1.一種用于生物人工肝支持系統(tǒng)的三維微肝組織單元的構(gòu)建方法,其特征在于:首先制備豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒,之后將制得的豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒在海藻酸鈉溶液中混合均勻,然后向混合液中加入肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,之后滴入氯化鈣溶液制備海藻酸鈣微球,再加入聚陽(yáng)離子溶液成膜后制成固態(tài)核心海藻酸鈉-聚陽(yáng)離子微膠囊,添加細(xì)胞培養(yǎng)液于37℃,含5%CO2的靜態(tài)培養(yǎng)體系或生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)細(xì)胞自組裝實(shí)現(xiàn)功能性三維微肝組織單元的構(gòu)建。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:
所述海藻酸鈉溶液濃度有效范圍為2%-4%(w/v);海藻酸鈉的分子量為100-1000kDa,海藻酸鈉分子中古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例(G/M)范圍為0.2-3:1;所述海藻酸鈉為精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾的海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)多肽修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)多肽修飾海藻酸鈉以質(zhì)量比為1:1:1的混合海藻酸鈉。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:
所述聚陽(yáng)離子包括α-聚賴氨酸、聚鳥氨酸、ε-聚賴氨酸、殼聚糖,其中α-聚賴氨酸分子量為2-80kDa,有效濃度范圍為0.05%-0.2%(w/v);聚鳥氨酸分子量為2-80kDa,有效濃度范圍為0.05%-0.2%(w/v);ε-聚賴氨酸分子量為5-50kDa,有效濃度范圍為0.05%-0.2%(w/v);殼聚糖分子量為0.5-20kDa,有效濃度范圍為0.05%-0.5%(w/v);聚陽(yáng)離子溶液與含脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒海藻酸鈉懸液的比例為1:5-1:20(w/v)。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒的制備包括以下兩個(gè)過(guò)程:
豬肝臟組織切片制備過(guò)程:用37℃含0.25%(w/v)胰蛋白酶及0.02%(w/v)乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖液灌注肝素化在體肝臟至土黃色,游離完整左、右外葉經(jīng)-80℃凍存≥24h后切片為1-4mm厚組織片;
肝臟組織片的脫細(xì)胞處理過(guò)程:肝臟組織片和脫細(xì)胞液以1:15-1:20(w/v)比例混合,脫細(xì)胞液依次為雙蒸水24h,2%(v/v)Triton X-100和0.1%(v/v)氨水溶液96h,0.1%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液24h,雙蒸水72h,真空冷凍干燥;將冷凍干燥后脫細(xì)胞組織片置于球磨儀中粉碎成粒徑范圍為10μm-100μm的顆粒,經(jīng)γ射線輻照消毒后凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
5.按照權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:
所述豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒在海藻酸鈉溶液中的濃度有效范圍為0.2%-5%(w/v)。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:
所述肝細(xì)胞包括人及哺乳動(dòng)物來(lái)源原代肝細(xì)胞、干細(xì)胞來(lái)源肝細(xì)胞、腫瘤源性肝細(xì)胞株、永生化肝細(xì)胞株的單細(xì)胞或肝細(xì)胞聚集體中的一種;所述血管內(nèi)皮細(xì)胞包括人及哺乳動(dòng)物來(lái)源動(dòng)脈、靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株中的一種;所述成纖維細(xì)胞包括人及哺乳動(dòng)物來(lái)源的胚胎成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞中的一種。
7.按照權(quán)利要求1或6所述的方法,其特征在于:
所述肝細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞個(gè)數(shù)比例范圍為5:1-1:3(個(gè)數(shù)比),肝細(xì)胞與成纖維細(xì)胞個(gè)數(shù)比例范圍為5:1-1:3(個(gè)數(shù)比),總細(xì)胞在含脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒海藻酸鈉懸液中的接種密度為1×106-1×107個(gè)/mL。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:
所述氯化鈣溶液濃度為0.05-0.2mol/L,氯化鈣溶液與含脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒海藻酸鈉懸液的比例(v/v)為1:50-1:200,鈣化時(shí)間為15-30min。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:
所述聚陽(yáng)離子成膜時(shí)間為10-20min;所述固態(tài)核心微囊的直徑范圍為200-2000μm。
10.按照權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:
所述生物型人工肝支持系統(tǒng)包括單純生物型人工肝及混合型生物人工肝支持系統(tǒng),所述的生物反應(yīng)器類型包括攪拌式、灌注式、中空纖維式、氣升式、旋轉(zhuǎn)式反應(yīng)器。