本發(fā)明涉及生物人工肝支持系統(tǒng)領(lǐng)域，具體是一種用于生物人工肝支持系統(tǒng)的三維微肝組織單元的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

肝臟是人體最重要的代謝器官，生物人工肝(Bio-artificial liver，BAL)支持系統(tǒng)能夠較好的替代肝臟的合成，代謝及分泌等功能，作為原位肝移植的替代或補(bǔ)充方法顯示出良好的應(yīng)用前景。然而，常規(guī)二維培養(yǎng)條件下的肝細(xì)胞很快丟失其合成、解毒等主要功能，因此如何獲得高功能肝細(xì)胞是生物人工肝應(yīng)用所面臨的核心問(wèn)題之一。

研究表明，肝細(xì)胞的功能受到肝組織微環(huán)境的密切調(diào)控，肝組織微環(huán)境中多種細(xì)胞共存，除了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，還有竇狀隙血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝星形細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，不同種類(lèi)細(xì)胞之間存在重要的相互作用，它們所形成三維肝組織具有比單獨(dú)肝細(xì)胞更高的活性與功能。此外，肝組織微環(huán)境中還含有多種重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原、纖連蛋白等，基質(zhì)成分除了起到支持作用外，還通過(guò)整合素等重要信號(hào)對(duì)肝細(xì)胞的功能起到重要的調(diào)控作用。因此可知，與常規(guī)二維培養(yǎng)相比，能夠模擬不同種類(lèi)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)成分之間相互作用的三維培養(yǎng)體系將有希望能夠產(chǎn)生類(lèi)似體內(nèi)肝組織的三維微肝組織，更好地保持肝細(xì)胞的極性及正常生理功能，這將大大推進(jìn)生物人工肝系統(tǒng)的發(fā)展。

然而，目前現(xiàn)有的三維肝細(xì)胞培養(yǎng)體系還存在兩個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題。首先，現(xiàn)有體系大多只使用一種基質(zhì)細(xì)胞來(lái)支持肝細(xì)胞，不能很好地模擬體內(nèi)肝組織中多種重要細(xì)胞共存的特點(diǎn)，難以形成高功能三維微肝組織。另外，現(xiàn)有體系主要通過(guò)添加膠原、透明質(zhì)酸等成分提高支架的生物功能，然而這些成分與體內(nèi)肝細(xì)胞外基質(zhì)實(shí)際成分相差很遠(yuǎn)，難以起到足夠的支持和調(diào)控作用。

上述兩個(gè)問(wèn)題限制了三維肝組織構(gòu)建以及生物人工肝支持系統(tǒng)的應(yīng)用，因此本發(fā)明提出了基于肝組織脫細(xì)胞仿生支架及多細(xì)胞共培養(yǎng)的三維微肝組織構(gòu)建方法，此方法能有效模擬肝組織微環(huán)境的特點(diǎn)，能夠制備出高功能的三維微肝組織，可以應(yīng)用于人工肝系統(tǒng)中。本發(fā)明具有的特點(diǎn)是：內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞同時(shí)和肝細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬了肝組織中多種細(xì)胞共存；肝組織脫細(xì)胞支架的使用保留了體內(nèi)肝組織的基質(zhì)成分以及多種生長(zhǎng)因子，比目前添加的單一成分效果更好；多細(xì)胞共培養(yǎng)和脫細(xì)胞支架的聯(lián)合使用更好地體現(xiàn)了肝組織微環(huán)境的主要特點(diǎn)，促進(jìn)三維功能微肝組織的形成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于生物人工肝支持系統(tǒng)的三維微肝組織單元的構(gòu)建方法，其特征在于：首先制備豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒，之后將制得的豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒在海藻酸鈉溶液中混合均勻，然后向混合液中加入肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，之后滴入氯化鈣溶液制備海藻酸鈣微球，再加入聚陽(yáng)離子溶液成膜后制成固態(tài)核心海藻酸鈉-聚陽(yáng)離子微膠囊，添加細(xì)胞培養(yǎng)液于37℃，含5％CO₂的靜態(tài)培養(yǎng)體系或生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞自組裝實(shí)現(xiàn)功能性三維微肝組織單元的構(gòu)建。本發(fā)明上述方法通過(guò)以下具體技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

1.豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒制備：

選用健康成年實(shí)驗(yàn)用小型豬，麻醉，手術(shù)開(kāi)腹后經(jīng)肝動(dòng)脈灌注肝素溶液抗凝，門(mén)靜脈插管并固定后經(jīng)蠕動(dòng)泵灌注37℃含0.25％(w/v)胰蛋白酶及0.02％(w/v)乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖液至肝臟呈土黃色，離斷肝臟周?chē)?，取完整的肝左外葉和右外葉于-80℃凍存≥24h后，用切片機(jī)將肝葉切成1-4mm厚，大小適宜組織片，將肝組織片與脫細(xì)胞液按1：15–1：20(w/v)比例混合置于4℃恒溫?fù)u床。脫細(xì)胞組織片經(jīng)真空冷凍干燥后，用球磨儀將其粉碎為10μm-100μm顆粒，經(jīng)γ射線輻照消毒后凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.海藻酸鈉-聚陽(yáng)離子制備微囊包封肝脫細(xì)胞支架顆粒及細(xì)胞：

無(wú)菌條件下，將肝脫細(xì)胞支架顆粒在海藻酸鈉溶液中混勻，將肝細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞按比例懸于含肝脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的海藻酸鈉混合液中，滴入氯化鈣溶液中制備海藻酸鈣微球，加入聚陽(yáng)離子溶液成膜后經(jīng)海藻酸鈉溶液中和多余電荷制備成固態(tài)核心海藻酸鈉-聚陽(yáng)離子微膠囊，添加細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

所述海藻酸鈉溶液濃度有效范圍為2％-4％(w/v)；海藻酸鈉的分子量為100-1000kDa，海藻酸鈉分子中古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例(G/M)范圍為0.2-3：1；所述海藻酸鈉為精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾的海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)多肽修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴(lài)氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)多肽修飾海藻酸鈉以質(zhì)量比為1：1：1的混合海藻酸鈉。

所述聚陽(yáng)離子包括α-聚賴(lài)氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸、ε-聚賴(lài)氨酸、殼聚糖，其中α-聚賴(lài)氨酸分子量為2-80kDa，有效濃度范圍為0.05％-0.2％(w/v)；聚鳥(niǎo)氨酸分子量為2-80kDa，有效濃度范圍為0.05％-0.2％(w/v)；ε-聚賴(lài)氨酸分子量為5-50kDa，有效濃度范圍為0.05％-0.2％(w/v)；殼聚糖分子量為0.5-20kDa，有效濃度范圍為0.05％-0.5％(w/v)；聚陽(yáng)離子溶液與含脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒海藻酸鈉懸液的比例為1： 5-1：20(w/v)。

所述豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒的制備包括以下兩個(gè)過(guò)程：

豬肝臟組織切片制備過(guò)程：用37℃含0.25％(w/v)胰蛋白酶及0.02％(w/v)乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖液灌注肝素化在體肝臟至土黃色，游離完整左、右外葉經(jīng)-80℃凍存≥24h后切片為1-4mm厚組織片；

肝臟組織片的脫細(xì)胞處理過(guò)程：肝臟組織片和脫細(xì)胞液以1：15-1：20(w/v)比例混合，脫細(xì)胞液依次為雙蒸水24h，2％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水溶液96h，0.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液24h，雙蒸水72h，真空冷凍干燥。將冷凍干燥后脫細(xì)胞組織片置于球磨儀中粉碎成粒徑范圍為10μm-100μm的顆粒，經(jīng)γ射線輻照消毒后凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

所述豬肝臟脫細(xì)胞支架顆粒在海藻酸鈉溶液中的濃度有效范圍為0.2％-5％(w/v)。

所述肝細(xì)胞包括人及哺乳動(dòng)物(如豬，家兔，猴，大鼠，小鼠)來(lái)源原代肝細(xì)胞、干細(xì)胞來(lái)源肝細(xì)胞、腫瘤源性肝細(xì)胞株、永生化肝細(xì)胞株的單細(xì)胞或肝細(xì)胞聚集體中的一種；所述血管內(nèi)皮細(xì)胞包括人及哺乳動(dòng)物來(lái)源動(dòng)脈、靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株中的一種；所述成纖維細(xì)胞包括人及哺乳動(dòng)物來(lái)源的胚胎成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞中的一種；

所述肝細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞個(gè)數(shù)比例范圍為5：1-1：3(個(gè)數(shù)比)，肝細(xì)胞與成纖維細(xì)胞個(gè)數(shù)比例范圍為5：1-1：3(個(gè)數(shù)比)，總細(xì)胞在含脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒海藻酸鈉懸液中的接種密度為1×10⁶-1×10⁷個(gè)/mL。

所述氯化鈣溶液濃度為0.05-0.2mol/L,氯化鈣溶液與含脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒海藻酸鈉懸液的比例(v/v)為1：50-1：200，鈣化時(shí)間為15-30min。

所述聚陽(yáng)離子成膜時(shí)間為10-20min；所述固態(tài)核心微囊的直徑范圍為200-2000μm。

所述生物型人工肝支持系統(tǒng)包括單純生物型人工肝及混合型生物人工肝支持系統(tǒng)，其反應(yīng)器類(lèi)型包括攪拌式、灌注式、中空纖維式、氣升式、旋轉(zhuǎn)式反應(yīng)器。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.制備方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明采用海藻酸鹽-聚陽(yáng)離子制備微膠囊包封脫細(xì)胞支架成分，復(fù)合肝細(xì)胞及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)構(gòu)建用于生物型人工肝系統(tǒng)三維肝微單元，制備工藝簡(jiǎn)單，所用材料容易獲得，成本較低，未使用稀有材料及復(fù)雜工藝，實(shí)用性強(qiáng)；

2.脫細(xì)胞支架較好地保留了體內(nèi)肝臟的多種細(xì)胞外基質(zhì)成分、 生長(zhǎng)因子和活性分子，免疫原性低，復(fù)合肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞后由海藻酸鈣微球構(gòu)建的肝微單元較充分地對(duì)體內(nèi)肝組織微環(huán)境進(jìn)行模擬，在此條件下，能快速穩(wěn)定獲得肝細(xì)胞，并進(jìn)一步提高所獲得肝細(xì)胞的活性及功能；

3.由聚陽(yáng)離子制成的微囊半透膜可以起到有效的免疫隔離作用，降低構(gòu)建生物人工肝的免疫反應(yīng)；

4.肝微單元制備條件溫和，均在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，不影響構(gòu)建的肝微單元細(xì)胞活性，培養(yǎng)規(guī)模易放大，有利于臨床應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1A為本發(fā)明初始制備的微肝組織單元顯微圖；B為微肝組織單元內(nèi)兩種細(xì)胞熒光染色圖；

圖2為添加脫細(xì)胞基質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞白蛋白分泌的影響結(jié)果圖

組1：二維肝細(xì)胞，組2：三維微囊化肝細(xì)胞，組3：三維微囊化肝細(xì)胞(加0.2％脫細(xì)胞基質(zhì)成分)，組4：三維微囊化肝細(xì)胞+內(nèi)皮細(xì)胞(加0.2％脫細(xì)胞基質(zhì)成分)，組5：三維微囊化肝細(xì)胞+成纖維細(xì)胞(加0.2％脫細(xì)胞基質(zhì)成分)，組6：三維微囊化肝細(xì)胞+內(nèi)皮細(xì)胞+成纖維細(xì)胞(加0.2％脫細(xì)胞基質(zhì)成分)，結(jié)果顯示添加脫細(xì)胞基質(zhì)成分的C3A肝細(xì)胞的白蛋白分泌水平高于未添加組，多細(xì)胞共培養(yǎng)組所形成的三維微肝組織優(yōu)于肝細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組及兩種細(xì)胞共培養(yǎng)組；

圖3為細(xì)胞比例對(duì)三維微肝組織白蛋白分泌的影響結(jié)果圖

三維肝細(xì)胞+內(nèi)皮細(xì)胞+成纖維細(xì)胞比例(各組均加含量0.2％的脫細(xì)胞基質(zhì)成分)：組1為2：1：1，組2為1：1：1，組3為1：2：2，組4為1：3：3，組5為1：5：5，隨著共培養(yǎng)細(xì)胞中內(nèi)皮及成纖維細(xì)胞比例增加，三維微肝組織的白蛋白分泌有所增加，在比例為1：2：2時(shí)最高；

圖4為不同脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒濃度對(duì)三維微肝組織白蛋白分泌的影響結(jié)果圖

肝脫細(xì)胞基質(zhì)添加濃度(w/v)為組1：0％，組2：0.2％，組3：1％，組4：2％，組5：3％,組6：5％，結(jié)果為組5及組6白蛋白分泌最高，兩組間無(wú)顯著差異。

實(shí)施例1：多細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)三維微肝組織功能的影響

將小型豬麻醉，脫毛，消毒后，腹正中行十字切口，肝動(dòng)脈灌注肝素溶液抗凝，門(mén)靜脈插管并固定后經(jīng)蠕動(dòng)泵以5mL/min速度灌注37℃含有0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA的PBS溶液約2L灌注肝臟至土黃色，離斷肝周血管，取完整的肝左外葉于-80℃凍存24h，用 切片機(jī)將肝葉切成3mm厚2cm×2cm大小組織片，將肝組織片與脫細(xì)胞液按1:15(w/v)比例混合于瓶中置于200轉(zhuǎn)/分，4℃恒溫?fù)u床中。按雙蒸水24h，2％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水96h，0.1％(w/v)SDS 24h，雙蒸水72h依次脫細(xì)胞，將脫細(xì)胞組織片凍干后球磨粉碎為10μm大小顆粒，經(jīng)γ射線輻照消毒。稱(chēng)量脫細(xì)胞顆粒混合于RGD、YIGSR、IKVAV多肽修飾質(zhì)量比1：1：1濃度為2％(w/v)海藻酸鈉溶液中，制備含脫細(xì)胞支架顆粒的濃度為0.2％(w/v)的海藻酸鈉懸液。

將肝腫瘤細(xì)胞C3A、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、人皮膚成纖維細(xì)胞HSF按細(xì)胞數(shù)1：1：1比例與上述懸液混合，總細(xì)胞密度為4×10⁶cells/mL。使用微膠囊制備儀將混勻懸液滴入0.1mol/L氯化鈣溶液中鈣化30min，加入制備微球10倍體積的0.05％(w/v)多聚賴(lài)氨酸溶液成膜10min，用0.15％(w/v)海藻酸鈉溶液中和多余電荷，獲得粒徑為500μm包封脫細(xì)胞支架顆粒及共培養(yǎng)細(xì)胞的固態(tài)核心APA微膠囊(見(jiàn)圖1A)。將此微膠囊置于添加0.03mg/ml EGF，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中于37℃，含5％CO₂的靜態(tài)培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)。以單獨(dú)培養(yǎng)C3A細(xì)胞，C3A與HUVEC或HSF添加脫細(xì)胞支架顆粒的微膠囊培養(yǎng)組作對(duì)照(見(jiàn)圖1B)。培養(yǎng)14天后ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中白蛋白的分泌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示添加脫細(xì)胞基質(zhì)成分的C3A細(xì)胞的白蛋白分泌水平高于未添加組，三種細(xì)胞共培養(yǎng)組所形成的三維微肝組織優(yōu)于肝細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組及兩種細(xì)胞共培養(yǎng)組。

將肝腫瘤細(xì)胞C3A、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、人皮膚成纖維細(xì)胞HSF細(xì)胞數(shù)比例調(diào)整為2：1：1，1：1：1，1：2：2，1：3：3，1：5：5后，仍以原接種密度制備四種不同細(xì)胞包封比例的微膠囊，培養(yǎng)14天，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中白蛋白的分泌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)(圖3)隨著共培養(yǎng)細(xì)胞中內(nèi)皮及成纖維細(xì)胞比例增加，三維微肝組織的白蛋白分泌相應(yīng)增加，在1：2：2細(xì)胞比例時(shí)最高。

實(shí)施例2脫細(xì)胞基質(zhì)對(duì)三維微肝組織功能的影響

將小型豬麻醉，脫毛，消毒后，腹正中行十字切口，肝動(dòng)脈灌注肝素溶液抗凝，門(mén)靜脈插管并固定后經(jīng)蠕動(dòng)泵以5mL/min速度灌注37℃含有0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA的PBS溶液約2L灌注肝臟至土黃色，離斷肝周血管，取完整的肝左外葉于-80℃凍存24h，用切片機(jī)將肝葉切成3mm厚2cm×2cm大小組織片，將肝組織片與脫細(xì)胞液按1：15(w/v)比例混合于瓶中置于200轉(zhuǎn)/分，4℃恒溫?fù)u床中。按雙蒸水24h，2％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水96h，0.1％(w/v)SDS 24h，雙蒸水72h依次脫細(xì)胞，將脫細(xì)胞組織片凍 干后球磨粉碎為10μm大小顆粒，經(jīng)γ射線輻照消毒。稱(chēng)量后溶于RGD、YIGSR、IKVAV多肽修飾質(zhì)量比1：1：1濃度為2％(w/v)海藻酸鈉溶液中,獲得脫細(xì)胞支架顆粒的終濃度(w/v)為0％，0.2％，1％，2％，3％，5％的懸液。

將肝腫瘤細(xì)胞C3A、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、人皮膚成纖維細(xì)胞HSF按細(xì)胞數(shù)1：2：2比例與含不同濃度脫細(xì)胞基質(zhì)的海藻酸鈉懸液混合制備固態(tài)核心APA微膠囊培養(yǎng)2周，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中白蛋白的分泌。考察不同脫細(xì)胞基質(zhì)濃度對(duì)微肝組織功能的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，六組中以3％及5％脫細(xì)胞基質(zhì)添加組微肝組織的白蛋白分泌最高，兩組間無(wú)顯著差異。

綜上，細(xì)胞接種密度為4×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，在3％脫細(xì)胞基質(zhì)添加組，C3A：HUVEC：HSF細(xì)胞數(shù)比例為1：2：2條件下可獲得最高的白蛋白分泌。

結(jié)論：由說(shuō)明書(shū)附圖和實(shí)施例可見(jiàn)，本發(fā)明所獲得的微肝組織功能優(yōu)于單細(xì)胞或兩種細(xì)胞共培養(yǎng)組以及未添加脫細(xì)胞基質(zhì)組，可應(yīng)用于生物人工肝支持系統(tǒng)。