一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產(chǎn)方法，包括步驟：Q1：原生質(zhì)體的制備;Q2：原生質(zhì)體的再生；Q3：原生質(zhì)體的紫外誘變；Q4：將制備好的原生質(zhì)體懸液按照下列步驟進(jìn)行離子注入誘變處理；Q5：分別以Q3步驟處理完成和Q4步驟處理培養(yǎng)長出的菌落作為具有不同遺傳背景的親本，進(jìn)行基因組改組處理；Q6：雜合再生子代菌絲體的培養(yǎng)；Q7：雜合子代原生質(zhì)體制備及原生質(zhì)體融合;Q8：子代原生質(zhì)體多輪融合與再生:按照上述Q1-Q7進(jìn)行后繼子代的多輪反復(fù)融合與再生,篩選得到了柔紅霉素產(chǎn)量得到大幅提高的突變株。
【專利說明】一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產(chǎn)方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 蒽環(huán)類抗生素 （Anthracycl ines )是一類重要的抗腫瘤藥物，它們均由蒽環(huán)酮的發(fā) 色團(tuán)通過糖苷鍵和一種或幾種不同的糖連接而成。大多數(shù)蒽環(huán)類的抗生素具有很強(qiáng)的骨髓 抑制和心臟毒性而不能應(yīng)用于臨床，只有柔紅霉素-阿霉素型蒽環(huán)類抗生素成為臨床上最 有應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤藥物，包括柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、洋紅霉素等。柔紅霉素在臨床 上主要用以治療急性白血病,對急性淋巴細(xì)胞性白血病和急性粒細(xì)胞性白血病，柔紅霉素 可作為首選藥物，柔紅霉素還可以治療淋巴肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤等。
[0003] 柔紅霉素（Daunorubicin，DNR)，又稱道諾霉素（Daunomycin)，是某些鏈霉 菌的次級代謝產(chǎn)物，例如波賽鏈霉菌（Streptomyces peucetius)，天藍(lán)淡紅鏈霉菌 (S. coeruleorubidus)，灰色鏈霉菌，鏈霉菌C5等等。目前工業(yè)上采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)柔 紅霉素，國外主要使用的菌種是波賽鏈霉菌；國內(nèi)主要使用的是正定變種HB1482。
[0004] 由于柔紅霉素是具有細(xì)胞毒性的抗腫瘤抗生素，初始的柔紅霉素產(chǎn)生菌的發(fā)酵單 位一般較低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本很高，并不能立即作為工業(yè)化生產(chǎn)用菌。對柔紅霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行 包括分子育種、常規(guī)誘變育種在內(nèi)的選育工作，是提高柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的 最有效的途徑之一。
[0005] 為了提高柔紅霉素產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)量，國內(nèi)外研究者做了大量研究工作。如采用 柔紅霉素篩選耐受菌株以提高菌株的蒽環(huán)類抗生素的產(chǎn)抗能力（斯圖茲曼·恩格沃，《鏈 霉菌的次生代謝調(diào)控及柔紅霉素的產(chǎn)生》《細(xì)菌學(xué)雜志》，刊號：1992, 174,頁數(shù)：144-154) 攜帶dnrl基因的高拷貝表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型柔紅霉素產(chǎn)生菌，提高轉(zhuǎn)化子的柔紅霉素產(chǎn) 抗水平；以SIPI1482為出發(fā)菌株，采用紫外誘變和自身耐藥等復(fù)合處理，獲得高產(chǎn)突變株 SIPI-89068,其發(fā)酵產(chǎn)柔紅霉素產(chǎn)量水平提高了 3-4倍(李莉，許文思，《柔紅霉素產(chǎn)生菌 SIPI89068的選育及發(fā)酵》，《中國抗生素》雜志，刊號：1993, 18(4):頁數(shù)：306-307)等。
[0006] 由于抗腫瘤抗生素產(chǎn)生菌的菌種選育有相當(dāng)大的難度，通過上述工作，不同菌種 的柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量雖然有了不同程度的提高，但與其他種類的抗生素發(fā)酵水平相比，仍 然有相當(dāng)大的差距。
[0007] 近年來隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，在單個(gè)基因水平、基因組水平對柔紅霉素的 生物合成途徑等有了越來越多的認(rèn)識，使組合利用新技術(shù)及傳統(tǒng)誘變手段對柔紅霉素產(chǎn)生 菌進(jìn)行菌種選育，進(jìn)而獲得高產(chǎn)柔紅霉素菌種成為可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量不高的上述缺陷和問題，本發(fā)明實(shí)施例的目的是提供 一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產(chǎn)方法，通過紫外誘變，離子注入誘變，結(jié)合基因組改組，獲 得高產(chǎn)柔紅霉素的菌種。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案：
[0010] 一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產(chǎn)方法，包括以下步驟：
[0011] Q1 :原生質(zhì)體的制備，包括以下分步驟：
[0012] Q11 :取培養(yǎng)菌絲體，以5000-7000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心5-8分鐘后得沉淀，加生 理鹽水進(jìn)行洗滌，再次離心后棄澄清部分,并以漩渦振蕩的方式分散菌絲體；
[0013] Q12 :在Q11步驟中處理后的懸浮菌絲體中加入生理鹽水，再加入溶菌酶溶液，用 移液槍吹吸5次混勻后，于30°水浴中進(jìn)行酶解，每隔10分鐘，用移液器吹吸3次，90分 鐘后終止酶解；
[0014] Q13 :以2000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心5分鐘上述Q12步驟結(jié)束后的處理液，使殘留 的菌絲斷片沉于管底，取上部澄清部分，即為原生質(zhì)體懸浮液，轉(zhuǎn)移到另一滅菌離心管中備 用，并以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘該原生質(zhì)體懸浮液，溫和地去除溶菌酶液，沉淀 出原生質(zhì)體；
[0015] Q14 :取Q13步驟中沉淀出原生質(zhì)體部分，輕輕震蕩離心管，使原生質(zhì)體分散開成 原生質(zhì)體懸浮液，加生理鹽水進(jìn)行稀釋并對原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，使原生質(zhì)體的濃度為1〇〇個(gè)/毫 升；
[0016] Q2 :原生質(zhì)體的再生，包括以下分步驟：
[0017] Q21 :取0. Q14步驟中得到的原生質(zhì)體懸液，與25ml-50ml軟瓊脂混合均 勻，傾倒于R2YE平板上層的培養(yǎng)基中；
[0018] Q22 :另取一 R2YE平板，蓋住Q21步驟中的R2YE平板，將雙層培養(yǎng)基平板于28° 倒置培養(yǎng)；
[0019] Q3 :原生質(zhì)體的紫外誘變，包括以下分步驟：
[0020] Q31 :將按照Q14步驟制備好、稀釋好濃度的原生質(zhì)體懸液進(jìn)行紫外誘變：
[0021] Q311 :紫外線照射強(qiáng)度為10-25W，200-350nm，光源距離保持30cm不變，一次性持 續(xù)紫外照射時(shí)間分別為30秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘；
[0022] Q312 :保持紫外線照射強(qiáng)度15W，254nm，照射距離分別設(shè)置為10cm、2〇Cm、3〇Cm、 40cm、50cm，每個(gè)距離的照射時(shí)間均為3分鐘；
[0023] Q32:完成后，按照Q2步驟，28°的培養(yǎng)環(huán)境下，避光培養(yǎng)5天-10天時(shí)間；
[0024] Q4:離子注入誘變處理：將按照Q14步驟制備好的原生質(zhì)體懸液按照下列步驟進(jìn) 行離子注入誘變處理：
[0025] Q41 :將孢子懸浮液均勻涂布于玻璃片上，自然風(fēng)干表面水分；
[0026] Q42 :以N+作為輻射致變劑，輻射室的真空度：10_3Pa，離子能量：65kev，輻射處理 的劑量率1015N+/秒，總輻射劑量為l*1015N+/cm 2 ;
[0027] Q43:處理后，用生理鹽水將玻璃片上的孢子洗脫，對洗脫的孢子液進(jìn)行梯度稀釋， 分別取稀釋10倍-50倍數(shù)的孢子液均勻地涂布在高氏一號培養(yǎng)基篩選平皿上，30°C培養(yǎng)10 天；
[0028] Q5 :分別以Q3步驟處理完成和Q4步驟處理培養(yǎng)長出的菌落作為具有不同遺傳背 景的親本，進(jìn)行下列基因組改組處理：
[0029] Q51 :分別對上述不同遺傳背景的親本進(jìn)行原生質(zhì)體制備，即重復(fù)步驟1的方法步 驟，然后將處理后的兩部分原生質(zhì)體混合；
[0030] Q52 :以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，在離心機(jī)中，離心上述混合液10分鐘，棄上部澄清 液；
[0031] Q53:將上一步驟得到的沉淀中加入生理鹽水，靜置產(chǎn)生分層后得到的沉淀物質(zhì)， 再次以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘，棄去上部澄清液；
[0032] Q54 :于得到的沉淀中緩慢加入500 μ ml溶解在生理鹽水中的、濃度為65%的PEG 溶液，室溫靜置1分鐘；
[0033] Q55 :加入500 μ ml生理鹽水，并以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘，棄去上部 澄清液；
[0034] Q56 :重復(fù)一次 Q55 ;
[0035] Q57 :將上一步驟得到的沉淀中加入生理鹽水，再與4毫升軟瓊脂混合，迅速傾倒 于R2YE平板上，在28°中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0036] Q6 :雜合再生子代菌絲體的培養(yǎng)：
[0037] 將Q5步驟中于R2YE培養(yǎng)基中長出的菌落，用接種鏟刮下，接種于YEME培養(yǎng)基中， 28°的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)三天，再按10%的接種量接種于含0. 5%甘氨酸的YEME培養(yǎng)基中，繼 續(xù)在28°的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)；
[0038] Q7 :雜合子代原生質(zhì)體制備及原生質(zhì)體融合：
[0039] Q71 :將步驟Q6完成的雜合子代菌絲體，重復(fù)一遍步驟Q1，完成制備新的原生質(zhì) 體；
[0040] Q72 :按步驟Q57的方法進(jìn)行原生質(zhì)體融合，即在上述原生質(zhì)體沉淀中加入PEG溶 液，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，并與軟瓊脂混合，傾注于R2YE平板上，在28°的培養(yǎng)環(huán)境中長出的 菌落即為第二輪融合后的再生群體；
[0041] Q8 :子代原生質(zhì)體多輪融合與再生：按照上述Q1-Q7進(jìn)行后繼子代的多輪反復(fù)融 合與再生。
[0042] 作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述Q21步驟中，培養(yǎng)基的成分為：蔗糖、葡萄糖、酵母 抽提物、氯化鎂、水解酪蛋白、硫酸鉀、TES、微量元素。
[0043] 作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述Q21步驟中，培養(yǎng)基中各成分的含量為：蔗 糖103g/L ;葡萄糖10g/L ;酵母抽提物5g/L ;氯化鎂10g/L ;水解酪蛋白0. lg/L ;硫酸 鉀0· 25g/L ;TES6. Og/L ;微量元素200微升/L，微量元素的成分為：Na2B407 · 10H20 : 10mg/100ml, ZnCl2 ：40mg/100ml, (NH4) 6M07024 · 4H20 ：10mg/100ml, FeCl3 · 6H20 ： 200mg/100ml,MnCl2 · 4H20 ：10mg/100ml, CuCl2 · 2H20 ： lOmg/lOOml 〇
[0044] 作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述Q4步驟中，孢子懸液的制備方法為：
[0045] 在孢子生長良好的新鮮平板上加入生理鹽水，用扁頭竹簽輕輕地刮下孢子，移入 裝有滅菌玻璃珠的三角搖瓶，于室溫環(huán)境中，旋轉(zhuǎn)振蕩10分鐘；
[0046] 將上述溶液移入無菌的、裝有脫脂棉的玻璃注射器中進(jìn)行過濾；
[0047] 將濾液于離心機(jī)中，以3, 000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘以沉淀孢子；
[0048] 棄去上部澄清液，用適量生理鹽水洗滌一次后，在離心機(jī)中再次進(jìn)行離心，再次棄 上部澄清液，并加入生理鹽水懸浮孢子。
[0049] 作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述Q4步驟中，高氏一號培養(yǎng)基的成分為：可溶性淀 粉20g/L，氯化鈉0. 5g/L，硝酸鉀lg/L，七水硫酸鎂0. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，硫酸亞鐵 0· 01g/L，瓊脂粉 2%，調(diào)節(jié) pH 至 7. 0-7. 2。
[0050] 作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述Q6步驟中，YEME培養(yǎng)基的成分為：酵母抽提物、 麥芽抽提物、蔗糖、聚胨、葡萄糖。
[0051] 作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述Q6步驟中，YEME培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌后，加入六 水氯化鎂進(jìn)行稀釋。
[0052] 同時(shí)，本發(fā)明嘗試提供一種鹽酸柔紅霉素菌種，其特征在于，該菌種是通過Q1-Q8 的方法而產(chǎn)生得到的。
[0053] 本發(fā)明實(shí)施例提供的一種鹽酸柔紅霉素菌種及其高產(chǎn)方法，對柔紅霉素產(chǎn)生菌進(jìn) 行原生質(zhì)體紫外誘變及離子注入誘變，獲得具有不同遺傳性狀的突變體，使用上述突變體 作為親本，進(jìn)行基因組改組，對子代原生質(zhì)體進(jìn)行多輪融合與再生，篩選得到了柔紅霉素產(chǎn) 量得到大幅提高的突變株。
[0054] 保藏說明
[0055] 本發(fā)明所涉及要求保護(hù)的鹽酸柔紅霉素菌種，其保藏信息為：
[0056] 保藏地址：中國?湖北省·武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
[0057] 保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心 分類命名： 天藍(lán)淡紅鏈霉菌ST-1 Streptomyces coeruleorubidus ST-1
[0058] 保藏單位簡稱：CCTCC
[0059] 保藏日期：2012. 04. 22
[0060] 保藏中心編號：CCTCC N0.M2012133

【具體實(shí)施方式】
[0061] 下面對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本 發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在 沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0062] 本發(fā)明申請中提及或涉及的基因組（Genome)-般的定義是單倍體細(xì)胞中的全套 染色體為一個(gè)基因組。
[0063] 實(shí)施例1
[0064] 步驟Q1 :原生質(zhì)體的制備，包括以下分步驟：
[0065] Q11 :取培養(yǎng)菌絲體（ATCC31276)，以8000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心5分鐘后得沉淀， 加生理鹽水進(jìn)行洗滌，再次離心后棄澄清部分,并以漩渦振蕩的方式分散菌絲體；
[0066] Q12 :在Q11步驟中處理后的懸浮菌絲體中加入lml生理鹽水，用來懸浮菌絲體，再 加入0. 2ml溶菌酶溶液，用移液槍吹吸5次混勻后，于30°水浴中進(jìn)行酶解，每隔10分鐘， 用移液器吹吸3次，90分鐘后終止酶解；
[0067] Q13 :以2000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心5分鐘上述Q12步驟結(jié)束后的處理液，使殘留 的菌絲斷片沉于管底，取上部澄清部分，即為原生質(zhì)體懸浮液，轉(zhuǎn)移到另一滅菌離心管中備 用，并以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘該原生質(zhì)體懸浮液，溫和地去除溶菌酶液，沉淀 出原生質(zhì)體；
[0068] Q14 :取Q13步驟中沉淀出原生質(zhì)體部分，輕輕震蕩離心管，使原生質(zhì)體分散開成 原生質(zhì)體懸浮液，加生理鹽水進(jìn)行稀釋并對原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，使原生質(zhì)體的濃度為1〇〇個(gè)/毫 升。
[0069] 實(shí)施例2
[0070] 步驟Q2 :原生質(zhì)體的再生，包括以下分步驟：
[0071] Q21 :取0. 5ml Q14步驟中得到的原生質(zhì)體懸液，與25ml軟瓊脂混合均勻，傾倒于 R2YE平板上層的培養(yǎng)基中；
[0072] Q22 :另取一 R2YE平板，蓋住Q21步驟中的R2YE平板，將雙層培養(yǎng)基平板于28° 倒置培養(yǎng)。
[0073] 其中，培養(yǎng)基的成分為：蔗糖、葡萄糖、酵母抽提物、氯化鎂、水解酪蛋白、硫酸鉀、 TES、微量元素，培養(yǎng)基中各成分的含量為：蔗糖103g/L ;葡萄糖10g/L ;酵母抽提物5g/L ; 氯化鎂l〇g/L ;水解酪蛋白0· lg/L ;硫酸鉀0· 25g/L ;TES6. Og/L ;微量元素200微升/L， 微量元素的成分為：Na2B407 · 10H20 :10mg/100ml，ZnCl2 :40mg/100ml，（ΝΗ4)6Μ07024 · 4H20 : 10mg/100ml,FeCl3 *6H20 ：200mg/100ml, MnCl2 *4H20 ：lOmg/lOOml, CuCl2 *2H20 ：10mg/100mL·
[0074] 實(shí)施例3
[0075] 步驟Q3 :原生質(zhì)體的紫外誘變，包括以下分步驟：
[0076] Q31 :將按照Q14步驟制備好、稀釋好濃度的原生質(zhì)體懸液進(jìn)行紫外誘變：
[0077] Q311 :紫外線照射強(qiáng)度為15W，254nm，光源距離保持30cm不變，一次性持續(xù)紫外照 射時(shí)間分別為30秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘；
[0078] Q312 :保持紫外線照射強(qiáng)度15W，254nm，照射距離分別設(shè)置為10cm、2〇Cm、3〇Cm、 40cm、50cm，每個(gè)距離的照射時(shí)間均為3分鐘；
[0079] Q32:完成后，按照Q2步驟，28°的培養(yǎng)環(huán)境下，避光培養(yǎng)7天時(shí)間。
[0080] 實(shí)施例4
[0081] 步驟Q4:離子注入誘變處理：將按照Q14步驟制備好的原生質(zhì)體懸液按照下列步 驟進(jìn)行離子注入誘變處理：
[0082] Q41 :將孢子懸浮液均勻涂布于玻璃片上，自然風(fēng)干表面水分；
[0083] Q42 :以N+作為輻射致變劑，輻射室的真空度：10_3Pa，離子能量：65kev，輻射處理 的劑量率1015N+/秒，總輻射劑量為l*1015N+/cm2 ;
[0084] Q43:處理后，用生理鹽水將玻璃片上的孢子洗脫，對洗脫的孢子液進(jìn)行梯度稀釋， 分別取稀釋10倍-50倍數(shù)的孢子液均勻地涂布在高氏一號培養(yǎng)基篩選平皿上，30°C培養(yǎng)10 天；
[0085] 其中孢子懸液的制備方法為：
[0086] 在孢子生長良好的新鮮平板上加入適量的生理鹽水，用扁頭竹簽輕輕地刮下孢 子，移入裝有滅菌玻璃珠的三角搖瓶，于室溫環(huán)境中，旋轉(zhuǎn)振蕩10分鐘；
[0087] 將上述溶液移入無菌的、裝有脫脂棉的玻璃注射器中進(jìn)行過濾；
[0088] 將濾液于離心機(jī)中，以3, 000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘以沉淀孢子；
[0089] 棄去上部澄清液，用適量生理鹽水洗滌一次后，在離心機(jī)中再次進(jìn)行離心10分 鐘，再次棄去上部澄清液，并加入生理鹽水以懸浮孢子。
[0090] 其中高氏一號培養(yǎng)基的成分為：
[0091] 可溶性淀粉20g/L，氯化鈉0. 5g/L，硝酸鉀lg/L，七水硫酸鎂0. 5g/L，磷酸氫二鉀 〇· 5g/L，硫酸亞鐵(λ 01g/L，瓊脂粉2%，調(diào)節(jié)pH至L 0-7. 2。
[0092] 實(shí)施例5
[0093] 步驟Q5 :分別以Q3步驟處理完成和Q4步驟處理培養(yǎng)長出的菌落作為具有不同遺 傳背景的親本，進(jìn)行下列基因組改組處理：
[0094] Q51 :分別對上述不同遺傳背景的親本進(jìn)行原生質(zhì)體制備，即重復(fù)步驟1的方法步 驟，然后將處理后的兩部分原生質(zhì)體混合；
[0095] Q52 :以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，在離心機(jī)中，離心上述混合液10分鐘，棄上部澄清 液；
[0096] Q53 :將上一步驟得到的沉淀中加入生理鹽水，靜置產(chǎn)生分層后得到的沉淀物質(zhì)， 再次以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘，棄去上部澄清液；
[0097] Q54 :于得到的沉淀中緩慢加入500 μ ml溶解在生理鹽水中的、濃度為65%的PEG 溶液，室溫靜置1分鐘，使原生質(zhì)體充分融合；
[0098] Q55 :加入500 μ ml生理鹽水，并以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘，棄去上部 澄清液；
[0099] Q56:重復(fù)一次 Q55;
[0100] Q57 :將上一步驟得到的沉淀中加入生理鹽水，再與4毫升軟瓊脂混合，迅速傾倒 于R2YE平板上，在28°中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0101] 實(shí)施例6
[0102] 步驟Q6 :雜合再生子代菌絲體的培養(yǎng)：
[0103] 將Q5步驟中于R2YE培養(yǎng)基中長出的菌落，用接種鏟刮下，接種于YEME培養(yǎng)基中， 28°的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)三天，再按10%的接種量接種于含0. 5%甘氨酸的YEME培養(yǎng)基中，繼 續(xù)在28°的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)；
[0104] YEME培養(yǎng)基的配置：
[0105] 酵母抽提物3g/L ;麥芽抽提物3g/L ;蔗糖340g/L ;聚胨5g/L ;葡萄糖10g/L，高溫 滅菌后加入六水氯化鎂至終濃度為5毫摩爾/升。
[0106] 實(shí)施例7
[0107] 步驟Q7 :雜合子代原生質(zhì)體制備及原生質(zhì)體融合：
[0108] Q71 :將步驟Q6完成的雜合子代菌絲體，重復(fù)一遍步驟Q1，完成制備新的原生質(zhì) 體；
[0109] Q72 :按步驟Q57的方法進(jìn)行原生質(zhì)體融合，即在上述原生質(zhì)體沉淀中加入PEG溶 液，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，并與軟瓊脂混合，傾注于R2YE平板上，在28°的培養(yǎng)環(huán)境中長出的 菌落即為第二輪融合后的再生群體；
[0110] 實(shí)施例8
[0111] Q8 :子代原生質(zhì)體多輪融合與再生：
[0112] 按照上述Q1-Q7進(jìn)行后繼子代的多輪反復(fù)融合與再生。
[0113] 按照上述方法進(jìn)行后繼子代的多輪反復(fù)融合與再生，不同的融合再生子代可以標(biāo) 記為 F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8?··
[0114] 誘變改組后高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株產(chǎn)柔紅霉素能力比較如下：
[0115] 1)對出發(fā)菌株和誘變改組得到的子代F1至F8代進(jìn)行發(fā)酵；
[0116] 2)高效液相色譜檢測發(fā)酵液中柔紅霉素的方法：
[0117] 檢測柱：Eel ipse XDB-C18, 250mm x4. 6mm, 5micrometri
[0118] 柱溫：室溫
[0119] 流速：lml/min
[0120] 檢測波長：UV lamp254nm
[0121] 方法：梯度洗脫
[0122]

【權(quán)利要求】
1. 一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟： Q1 :原生質(zhì)體的制備，包括以下分步驟： Q11 :取培養(yǎng)菌絲體，以5000-7000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心5-8分鐘后得沉淀，加生理鹽 水進(jìn)行洗滌，再次離心后棄澄清部分，并以漩渦振蕩的方式分散菌絲體； Q12 :在Q11步驟中處理后的懸浮菌絲體中加入生理鹽水，再加入溶菌酶溶液，用移液 槍吹吸5次混勻后，于30°水浴中進(jìn)行酶解，每隔10分鐘，用移液器吹吸3次，90分鐘后終 止酶解； Q13 :以2000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心5分鐘上述Q12步驟結(jié)束后的處理液，使殘留的菌 絲斷片沉于管底，取上部澄清部分，即為原生質(zhì)體懸浮液，轉(zhuǎn)移到另一滅菌離心管中備用， 并以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘該原生質(zhì)體懸浮液，溫和地去除溶菌酶液，沉淀出 原生質(zhì)體； Q14 :取Q13步驟中沉淀出原生質(zhì)體部分，輕輕震蕩離心管，使原生質(zhì)體分散開成原生 質(zhì)體懸浮液，加生理鹽水進(jìn)行稀釋并對原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，使原生質(zhì)體的濃度為100個(gè)/毫升； Q2 :原生質(zhì)體的再生，包括以下分步驟： Q21 :取0. Q14步驟中得到的原生質(zhì)體懸液，與25ml-50ml軟瓊脂混合均勻，傾 倒于R2YE平板上層的培養(yǎng)基中； Q22 :另取一 R2YE平板，蓋住Q21步驟中的R2YE平板，將雙層培養(yǎng)基平板于28°倒置 培養(yǎng)； Q3 :原生質(zhì)體的紫外誘變，包括以下分步驟： Q31 :將按照Q14步驟制備好、稀釋好濃度的原生質(zhì)體懸液進(jìn)行紫外誘變： Q311 :紫外線照射強(qiáng)度為10-25W，200-350nm，光源距離保持30cm不變，一次性持續(xù)紫 外照射時(shí)間分別為30秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘； Q312 :保持紫外線照射強(qiáng)度15W，254nm，照射距離分別設(shè)置為10cm、20cm、30cm、40cm、 50cm，每個(gè)距離的照射時(shí)間均為3分鐘； Q32:完成后，按照Q2步驟，28°的培養(yǎng)環(huán)境下，避光培養(yǎng)5天-10天時(shí)間； Q4:離子注入誘變處理：將按照Q14步驟制備好的原生質(zhì)體懸液按照下列步驟進(jìn)行離 子注入誘變處理： Q41 :將孢子懸浮液均勻涂布于玻璃片上，自然風(fēng)干表面水分； Q42 :以N+作為輻射致變劑，輻射室的真空度：l(T3Pa，離子能量：65kev，輻射處理的劑 量率1015N+/秒，總輻射劑量為l*1015N+/cm2 ; Q43 :處理后，用生理鹽水將玻璃片上的孢子洗脫，對洗脫的孢子液進(jìn)行梯度稀釋，分別 取稀釋10倍-50倍數(shù)的孢子液均勻地涂布在高氏一號培養(yǎng)基篩選平皿上，30°C培養(yǎng)10天； Q5 :分別以Q3步驟處理完成和Q4步驟處理培養(yǎng)長出的菌落作為具有不同遺傳背景的 親本，進(jìn)行下列基因組改組處理： Q51 :分別對上述不同遺傳背景的親本進(jìn)行原生質(zhì)體制備，即重復(fù)步驟1的方法步驟， 然后將處理后的兩部分原生質(zhì)體混合； Q52 :以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，在離心機(jī)中，離心上述混合液10分鐘，棄上部澄清液； Q53 :將上一步驟得到的沉淀中加入生理鹽水，靜置產(chǎn)生分層后得到的沉淀物質(zhì)，再次 以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘，棄去上部澄清液； Q54 :于得到的沉淀中緩慢加入500 μ ml溶解在生理鹽水中的、濃度為65%的PEG溶液， 室溫靜置1分鐘； Q55 :加入500 μ ml生理鹽水，并以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘，棄去上部澄清 液； Q56 :重復(fù)一次Q55 ; Q57 :將上一步驟得到的沉淀中加入生理鹽水，再與4毫升軟瓊脂混合，迅速傾倒于 R2YE平板上，在28°中進(jìn)行培養(yǎng)； Q6 :雜合再生子代菌絲體的培養(yǎng)： 將Q5步驟中于R2YE培養(yǎng)基中長出的菌落，用接種鏟刮下，接種于YEME培養(yǎng)基中，28 ° 的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)三天，再按10%的接種量接種于含〇. 5%甘氨酸的YEME培養(yǎng)基中，繼續(xù)在 28°的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)； Q7 :雜合子代原生質(zhì)體制備及原生質(zhì)體融合： Q71 :將步驟Q6完成的雜合子代菌絲體，重復(fù)一遍步驟Q1，完成制備新的原生質(zhì)體； Q72 :按步驟Q57的方法進(jìn)行原生質(zhì)體融合，即在上述原生質(zhì)體沉淀中加入PEG溶液，進(jìn) 行原生質(zhì)體融合，并與軟瓊脂混合，傾注于R2YE平板上，在28°的培養(yǎng)環(huán)境中長出的菌落 即為第二輪融合后的再生群體； Q8 :子代原生質(zhì)體多輪融合與再生：按照上述Q1-Q7進(jìn)行后繼子代的多輪反復(fù)融合與 再生。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產(chǎn)方法，其特征在于，所述Q21步 驟中，培養(yǎng)基的成分為：蔗糖、葡萄糖、酵母抽提物、氯化鎂、水解酪蛋白、硫酸鉀、TES、微量 元素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產(chǎn)方法，其特征在于，所述Q21 步驟中，培養(yǎng)基中各成分的含量為：蔗糖l〇3g/L ;葡萄糖10g/L ;酵母抽提物5g/L ;氯化 鎂10g/L ;水解酪蛋白0· lg/L ;硫酸鉀0· 25g/L ;TES6. Og/L ;微量元素200微升/L，微 量元素的成分為：Na2B407 · 10H20 :10mg/100ml，ZnCl2 :40mg/100ml，（ΝΗ4)6Μ07024 · 4H20 : lOmg/lOOml，F(xiàn)eCl3·6Η20 :200mg/100ml，MnCl2·4Η20 :10mg/100ml，CuCl2·2Η20 :10mg/100ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產(chǎn)方法，其特征在于，所述Q4步 驟中，孢子懸液的制備方法為： 在孢子生長良好的新鮮平板上加入生理鹽水，用扁頭竹簽輕輕地刮下孢子，移入裝有 滅菌玻璃珠的三角搖瓶，于室溫環(huán)境中，旋轉(zhuǎn)振蕩10分鐘； 將上述溶液移入無菌的、裝有脫脂棉的玻璃注射器中進(jìn)行過濾； 將濾液于離心機(jī)中，以3, 000轉(zhuǎn)/分鐘的速率，離心10分鐘以沉淀孢子； 棄去上部澄清液，用適量生理鹽水洗滌一次后，在離心機(jī)中再次進(jìn)行離心，再次棄上部 澄清液，并加入生理鹽水懸浮孢子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產(chǎn)方法，其特征在于，所述Q4步 驟中，高氏一號培養(yǎng)基的成分為：可溶性淀粉20g/L，氯化鈉0. 5g/L，硝酸鉀lg/L，七水硫酸 鎂0· 5g/L，磷酸氫二鉀0· 5g/L，硫酸亞鐵0· 01g/L，瓊脂粉2%，調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產(chǎn)方法，其特征在于，所述Q6步 驟中，YEME培養(yǎng)基的成分為：酵母抽提物、麥芽抽提物、蔗糖、聚胨、葡萄糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種鹽酸柔紅霉素菌種的高產(chǎn)方法，其特征在于，所述Q6步 驟中，YEME培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌后，加入六水氯化鎂進(jìn)行稀釋。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹽酸柔紅霉素菌種，其特征在于，該菌種是通過Q1-Q8的 方法而產(chǎn)生得到的。
【文檔編號】C12N15/03GK104059871SQ201310086639
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月18日
【發(fā)明者】余宏, 徐超波, 陳歡斌, 王波, 姚定余 申請人:江蘇禾昌生物科技有限公司