本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，尤其涉及一株具有溶藻能力的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著我國社會經(jīng)濟和城鎮(zhèn)化的迅速發(fā)展，大量城市生活污水、工業(yè)廢水和農(nóng)業(yè)面源污染排入江河湖泊，加速了水體污染和富營養(yǎng)化進程。太湖、巢湖和滇池等湖泊有毒藍藻(主要是微囊藻)水華頻繁暴發(fā)，危及多個大中城市的自來水供應(yīng)和飲用水安全。微囊藻水華可造成水體水質(zhì)變壞、發(fā)臭，所釋放的微囊藻毒素是一種七環(huán)肽，其性質(zhì)非常穩(wěn)定(煮沸不能使之失活)，毒性很強。研究顯示微囊藻毒素可能與人群中肝癌發(fā)病率提高相關(guān)。另一方面，高密度精養(yǎng)造成湖泊和池塘水質(zhì)惡化和微囊藻水華暴發(fā)，也造成水產(chǎn)動物的死亡和水產(chǎn)品的安全性降低。目前尚缺乏有效控藻手段，亟需開發(fā)有效的微囊藻水華控制措施。目前國內(nèi)外學者對如何治理藍藻水華展開了一系列的研究，其處理方法主要包括三個方向:一是物理方法，包括以打撈的方式機械除藻，在水華區(qū)域覆蓋板料或薄膜等遮光抑藻，以填料吸附藻類等，這種方法工作量大、耗時長、效率低；二是化學方法，如投加CuSO4等殺藻劑，這種方法的缺點是投加的化學藥劑對水生生物有毒害作用；三是生物方法，種群競爭抑藻、魚類吞噬除藻、微生物除藻和綜合防治法都是針對湖泊富營養(yǎng)化的生物控制技術(shù)。如:《武漢植物學研究》2005年第23卷第I期53-57頁報道了李修嶺的發(fā)現(xiàn):水龍可以漂浮于水面生長，去除氮磷的能力強，抑藻效果好且可操作性強?！董h(huán)境科學學報》2002年第22卷第6期732-737頁報道了陸開宏的研究成果:羅非魚能夠大量攝食并消化藍藻?！吨袊o排水》2011年第27卷第13期63-66頁報道了閔智的研究成果:草履蟲對銅綠微囊藻具有吞噬能力。對于大面積水體來說，物理、化學方法均不利于實施。目前，越來越多的研究人員在細菌的篩選與鑒定、溶藻特性、混合菌群構(gòu)建等方面對溶藻細菌進行了研究，從不同環(huán)境中分離出了多種溶藻細菌。《中國環(huán)境與科學》2008年第28卷第5期461-465頁報道汪輝等從青島市黃島邊的某富營養(yǎng)化池塘中分離得到I株具有溶解銅綠微囊藻作用的無色桿菌屬細菌；《微生物學通報》2012年第39卷第5期677-682頁報道崔璐璐等從水庫水體中篩選出I株溶藻細菌，經(jīng)鑒定為黃單胞菌科的寡養(yǎng)單胞菌。分離的溶藻細菌應(yīng)用于預防與控制藍藻暴發(fā)依然存在一定的局限性。據(jù)統(tǒng)計，溶藻細菌的來源主要是富營養(yǎng)化水體。如:公開號CN101139140A的發(fā)明專利，公開了一種利用微生物降解銅綠微囊藻的方法，從深度富營養(yǎng)化城市湖泊水體中分離純化得到Brevibacillusspp.FDK2,該細菌對銅綠微囊藻有較好的去除作用，去除率達到90％以上。公開號CN101955904A的發(fā)明專利，公開了一種自然水環(huán)境中的溶藻細菌分離方法，從富營養(yǎng)水體中分離出了高效溶藻細菌DC1，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，該方法分離的溶藻細菌能夠有效控制魚腥藻的生長。由于藍藻的暴發(fā)不僅限于城市湖泊，大面積的自然水體如太湖、滇池、巢湖等大面積的水域同樣存在相似的問題，藍藻水華污染的難題尚未有有效的解決方法。傳統(tǒng)的治理方法如機械除藻，高頻電磁脈沖以及利用除草劑等方法，常受到成本和環(huán)境安全性問題等諸多因素的限制。相比之下，生物控藻技術(shù)成本低、安全性好，其中溶藻細菌因其較高的除藻效力，成為防治水華和赤潮的一個新方向。為有效控制微囊藻水華暴發(fā)及在水華暴發(fā)后進行應(yīng)急控制，篩選具有生物安全性、無毒副作用、不污染環(huán)境的殺藻劑已成為必然的趨勢。溶藻細菌(algae-lysingbacteria)是一類以直接或間接方式抑制藻類生長，或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統(tǒng)稱，作為水生生態(tài)系統(tǒng)中生物種群結(jié)構(gòu)和功能的一個重要組成部分，對水華和赤潮的控制、維持藻類生物量的平衡有非常重要的作用，它們對浮游植物的溶解作用也可能是調(diào)節(jié)水生生態(tài)系統(tǒng)中初級生產(chǎn)力的一個重要因素。水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻細菌的感染有關(guān)。溶藻細菌作為水華和赤潮防治的生物，引起了國內(nèi)外不少學者的關(guān)注，近年來國外不斷分離出新的溶藻細菌。相對而言，國內(nèi)報道較少，近十多年來幾乎處于停滯狀態(tài)。如郭吉等從太湖分離到對銅綠微囊藻有溶藻作用的芽孢桿菌；劉晶等也在廣州富營養(yǎng)化的池塘中分離到對銅綠微囊藻和水華魚腥藻具有溶藻功能的蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌等。溶藻細菌抑制微藻的生長主要通過以下方式：直接接觸溶藻、分泌溶藻物質(zhì)、與微藻競爭營養(yǎng)物質(zhì)、形成菌膠膜、進入藻細胞殺藻。直接接觸溶藻是指溶藻細菌主動攻擊接觸微藻(藻細胞)后，侵入并破壞其細胞結(jié)構(gòu)從而殺滅微藻。粘細菌與CFB菌群的細菌大多通過直接方式溶藻，如Imai報道噬胞菌(J18/M01)的培養(yǎng)物對硅藻有強烈的溶解作用，而無菌濾液則不起任何作用。KANG等發(fā)現(xiàn)一株惡臭假單胞菌通過直接溶藻方式殺死冠盤藻。其二，是通過釋放特異性或非特異性的胞外活性物質(zhì)溶藻。這類細菌有芽孢桿菌、假單胞菌、黃桿菌、交替單胞菌、假交替單胞菌等，目前已分離和鑒定的活性物質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物、生物堿、色素。Lee等報道海洋細菌假交替單胞菌A28分泌絲氨酸蛋白酶其上清液能殺滅骨條藻。Jeong等從一株可強烈殺滅多環(huán)旋溝藻的芽孢桿菌SY-I中分離得到一種溶藻物質(zhì)Bacillamide，可抑制多環(huán)旋溝藻水華。Yoshikawa等報道溶藻細菌C-979(Vibriosp.)可產(chǎn)生β-氰基-L-丙氨酸(L-CNAla)，它對一些藍藻有明顯抑制作用。Kawamo從菌株ΡΚ654分離出抗生素Thiotropicin,可抑制中肋骨條藻及赤潮異彎藻。Volk等從Nodulariaharveyana和Nostocinsulare分離出卩引哚類生物喊，可溶解螺旋藻。Jeong等發(fā)現(xiàn)Hahellachejuensis細菌可合成一種具有由3個批咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)的靈菌紅素，它具有強烈的細胞溶解酶活性，能殺死引起赤潮的微藻。Nokuyubi等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌N-14可分泌一種非蛋白類物質(zhì)對微囊藻具有溶藻效應(yīng)。此外，細菌還可通過與微藻競爭營養(yǎng)、形成菌膠膜等方式抑制微藻生長。目前，國內(nèi)外溶藻細菌一般分離自因富營養(yǎng)化而發(fā)生水華或赤潮的湖泊及海洋，大多為革蘭氏陰性菌。由于溶藻細菌在自然水體中存在的比率比較低，故采用傳統(tǒng)的方法需要濃縮大量水樣，耗時長且很難獲得理想溶藻細菌。因此，采用基因工程的方法對已知的溶藻細菌進行特異性的改造，從而獲得溶藻效果更佳光譜，溶藻效果更好的菌是最好的研究方向。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明采用基因工程的方法構(gòu)建得到一株具有溶藻能力的解淀粉芽孢桿菌，驗證了所述的解淀粉芽孢桿菌的溶藻效果。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一株具有溶藻能力的SZ多肽，所述多肽的氨基酸序列如VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA所示。所述的多肽為從嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，保藏號：CCTCCN0:M2013129中分離得到。本發(fā)明另外提供一種具有溶藻能力的SZ多肽的分離鑒定方法，所述方法包括:(1)培養(yǎng)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，30℃200r/min培養(yǎng)20小時得到培養(yǎng)液；離心去除菌體以及大顆粒雜質(zhì)；(2)將離心上清液，經(jīng)過丙酮預處理以降低雜質(zhì)含量；(3)將處理過的樣品在非變性條件下進行等電聚焦IEF，IEF之后從凝膠上切下兩根寬度相同的IEF膠條，在緩沖液A中平衡后進行第二向的聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺制備非變性凝膠，上槽緩沖液的組分為Tris-base，Tricine和SDS，恒壓電泳至溴酚藍前緣到達底部；(4)將PAGE所得的兩塊膠分別處理，一塊膠用考馬斯亮藍CBB染色，脫色后用做備份，另一塊膠則經(jīng)電印跡，將蛋白質(zhì)斑點轉(zhuǎn)移到NC膜上，使用不含SDS的緩沖液A；(5)經(jīng)過0.01～0.2MTris-Cl，pH＝7.5的緩沖液漂洗除去SDS，將NC膜真空干燥；(6)在NC膜上均勻地分布藍藻，使其密度達到1.5×103～2×105CFU/mm2后，將膜置于牛肉膏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含顯色劑；同時含有藍藻生長所需的底物，該底物經(jīng)藍藻代謝能產(chǎn)生酸性產(chǎn)物；在NC膜上正常生長的藍藻由于其代謝產(chǎn)物呈酸性因而在其周圍呈亮黃色，而有抗藻肽斑點的地方藍藻生長受抑制，故而和周圍呈現(xiàn)出色差，為暗色的斑點；(7)將NC膜上的斑點與雙向電泳所得到的凝膠上的斑點相對照，將凝膠上對應(yīng)于NC膜上抗藻肽色斑的斑點切下，然后對這些斑點用質(zhì)譜指紋圖，N端序列分析，氨基酸組成分析進行微量鑒定。(8)通過效果分析，發(fā)現(xiàn)了11個具有抑藻活性的多肽，其中有2個多肽抑藻活性特別顯著，其序列分別為VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA所示。本發(fā)明另外提供一種將抗菌肽導入到枯草芽孢桿菌中從而提高殺藻的廣譜性以及殺藻活性的方法，該方法包括：獲得P43啟動子與合成的編碼VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA的核苷酸序列(兩端分別帶有BamHI和SmaI酶切位點)，而后將二者通過酶切與PHCMC-P43載體相連，最后導入到解淀粉芽孢桿菌中獲得。其中解淀粉芽孢桿菌優(yōu)選為保藏編號為CCTCCM2012184的菌株。本發(fā)明另外提供一種菌劑，活性成分為導入了殺菌肽的枯草芽孢桿菌CCTCCM2012534,其中殺菌肽的氨基酸序列為VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA所示；本發(fā)明另外提供一種粉劑或片劑，由所述菌劑制備而成。本發(fā)明另外提供一種所述菌株和/或所述菌劑和/或所述粉劑和/或所述片劑，在殺滅有害藻類中的應(yīng)用，所述有害藻類為銅綠微囊藻、水華微囊藻，假絲微囊藻和赤潮導灣藻；在防治水華和赤潮中的應(yīng)用；在水產(chǎn)養(yǎng)殖中治理水體環(huán)境中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)效果：通過針對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的發(fā)酵液進行特異的分析，篩選得到了二個具有殺藻活性的多肽，該多肽導入到枯草芽孢桿菌中后得到的發(fā)酵液具有較好的殺死藻類的效果。具體實施方式實施例1殺藻多肽的獲得(9)培養(yǎng)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，30℃200r/min培養(yǎng)20小時得到培養(yǎng)液；離心去除菌體以及大顆粒雜質(zhì)；(10)將離心上清液，經(jīng)過丙酮預處理以降低雜質(zhì)含量；(11)將處理過的樣品在非變性條件下進行等電聚焦IEF，IEF之后從凝膠上切下兩根寬度相同的IEF膠條，在緩沖液A中平衡后進行第二向的聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺制備非變性凝膠，上槽緩沖液的組分為Tris-base，Tricine和SDS，恒壓電泳至溴酚藍前緣到達底部；(12)將PAGE所得的兩塊膠分別處理，一塊膠用考馬斯亮藍CBB染色，脫色后用做備份，另一塊膠則經(jīng)電印跡，將蛋白質(zhì)斑點轉(zhuǎn)移到NC膜上，使用不含SDS的緩沖液A；(13)經(jīng)過0.01～0.2MTris-Cl，pH＝7.5的緩沖液漂洗除去SDS，將NC膜真空干燥；(14)在NC膜上均勻地分布藍藻，使其密度達到1.5×103～2×105CFU/mm2后，將膜置于牛肉膏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含顯色劑；同時含有藍藻生長所需的底物，該底物經(jīng)藍藻代謝能產(chǎn)生酸性產(chǎn)物；在NC膜上正常生長的藍藻由于其代謝產(chǎn)物呈酸性因而在其周圍呈亮黃色，而有抗藻肽斑點的地方藍藻生長受抑制，故而和周圍呈現(xiàn)出色差，為暗色的斑點；(15)將NC膜上的斑點與雙向電泳所得到的凝膠上的斑點相對照，將凝膠上對應(yīng)于NC膜上抗藻肽色斑的斑點切下，然后對這些斑點用質(zhì)譜指紋圖，N端序列分析，氨基酸組成分析進行微量鑒定。(16)通過效果分析，發(fā)現(xiàn)了11個具有抑藻活性的多肽，其中有2個多肽抑藻活性特別顯著，其序列分別為VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA所示。實施例2基因工程菌解淀粉芽孢桿菌的構(gòu)建以枯草芽孢桿菌{Bacillussubtilis)ATCC9943基因組DNA為模板PCR擴增P43啟動子基因，獲得300bp基因片段；擴增引物為P43-F～5’GCGAGCTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGC3’-SacI；P43-R5'GCGGGATCCCATGTGTACATTCCTCTCTT3’-BamHI。用BernHI/SeicI雙酶切后獲得P43啟動子基因片段，與經(jīng)過相同雙酶切處理的PHCMC04載體(購自Bacillusgeneticstockcenter，ECE189P)，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pHCMC-P43載體，酶切驗證正確后于-20℃條件下保存?zhèn)溆?；VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA在上海生工合成其分別對應(yīng)的核苷酸序列，兩端分別帶有BamH/SmaI酶切位點。用BamH/SmaI雙酶切后獲得SJT片段，與經(jīng)過相同雙酶切處理的PHCMC-P43載體，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pHCMC-SJT載體，酶切驗證正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用于下一步轉(zhuǎn)化；以保藏編號為CCTCCM2012184的解淀粉芽孢桿菌制備感受態(tài)細胞，采用電轉(zhuǎn)化方法，將獲得的pHCMC-SJT載體轉(zhuǎn)化入解淀粉芽孢桿菌，氯霉素平板上篩選得到氯霉素抗性菌株12株，命名為解淀粉芽孢桿菌SJT；質(zhì)粒pHCMC-SJT可以在桿菌中過量表達所述的多肽，成為超量表達多肽的菌株，即為所希望得到的菌株。菌株的分子驗證對桿菌進行分子驗證。由于菌株內(nèi)含有pHCMC-SJT質(zhì)粒，所以我們從轉(zhuǎn)化菌株中提取質(zhì)粒pHCMC_SJT來驗證其是否被成功轉(zhuǎn)化入桿菌中。經(jīng)過提取質(zhì)粒，電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)桿菌中確實含有pHCMC-SJT質(zhì)粒。經(jīng)過分子生物學驗證，我們確實得到了超量表達SJT的解淀粉芽孢桿菌。實施例3溶藻活性檢測1、發(fā)酵上清液的制備將解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，所述芽孢桿菌發(fā)酵液4℃12000rpm離心10min，收集上清液，所得上清液即發(fā)酵上清液。離心后的菌體加滅菌水還原到原來的體積，即菌體懸液。2、藻類的培養(yǎng)將購買的銅綠微囊藻、水華微囊藻、假絲微囊藻和赤潮導灣藻藻種于2000LX、25℃條件下的光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔3h人工搖動一次(均在無菌條件下進行)，持續(xù)預培養(yǎng)一周，并鏡檢有無雜藻和藻類生長情況，如達到同步良好生長，就可作為試驗的藻種液。銅綠微囊藻、水華微囊藻、假絲微囊藻和赤潮導灣藻分別按照本領(lǐng)域常規(guī)的藻類培養(yǎng)方法，培養(yǎng)得到藻液。3、抑藻活性檢測分別將150μL菌體懸液、發(fā)酵上清液接種于30mL四種藻液中，對照Control為Landy培養(yǎng)基,進行溶藻實驗，7d后測定葉綠素a含量，計算抑藻率，比較發(fā)酵液不同處理方式對銅綠微囊藻的影響。結(jié)果:發(fā)酵上清液的抑藻率遠遠大于菌體懸浮液的抑藻率。表明本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌主要是通過分泌胞外物質(zhì)的間接方式起到溶藻作用。所述結(jié)果如下：同時采用常規(guī)的觀測指標進行檢驗也可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵上清液針對四種藻類的顯微鏡鏡檢藻細胞幾乎沒有完整細胞存在；肉眼觀察藻液顏色出現(xiàn)明顯的黃化現(xiàn)象，說明葉綠素被破壞嚴重。實施例4.溶藻活性成分的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性檢測為了研究發(fā)酵上清液中溶藻活性成分在不同的地理環(huán)境氣候和水質(zhì)中使用時的穩(wěn)定性，我們將發(fā)酵上清液分別在0℃、10℃、25℃、37℃、100℃溫度下處理30min；將發(fā)酵上清液通過添加HCl或NaOH調(diào)節(jié)其pH為4、5、6、7、8、9，分別接種150μL各pH發(fā)酵上清液于30mL銅綠微囊藻藻液中，來檢測這些處理對銅綠微囊藻生長繁殖的抑制作用。結(jié)果:發(fā)酵上清液100℃處理后，溶藻率仍然高達89.56％，其他溫度處理后溶藻率仍在98％以上。發(fā)酵上清液調(diào)為各pH值處理后，均不影響溶藻活性成分，溶藻率分別為96.7％、96.8％、97.2％、99.20％、98.56％、98.43％都在95％以上。表明起到有效抑藻作用的胞外分泌物具有熱穩(wěn)定性且在偏酸或偏堿的條件下均不影響其活性。溶藻活性成分具有很好的熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性。實施例5動物安全性檢測(1)人工感染試驗：取健康鯽魚30尾，分為2組，每組15尾，其中一組為試驗組，一組為對照組。在試驗組水體中加入本發(fā)明的芽孢桿菌，使水體的含菌量達109cfu/mL，進行人工感染試驗。觀察感染過程中鯽魚的活動狀況、發(fā)病及死亡情況。(2)人工注射試驗：離心收集培養(yǎng)24h的菌體，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為0.75％無菌生理鹽水洗滌并配制成109cfu/mL的菌懸液，取健康鯽魚30尾，分為2組，每組15尾，其中一組為試驗組，一組為對照組。試驗組鯽魚每尾腹腔接種0.1mL經(jīng)上述處理的菌懸液，對照組注射0.1mL無菌生理鹽水。觀察注射后鯽魚的活動狀況、發(fā)病及死亡情況。于注射后第15d剖解鯽魚，觀察內(nèi)臟器官有無病理變化。結(jié)果如下：死亡率(％)活力攝食情況內(nèi)臟情況人工感染實驗0無不良反應(yīng)正常健康人工注射實驗0無不良反應(yīng)正常健康從以上結(jié)果可以看出，所述的菌對養(yǎng)殖動物是安全的，在試驗周期內(nèi)無死亡現(xiàn)象，攝食正常，在人工注射實驗中同樣沒有出現(xiàn)不良現(xiàn)象。上述對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。當前第1頁1 2 3