本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基領(lǐng)域，具體地涉及體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)所使用的培養(yǎng)基以及用于構(gòu)成該培養(yǎng)基的添加劑。

背景技術(shù)：

哺乳動(dòng)物細(xì)胞是細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)。其所述細(xì)胞含有包括人在內(nèi)的哺乳類的具有多分化功能的細(xì)胞以及這些細(xì)胞分化出來的細(xì)胞。推進(jìn)培養(yǎng)這些細(xì)胞，使其快速增殖，成為該領(lǐng)域研究性和生產(chǎn)性的關(guān)鍵。

已知哺乳動(dòng)物細(xì)胞離體后，通常培養(yǎng)在添加了10％左右的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖。但是作為血清，通常來自于所培養(yǎng)的細(xì)胞的自體血液(例如采集了要培養(yǎng)的體細(xì)胞的患者血液)，或牛血清等其他來源血清。但是，使用來自自體的血清時(shí)，必須較大量地使用患者的血液，因此加重了患者的負(fù)擔(dān)。而使用來自其他種的血清時(shí)，存在可能混入未知的病毒或者朊病毒等感染性病原體的問題。由于任何血清的成分都尚未完全了解，根據(jù)所使用的血清的來源或者市售產(chǎn)品批次的不同，其所含有的成分也可能不同，因此在大量使用血清進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，難以使培養(yǎng)所得的細(xì)胞品質(zhì)一致。因此，人們希望能夠在不使用血清情況下使體細(xì)胞同樣能夠快速穩(wěn)定增殖。

目前市面上共知的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基有：Eagle培養(yǎng)基等的最小必需培養(yǎng)基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、最小必需培養(yǎng)基α(MEM-α)、間葉系細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MSCBM)、Ham’s F-12和F-10培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、Williams培養(yǎng)基E、RPMI-1640培養(yǎng)基、MCDB培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、Fisher培養(yǎng)基、Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)、McCoy改良培養(yǎng)基等，其中RPMI-1640培養(yǎng)基由于適用性強(qiáng)，被廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。但是，由于RPMI-1640培養(yǎng)基往往在培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)會(huì)添加血清，進(jìn)而容易造成細(xì)胞污染或病原體侵染。同時(shí)，由于RPMI-1640培養(yǎng)基不具有所培養(yǎng)細(xì)胞種類的專一性，所以針對(duì)某些特殊細(xì)胞而言，反而造成細(xì)胞增殖能力的相對(duì)下降。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所需解決的問題

本發(fā)明的課題在于提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及其添加劑，所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，在盡可能地抑制在培養(yǎng)基中添加血清的情況下可以有效地使哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞增殖。用于解決課題的方法

本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過在培養(yǎng)基中摻混鹿茸活性多糖成分，可以使哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞有效增殖。從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有鹿茸活性多糖成分。本發(fā)明還提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基的添加劑，該添加劑含有鹿茸活性多糖。

發(fā)明的效果

本發(fā)明的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑可以在不使用血清的條件下，有效地使哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖。因此，可以解決由于使用血清而產(chǎn)生的問題。即，對(duì)患者的負(fù)擔(dān)、感染性病原體的混入等問題。通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法，可以抑制血清的使用量來培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以提供穩(wěn)定品質(zhì)的培養(yǎng)體細(xì)胞。因此，所得到的培養(yǎng)細(xì)胞是感染性病原體混入問題被抑制到最小限度的穩(wěn)定品質(zhì)的培養(yǎng)體細(xì)胞。

實(shí)施發(fā)明的最佳方式

本說明書中，“哺乳動(dòng)物細(xì)胞”是指哺乳動(dòng)物細(xì)胞中除了增殖細(xì)胞以外的細(xì)胞，包括為某種目的進(jìn)行特化而不會(huì)成為除此以外的細(xì)胞的分化細(xì)胞，以及具有分化為具有幾種不同功能細(xì)胞能力的細(xì)胞。前者的細(xì)胞是成體的功能性細(xì)胞，包括皮膚細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、血液系細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等形成生物體內(nèi)各器官的細(xì)胞。后者稱為干細(xì)胞，是可分化轉(zhuǎn)換為上述已分化的細(xì)胞中至少一種以上的分化細(xì)胞的細(xì)胞，包含胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。“成體干細(xì)胞”是具有分化為具有幾種不同功能的細(xì)胞的能力的干細(xì)胞和前體細(xì)胞中除了胚胎干細(xì)胞以外的細(xì)胞，包括誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間葉系干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞等。

作為在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，只要是哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞即可，沒有任何限定。優(yōu)先的實(shí)例可例T淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞等成體干細(xì)胞，但并不受其限定。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中含有鹿茸活性多糖作為必須成分。鹿茸活性多糖與其它多糖相比，除具有其它活性多糖的生物功能外，還有獨(dú)特的生物活性，硫酸鹿茸軟骨素是其主要成分之一，同時(shí)它還含有生長因子。它們能促進(jìn)骨生長、傷口愈合和治療腫瘤。此外，通過我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸活性多糖可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且效果顯著。

鹿茸活性多糖成分的獲取途徑和方法也較為簡(jiǎn)單。主要經(jīng)過鹿茸水浸、細(xì)胞破碎、膠體磨研磨、多次凍融、加酶水解、反復(fù)沉降等操作后，可以得到純化的鹿茸多糖。

附圖說明

圖1是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.01mM)

圖2是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.1mM)

圖3是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為5mM)

圖4是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為10mM)

圖5是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為100mM)

圖6是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.01mM)

圖7是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.1mM)

圖8是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為5mM)

圖9是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為10mM)

圖10是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為100mM)

圖11是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.01mM)

圖12是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.1mM)

圖13是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為5mM)

圖14是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為10mM)

圖15是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為100mM)

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

需要說明的是，在下列實(shí)例中，如未進(jìn)行特殊說明，以下術(shù)語和培養(yǎng)基的組分如下所述：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：為人工制備的含有糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、脂質(zhì)等細(xì)胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)品。本發(fā)明所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

血清替代物：為一類商品化代替血清的培養(yǎng)物添加劑，成分一般確定。本發(fā)明所用的血清替代物是N2(一種商業(yè)化的血清替代添加劑，成分為胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮、腐胺、亞硒酸鈉)。

鹿茸活性多糖：為本培養(yǎng)基的添加劑，主要是從鹿茸干細(xì)胞中提取純化的多糖類物質(zhì)。成分較為復(fù)雜。主要含有香菇多糖、蟲草多糖、硫酸鹿茸軟骨素以及一些生長因子等。其中，以往的實(shí)驗(yàn)研究表明，硫酸鹿茸軟骨素是鹿茸活性多糖的最主要成分，具有促進(jìn)骨質(zhì)細(xì)胞生長、傷口愈合及治療腫瘤的功效。其用于細(xì)胞培養(yǎng)基的組成成分報(bào)道未曾出現(xiàn)。

培養(yǎng)基中的鹿茸多糖成分的濃度(含有多種時(shí)，為其總濃度)通常是0.01-100mM左右，進(jìn)一步優(yōu)選0.1-10mM。其中，硫酸鹿茸軟骨素在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選0.1-100mM，進(jìn)一步優(yōu)選0.25-20mM。香菇多糖在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為0.25-10mM，進(jìn)一步優(yōu)選0.5-5mM。蟲草多糖在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為0.25-10mM，進(jìn)一步優(yōu)選0.5-5mM。

本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)選含有抗氧化劑?？寡趸瘎┑膬?yōu)選實(shí)例是L-半胱氨酸。已知抗氧化劑具有程序性細(xì)胞死亡抑制作用，因此對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的保持、增殖有效?？寡趸瘎┛梢詥为?dú)使用，也可以將兩種以上組合使用。培養(yǎng)基中的抗氧化劑濃度(含有多種時(shí)，為其總濃度)優(yōu)選0.01mM-10mM，進(jìn)一步優(yōu)選0.1mM-1mM。

本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選進(jìn)一步含有生長因子。通過含有生長因子，可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖。生長因子的優(yōu)選實(shí)例是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)及表皮生長因子(EGF)。這些生長因子本身在該領(lǐng)域都是周知的。生長因子可以單獨(dú)使用也可以將兩種以上組合使用。培養(yǎng)基中的生長因子濃度(含有多種時(shí)，為其總濃度)優(yōu)選0.1-100ng/mL，進(jìn)一步優(yōu)選1-10ng/mL。

本發(fā)明的培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有表面活性劑?？梢哉J(rèn)為，通過含有低濃度的表面活性劑，具有減少對(duì)細(xì)胞膜的不良影響的效果。已知如果將高濃度的表面活性劑添加到培養(yǎng)基中，則抑制細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。表面活性劑的優(yōu)選實(shí)例是烷基苯氧基聚乙二醇。表面活性劑的濃度(含有多種時(shí)，為其總濃度)通常為0.1-100ng/mL，優(yōu)選1-10ng/mL。

本發(fā)明的培養(yǎng)基可以與常規(guī)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基同樣地含有血清，但通過含有血清替代物及鹿茸多糖成分，即使是不含有血清的培養(yǎng)基也可以使細(xì)胞高效增殖。因此培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基時(shí)，可以最良好地發(fā)揮本發(fā)明的效果。即，相對(duì)于培養(yǎng)基總量，本發(fā)明的培養(yǎng)基中的血清含量?jī)?yōu)選0％。

本發(fā)明的培養(yǎng)基除含有鹿茸多糖成分，進(jìn)一步優(yōu)選含有上述抗氧化劑、血清替代物、生長因子和表面活性劑的一種以上之外，還可以與公知的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基同樣。因此基本上通過在公知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加上述兩種必須成分、進(jìn)一步優(yōu)選一種以上上述優(yōu)選的成分，可以獲得本發(fā)明的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的培養(yǎng)基可以含有周知的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基中含有的各種添加劑。上述周知的添加劑可例舉：氨基酸類、無機(jī)鹽類、維生素類和碳源或抗生素等其它的添加劑。

作為氨基酸類，可例舉：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。

作為無機(jī)鹽類，可例舉：氯化鈣、硫酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鋅和硒酸。

作為維生素類，可例舉：膽堿、維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B4、維生素B5、維生素B6、維生素B7、維生素B12、維生素B13、維生素B15、維生素B17、 維生素Bh、維生素Bt、維生素Bx、維生素C、維生素D、維生素E、維生素F、維生素K、維生素M和維生素P。

將這些添加劑添加到哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基中，這本身是公知的，各添加劑的添加量也可以與公知的培養(yǎng)基同樣，還可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)適當(dāng)設(shè)定。例如氨基酸類的添加量通常是每種氨基酸為5mg/L-500mg/L左右，優(yōu)選10mg/L-400mg/L左右，無機(jī)鹽類的添加量通常是每種無機(jī)鹽類為0mg/L-10g/L左右，優(yōu)選0.01mg/L-7g/L左右，維生素的添加量是每種維生素為0.01mg/L-500mg/L左右，優(yōu)選0.05mg/L-300mg/L左右。

作為其它添加劑，可例舉：(1)皮質(zhì)酮、孕酮等的生長因子，(2)青霉素、鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素等抗生素，(3)葡萄糖、半乳糖、果糖和蔗糖等碳源，(4)鎂、鐵、鋅、鈣、鉀、鈉、銅、硒、鈷、錫、鉬、鎳和硅等微量金屬元素以及腺苷5’一磷酸、皮質(zhì)酮、乙醇胺、胰島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、次黃嘌呤、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲腺原氨酸、運(yùn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等其它添加劑。這些添加劑的添加量也與以往同樣，還可以根據(jù)各添加劑的目的通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)適當(dāng)設(shè)定。通常為0.001mg/L-5g/L，特別為0.1-3g/L左右。

本發(fā)明的培養(yǎng)基除用于為了體細(xì)胞的增殖或保持的培養(yǎng)之外，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞為干細(xì)胞時(shí)，可以用于干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。用于干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)時(shí)，可以進(jìn)一步添加分化誘導(dǎo)劑。作為分化誘導(dǎo)劑，可例舉：細(xì)胞因子(各種白細(xì)胞介素、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素等)、集落刺激因子(例如G-CSF等)、類固醇激素(地塞米松等)、吲哚(吲哚美辛)、噻唑烷衍生物(羅西格列酮等)等?？梢允褂盟鼈兊囊环N或多種。分化誘導(dǎo)劑的添加量也與以往同樣，通常相對(duì)于培養(yǎng)基的總量可以加入1×10-10至1×10-6重量％左右。

本發(fā)明的培養(yǎng)基可以含有上述各種添加劑的一種或多種。通?？梢越M合含有多種添加劑。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞培養(yǎng)本身可以按照與以往同樣的方法進(jìn)行，通常在30-37℃的溫度和5％CO₂的環(huán)境下以及5-21％O₂的環(huán)境下進(jìn)行。

本發(fā)明還提供用于構(gòu)成上述本發(fā)明的培養(yǎng)基的添加劑。因此，本發(fā)明的添加劑含有鹿茸多糖。進(jìn)一步優(yōu)選含有上述優(yōu)選的各種成分。還進(jìn)一步優(yōu)選含有上述各種添加劑的一種或多種。就本發(fā)明的添加劑而言，如下添加劑是簡(jiǎn)便的，因而優(yōu)選，所述添加劑具有通過溶解于水或基礎(chǔ)培養(yǎng)基中而可以形成上述本發(fā)明培養(yǎng)基的組成。這種情況下，添加劑中所含的各種成分的摻混比例與培養(yǎng)基中各成分的含量的比例相同。需說明的是，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可例舉以往在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的上述培養(yǎng)基。

實(shí)施例1：來自人外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的培養(yǎng)

(1-1)鹿茸活性多糖的配制

將2mg的鹿茸活性多糖溶解于1mL PBS中，制備鹿茸活性多糖添加劑(A)。

(1-2)人外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的增殖

在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無機(jī)鹽類(上述全部無機(jī)鹽類)、維生素類(上述全部維生素類)以及其他添加劑(腺苷5’一磷酸、皮質(zhì)酮、乙醇胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、胰島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、次黃嘌呤、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲腺原氨酸、運(yùn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、L-半胱氨酸、轉(zhuǎn)化生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、表皮生長因子)的培養(yǎng)基中加入7×10^-4％ 2-巰基乙醇(2-Me)、100U/mL青霉素·鏈霉素(PBS制備)，得到無血清培養(yǎng)基(B1)。

(1-3)以各種濃度向無血清培養(yǎng)基中添加(1-1)制備的A，得到無血清培養(yǎng)基(C1)。

具體是按照以下濃度添加A。

在培養(yǎng)基B中添加0.01mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B中添加0.1mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B中添加5mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B中添加10mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B中添加100mM A的無血清培養(yǎng)基；

在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入7×10^-4％2-巰基乙醇(2-ME)、100U/L青霉素·鏈霉素(PBS制備)、2.5ng/mL的生長因子，得到以往的無血清培養(yǎng)基(以往無血清培養(yǎng)基)。

將10mL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑100mm的培養(yǎng)皿中，以初始細(xì)胞數(shù)10000個(gè)細(xì)胞/mL接種hMADs，在37℃下、5％CO₂的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

由細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)每天的細(xì)胞數(shù)量，自培養(yǎng)之日起開始的12天內(nèi)細(xì)胞群體倍增數(shù)量(10ⁿ)的變化。群體倍增數(shù)量是每天觀察的細(xì)胞總量。

結(jié)果表示如下：

圖1是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.01mM)

圖2是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.1mM)

圖3是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為5mM)

圖4是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為10mM)

圖5是表示人血液中單個(gè)核細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為100mM)

實(shí)施例2：來自人脂肪組織源性干細(xì)胞(ADMSCs)的培養(yǎng)

(2-1)鹿茸活性多糖的配制

將2mg的鹿茸活性多糖溶解于1mL PBS中，制備鹿茸活性多糖添加劑(A)。

(2-2)人脂肪組織源性干細(xì)胞(ADMSCs)的增殖

從實(shí)施例1中制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中除去次黃嘌呤和胸苷以及一部分無機(jī)鹽類(硫酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅)，在所得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入100U/mL青霉素·鏈霉素(PBS配制)，得到無血清培養(yǎng)基(B2)。

(2-3)以各種濃度向無血清培養(yǎng)基中添加(2-1)制備的A，得到無血清培養(yǎng)基(C2)。

具體是按照以下濃度添加A。

在培養(yǎng)基B2中添加0.01mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B2中添加0.1mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B2中添加5mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B2中添加10mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B2中添加100mM A的無血清培養(yǎng)基；

在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入7×10^-4％2-巰基乙醇(2-ME)、100U/L青霉素·鏈霉素(PBS制備)、2.5ng/mL的生長因子，得到以往的無血清培養(yǎng)基(以往無血清培養(yǎng)基)。

將10mL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑100mm的培養(yǎng)皿中，以初始細(xì)胞數(shù)10000個(gè)細(xì)胞/mL接種ADMSCs，在37℃下、5％CO₂的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

由細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)每天的細(xì)胞數(shù)量，自培養(yǎng)之日起開始的12天內(nèi)細(xì)胞群體倍增數(shù)量(10n)的變化。群體倍增數(shù)量是每天觀察的細(xì)胞總量。

結(jié)果表示如下：

圖6是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.01mM)

圖7是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.1mM)

圖8是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為5mM)

圖9是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為10mM)

圖10是表示人脂肪組織源性干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為100mM)

實(shí)施例3：來自人骨髓干細(xì)胞(MSC)的培養(yǎng)

(3-1)鹿茸活性多糖的配制

將2mg的鹿茸活性多糖溶解于1mL PBS中，制備鹿茸活性多糖添加劑(A)。

(3-2)人骨髓干細(xì)胞(MSC)的增殖

從實(shí)施例1中制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中除去轉(zhuǎn)化生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、表皮生長因子和三碘甲腺原氨酸以及一部分無機(jī)鹽類(硫酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸 氫二鈉、硫酸鋅)，在所得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入100U/mL青霉素·鏈霉素(PBS配制)，得到無血清培養(yǎng)基(B3)。

(3-3)以各種濃度向無血清培養(yǎng)基中添加(2-1)制備的A，得到無血清培養(yǎng)基(C3)。

具體是按照以下濃度添加A。

在培養(yǎng)基B3中添加0.01mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B3中添加0.1mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B3中添加5mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B3中添加10mM A的無血清培養(yǎng)基；

在培養(yǎng)基B3中添加100mM A的無血清培養(yǎng)基；

在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入7×10^-4％2-巰基乙醇(2-ME)、100U/L青霉素·鏈霉素(PBS制備)、2.5ng/mL的生長因子，得到以往的無血清培養(yǎng)基(以往無血清培養(yǎng)基)。

將10mL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑100mm的培養(yǎng)皿中，以初始細(xì)胞數(shù)10000個(gè)細(xì)胞/mL接種ADMSCs，在37℃下、5％CO₂的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

由細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)每天的細(xì)胞數(shù)量，自培養(yǎng)之日起開始的12天內(nèi)細(xì)胞群體倍增數(shù)量(10n)的變化。群體倍增數(shù)量是每天觀察的細(xì)胞總量。

結(jié)果表示如下：

圖11是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.01mM)

圖12是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為0.1mM)

圖13是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為5mM)

圖14是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為10mM)

圖15是表示人骨髓干細(xì)胞的群體倍增數(shù)量的變化(鹿茸活性多糖的濃度為100mM) 。