本發(fā)明屬于免疫細胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種免疫細胞用培養(yǎng)基及構(gòu)成該培養(yǎng)基的添加劑。

背景技術(shù)：

生物治療是繼手術(shù)、放療、化療后的第四種腫瘤治療模式。生物治療是通過調(diào)動宿主天然防衛(wèi)機制或給予天然產(chǎn)生的靶向性很強的物質(zhì)來達到臨床治療效果，生物領(lǐng)域中的一個重要方法就是免疫細胞療法，即將分離的自身免疫細胞在體外通過細胞因子誘導，擴增出大量具有高度細胞毒性的異質(zhì)細胞群，再回輸?shù)襟w內(nèi)發(fā)揮治療作用。此類免疫細胞的種類包括了淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)，腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，細胞毒淋巴細胞(CTL)等，在眾多的免疫細胞中，CIK細胞由于有殺瘤活性高，殺瘤譜廣，對多種耐藥細胞同樣敏感以及對正常骨髓造血前提細胞毒性更小等優(yōu)良特點，廣泛的應(yīng)用于臨床。

CIK細胞治療腫瘤的療效主要取決于輸注細胞的數(shù)量和殺傷活性。CIK細胞中最具細胞毒活性的是CD3+CD56+細胞(NKT細胞)，NKT細胞表面能夠同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性又具備NK細胞的非MHC限制性殺瘤的特點，然而NKT細胞在正常的外周血中含量極低，僅為1％左右。根據(jù)實驗觀察，清除一個腫瘤細胞需要上百個淋巴細胞，而1cm³大小的瘤塊中約有10億個瘤細胞。因此，在體外培養(yǎng)中，提高CIK細胞的絕對數(shù)量和其中的NKT細胞的比例對提高臨床治療效果至關(guān)重要。

傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)基含有異源血清成分，如牛血清。由于不同批次牛血清活性和因子的不一致，細胞培養(yǎng)中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的風險，制品中殘留的牛血清易引起接種者對血清的過敏反應(yīng)，導致產(chǎn)品和實驗結(jié)果的重現(xiàn)性差。若使用患者自身血清，必須較大量地使用患者的血液，造成患者的負擔增大。因此，人們希望在不使用或盡可能減少血清使用量的培養(yǎng)基中使免疫細胞增殖。

目前傳統(tǒng)的免疫細胞制備方法是先分離出外周血中的單個核細胞，用適合于淋巴細胞的培養(yǎng)液，加入適量的細胞因子進行刺激誘導，最終獲得一定數(shù)量的免疫細胞，但最終獲得的免疫細胞的增殖倍數(shù)和細胞毒性都不夠理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決上述技術(shù)問題。為此，本發(fā)明提供了一種免疫細胞用無血清培養(yǎng)基 及構(gòu)成該培養(yǎng)基的添加劑。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基在盡可能不向培養(yǎng)基中添加血清的情況下可以使免疫細胞得到迅速增殖。

本說明書中，“免疫細胞”是指與免疫應(yīng)答有關(guān)的所有細胞，主要包括T細胞、B細胞、殺傷細胞(K細胞)、自然殺傷細胞(NK細胞)、單核巨噬細胞等。其中T細胞和B細胞又稱為免疫活性細胞，因這類細胞受抗原刺激而被活化，分裂增殖、發(fā)生特異性免疫應(yīng)答。

作為在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的免疫細胞，主要是指識別抗原，產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細胞，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、K淋巴細胞、NK淋巴細胞等。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中進一步含有活性多糖和殼寡糖。其中，活性多糖優(yōu)選香菇多糖、褐藻多糖和海帶多糖，進一步優(yōu)選香菇多糖。殼寡糖是殼聚糖的降解產(chǎn)物，是自然界中唯一大量存在的堿性氨基酸寡糖。

培養(yǎng)基中的活性多糖濃度優(yōu)選0.5～20mg/L，進一步優(yōu)選2～10mg/L；殼寡糖濃度優(yōu)選1～40mg/L，進一步優(yōu)選5～36mg/L。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中進一步含有血清替代物。當本發(fā)明的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基時，可以最好的發(fā)揮本發(fā)明的效果。在本發(fā)明中，血清替代物優(yōu)選KSR(一種商業(yè)化的帶血清培養(yǎng)添加劑)、N2(一種商業(yè)化的血清替代添加劑，成分為胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮、腐胺、亞硒酸鈉)和B27(一種用于培養(yǎng)神經(jīng)細胞的無血清培養(yǎng)添加劑)的至少一種，但不限于這幾種。進一步優(yōu)選N2作為血清替代物。

培養(yǎng)基中的血清替代物濃度優(yōu)選0～20重量％，進一步優(yōu)選10～15重量％。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中進一步含有抗氧化劑。抗氧化劑具有程序性抑制細胞死亡作用。優(yōu)選維生素C、N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和2-巰基乙醇的至少一種，進一步優(yōu)選2-巰基乙醇。

培養(yǎng)基中的抗氧化劑濃度優(yōu)選0.01～20mg/L，進一步優(yōu)選0.1～15mg/L。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中進一步含有細胞生長因子。通過細胞生長因子對免疫細胞的誘導作用，實現(xiàn)免疫細胞的增殖。細胞生長因子優(yōu)選轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及表皮生長因子(EGF)。

培養(yǎng)基中的細胞生長因子濃度(含有多種時，為其總濃度)優(yōu)選0.05～100mg/L，進一步優(yōu)選0.5～10mg/L。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中進一步含有緩沖鹽。緩沖鹽可維持本發(fā)明的培養(yǎng)基的pH值保持在6.8～7.2之間。緩沖鹽優(yōu)選碳酸氫鈉、磷酸鹽和HEPEs。進一步優(yōu)選HEPEs。

培養(yǎng)基中的緩沖鹽濃度優(yōu)選0.05～5重量％，進一步優(yōu)選0.1～3重量％。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中進一步含有動物血清白蛋白。已知白蛋白可以增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷，進一步促進培養(yǎng)細胞的增殖。此外，白蛋白在血液中擔負著藥物的傳遞等作用。血清白蛋白優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和重組人血清白蛋白(rHSA)的至少一種，進一步優(yōu)選人血清白蛋白(HAS)。

培養(yǎng)基中的動物血清白蛋白濃度優(yōu)選2～20g/L，進一步優(yōu)選5～15g/L。

本發(fā)明的培養(yǎng)基除用于免疫細胞的增殖或保持的培養(yǎng)外，還可以對免疫細胞進行誘導培養(yǎng)。用于免疫細胞誘導培養(yǎng)時，可以進一步添加分化誘導劑。作為分化誘導劑，可選細胞因子、集落刺激因子、類固醇激素等，可以單獨使用也可聯(lián)合使用。如在本發(fā)明實例一中，CIK細胞的誘導培養(yǎng)基中加入的分化誘導劑為白介素2(IL-2)、白介素1α(IL-1α)、干擾素γ(IFN-γ)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CD3激發(fā)型單抗，其分化誘導劑的添加量與以往相同。

本發(fā)明的培養(yǎng)基除含有上述活性多糖和殼寡糖及血清替代物、進一步優(yōu)選含有上述抗氧化劑、細胞生長因子、動物血清白蛋白和緩沖鹽的一種以上之外，還可以與公知的細胞用培養(yǎng)基同樣。因此基本上通過在公知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)選無血清培養(yǎng)基中添加上述兩種必須成分、進一步優(yōu)選一種以上上述優(yōu)選的成分，可以獲得本發(fā)明的培養(yǎng)基。

以往公知的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基有：MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、Ham’s F-12培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基等。本發(fā)明中優(yōu)選IMDM培養(yǎng)基。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中的免疫細胞培養(yǎng)可以按照與以往同樣的方法進行，通常在37℃、5％CO2濃度和飽和濕度的環(huán)境下進行。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明所述培養(yǎng)基中添加活性多糖、殼寡糖和多種生物因子，可以高效擴增免疫細胞，提高了免疫細胞的生長速度和細胞毒性作用。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基中不含有血清，大大避免了含血清培養(yǎng)基的血清批次間不穩(wěn)定、有細胞毒性和大量異源蛋白等缺陷，為免疫細胞的臨床治療提供了很好的工具。

附圖說明

圖1是表示實施實例一中，不同實驗條件下的CIK細胞的增殖倍數(shù)變化示意圖。

圖2是表示實施實例一中，不同實驗條件下的CD3+CD4+T細胞的表達變化示意圖。

圖3是表示實施實例一中，不同實驗條件下的CD3+CD8+T細胞的表達變化示意圖。

圖4是表示實施實例一中，不同實驗條件下的CD3+CD56+T細胞的表達變化示意圖。

圖5是表示實施實例一中，不同實驗條件下的CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷率變化示意圖。

圖6是表示實施實例二中，不同實驗條件下的CIK細胞的增殖倍數(shù)變化示意圖。

圖7是表示實施實例三中，不同實驗條件下的CIK細胞的增殖倍數(shù)變化示意圖。

圖8是表示實施實例四中，不同實驗條件下的DC細胞的增殖倍數(shù)變化示意圖。

圖9是表示實施實例五種，不同實驗條件下的NK細胞的增殖倍數(shù)變化示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明作進一步的闡述，在實施實例中未注明具體實驗方法的，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。

實施實例一、CIK細胞的培養(yǎng)

Ⅰ、CIK細胞用培養(yǎng)基的配制

1.M-0培養(yǎng)基的配制

以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中加入N210％(v/v)、2-巰基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生長因子7.5mg/L、青/鏈霉素100U/mL。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.1，用0.22μm濾器過濾除菌，密封，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

在細胞培養(yǎng)時，以終濃度計，向M-0培養(yǎng)基中依次加入IFN-γ1000U/mL、CD3激發(fā)型單抗20mg/L、IL-1α100U/ml、IL-21000U/mL和GM-CSF1000U/mL。

2.M-1培養(yǎng)基的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中再加入活性多糖6mg/L。

3.M-2培養(yǎng)基(即本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基)的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中再加入殼寡糖20mg/L、活性多糖6mg/L。

Ⅱ、CIK細胞的誘導培養(yǎng)

CIK細胞的制備方法如下：

1.用常規(guī)方法從人外周血中分離獲得外周血單個核細胞(PBMC)，用M-0培養(yǎng)基懸浮，并調(diào)整細胞密度為1～2×10⁶/mL，37℃、5％CO2、飽和濕度條件下孵育2h。

2.收集懸浮細胞并調(diào)整細胞密度為1～2×10⁶/mL，轉(zhuǎn)移至F75培養(yǎng)瓶中，加入1000U/mL 的IFN-γ，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24h；

3.第二天加入CD3激發(fā)型單抗、IL-2、IL-1α、IFN-γ、GM-CSF，并分別加入M-0、M-1和M-2培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)7～15天，離心收集即可獲得的CIK細胞。

其中，加入培養(yǎng)基中的CD3激發(fā)型單抗的濃度為20mg/L，IL-2的濃度為1000U/mL，IL-1α的濃度為100U/mL、IFN-γ的濃度為1000U/mL、GM-CSF的濃度為1000U/mL；

4.步驟3.過程中，每隔3天換液一次，換液前后進行細胞計數(shù)，并根據(jù)細胞濃度補加相應(yīng)培養(yǎng)基和IL-2至相應(yīng)濃度。

Ⅲ、CIK細胞活性、細胞增值倍數(shù)和細胞表型的比較分析

分別在第3、6、9、12、15天收集各組培養(yǎng)的CIK細胞用于各項檢測。以下從幾個方面比較M-0、M-1和M-2組獲得的CIK細胞的差異性。

1、細胞活性的比較

將第3、6、9、12、15天收集M-0、M-1和M-2組培養(yǎng)的CIK細胞用0.4％的臺盼藍染色，然后用全自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，其中，死細胞被染成藍色，活細胞不被染色。具體情況見表1.

表1 不同實驗條件下，CIK細胞活性的變化

由表1可以看出，各組細胞活性均大于95％，但M-2組高于M-1組，高于M-0組，各組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2、細胞增殖倍數(shù)的比較

將各組取得的CIK細胞用0.4％的臺盼藍染液染色后進行細胞計數(shù)，將當前的細胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的單個核細胞數(shù)，數(shù)值即為細胞的增殖倍數(shù)。具體情況見表2和圖1。

表2 不同實驗條件下，CIK細胞增殖倍數(shù)的變化

由表2和圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，三組細胞均在增長，但在每個時間節(jié)點上，M-2組的增殖倍數(shù)都大于M-1組，更大于M-0組，三組在第15天時，增殖倍數(shù)達到高峰，且在培養(yǎng)15天時，相比M-0組，M-2組的CIK細胞增殖倍數(shù)提高了近4倍。

3、細胞免疫表型的比較

分別在第3、6、9、12、15天取各組的CIK細胞，離心，調(diào)整細胞密度為1×10⁶/mL,PBS洗滌2次，制備細胞懸液。分別加入檢測用鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC抗體10μl，同時設(shè)同型對照管，分別加入IgG1-PerCP、IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC，于室溫暗處孵育20min，PBS洗滌兩次，進行流式細胞檢測。具體情況見表3和圖2-4.

表3 不同實驗條件下，CIK細胞免疫表型的變化

由表3和圖2-4可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，三組細胞中的CD3+CD8+細胞及CD3+CD56+細胞比例都在增加，在培養(yǎng)第15天達到峰值；其中，CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞中，M-2組均明顯高于M-1和M-0組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CD3+CD4+ 細胞中，M-2組高于M-1組和M-0組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

Ⅳ、細胞對腫瘤殺傷活性的比較(MTT法)

本實施實例是對CIK細胞進行細胞毒性檢測，以培養(yǎng)的CIK細胞作為效應(yīng)細胞，K562腫瘤細胞作為靶細胞。按以下步驟進行：

96孔板內(nèi)接種對數(shù)生長期的K562腫瘤細胞并培養(yǎng)24h，之后按效靶比例10：1、20∶1以及40∶1比例加入各組培養(yǎng)第15天的CIK細胞，每孔設(shè)4個復孔，并設(shè)未與腫瘤細胞反應(yīng)的兩組CIK細胞為效應(yīng)細胞空白對照，共同培養(yǎng)24h后加入10μl新鮮配制的5mg/mL的MTT，共同培養(yǎng)4h后，離心吸棄上清液，每孔加入100μl的DMSO振蕩溶解10min，用酶標檢測儀在570nm處測定吸光度A值，計算殺傷率。具體情況見表4和圖5

殺傷率按如下公式計算：

殺傷率＝[1-(試驗孔A值-效應(yīng)細胞A值)/靶細胞對照孔A值]×100％

表4 不同實驗條件下，CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用

由表4和圖5可以看出，在不同效靶比作用下，CIK細胞的殺傷作用與效靶比呈正相關(guān)，在相同效靶比條件下，M-2組的殺傷率明顯高于M-1和M-0組，且組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

實施實例二、CIK細胞的培養(yǎng)

Ⅰ、CIK細胞用培養(yǎng)基的配制

2.M-0培養(yǎng)基的配制

以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中加入KSR 10％(v/v)、2-巰基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生長因子7.5mg/L、青/鏈霉素100U/mL。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.1，用0.22μm濾器過濾除菌，密封，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

在細胞培養(yǎng)時，以終濃度計，向M-0培養(yǎng)基中依次加入IFN-γ1000U/mL、CD3激發(fā)型單抗20mg/L、IL-1α100U/ml、IL-21000U/mL和GM-CSF1000U/mL。

2.M-1培養(yǎng)基的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中再加入活性多糖2mg/L。

3.M-2培養(yǎng)基(即本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基)的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中再加入殼寡糖5mg/L、活性多糖2mg/L。

Ⅱ、CIK細胞的誘導培養(yǎng)

CIK細胞的制備方法同實施實例一。

Ⅲ、CIK細胞活性和細胞增值倍數(shù)比較分析

分別在第3、6、9、12、15天收集各組培養(yǎng)的CIK細胞用于各項檢測。以下從幾個方面比較M-0、M-1和M-2組獲得的CIK細胞的差異性。

1、細胞活性的比較

將3、6、9、12、15天收集M-0、M-1和M-2組培養(yǎng)的CIK細胞用0.4％的臺盼藍染色，然后用全自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，其中，死細胞被染成藍色，活細胞不被染色。具體情況見表5.

表5 不同實驗條件下，CIK細胞活性的變化

由表5可以看出，各組細胞活性均大于95％，但M-2組活性均高于M-1組和M-0組，各組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2、細胞增殖倍數(shù)的比較

將各組取得的CIK細胞用0.4％的臺盼藍染液染色后進行細胞計數(shù)，將當前的細胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的單個核細胞數(shù)，數(shù)值即為細胞的增殖倍數(shù)。具體情況見表6和圖6。

表6 不同實驗條件下，CIK細胞增殖倍數(shù)的變化

由表6和圖6可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，三組細胞均在增長，但在每個時間節(jié)點上，M-2組的增殖倍數(shù)都大于M-1組和M-0組，且增殖倍數(shù)最高。

實施實例三、CIK細胞的培養(yǎng)

Ⅰ、CIK細胞用培養(yǎng)基的配制

3.M-0培養(yǎng)基的配制

以終濃度計，在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入KSR 10％(v/v)、2-巰基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生長因子7.5mg/L、青/鏈霉素100U/mL。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.1，用0.22μm濾器過濾除菌，密封，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

在細胞培養(yǎng)時，以終濃度計，向M-0培養(yǎng)基中依次加入IFN-γ1000U/mL、CD3激發(fā)型單抗20mg/L、IL-1α100U/ml、IL-21000U/mL和GM-CSF1000U/mL。

2.M-1培養(yǎng)基的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在DMEM/F12培養(yǎng)基中再加入活性多糖10mg/L。

3.M-2培養(yǎng)基(即本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基)的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在DMEM/F12培養(yǎng)基中再加入殼寡糖36mg/L、活性多糖10mg/L。

Ⅱ、CIK細胞的誘導培養(yǎng)

CIK細胞的制備方法同實施實例一。

Ⅲ、CIK細胞活性、細胞增值倍數(shù)和細胞表型的比較分析

分別在第3、6、9、12、15天收集各組培養(yǎng)的CIK細胞用于各項檢測。以下從幾個方面比較M-0、M-1和M-2組獲得的CIK細胞的差異性。

1、細胞活性的比較

將3、6、9、12、15天收集M-0、M-1和M-2組培養(yǎng)的CIK細胞用0.4％的臺盼藍染色，然后用全自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，其中，死細胞被染成藍色，活細胞不被染色。具體情況見表7.

表7 不同實驗條件下，CIK細胞活性的變化

由表7可以看出，各組細胞活性均大于95％，但M-2組高于M-1組，高于M-0組，各組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2、細胞增殖倍數(shù)的比較

將各組取得的CIK細胞用0.4％的臺盼藍染液染色后進行細胞計數(shù)，將當前的細胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的單個核細胞數(shù)，數(shù)值即為細胞的增殖倍數(shù)。具體情況見表8和圖7。

表8 不同實驗條件下，CIK細胞增殖倍數(shù)的變化

由表8和圖7可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，三組細胞均在增長，但在每個時間節(jié)點上，M-2組的增殖倍數(shù)都大于M-1和M-0組，且細胞增殖倍數(shù)最高。

實施實例四、DC細胞的培養(yǎng)

Ⅰ、DC細胞用培養(yǎng)基的配制

1.M-0培養(yǎng)基的配制

以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中加入N210％(v/v)、2-巰基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生長因子7.5mg/L、青/鏈霉素100U/mL。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.1，用0.22μm濾器過濾除菌，密封，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

在細胞培養(yǎng)時，以終濃度計，向M-0培養(yǎng)基中依次加入IL-4500U/mL、GM-CSF 1000U/mL、和TNF-α500U/mL。

2.M-1培養(yǎng)基的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中再加入活性多糖6mg/L。

3.M-2培養(yǎng)基的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中再加入殼寡糖20mg/L、活性多糖6mg/L。

Ⅱ、DC細胞的誘導培養(yǎng)

DC細胞的制備方法如下：

1.將實施實例一步驟Ⅱ1.中剩下的貼壁細胞分別加入含有IL-4和GM-CSF的M-0、M-1和M-2培養(yǎng)基，37℃、5％CO2、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)；

其中，加入IL-4的終濃度為500U/mL，加入GM-CSF的終濃度為1000U/mL；

2.步驟1.過程中，每隔2天換液一次，換液前后進行細胞計數(shù)，并根據(jù)細胞濃度補加相應(yīng)的培養(yǎng)基和細胞因子；

3.在培養(yǎng)的第六天，分別向M-0、M-1和M-2培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞中加入500U/mL TNF-α；

4.在培養(yǎng)的第八天，收獲DC細胞。

Ⅲ、DC細胞活性和細胞增值倍數(shù)的比較分析

分別在第2、4、6、8天收集各組培養(yǎng)的DC細胞用于各項檢測。以下從幾個方面比較M-0、M-1和M-2組獲得的DC細胞的差異性。

1、細胞活性的比較

將第2、4、6、8天收集M-0、M-1和M-2組培養(yǎng)的DC細胞用0.4％的臺盼藍染色，然后用全自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，其中，死細胞被染成藍色，活細胞不被染色。具體情況見表9.

表9 不同實驗條件下，DC細胞活性的變化

由表9可以看出，各組細胞活性均大于94％，三組之間M-2組細胞活性最高，且各組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2、細胞增殖倍數(shù)的比較

將各組取得的DC細胞用0.4％的臺盼藍染液染色后進行細胞計數(shù)，將當前的細胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的單個核細胞數(shù)，數(shù)值即為細胞的增殖倍數(shù)。具體情況見表10和圖8。

表10 不同實驗條件下，DC細胞增殖倍數(shù)的變化

由表10和圖8可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，三組細胞均在增長，但在每個時間節(jié)點上，M-2組的增殖倍數(shù)都大于M-1組，更大于M-0組。

實施實例五、NK細胞的培養(yǎng)

Ⅰ、NK細胞用培養(yǎng)基的配制

1.M-0培養(yǎng)基的配制

以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中加入N210％(v/v)、2-巰基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生長因子7.5mg/L、青/鏈霉素100U/mL。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.1，用0.22μm濾器過濾除菌，密封，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

在細胞培養(yǎng)時，以終濃度計，向M-0培養(yǎng)基中依次加入IL-2800U/mL、IL-1210mg/L和TNF-α10mg/L。

2.M-1培養(yǎng)基的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中再加入活性多糖6mg/L。

3.M-2培養(yǎng)基的配制

在M-0培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以終濃度計，在IMDM培養(yǎng)基中再加入殼寡糖20mg/L、活性多糖6mg/L。

Ⅱ、NK細胞的誘導培養(yǎng)

NK細胞的制備方法如下：

1.用常規(guī)方法從人外周血中分離獲得外周血單個核細胞(PBMC)，用M-0培養(yǎng)基懸浮，磁珠法對PBMC進行純化(磁珠用抗CD3抗體進行固定)。

2.將純化后的細胞轉(zhuǎn)移至F25培養(yǎng)瓶中，分別加入M-0、M-1和M-2培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)7～15天；

3.步驟2.中每隔3天換液一次，換液前后計數(shù)進行細胞計數(shù)，并根據(jù)細胞密度補加相應(yīng)培養(yǎng)基和細胞因子。

4.在培養(yǎng)的第15天，離心收獲NK細胞。

Ⅲ、NK細胞活性和細胞增值倍數(shù)的比較分析

分別在第3、6、9、12、15天收集各組培養(yǎng)的NK細胞用于各項檢測。以下從幾個方面比較M-0、M-1和M-2組獲得的NK細胞的差異性。

1、細胞活性的比較

將第3、6、9、12、15天收集M-0、M-1和M-2組培養(yǎng)的NK細胞用0.4％的臺盼藍染色，然后用全自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，其中，死細胞被染成藍色，活細胞不被染色。具體情況見表11.

表11 不同實驗條件下，NK細胞活性的變化

由表11可以看出，各組細胞活性均大于95％，但相同的時間節(jié)點上，M-2組、M-1組略高于M-0組，各組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2、細胞增殖倍數(shù)的比較

將各組取得的NK細胞用0.4％的臺盼藍染液染色后進行細胞計數(shù)，將當前的細胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的單個核細胞數(shù)，數(shù)值即為細胞的增殖倍數(shù)。具體情況見表12和圖9。

表12 不同實驗條件下，NK細胞增殖倍數(shù)的變化

由表12和圖9可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，M-0、M-1和M-2各組細胞均在增長，其中M-2組細胞增殖最快，增殖倍數(shù)近20倍，M-1組次之，M-0組細胞增殖最慢。