucetius strain NBRC 100596):

實施例5：制備表柔紅霉素1

(1)斜面菌絲體的制備與培養(yǎng)：

斜面孢子培養(yǎng)基配方(g/L)：蔗糖10，酵母抽提粉10，KH₂PO₄0.2，MgCl₂0.2，瓊脂20，消前pH6.5-7.0，試管30×200mm，裝量20mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘后，冷卻到50-60℃擺斜面，接入一環(huán)HS1402001的菌絲體經(jīng)28±1℃培養(yǎng)10天后，菌絲成熟。

(2)種子液的制備與培養(yǎng)：

種子培養(yǎng)基配方(g/L)：可溶性淀粉20，葡萄糖10，酵母抽提粉15，CaCO₃4，消前pH7.0，搖瓶(250mL三角瓶)裝液量為25mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。菌體接種量為10⁵-10⁶c.f.u./mL，培養(yǎng)溫度28±1℃，250rpm，搖床振蕩培養(yǎng)40小時，這時培養(yǎng)液pH7.0-7.5，菌絲濃度為15-20％(體積百分比)。

(3)表柔紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)：

發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：可溶性淀粉50，乳糖30，葡萄糖20，麩質(zhì)粉10，花生餅粉20，玉米漿干粉10，CaCO₃3，消前pH7.0，搖瓶(250mL三角瓶)裝液量為25mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。將種子液以5-10％(體積百分比)的接種量接入，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養(yǎng)8天，發(fā)酵結(jié)束后HPLC測表柔紅霉素的發(fā)酵單位，測得發(fā)酵單位為700mg/L。

實施例6：制備表柔紅霉素2

(1)種子罐種子液的制備：

在20L種子罐中投入15L的種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基的配比為在實施例5的種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，再添加0.3％的豆油作消泡劑)，采用蒸汽滅菌，在121℃條件下滅菌30分鐘，待冷卻后，接入200mL搖瓶種子液中，培養(yǎng)溫度28±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量1vvm，培養(yǎng)24小時，此時pH7.0-7.5，菌絲濃度為15-25％(體積百分比)。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng)：

發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與前述實施例5的發(fā)酵培養(yǎng)基配方相同，但要添加0.05％聚丙二醇(PPG)作為消泡劑。發(fā)酵罐50L，投料體積為35L，消前pH6.8，消后pH7.0，于121℃下蒸汽滅菌30分鐘，冷卻后，接入約3.5L種子罐培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度28±1℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速150-200rpm，通氣量為0.8-1.0vvm，發(fā)酵培養(yǎng)8天，放罐，測得表柔紅霉素發(fā)酵單位為800mg/L。

實施例7：制備表柔紅霉素3

(1)種子培養(yǎng)：

種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉20，葡萄糖10，麥芽糊精20，酵母抽提粉15，黃豆餅粉10，CaCO₃4，MgSO₄·7H₂O 1，pH7.0，搖瓶(250mL三角瓶)裝液量為25mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。從實施例5的斜面挖一塊菌絲體接入種子培養(yǎng)基，置于搖床上28±1℃培養(yǎng)40小時。

(2)表柔紅霉素的制備：

將2.5mL步驟(1)得到的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麥芽糊精100，工業(yè)糖蜜20，蔗糖10，酵母粉10，蛋白胨20，棉籽餅粉10，CaCO₃3，CaCl₂3，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為25mL/250mL三角瓶，121℃滅菌20分鐘，置于搖床上28℃培養(yǎng)8天。HPLC檢測，發(fā)酵單位為800mg/L。

實施例8：制備表柔紅霉素4

種子培養(yǎng)液的制備按照實施例7步驟(1)進行。然后2.5mL的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麥芽糊精120，玉米淀粉20，麥芽糖10，酵母粉10，黃豆餅粉20，麩質(zhì)粉10，棉籽餅粉10，CaCO₃3，CaCl₂3，CuSO₄·5H₂O 0.01，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為25mL/250mL三角瓶，121℃滅菌20分鐘，置于搖床上28℃培養(yǎng)9天。HPLC檢測，發(fā)酵單位為1000mg/L。