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背景技術(shù)：

兒童發(fā)育的病癥，也稱為發(fā)育遲緩癥，是一組日益增長的病癥。兒童發(fā)育的許多病癥與特定亞染色體區(qū)域的異常拷貝數(shù)(即，拷貝數(shù)的增益或損失)相關(guān)。根據(jù)國家心理健康研究所(National Institute of Mental Health，NIMH)，自閉癥包括于一組大腦發(fā)育障礙中，統(tǒng)稱作自閉癥譜系障礙(ASD)。由于術(shù)語“譜系”表明，ASD包涵廣泛范圍的削弱的癥狀、技能和水平、或無能，因此患有這種病癥的兒童可以具有并且是特征為社會(huì)互動(dòng)和溝通的削弱以及重復(fù)和定型的行為和興趣的復(fù)雜、異質(zhì)、行為界定的病癥。第四版-文本修訂的《心理障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)》定義了五種病癥，有時(shí)稱為廣泛性發(fā)育障礙(PDD)，如同ASD一樣。這些包括：自閉性障礙(典型自閉癥)、阿斯伯格氏癥(Asperger's disorder)(阿斯伯格綜合癥(Asperger syndrome))、待分類的廣泛性發(fā)展障礙(PDD-NOS)、雷特氏癥(Rett's disorder)(雷特綜合癥(Rett syndrome))以及兒童期崩解癥(CDD)。

ASD的當(dāng)前技術(shù)現(xiàn)狀的診斷是一系列的各種行為問卷。因?yàn)锳SD表型是如此復(fù)雜的，所以基于分子的測(cè)試在較早的年齡當(dāng)表型/行為評(píng)估不可能時(shí)，或與表型/行為評(píng)估相結(jié)合將大大改善診斷的準(zhǔn)確性。而且，早期診斷將允許在較早的年齡起始ASD治療，這可能對(duì)短期和長期結(jié)果有益。具體地說，對(duì)于兒童發(fā)育的ASD和其它病癥的遺傳標(biāo)志物和生物標(biāo)志物的鑒別將允許在嬰兒期或胎兒期鑒別現(xiàn)在通常在三歲與五歲之間診斷的疾病。

罹患兒童發(fā)育障礙的受試者的遺傳評(píng)價(jià)還可以幫助預(yù)測(cè)藥理與行為療法的結(jié)果。因此，迫切需要一種可靠地鑒別患有兒童發(fā)育的ASD或其它病癥的受試者的方法。特別地，需要一種關(guān)于引起ASD或其它兒童發(fā)育遲緩癥的多態(tài)性的更準(zhǔn)確的測(cè)試。具有受影響的成員的家族將得益于知曉其是否攜帶可以影響未來妊娠的突變。臨床醫(yī)師需要測(cè)試作為診斷的輔助，并且研究者將使用測(cè)試以根據(jù)其疾病的病原學(xué)將受試者歸類。本發(fā)明解決這個(gè)和其它需要。

遺傳因素在兒童發(fā)育的病癥中起到實(shí)質(zhì)性作用(Abrahams等(2008).《自然綜述遺傳學(xué)(Nat.Rev.Genet.)》9,第341-355頁；Matsunami等(2014).《分子自閉癥(Molecular Autism)》5,第5頁；Matsunami等(2013).《公共科學(xué)圖書館期刊(PLOS one)》8(1),第e52239頁，其中每一者的公開內(nèi)容出于所有目的以其全文引用的方式并入)。在兒童發(fā)育的病癥中起作用的遺傳突變和染色體異常可以是缺失或重復(fù)變體，包括拷貝數(shù)變體(CNV)或單核苷酸多態(tài)性(SNP)。先前的基因組廣泛連鎖和關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)牽涉到可能涉及于自閉癥和ASD中的多個(gè)遺傳區(qū)域。這樣的異質(zhì)性增加了包括大擴(kuò)展系譜的研究的價(jià)值。許多自閉癥研究已經(jīng)集中于小家族(同胞對(duì)，或雙親和受影響的后代)以試圖定位自閉癥易感基因。小家族的這些集合可以包括具有許多不同敏感基因座的病例。作為大擴(kuò)展家族的成員的受ASD影響的受試者更有可能經(jīng)由其共同的祖先共享相同的遺傳原因。在這樣的家族內(nèi)，自閉癥可能是更加遺傳上同質(zhì)的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種將來自人類受試者的樣本診斷為ASD陽性或ASD陰性的方法，和用于進(jìn)行這種方法的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種方法包括在核酸水平上通過使用對(duì)表1、表2、表3、表6或表7中的一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物具特異性的引物進(jìn)行包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的雜交試驗(yàn)來檢測(cè)所述分類器生物標(biāo)志物的存在；將表1、表2、表3、表6或表7的一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物的存在和/或不存在與至少一個(gè)樣本訓(xùn)練集中所述SNP分類器生物標(biāo)志物的存在和/或不存在相比較，其中至少一個(gè)樣本訓(xùn)練集包含(i)來自ASD陽性樣本的表1、表2、表3、表6或表7的一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物的存在和/或不存在的數(shù)據(jù)，或(ii)來自ASD陰性樣本的表1、表2、表3、表6或表7的一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物的存在和/或不存在的數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，比較步驟包括應(yīng)用統(tǒng)計(jì)算法，這種統(tǒng)計(jì)算法包括確定獲自樣本的SNP分類器生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)與來自至少一個(gè)訓(xùn)練集的SNP分類器生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性?；诮y(tǒng)計(jì)算法的結(jié)果將樣本診斷為ASD陽性或ASD陰性。

在另一個(gè)方面，提供了一種將來自人類受試者的樣本歸類為特定的ASD亞型的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種方法包括在核酸水平上通過使用對(duì)表1、表2、表3、表6或表7中的一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物具特異性的引物進(jìn)行包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的雜交試驗(yàn)來檢測(cè)所述分類器生物標(biāo)志物的存在；將表1、表2、表3、表6或表7的一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物的存在和/或不存在與至少一個(gè)樣本訓(xùn)練集中所述SNP分類器生物標(biāo)志物的存在和/或不存在相比較。至少一個(gè)樣本訓(xùn)練集包含(i)來自第一ASD亞型陽性樣本的表1、表2、表3、表6或表7的一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物的存在和/或不存在的數(shù)據(jù)，或(ii)來自第二ASD亞型陽性樣本的表1、表2、表3、表6或表7的一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物的存在和/或不存在的數(shù)據(jù)。比較步驟包括應(yīng)用統(tǒng)計(jì)算法，這種統(tǒng)計(jì)算法包括確定獲自樣本的SNP分類器生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)與來自至少一個(gè)訓(xùn)練集的SNP分類器生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性?；诮y(tǒng)計(jì)算法的結(jié)果將樣本診斷為特定的ASD亞型。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一ASD亞型和第二ASD亞型選自由自閉性障礙(典型自閉癥)、阿斯伯格氏癥(阿斯伯格綜合癥)、待分類的廣泛性發(fā)展障礙(PDD-NOS)以及兒童期崩解癥(CDD)組成的群組，其中第一ASD亞型和第二ASD亞型是不同的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)于上述方面，一個(gè)或多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物包含來自表1、2、3、6或7的兩個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、三個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、四個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、五個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、六個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、七個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、八個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、九個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、十個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、十一個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、十二個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、十三個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、十四個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、十五個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、二十個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、二十五個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物、或三十個(gè)或更多個(gè)SNP分類器生物標(biāo)志物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交試驗(yàn)是微陣列試驗(yàn)、高通量測(cè)序試驗(yàn)、定量PCR試驗(yàn)或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，來自人類受試者的樣本是頰樣本。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所提供的方法和組合物檢測(cè)RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的每一者中的SNP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RAB11FIP5SNP位于chr2:73302656(hg19)處，ABP1SNP位于chr7:150554592(hg19)處，并且JMJD7-PLA2G4B SNP位于chr15:42133295(hg19)處。

在一個(gè)方面，本文所提供的方法可以進(jìn)一步包括基于統(tǒng)計(jì)算法的結(jié)果鑒別人類受試者用于ASD療法。

附圖說明

圖1：序列變體發(fā)現(xiàn)和分析的工作流程。只有種族和性別匹配的無關(guān)病例和對(duì)照用于關(guān)聯(lián)測(cè)試。

圖2：RAB11FIP5變體的共分離。具有受自閉癥影響的三個(gè)男性同胞的兩代系譜(系譜1)。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。開放方框-未受影響的男性家族成員；開放圓圈-未受影響女性家族成員；填充方框-受影響的男性家族成員。示出了在病例/對(duì)照研究中觀測(cè)到的變體的優(yōu)勢(shì)比。只有在高風(fēng)險(xiǎn)家族中觀測(cè)到不具有優(yōu)勢(shì)比的變體。測(cè)試所有家族成員的所有變體。

圖3：C14orf2變體的分離。具有三個(gè)受影響的女性和兩個(gè)受影響的男性同胞以及受影響的男性半同胞的兩代系譜(系譜2)。C14ORF2變體分離至六個(gè)受影響兒童中的五個(gè)。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。在受影響的半同胞中發(fā)現(xiàn)的CNV[27]示于紅色方框中。在病例/對(duì)照研究中觀測(cè)到的變體的優(yōu)勢(shì)比示于圓括號(hào)中。只有在高風(fēng)險(xiǎn)家族中觀測(cè)到不具有優(yōu)勢(shì)比的變體。除非無DNA可用，否則測(cè)試所有家族成員的所有變體。指示不具有可用的DNA的個(gè)體。

圖4：KLHL6、SPATA5L1以及ITPK1變體的分離。具有五個(gè)受影響的男性同胞的兩代系譜(系譜3)。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。只有在高風(fēng)險(xiǎn)家族中觀測(cè)到不具有優(yōu)勢(shì)比的變體。測(cè)試所有家族成員的所有變體。

圖5：多代系譜中DEFB124變體的分離。系譜4具有受自閉癥影響的七個(gè)兒童。這個(gè)系譜與其它高風(fēng)險(xiǎn)自閉癥系譜之間的聯(lián)系由藍(lán)色方框指示。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。由兩個(gè)個(gè)體繼承的CNV[27]示于紅色方框中。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。在病例/對(duì)照研究中觀測(cè)到的變體的優(yōu)勢(shì)比示于圓括號(hào)中。只有在高風(fēng)險(xiǎn)家族中觀測(cè)到不具有優(yōu)勢(shì)比的變體。除非無DNA可用，否則測(cè)試所有家族成員的所有變體。指示不具有可用的DNA的個(gè)體。

圖6：多代系譜中包括AKAP9中的序列變體和NRXN1中的拷貝數(shù)變體的多個(gè)變體的分離。系譜5具有受自閉癥影響的九個(gè)兒童。這個(gè)系譜與另一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)自閉癥系譜之間的聯(lián)系由藍(lán)色方框指示。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。在4個(gè)個(gè)體中鑒別的CNV[27]示于紅色方框中。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。在病例/對(duì)照研究中觀測(cè)到的變體的優(yōu)勢(shì)比示于圓括號(hào)中。只有在高風(fēng)險(xiǎn)家族中觀測(cè)到不具有優(yōu)勢(shì)比的變體。除非無DNA可用，否則測(cè)試所有家族成員的所有變體。指示不具有可用的DNA的個(gè)體。

圖7.在高風(fēng)險(xiǎn)自閉癥系譜中共享的單體型。這些圖示出了在系譜中受影響的個(gè)體當(dāng)中共享的單體型的圖形表示，使用HapShare程序創(chuàng)建。X軸代表指定染色體的染色體坐標(biāo)。Y軸代表在系譜中受影響的個(gè)體當(dāng)中共享的單體型的各種組合，由迭代次數(shù)任意地列出。Y軸上的最低值代表在系譜中全部N個(gè)受影響的個(gè)體當(dāng)中共享，并且在全部N個(gè)個(gè)體共享的情況下，僅存在一個(gè)可能的組合。在更低程度的共享下，存在更多的可能性。舉例來說，在具有6個(gè)受影響的個(gè)體的系譜10中，對(duì)于全部6個(gè)共享相同的單體型來說，僅存在一個(gè)可能的途徑。在6個(gè)中僅5個(gè)共享單體型的情況下，存在6個(gè)不同的途徑得到這個(gè)結(jié)果，其中6個(gè)受影響的個(gè)體中的每一者排除在所示出的6個(gè)迭代中的每一者中共享。在更低程度的共享下，存在更多的可能性，并且每種可能性在Y軸上作為獨(dú)立的行示出。共享區(qū)域由有色塊指示。紅色指示在系譜中N個(gè)受影響的個(gè)體中的N個(gè)當(dāng)中共享，并且其它顏色代表更低程度的共享。畫面(a)由系譜10中全部6個(gè)受影響的個(gè)體共享的染色體2的兩個(gè)區(qū)域；畫面(b)在染色體14區(qū)域的系譜10中全部6個(gè)受影響的個(gè)體當(dāng)中共享；畫面(c)在系譜5中染色體7上8個(gè)受影響的個(gè)體中的5個(gè)當(dāng)中共享和在系譜4中染色體20上7個(gè)受影響的個(gè)體中的4個(gè)當(dāng)中共享。在這些單體型上發(fā)現(xiàn)的變體(如果有的話)由圖中的基因名稱指示。注意，在系譜5中鑒別為在8個(gè)受影響的個(gè)體當(dāng)中共享的染色體7區(qū)域稍后示出不由額外受影響的家族成員共享，得到在9個(gè)受影響的個(gè)體中的5個(gè)當(dāng)中共享的最終計(jì)數(shù)。

圖8.SNP基因型聚類。示出了在病例/對(duì)照研究中觀測(cè)到的所有SNP的基因型聚類(表3)。

圖9.RAB11FIP5、AUP1、SCN3A、ATP11B、KLHL6、C7orf10、AKAP9、HEPACAM2、PDK4、RELN、ABP1、ALX1、AP1G2、DCAF11、RNF31、IRF9、SDR39U1以及PRKD1基因中的變體的桑格(Sanger)序列確認(rèn)。雜合位置由每個(gè)畫面中央的藍(lán)色線指示。

圖10.SEC23A、ITPK1、CLMN、CCDC85C、MOK、C14orf2、TRPM1、FMN1、PGBD4、OIP5、JMJD7、JMJD7-PLA2G4B、CASC4、SPATA5L1、PYGO1、PRTG、NUDT7、DEFB124以及EPB41L1基因中的變體的桑格序列確認(rèn)。雜合位置由每個(gè)畫面中央的藍(lán)色線指示。

圖11.小系譜中第二AKAP9變體的分離。系譜6具有單個(gè)受影響的兒童。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。這個(gè)系譜與其它高風(fēng)險(xiǎn)自閉癥系譜之間的聯(lián)系由藍(lán)色方框指示。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。在病例/對(duì)照研究中觀測(cè)到的變體的優(yōu)勢(shì)比示于圓括號(hào)中。只有在高風(fēng)險(xiǎn)家族中觀測(cè)到不具有優(yōu)勢(shì)比的變體。除非無DNA可用，否則測(cè)試所有家族成員的所有變體。指示不具有可用的DNA的個(gè)體。

圖12.小兩代系譜中ALX1變體的分離。系譜6具有受自閉癥影響的兩個(gè)同胞。單個(gè)ALX1變體由兩個(gè)同胞共享。這個(gè)系譜與另一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)自閉癥系譜之間的聯(lián)系由藍(lán)色方框指示。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。在病例/對(duì)照研究中觀測(cè)到的變體的優(yōu)勢(shì)比示于圓括號(hào)中。只有在高風(fēng)險(xiǎn)家族中觀測(cè)到不具有優(yōu)勢(shì)比的變體。測(cè)試所有家族成員的所有變體。

圖13.具有多個(gè)序列變體和重疊的損失與增益拷貝數(shù)變體的多代系譜。系譜8具有5個(gè)受影響的男性兒童。這個(gè)家族中潛在的致病變體并不分離至多于一個(gè)受影響的個(gè)體。在4個(gè)個(gè)體中鑒別的CNV[27]示于紅色方框中。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。在病例/對(duì)照研究中觀測(cè)到的變體的優(yōu)勢(shì)比示于圓括號(hào)中。只有在高風(fēng)險(xiǎn)家族中觀測(cè)到不具有優(yōu)勢(shì)比的變體。除非無DNA可用，否則測(cè)試所有家族成員的所有變體。指示不具有可用的DNA的個(gè)體。

圖14.兩代系譜中兩個(gè)序列變體的分離。系譜九具有三個(gè)受影響的女性同胞。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。測(cè)試所有家族成員的所有變體。

圖15.系譜10中SCN3A和OIP5中的序列變體和涉及LINGO2的CNV的分離。系譜10具有6個(gè)受影響的男性同胞。最低一代中的女性同胞具有三染色體21并且包括自閉癥的一些特征。LINGO2損失CNV在我們的病例/對(duì)照研究中顯示具有3.74的優(yōu)勢(shì)比，而LINGO2增益CNV在廣泛ASD群體中不具有臨床上相關(guān)的優(yōu)勢(shì)比。在我們的病例/對(duì)照研究中未觀測(cè)到SCN3A序列變體，而OIP5變體得到2.25的優(yōu)勢(shì)比。系譜符號(hào)在圖2的圖例中描述。在家族中鑒別的序列變體示于黑色方框中。測(cè)試具有可用的DNA的所有家族成員的所有變體。

圖16.RAB11FIP5P652L對(duì)RAB11結(jié)合的影響。(A)將P652L突變體FIP5(490-653)的野生型與各種GST標(biāo)記的Rab或GST標(biāo)記的FIP一起孵育。然后洗滌小珠并且用1％SDS洗脫結(jié)合的FIP5(490-653)。然后通過用抗Rab11FIP5抗體進(jìn)行免疫印跡來分析洗脫液。(B-G)用野生型FIP5-GFP(A和D)或FIP5-GFP-P652L(E和G)轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLa細(xì)胞。然后固定細(xì)胞并且用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體染色(C、D、F以及G)。D和E是合并的圖像，其中黃色代表Rab11FIP5與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體之間重疊的程度。(H)將表達(dá)FIP5-GFP或FIP5-GFP-P652L的HeLa細(xì)胞與1μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白-Alexa488一起孵育。然后洗滌細(xì)胞并且在血清補(bǔ)充的培養(yǎng)基中孵育不同的時(shí)間量。使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞相關(guān)(未再循環(huán))的轉(zhuǎn)鐵蛋白-Alexa488。所示出的數(shù)據(jù)是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。

具體實(shí)施方式

當(dāng)比較兩個(gè)個(gè)體的人類基因組時(shí)，其為99.9％一致的(Kwok和Chen(2003).《分子生物學(xué)當(dāng)前問題(Curr.Issues Mol.Biol.)》5,第43-60頁，以其全文引用的方式并入)。然而，因?yàn)槿祟惢蚪M的大小為約32億個(gè)堿基對(duì)，所以一個(gè)基因組與另一個(gè)存在約320萬個(gè)堿基對(duì)差異。大多數(shù)差異歸因于單堿基替換多態(tài)性，普遍稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)。(Kwok和Chen(2003).《分子生物學(xué)當(dāng)前問題(Curr.Issues Mol.Biol.)》5,第43-60頁)。一小部分多態(tài)性具有功能意義并且據(jù)信是在人類當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的多樣性的基礎(chǔ)(Collins等(1997).《科學(xué)(Science)》278,第1580-1581頁，以其全文引用的方式并入)。在本發(fā)明的情況下，樣本獲自受試者并且分析特定的SNP以評(píng)估受試者是否處于發(fā)展自閉癥譜系障礙(ASD)的風(fēng)險(xiǎn)下或診斷受試者患有ASD。

在一些方面，本文所提供的方法針對(duì)(i)診斷受試者患有ASD，(ii)預(yù)測(cè)受試者是否處于ASD的風(fēng)險(xiǎn)下或評(píng)估受試者發(fā)展ASD，例如自閉癥的可能性，(iii)診斷受試者具有特定的ASD亞型，或(iv)選擇受試者用于ASD的治療。這些方法部分地包括確定以下基因中的一者或多者中的一個(gè)或多個(gè)SNP，例如在表1所提供的位置處的SNP的存在：RAB11FIP5、AUP1、SCN3A、ATP11B、KLHL6、C7orf10、AKAP9、HEPACAM2、PDK4、RELN、ABP1、ALX1、AP1G2、DCAF11、RNF31、IRF9、SDR39U1、PRKD1、SEC23A、ITPK1、CLMN、CCDC85C、MOK、C14orf2、TRPM1、FMN1、PGBD4、OIP5、JMJD7、JMJD7-PLA2G4B、CASC4、SPATA5L1、PYGO1、PRTG、NUDT7、DEFB124、EPB41L1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，確定前述基因的兩個(gè)或更多個(gè)SNP的存在或不存在。在甚至另一個(gè)實(shí)施方案中，確定前述基因的五個(gè)或更多個(gè)SNP的存在或不存在。在甚至另一個(gè)實(shí)施方案中，確定前述基因的十個(gè)或更多個(gè)SNP的存在或不存在。

在本發(fā)明的上下文中，提及任何特定的SNP集中所列的SNP中的“一個(gè)或多個(gè)”、“兩個(gè)或更多個(gè)”、“五個(gè)或更多個(gè)”等等意指所列的SNP中的任一者或任何和所有組合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所提供的方法和組合物檢測(cè)RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的每一者中的SNP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RAB11FIP5SNP位于chr2:73302656(hg19)處，ABP1SNP位于chr7:150554592(hg19)處，并且JMJD7-PLA2G4B SNP位于chr15:42133295(hg19)處。

在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)SNP包含上文所提供的基因中的一個(gè)或多個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)、30個(gè)或更多個(gè)、或35個(gè)或更多個(gè)SNP，例如表1、2、3、6或7中的SNP，例如RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的一個(gè)或多個(gè)SNP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用本文所提供的方法和組合物可檢測(cè)的一個(gè)或多個(gè)(例如，兩個(gè)或更多個(gè)、或五個(gè)或更多個(gè))SNP可以與其它標(biāo)志物組合用于診斷ASD、預(yù)測(cè)受試者中的ASD、診斷特定的ASD亞型。舉例來說，與美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2010/0210471(出于所有目的以其全文引用的方式并入)和國際PCT公布號(hào)2014/055915(出于所有目的以其全文引用的方式并入)中所公開的ASD相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(例如，兩個(gè)或更多個(gè)、或五個(gè)或更多個(gè))中的一個(gè)或多個(gè)(例如，兩個(gè)或更多個(gè)、或五個(gè)或更多個(gè))可以與本文在組合物或方法中的一者或多者中所描述的一個(gè)或多個(gè)SNP組合檢測(cè)。另外，與美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2010/0210471(出于所有目的以其全文引用的方式并入)中所公開的ASD相關(guān)的CNV中的一個(gè)或多個(gè)(例如，兩個(gè)或更多個(gè)、或五個(gè)或更多個(gè))和/或國際PCT公布號(hào)2014/055915(出于所有目的以其全文引用的方式并入)中所描述的CNV中的一個(gè)或多個(gè)(例如，兩個(gè)或更多個(gè)、或五個(gè)或更多個(gè))可以與本文在組合物或方法中的一者或多者中所描述的SNP組合檢測(cè)。

因此，本發(fā)明的方面涉及用于檢測(cè)受試者中的一個(gè)或多個(gè)SNP的方法和組合物以(i)診斷受試者患有ASD，(ii)預(yù)測(cè)受試者是否處于ASD的風(fēng)險(xiǎn)下或評(píng)估受試者發(fā)展ASD，例如自閉癥的可能性，(iii)診斷受試者具有特定的ASD亞型，或(iv)選擇受試者用于ASD的治療。在這些方面的一個(gè)實(shí)施方案中，樣本獲自人類受試者并且分析表1、2、3、6或7中所闡述的SNP中的一者或多者。然后將結(jié)果與參考值相比較，并且取決于這個(gè)比較，診斷受試者患有ASD，預(yù)測(cè)處于ASD的風(fēng)險(xiǎn)下，診斷特定的ASD亞型，或選擇受試者用于ASD的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，ASD亞型是自閉性障礙。

第四版-文本修訂的《心理障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)》當(dāng)前定義了五種病癥(本文中也稱作“ASD亞型”)，有時(shí)稱為廣泛性發(fā)育障礙(PDD)，如同ASD一樣。這些包括：自閉性障礙(典型自閉癥)、阿斯伯格氏癥(阿斯伯格綜合癥(AS))、待分類的廣泛性發(fā)展障礙(PDD-NOS)、雷特氏癥(雷特綜合癥)以及兒童期崩解癥(CDD)。注意，已知大多數(shù)雷特綜合癥病例由MeCP2基因或CDKL5基因的突變引起并且預(yù)期《心理障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)》的更新修訂將雷特綜合癥獨(dú)立于ASD歸類。因此，在某些實(shí)施方案中，ASD不包括雷特綜合癥。自閉性障礙應(yīng)理解為在3歲前呈現(xiàn)出的削弱的社會(huì)互動(dòng)和溝通與受限的重復(fù)和定型模式的行為、興趣以及活動(dòng)的任何病狀，達(dá)到健康可能受損的程度。阿斯伯格綜合癥與自閉性障礙的區(qū)別在于在表征ASD的削弱的社會(huì)互動(dòng)和受限的重復(fù)行為、興趣以及活動(dòng)存在下臨床上顯著的語言發(fā)育遲緩的缺乏。PDD-NOS用于將不滿足嚴(yán)格的自閉癥標(biāo)準(zhǔn)，但通過表現(xiàn)非典型自閉癥或通過近乎滿足關(guān)鍵區(qū)中的兩者或三者中的診斷標(biāo)準(zhǔn)而接近滿足的個(gè)體分類。本文所提供的方法和組合物可用于診斷受試者患有ASD譜系上的病癥中的任一者，或預(yù)測(cè)受試者是否將發(fā)展ASD譜系上的病癥中的任一者。

“單核苷酸多態(tài)性(SNP)”是核酸序列中的單堿基對(duì)變異。多態(tài)性可以例如由變異所存在的核苷酸位置，由核苷酸變異所引起的氨基酸序列的變化，或由與變異(例如，諸如莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變更，或核酸對(duì)相關(guān)分子，諸如聚合酶、RNase等等的結(jié)合親和力的變更)相聯(lián)系的核酸分子的某種其它特征的變化來提及。舉例來說，在本文所闡述的基因的區(qū)域中的本文所公開的SNP可以由其在相應(yīng)的基因或染色體中的位置，例如，基于變體殘基或染色體位置的數(shù)位來提及。通過方法和組合物可檢測(cè)的SNP提供于表1、2、3、6以及7中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在表1中所提供的染色體位置處的任何SNP用于本文所描述的方法中并且使用本文所提供的組合物可檢測(cè)。

如本文所用的“樣本”或“生物樣本”指的是獲自人類受試者或患者的樣本，其可以針對(duì)特定的分子，例如本文所闡述的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或拷貝數(shù)變體(CNV)中的一者或多者，諸如表1、2、3、6或7中所闡述的SNP中的一者或多者進(jìn)行測(cè)試。樣本可以包括(但不限于)細(xì)胞，頰拭子樣本，體液，包括血液、血清、血漿、尿液、唾液、腦脊髓液、淚液、胸膜液，等等。

適合用于本文所描述的方法中的樣本含有遺傳物質(zhì)，例如基因組DNA(gDNA)。樣本來源的非限制性實(shí)例包括尿液、血液以及組織。樣本本身將通常由從受試者中移出的有核細(xì)胞(例如，血液或頰細(xì)胞)、組織等等組成。受試者可以是成人、兒童、胎兒或胚胎。在一些實(shí)施方案中，樣本在產(chǎn)前獲自胎兒或胚胎，或獲自母體(例如，獲自母系循環(huán)中的胎兒或胚胎細(xì)胞)。在本領(lǐng)域中已知方法和試劑用于獲得、處理以及分析樣本。在一些實(shí)施方案中，樣本在衛(wèi)生保健提供者的幫助下獲得，例如，抽取血液。在一些實(shí)施方案中，樣本在沒有衛(wèi)生保健提供者的幫助下獲得，例如，在非侵入性地獲得樣本的情況下，諸如包含使用頰拭子或刷子獲得的頰細(xì)胞的樣本，或漱口液樣本。

樣本可以在檢測(cè)步驟之前進(jìn)一步處理。舉例來說，可以使細(xì)胞或組織樣本中的DNA與樣本的其它組分分離?？梢詽饪s和/或純化樣本以分離DNA。可以使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從生物樣本收集細(xì)胞。舉例來說，可以通過使細(xì)胞樣本離心并且使成團(tuán)的細(xì)胞再懸浮來收集細(xì)胞?？梢允辜?xì)胞再懸浮于諸如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的緩沖溶液中。使細(xì)胞懸浮液離心以獲得細(xì)胞團(tuán)塊之后，可以溶解細(xì)胞以提取DNA，例如基因組DNA。獲自受試者的所有樣本，包括經(jīng)受任何種類的進(jìn)一步處理的那些，都被認(rèn)為獲自受試者。

一旦獲得樣本，即詢問本文所闡述的SNP中的一者或多者，例如表1、2、3、6或7中所闡述的SNP中的一者或多者。

一般來說，可以使用單獨(dú)或與擴(kuò)增試驗(yàn)(即，在檢測(cè)之前擴(kuò)增樣本中的核酸)組合的寡核苷酸雜交試驗(yàn)來鑒別SNP中的一者或多者。在一個(gè)實(shí)施方案中，如下文詳細(xì)描述，對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序或雜交至陣列。然后確定樣本是否包括一個(gè)或多個(gè)SNP，還是包括“正?！被颉耙吧汀毙蛄?也稱作“參考序列”或“參考等位基因”)。在本文所描述的SNP的情況下，在一個(gè)實(shí)施方案中，“參考等位基因”提供于表2中。

一般來說，如果雜交試驗(yàn)揭示測(cè)序區(qū)域與參考序列之間的差異，那么已經(jīng)鑒別多態(tài)性。如本文所描述，某些統(tǒng)計(jì)算法可以有助于這種確定。在特定的位點(diǎn)處鑒別核苷酸序列的差異的事實(shí)確定多態(tài)性存在于那個(gè)位點(diǎn)處。在大多數(shù)情況下，特別是在SNP的情況下，可以存在至多四個(gè)變體，這是因?yàn)镈NA中存在四個(gè)天然存在的核苷酸。

舉例來說，寡核苷酸或寡核苷酸對(duì)可以用于本領(lǐng)域中已知的方法中，例如微陣列或聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)中，以檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)SNP。

術(shù)語“寡核苷酸”指的是相對(duì)短的多核苷酸(例如，100個(gè)、50個(gè)、20個(gè)或更少的核苷酸)，包括(但不限于)單股脫氧核糖核苷酸、單股或雙股核糖核苷酸、RNA:DNA雜交體以及雙股DNA。寡核苷酸，諸如單股DNA探針寡核苷酸，常常通過化學(xué)方法，例如使用可商購的自動(dòng)寡核苷酸合成器合成。然而，寡核苷酸可以通過多種其它方法，包括體外重組DNA介導(dǎo)的技術(shù)，以及通過在細(xì)胞和生物體中表達(dá)DNA而制得。

在本發(fā)明的上下文中，“分離”或“純化”的核酸分子，例如DNA分子或RNA分子，是與其原生環(huán)境分開存在并且因此不是自然的產(chǎn)物的DNA分子或RNA分子。分離的DNA分子或RNA分子可以按純化的形式存在或可以存在于非原生環(huán)境，諸如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。舉例來說，“分離”或“純化”的核酸分子當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)實(shí)質(zhì)上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)實(shí)質(zhì)上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，“分離”的核酸不含在核酸所來源的生物體的基因組DNA中天然地側(cè)接核酸的序列(即，位于核酸的5'和3'末端處的序列)。

如本文所用的一組寡核苷酸可以包含約2個(gè)至約100個(gè)寡核苷酸，其全部特異性地雜交至與ASD相關(guān)的特定遺傳標(biāo)志物(包括例如表1、2、3、6或7中的一者或多者中所闡述的SNP)。在一個(gè)實(shí)施方案中，一組寡核苷酸包含約5個(gè)至約30個(gè)寡核苷酸、約10個(gè)至約20個(gè)寡核苷酸，并且在一個(gè)實(shí)施方案中包含約20個(gè)寡核苷酸，其全部特異性地雜交至與ASD相關(guān)的特定遺傳標(biāo)志物。因此，一組寡核苷酸可以包含約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個(gè)或更多個(gè)寡核苷酸，其全部特異性地雜交至與ASD相關(guān)的特定SNP。在一個(gè)實(shí)施方案中，一組寡核苷酸包含DNA探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA探針包含重疊的DNA探針。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA探針包含不重疊的DNA探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA探針提供覆蓋與ASD相關(guān)的SNP遺傳標(biāo)志物的長度的檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一組寡核苷酸包含擴(kuò)增與ASD相關(guān)的SNP遺傳標(biāo)志物的擴(kuò)增引物。在這點(diǎn)上，包含擴(kuò)增引物的寡核苷酸組可以包含多重?cái)U(kuò)增引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸組或DNA探針可以在陣列上提供，諸如固相陣列、染色體/DNA微陣列或微珠陣列。陣列技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。預(yù)期用于本發(fā)明中的說明性陣列包括(但不限于)可得自Affymetrix(Santa Clara,CA)和Illumina(San Diego,CA)的陣列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在微陣列上的雜交用于檢測(cè)患者的樣本中一個(gè)或多個(gè)SNP的存在。術(shù)語“微陣列”指的是在襯底上可雜交陣列元素，例如多核苷酸探針的有序排列。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，恒定變性毛細(xì)管電泳(CDCE)可以與高保真PCR(HiFi-PCR)組合以檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)SNP的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用高保真PCR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用變性HPLC、變性毛細(xì)管電泳、循環(huán)溫度毛細(xì)管電泳、等位基因特異性PCR、定量實(shí)時(shí)PCR方法(諸如)來檢測(cè)SNP?？捎糜诒景l(fā)明的檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)SNP的存在的其它方法包括使用聚合酶克隆測(cè)序法(polony sequencing approach)、微陣列法、質(zhì)譜法、高通量測(cè)序法，例如在單分子水平上。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)SNP，例如兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、或四個(gè)或更多個(gè)SNP的試劑包含一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，其中每個(gè)寡核苷酸特異性地雜交至與ASD相關(guān)的SNP遺傳標(biāo)志物。如本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將了解，一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸經(jīng)過設(shè)計(jì)以雜交至一個(gè)位置處的基因。

雜交檢測(cè)方法是基于互補(bǔ)核酸序列之間特異性雜交體的形成，這些雜交體用來檢測(cè)核酸序列突變。用以檢測(cè)多態(tài)性和/或多態(tài)變體的核酸分析方法包括例如微陣列分析和實(shí)時(shí)PCR。還可以使用雜交方法，諸如南方分析(Southern analysis)、北方分析(Northern analysis)或原位雜交(參看《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案(Current Protocols in Molecular Biology)》,Ausubel等編,John Wiley&Sons 2003，以其全文引用的方式并入)。

舉例來說，其它方法包括直接人工測(cè)序(Church和Gilbert,《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》81:1991-1995(1988)；Sanger等,《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》74:5463-5467(1977)；Beavis等美國專利號(hào)5,288,644，各自出于所有目的以其全文引用的方式并入)；自動(dòng)熒光測(cè)序；單股構(gòu)象多態(tài)性試驗(yàn)(SSCP)；夾持變性凝膠電泳(CDGE)；二維凝膠電泳(2DGE或TDGE)；構(gòu)象敏感性凝膠電泳(CSGE)；變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Sheffield等,《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:232-236(1989))；遷移率變動(dòng)分析(Orita等,《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:2766-2770(1989)，以其全文引用的方式并入)；限制酶分析(Flavell等,《細(xì)胞(Cell)》15:25(1978)；Geever等,《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》78:5081(1981)，以其全文引用的方式并入)；定量實(shí)時(shí)PCR(Raca等,《遺傳學(xué)測(cè)試(Genet Test)》8(4):387-94(2004)，以其全文引用的方式并入)；異源雙鏈分析；化學(xué)錯(cuò)配裂解(CMC)(Cotton等,《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:4397-4401(1985)，以其全文引用的方式并入)；RNase保護(hù)試驗(yàn)(Myers等,《科學(xué)(Science)》230:1242(1985)，以其全文引用的方式并入)；識(shí)別核苷酸錯(cuò)配的多肽的使用，例如大腸桿菌mutS蛋白；等位基因特異性PCR。參看例如美國專利公布號(hào)2004/0014095，以其全文引用的方式并入本文中。

為了檢測(cè)多態(tài)性和/或多態(tài)變體，在一個(gè)實(shí)施方案中，首先擴(kuò)增存在于獲自受試者的樣本中的含有多態(tài)位點(diǎn)的基因組DNA(gDNA)或其一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，多態(tài)變體是表1、2、3、6或7之一中所闡述的SNP中的一者或多者。這樣的區(qū)域可以通過使用基于側(cè)接位點(diǎn)的基因組和/或cDNA序列而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR來擴(kuò)增和分離。參看例如《PCR引物：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(PCR Primer:A Laboratory Manual)》,Dieffenbach和Dveksler,(編)；McPherson等,《PCR基礎(chǔ)：從背景到實(shí)驗(yàn)臺(tái)(PCR Basics:From Background to Bench)》(Springer Verlag,2000，以其全文引用的方式并入)；Mattila等,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,19:4967(1991)，以其全文引用的方式并入；Eckert等,《PCR方法和應(yīng)用(PCR Methods and Applications)》,1:17(1991)，以其全文引用的方式并入；PCR(McPherson等編,IRL Press,Oxford)，以其全文引用的方式并入；以及美國專利號(hào)4,683,202，以其全文引用的方式并入。可以采用的其它擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(Wu和Wallace,《基因組學(xué)(Genomics)》,4:560(1989)；Landegren等,《科學(xué)(Science)》,241:1077(1988))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh等,《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,86:1173(1989))、自我持續(xù)序列復(fù)制(Guatelli等,《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》,87:1874(1990))，以其全文引用的方式并入，以及基于核酸的序列擴(kuò)增(NASBA)。選擇用于PCR擴(kuò)增的引物的準(zhǔn)則為本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知。參看例如McPherson等,《PCR基礎(chǔ)：從背景到實(shí)驗(yàn)臺(tái)(PCR Basics:From Background to Bench)》,Springer-Verlag,2000，以其全文引用的方式并入。用于設(shè)計(jì)引物的多種計(jì)算機(jī)程序是可用的。

在一個(gè)實(shí)例中，樣本(例如，包含基因組DNA的樣本)獲自受試者。然后檢查樣本中的DNA以確定如本文所描述的SNP型態(tài)和任選地CNV型態(tài)。這種型態(tài)通過本文所描述的任何方法確定，例如，通過測(cè)序或通過基因組DNA、RNA或cDNA中的基因雜交至核酸探針，例如DNA探針(包括cDNA和寡核苷酸探針)或RNA探針。核酸探針可以經(jīng)過設(shè)計(jì)以特異性地或優(yōu)先與特定的多態(tài)變體雜交。

在一些實(shí)施方案中，如果多態(tài)性的替代性多態(tài)變體得以創(chuàng)建或消除限制性位點(diǎn)，那么限制性消化分析可以用于檢測(cè)多態(tài)性的多態(tài)變體的存在。含有基因組DNA的樣本獲自個(gè)體。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以用于擴(kuò)增包含多態(tài)位點(diǎn)的區(qū)域，并且進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析(參看《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案(Current Protocols in Molecular Biology)》,Ausubel等編,John Wiley&Sons 2003，以其全文引用的方式并入)。相關(guān)DNA片段的消化模式指示多態(tài)性的特定多態(tài)變體的存在或不存在并且因此指示對(duì)SZ的敏感性的存在或不存在。

序列分析也可以用于檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)SNP，例如表1、2、3、6或7中所闡述的一個(gè)或多個(gè)SNP。包含DNA或RNA的樣本獲自受試者。必要時(shí)，PCR或其它適當(dāng)方法可以用于擴(kuò)增包涵多態(tài)位點(diǎn)的部分。然后使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法查明序列，并且確定多態(tài)變體的存在。

等位基因特異性寡核苷酸也可以用于檢測(cè)多態(tài)變體的存在，例如，經(jīng)由使用擴(kuò)增的寡核苷酸與等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針的斑點(diǎn)印跡雜交(參看例如Saiki等,《自然(Nature)》(London)324:163-166(1986))。“等位基因特異性寡核苷酸”(本文中也稱作“等位基因特異性寡核苷酸探針”)通常是約10-50個(gè)堿基對(duì)、優(yōu)選地約15-30個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸，其特異性地雜交至含有多態(tài)性的核酸區(qū)域。對(duì)特定的多態(tài)性具特異性的等位基因特異性寡核苷酸探針可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備(參看《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案(Current Protocols in Molecular Biology)》,Ausubel等編,John Wiley&Sons 2003，以其全文引用的方式并入)。

一般來說，為了確定多個(gè)SNP變體中的哪個(gè)存在于受試者中，包含DNA的樣本獲自受試者。PCR或另一個(gè)擴(kuò)增程序可以用于擴(kuò)增包涵多態(tài)位點(diǎn)的部分。

實(shí)時(shí)焦磷酸DNA測(cè)序是用以檢測(cè)多態(tài)性和多態(tài)變體的另一種方法(Alderborn等,(2000)《基因組研究(Genome Research)》,10(8):1249-1258，以其全文引用的方式并入)。額外的方法包括例如PCR擴(kuò)增與變性高效液相色譜法(dHPLC)組合(Underhill等,《基因組研究(Genome Research)》,第7卷,第10期,第996-1005頁,1997，出于所有目的以其全文引用的方式并入)。

高通量測(cè)序或下一代測(cè)序也可以用于檢測(cè)本文所描述的SNP中的一者或多者。這樣的方法在本領(lǐng)域中是已知的(參看例如Zhang等,《遺傳基因組學(xué)雜志(J Genet Genomics)》.2011年3月20日；38(3):95-109，出于所有目的以其全文引用的方式并入；Metzker,《自然綜述遺傳學(xué)(Nat Rev Genet)》.2010年1月；11(1):31-46，出于所有目的以其全文引用的方式并入)，并且包括(但不限于)以下技術(shù)：諸如ABI SOLiD測(cè)序技術(shù)(現(xiàn)在歸屬于Life Technologies,Carlsbad,CA)；Roche 454FLX，其使用通過合成技術(shù)進(jìn)行的測(cè)序，稱為焦磷酸測(cè)序(Roche,Basel Switzerland)；Illumina基因組分析儀(Illumina,San Diego,CA)；Dover Systems Polonator G.007(Salem,NH)；赫利克斯(Helicos)(Helicos BioSciences Corporation,Cambridge Mass.,USA)和桑格。在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA測(cè)序可以使用本領(lǐng)域中熟知的方法進(jìn)行，包括質(zhì)譜技術(shù)和全基因組測(cè)序技術(shù)、單分子測(cè)序等等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸，例如基因組DNA，使用納米孔測(cè)序進(jìn)行測(cè)序，以確定一個(gè)或多個(gè)SNP并且在一些情況下一個(gè)或多個(gè)CNV的存在(例如，如Soni等(2007).《臨床化學(xué)(Clin Chem)》53,第1996-2001頁所描述，出于所有目的以其全文引用的方式并入)。納米孔測(cè)序是單分子測(cè)序技術(shù)，借此當(dāng)DNA的單分子通過納米孔時(shí)直接測(cè)序。納米孔是直徑約1納米的小孔洞。納米孔浸入傳導(dǎo)流體中并且跨越其施加電勢(shì)(電壓)由于離子穿過納米孔傳導(dǎo)而產(chǎn)生微小的電流。流動(dòng)的電流量對(duì)納米孔的大小和形狀敏感。當(dāng)DNA分子通過納米孔時(shí)，DNA分子上的每個(gè)核苷酸不同程度地阻塞納米孔，在不同程度上改變穿過納米孔的電流的量值。因此，當(dāng)DNA分子通過納米孔時(shí)電流的這種變化代表DNA序列的讀取。如美國專利號(hào)5,795,782、6,015,714、6,627,067、7,238,485和7,258,838以及美國專利申請(qǐng)公布美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2006/003171和2009/0029477(各自出于所有目的以其全文引用的方式并入)中所公開的納米孔測(cè)序技術(shù)可用于本文所描述的方法。

核酸探針可以用于檢測(cè)和/或定量核酸序列的樣本內(nèi)特定靶核酸序列(例如，作為雜交探針)的存在，或擴(kuò)增樣本內(nèi)的特定靶序列(例如，作為引物)。探針具有選擇性地雜交至靶核酸序列的互補(bǔ)核酸序列。為了探針雜交至靶序列，雜交探針必須與靶序列具有足夠的一致性，即，與靶序列至少70％，例如80％、90％、95％、98％或更高一致。探針序列還必須足夠長，以使得探針對(duì)靶序列展現(xiàn)優(yōu)于非靶序列的選擇性。舉例來說，探針的長度將為至少10個(gè)，例如15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、50個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，探針的長度不大于30個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)或500個(gè)核苷酸。探針包括引物，其一般指的是可以充當(dāng)使用諸如PCR(聚合酶鏈反應(yīng))、LCR(連接酶鏈反應(yīng))等等用于擴(kuò)增靶序列的方法進(jìn)行模板引導(dǎo)的DNA合成的起始點(diǎn)的單股寡核苷酸探針。

在一些實(shí)施方案中，探針是測(cè)試探針，例如，可以用于檢測(cè)本文所描述的區(qū)域中的多態(tài)性的探針，這些多態(tài)性例如本文所描述的多態(tài)性，例如，表1、2、3、6或7之一中所闡述的一個(gè)或多個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、十個(gè)或更多個(gè)、或二十個(gè)或更多個(gè)SNP。在一些實(shí)施方案中，探針可以雜交至通過限定如表1中的特定基因所指定的SNP(SNP1和SNP2包括在內(nèi))或者表1、2、3、6或7的SNP而限定的區(qū)域內(nèi)的靶序列。

還可以使用對(duì)照探針。舉例來說，結(jié)合更少可變序列，例如與染色體的著絲粒相關(guān)的重復(fù)DNA的探針，或展現(xiàn)差異性結(jié)合至所詢問的多態(tài)位點(diǎn)的探針，可以用作對(duì)照。與各種著絲粒DNA和基因座特異性DNA雜交的探針可購自例如Vysis,Inc.(Downers Grove,Ill.)、Molecular Probes,Inc.(Eugene,Oreg.)或Cytocell(Oxfordshire,UK)。

在一些實(shí)施方案中，探針用“可檢測(cè)標(biāo)記”作標(biāo)記，例如，通過直接標(biāo)記。在各種實(shí)施方案中，用于檢測(cè)本文所描述的與ASD相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)SNP遺傳標(biāo)志物的寡核苷酸偶聯(lián)至可以直接或間接檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記。在本發(fā)明中，寡核苷酸可以全部共價(jià)連接至可檢測(cè)標(biāo)記。

“可檢測(cè)標(biāo)記”是可以產(chǎn)生指示樣本中標(biāo)記的存在和/或濃度的可檢測(cè)(諸如視覺上、以電子方式或以其它方式)信號(hào)的分子或物質(zhì)。當(dāng)偶聯(lián)至諸如DNA探針的核酸時(shí)，可檢測(cè)標(biāo)記可以用于定位和/或定量特異性探針?biāo)槍?duì)的靶核酸序列。從而，可以通過檢測(cè)由可檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)來檢測(cè)樣本中標(biāo)靶的存在和/或量?？梢灾苯踊蜷g接檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記，并且可以組合使用偶聯(lián)至不同探針的若干不同的可檢測(cè)標(biāo)記以檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)靶。

一種類型的“可檢測(cè)標(biāo)記”是熒光團(tuán)，一種在吸收更低波長/更高能量的光之后發(fā)熒光的有機(jī)分子。直接標(biāo)記的熒光團(tuán)允許探針在沒有二級(jí)檢測(cè)分子的情況下顯現(xiàn)。使熒光團(tuán)共價(jià)附接至核苷酸之后，可以使用諸如缺口平移、隨機(jī)引發(fā)以及PCR標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將核苷酸直接并入探針中?；蛘撸梢杂眠B接子使探針內(nèi)的脫氧胞苷核苷酸轉(zhuǎn)氨。然后使熒光團(tuán)共價(jià)附接至轉(zhuǎn)氨的脫氧胞苷核苷酸。參看例如美國專利號(hào)5,491,224，以其全文引用的方式并入。

熒光標(biāo)記的實(shí)例包括5-(和6)-羧基熒光素、5-或6-羧基熒光素、6-(熒光素)-5-(和6)-甲酰胺基己酸、異硫氰酸熒光素、若丹明(rhodamine)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)，以及染料，諸如Cy2、Cy3和Cy5，任選地被取代的香豆素，包括AMCA、PerCP，藻膽蛋白，包括R-藻紅蛋白(RPE)和別藻紅蛋白(allophycoerythrin，APC)，德克薩斯紅(Texas Red)，普林斯頓紅(Princeton Red)，綠色熒光蛋白(GFP)和其類似物，以及R-藻紅蛋白或別藻紅蛋白的偶聯(lián)物，無機(jī)熒光標(biāo)記，諸如基于半導(dǎo)體材料，如包覆的CdSe納米微晶的粒子。

可以直接檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的其它實(shí)例包括放射性物質(zhì)和金屬粒子。相比之下，間接檢測(cè)需要在應(yīng)用初級(jí)探針或抗體之后應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)額外的探針或抗體，即，二級(jí)抗體。因此，在某些實(shí)施方案中，如熟練的技術(shù)人員將了解，通過檢測(cè)二級(jí)探針或結(jié)合劑與初級(jí)可檢測(cè)探針的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。需要添加二級(jí)結(jié)合劑或抗體的初級(jí)可檢測(cè)結(jié)合劑或探針的實(shí)例包括酶促可檢測(cè)結(jié)合劑和半抗原可檢測(cè)結(jié)合劑或抗體。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)至包含第一結(jié)合劑的核酸聚合物(例如，在ISH、WISH或FISH工藝中)。在其它實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)至包含第一結(jié)合劑的抗體(例如，在IHC工藝中)。

在本公開的方法中使用的可以偶聯(lián)至寡核苷酸的可檢測(cè)標(biāo)記的實(shí)例包括熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、聚合物、聚合物粒子、金屬粒子、半抗原以及染料。

聚合物粒子標(biāo)記的實(shí)例包括可以與熒光染料一起包埋的聚苯乙烯、PMMA或二氧化硅的微粒子或乳膠粒子，或含有染料、酶或底物的聚合物膠束或膠囊。

金屬粒子標(biāo)記的實(shí)例包括金粒子和包覆的金粒子，其可以通過銀染而轉(zhuǎn)化。半抗原的實(shí)例包括DNP、異硫氰酸熒光素(FITC)、生物素以及地高辛(digoxigenin)。酶標(biāo)記的實(shí)例包括辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ALP或AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、轉(zhuǎn)化酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲熒光素酶以及葡糖氧化酶(GO)。辣根過氧化物酶的通常所用的底物的實(shí)例包括3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、鎳加強(qiáng)的二氨基聯(lián)苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、聯(lián)苯胺二鹽酸鹽(BDHC)、漢克-耶茨試劑(Hanker-Yates reagent，HYR)、靛酚藍(lán)(Indophane blue，IB)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚派若寧(α-naphtol pyronin，α-NP)、鄰聯(lián)茴香胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、硝基藍(lán)四唑(NBT)、氯化2-(對(duì)碘苯基)-3-對(duì)硝基苯基-5-苯基四唑(INT)、四硝基藍(lán)四唑(TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷/氰亞鐵酸亞鐵(BCIG/FF)。

堿性磷酸酶的通常所用的底物的實(shí)例包括萘酚-AS-B1-磷酸/堅(jiān)牢紅TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸/堅(jiān)牢紅TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸/-堅(jiān)牢紅TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸/堅(jiān)牢紅TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸/新品紅(NABP/NF)、溴氯吲哚基磷酸/硝基藍(lán)四唑(BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-吡喃半乳糖苷(BCIG)。

發(fā)光標(biāo)記的實(shí)例包括魯米諾(luminol)、異魯米諾(isoluminol)、吖啶酯(acridinium ester)、1,2-二氧雜環(huán)丁烷以及吡啶并噠嗪。電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的實(shí)例包括釕衍生物。放射性標(biāo)記的實(shí)例包括碘、鈷、硒、氚、碳、硫以及磷的放射性同位素。

可檢測(cè)標(biāo)記可以連接至特異性地結(jié)合至所關(guān)注的生物標(biāo)志物的任何分子，例如抗體、核酸探針或聚合物。此外，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將了解可檢測(cè)標(biāo)記還可以偶聯(lián)至第二和/或第三和/或第四和/或第五結(jié)合劑、核酸或抗體等等。此外，熟練的技術(shù)人員將了解用于表征所關(guān)注的生物標(biāo)志物(例如，如表1、2、3、6或7中的一者或多者中所闡述的與ASD相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)SNP遺傳標(biāo)志物)的每個(gè)額外的結(jié)合劑或核酸可以充當(dāng)信號(hào)擴(kuò)增步驟?？梢允褂美绻鈱W(xué)顯微術(shù)、熒光顯微術(shù)、電子顯微術(shù)視覺上檢測(cè)生物標(biāo)志物，其中可檢測(cè)物質(zhì)是例如染料、膠體金粒子、發(fā)光試劑。還可以使用分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)合至生物標(biāo)志物的視覺上可檢測(cè)的物質(zhì)。在可檢測(cè)物質(zhì)是放射性同位素的情況下，可以通過自動(dòng)射線照相術(shù)視覺上，或使用閃爍計(jì)數(shù)器非視覺上進(jìn)行檢測(cè)。參看例如Larsson,1988,《免疫細(xì)胞化學(xué)：理論和實(shí)踐(Immunocytochemistry:Theory and Practice)》(CRC Press,Boca Raton,Fla.)；《分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)》,第80卷1998,John D.Pound(編)(Humana Press,Totowa,N.J.)，各自出于所有目的以其全文引用的方式并入。

在其它實(shí)施方案中，探針可以用例如生物素或地高辛間接作標(biāo)記，或用諸如³²P和³H的放射性同位素作標(biāo)記。舉例來說，可以由偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)志物的抗生物素蛋白檢測(cè)用生物素間接作標(biāo)記的探針。舉例來說，抗生物素蛋白可以偶聯(lián)至諸如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶的酶標(biāo)志物?？梢栽跇?biāo)準(zhǔn)比色反應(yīng)中使用酶的底物和/或催化劑檢測(cè)酶標(biāo)志物。堿性磷酸酶的催化劑包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸和硝基藍(lán)四唑。二氨基苯甲酸酯可以用作辣根過氧化物酶的催化劑。

展現(xiàn)差異性或選擇性結(jié)合至多態(tài)位點(diǎn)的寡核苷酸探針可以由本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員容易地設(shè)計(jì)。舉例來說，與包涵多態(tài)位點(diǎn)的序列(即，在內(nèi)部或在一個(gè)末端處包括多態(tài)位點(diǎn)的序列)完美互補(bǔ)的寡核苷酸一般將優(yōu)先雜交至包含那個(gè)序列的核酸，與包含替代性多態(tài)變體的核酸相反。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于包括具有多個(gè)可尋址區(qū)的襯底的陣列，和使用其的方法。這多個(gè)中的至少一個(gè)區(qū)包括特異性地結(jié)合至包含表1、2、3、6或7中所列的多態(tài)性的序列，并且可以用于檢測(cè)所述多態(tài)性，例如，如本文所描述的一個(gè)或多個(gè)SNP的不存在或存在的核酸探針。舉例來說，陣列可以包括可以用于檢測(cè)表1或2中所列的多態(tài)性的一個(gè)或多個(gè)核酸探針。在一些實(shí)施方案中，陣列進(jìn)一步包括至少一個(gè)區(qū)，其包括可以用于特異性地檢測(cè)與ASD相關(guān)的另一個(gè)標(biāo)志物，例如拷貝數(shù)變體(CNV)，例如美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2010/0210471和/或國際PCT公布號(hào)2014/055915(各自出于所有目的以其全文引用的方式并入)中所描述的CNV中的一者或多者的核酸探針。襯底可以是例如本領(lǐng)域中已知的二維襯底，諸如玻璃載片、晶片(例如，二氧化硅或塑料)、質(zhì)譜板，或三維襯底，諸如凝膠墊。在一些實(shí)施方案中，探針是核酸捕獲探針。

產(chǎn)生陣列的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且包括例如光刻法(參看例如美國專利號(hào)5,143,854、5,510,270以及5,527,681，其中每一者以其全文引用的方式并入)、機(jī)械法(例如，如美國專利號(hào)5,384,261中所描述的導(dǎo)向流法)、基于栓銷的方法(例如，如美國專利號(hào)5,288,514中所描述，以其全文引用的方式并入)、以及基于小珠的技術(shù)(例如，如PCT US/93/04145中所描述，以其全文引用的方式并入)。陣列通常包括能夠特異性地雜交至不同多態(tài)變體的寡核苷酸探針。根據(jù)這種方法，使所關(guān)注的核酸，例如包涵多態(tài)位點(diǎn)的核酸(其通常經(jīng)過擴(kuò)增)與陣列雜交并掃描。雜交和掃描一般根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。雜交和洗滌之后，掃描陣列以確定陣列上來自樣本的核酸雜交的位置。獲自掃描的雜交數(shù)據(jù)通常呈隨著陣列上的位置而變的熒光強(qiáng)度的形式。

陣列可以包括多個(gè)檢測(cè)塊(即，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)特定多態(tài)性的多組探針)。這樣的陣列可以用于分析多個(gè)不同的多態(tài)性，例如，在相同多態(tài)位點(diǎn)處的相異多態(tài)性或在不同染色體位點(diǎn)處的多態(tài)性。檢測(cè)塊可以在單個(gè)陣列內(nèi)或在多個(gè)獨(dú)立陣列中分組以使得在雜交期間可以使用變化的條件(例如，針對(duì)特定多態(tài)性而優(yōu)化的條件)。

寡核苷酸陣列用于檢測(cè)多態(tài)性的用途的額外描述可以例如在美國專利號(hào)5,858,659和5,837,832中找到，其中每一者以其全文引用的方式并入。

對(duì)來自受試者的樣本(測(cè)試樣本)進(jìn)行的SNP和/或CNV分型的結(jié)果可以與已知或疑似正常的生物樣本(“參考樣本”或“正常樣本”)或來源于這類生物樣本的數(shù)據(jù)相比較。在一些實(shí)施方案中，參考樣本是不獲自患有ASD的個(gè)體，或?qū)⒃赟NP分型試驗(yàn)中對(duì)于評(píng)價(jià)下的一個(gè)或多個(gè)SNP測(cè)試呈陰性的樣本。參考樣本可以在與測(cè)試樣本相同的時(shí)間或在不同的時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)。

對(duì)測(cè)試樣本的試驗(yàn)的結(jié)果可以與對(duì)參考樣本的相同試驗(yàn)的結(jié)果相比較。在一些情況下，對(duì)參考樣本的試驗(yàn)的結(jié)果來自數(shù)據(jù)庫或參考文獻(xiàn)。在一些情況下，對(duì)參考樣本的試驗(yàn)的結(jié)果是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或一般接受的值或值的范圍。在一些情況下，比較是定性的。在其它情況下，比較是定量的。在一些情況下，定性或定量比較可以涉及(但不限于)以下一者或多者：比較熒光值、光點(diǎn)強(qiáng)度、吸光度值、化學(xué)發(fā)光信號(hào)、直方圖、臨界閾值、統(tǒng)計(jì)顯著值、SNP存在或不存在、拷貝數(shù)變異。

在一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算每個(gè)個(gè)別的SNP測(cè)量的優(yōu)勢(shì)比(OR)。這里，OR是SNP的存在或不存在與結(jié)果，例如ASD陽性或ASD陰性之間的關(guān)聯(lián)的量度。優(yōu)勢(shì)比在病例-對(duì)照研究中是最常用的。舉例來說，參看《加拿大兒童和青少年精神病學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Can.Acad.Child Adolesc.Psychiatry)》2010；19(3):227-229，出于所有目的以其全文引用的方式并入。可以組合每個(gè)SNP的優(yōu)勢(shì)比以作出最終的ASD診斷。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以確定指定的統(tǒng)計(jì)置信水平以提供診斷置信水平。舉例來說，可以確定高于90％的置信水平可以是ASD的存在或受試者將發(fā)展ASD的可能性的有用預(yù)測(cè)因子。在其它實(shí)施方案中，可以選擇更大或更小嚴(yán)格度的置信水平。舉例來說，可以選擇約或至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或99.9％的置信水平作為有用的表型預(yù)測(cè)因子。在一些情況下，所提供的置信水平可能與樣本的質(zhì)量、數(shù)據(jù)的質(zhì)量、分析的質(zhì)量、所使用的特定方法和/或所分析的SNP和任選地CNV的數(shù)目有關(guān)。用于提供診斷的指定的置信水平可以在假陽性或假陰性的預(yù)期數(shù)目和/或成本的基礎(chǔ)上選擇。選擇用于達(dá)成指定的置信水平或用于鑒別具有診斷力的標(biāo)志物的參數(shù)的方法包括(但不限于)接受者工作特征(ROC)曲線分析、雙正態(tài)ROC、主分量分析、優(yōu)勢(shì)比分析、偏最小二乘分析、奇異值分解、最小絕對(duì)值收縮和選擇算子分析、最小角回歸以及閾值梯度導(dǎo)向正則化方法。

在一些情況下，SNP和CNV檢測(cè)可以經(jīng)由應(yīng)用經(jīng)過設(shè)計(jì)以標(biāo)準(zhǔn)化和/或改善數(shù)據(jù)的可靠性的算法來改善。在本公開的一些實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)分析由于所處理的大量個(gè)別數(shù)據(jù)點(diǎn)而需要用于應(yīng)用本文所描述的各種算法的計(jì)算機(jī)或其它裝置、機(jī)器或設(shè)備?！皺C(jī)器學(xué)習(xí)算法”指的是基于計(jì)算的預(yù)測(cè)方法，也被本領(lǐng)域的技術(shù)人員稱為“分類器”，用于表征SNP或SNP/CNV型態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過例如基于微陣列的雜交試驗(yàn)獲得的對(duì)應(yīng)于某些SNP或SNP/CNV的信號(hào)經(jīng)受算法以將型態(tài)歸類。監(jiān)督式學(xué)習(xí)一般涉及“訓(xùn)練”分類器以識(shí)別種類(例如，ASD陽性、ASD陰性、特定的ASD亞型)當(dāng)中的區(qū)別并且然后在獨(dú)立測(cè)試集上“測(cè)試”分類器的準(zhǔn)確性。對(duì)于新的未知樣本，分類器可以用于預(yù)測(cè)樣本所屬的種類(例如，ASD陽性、ASD陰性、特定的ASD亞型)。

在一些實(shí)施方案中，穩(wěn)健多陣列平均(RMA)方法可以用于標(biāo)準(zhǔn)化原始數(shù)據(jù)。RMA方法通過計(jì)算許多微陣列上的每個(gè)匹配單元的背景校正強(qiáng)度而開始。在一個(gè)實(shí)施方案中，背景校正值局限于如Irizarry等(2003).《生物統(tǒng)計(jì)學(xué)(Biostatistics)》4月4日(2):249-64(出于所有目的以其全文引用的方式并入)所描述的陽性值。在背景校正之后，然后獲得每個(gè)背景校正的匹配單元強(qiáng)度的以2為底的對(duì)數(shù)。然后使用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化方法來標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)微陣列上的背景校正、對(duì)數(shù)變換的匹配強(qiáng)度，其中對(duì)于每個(gè)輸入陣列和每個(gè)探針值，陣列百分位探針值被所有陣列百分位點(diǎn)的平均值替換，這種方法由Bolstad等《生物信息學(xué)(Bioinformatics)》2003(以其全文引用的方式并入)更全面地描述。在分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化之后，然后可以使標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)與線性模型擬合以獲得每個(gè)微陣列上的每個(gè)探針的強(qiáng)度量度。然后可以使用杜凱氏中位數(shù)平滑算法(Tukey's median polish algorithm)(Tukey,J.W.,《探索性數(shù)據(jù)分析(Exploratory Data Analysis)》.1977，以其全文引用的方式并入)確定標(biāo)準(zhǔn)化的探針組數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)級(jí)強(qiáng)度水平。

可以執(zhí)行各種其它軟件程序。在某些方法中，可以通過使用glmnet以lasso懲罰進(jìn)行邏輯回歸來進(jìn)行特征選擇和模型估計(jì)(Friedman等(2010).《統(tǒng)計(jì)軟件雜志(Journal of statistical software)》33(1):1-22，以其全文引用的方式并入)?？梢允褂肨opHat比對(duì)原始讀出(Trapnell等(2009).《生物信息學(xué)(Bioinformatics)》25(9):1105-11，以其全文引用的方式并入)。在方法中，頂部特征(N在10至200的范圍內(nèi))用于使用e1071文庫(Meyer D.支持向量機(jī)：程序包中與libsvm的界面(Support vector machines:the interface to libsvm in package)e1071.2014，以其全文引用的方式并入)訓(xùn)練線性支持向量機(jī)(SVM)(Suykens JAK,Vandewalle J.最小二乘支持向量機(jī)分類器(Least Squares Support Vector Machine Classifiers).《文字的神經(jīng)處理(Neural Processing Letters)》1999；9(3):293-300，以其全文引用的方式并入)?？梢允褂胮ROC包計(jì)算置信區(qū)間(Robin X,Turck N,Hainard A等pROC：用于R和S+以分析和比較ROC曲線的開源包(pROC:an open-source package for R and S+to analyze and compare ROC curves).《BMC生物信息學(xué)(BMC bioinformatics)》2011；12:77，以其全文引用的方式并入)。

另外，可以過濾數(shù)據(jù)以去除可能被認(rèn)為可疑的數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，來源于具有少于約4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)或8個(gè)鳥苷+胞嘧啶核苷酸的微陣列探針的數(shù)據(jù)由于其異常的雜交傾向或二級(jí)結(jié)構(gòu)問題而可能被認(rèn)為是不可靠的。類似地，來源于具有多于約12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)或22個(gè)鳥苷+胞嘧啶核苷酸的微陣列探針的數(shù)據(jù)由于其異常的雜交傾向或二級(jí)結(jié)構(gòu)問題而可能被認(rèn)為是不可靠的。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，來自探針組的數(shù)據(jù)如果在可檢測(cè)水平上(高于背景)不能鑒別，那么其可以從分析中排除。

在本公開的一些實(shí)施方案中，不展現(xiàn)或展現(xiàn)低方差的探針組可以從進(jìn)一步分析中排除。低方差探針組經(jīng)由卡方檢驗(yàn)(Chi-Square test)從分析中排除。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果探針組的變換方差在具有(N-l)自由度的卡方分布(Chi-Squared distribution)的99％置信區(qū)間的左邊，那么這個(gè)探針組被認(rèn)為是低方差。(N-l)×探針組方差/(基因探針組方差)。關(guān)于Chi-Sq(N-l)，其中N是輸入CEL文件的數(shù)目，(N-l)是卡方分布的自由度，并且“基因的探針組方差”是跨越基因的探針組方差的平均值。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，給定的SNP或SNP群組的探針組如果含有少于最少數(shù)目的通過先前所描述的GC含量、可靠性、方差等過濾步驟的探針，那么其可以從進(jìn)一步分析中排除。舉例來說，在一些實(shí)施方案中，給定的基因或轉(zhuǎn)錄物聚類的探針組如果含有少于約1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)或少于約20個(gè)探針，那么其可以從進(jìn)一步分析中排除。

SNP和任選地CNV數(shù)據(jù)分析的方法可以進(jìn)一步包括如本文所提供的特征選擇算法的使用。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，特征選擇通過使用LIMMA軟件包而提供(Smyth,G.K.(2005).Limma：微陣列數(shù)據(jù)的線性模型(Limma:linear models for microarray data).《使用R和生物導(dǎo)體的生物信息學(xué)和計(jì)算生物學(xué)解決方案(Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor)》,R.Gentleman,V.Carey,S.Dudoit,R.Irizarry,W.Huber(編),Springer,New York,第397-420頁，出于所有目的以其全文引用的方式并入)。

SNP和任選地CNV數(shù)據(jù)分析的方法可以進(jìn)一步包括預(yù)分類器算法的使用。舉例來說，算法可以使用特定的分子指紋以根據(jù)其組成將樣本預(yù)分類并且然后應(yīng)用校正/標(biāo)準(zhǔn)化因子。然后可以將這個(gè)數(shù)據(jù)/信息輸進(jìn)最終分類算法中，這個(gè)算法將合并那個(gè)信息以有助于最終診斷。

SNP和任選地CNV數(shù)據(jù)分析的方法可以進(jìn)一步包括如本文所提供的分類器算法的使用。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供對(duì)角線線性判別分析、k最近鄰算法、支持向量機(jī)(SVM)算法、線性支持向量機(jī)、隨機(jī)森林算法或基于概率模型的方法或其組合用于微陣列數(shù)據(jù)的分類。在一些實(shí)施方案中，區(qū)分樣本(例如，區(qū)分ASD陽性與正常)的所鑒別的標(biāo)志物是基于所關(guān)注的種類之間的表達(dá)水平的差異的統(tǒng)計(jì)顯著性來選擇。在一些情況下，統(tǒng)計(jì)顯著性通過應(yīng)用假發(fā)現(xiàn)率(FDR)的本杰明-霍奇伯格(Benjamin Hochberg)或另一種校正來調(diào)整。

在一些情況下，分類器算法可以用元分析方法補(bǔ)充，諸如由Fishel和Kaufman等2007《生物信息學(xué)(Bioinformatics)》23(13):1599-606(出于所有目的以其全文引用的方式并入)所描述。在一些情況下，分類器算法可以用諸如可重復(fù)性分析的元分析方法補(bǔ)充。

得出事后概率并且將其應(yīng)用于微陣列數(shù)據(jù)分析的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且已經(jīng)描述于例如Smyth,G.K.2004《遺傳學(xué)和分子生物學(xué)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用(Stat.Appi.Genet.Mol.Biol.)》3:第3節(jié)(出于所有目的以其全文引用的方式并入)中。在一些情況下，事后概率可以用于本發(fā)明的方法中以將分類器算法所提供的標(biāo)志物分級(jí)。

分子分型的結(jié)果的統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)可以提供指示以下一者或多者的定量值：ASD的診斷準(zhǔn)確的可能性；特定ASD(例如，自閉性障礙對(duì)比AS)的可能性；特定治療性干預(yù)成功的可能性。在一個(gè)實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)以其最有用的形式直接呈遞給醫(yī)師以指導(dǎo)患者護(hù)理。分子分型的結(jié)果可以使用本領(lǐng)域中已知的許多方法在統(tǒng)計(jì)上評(píng)價(jià)，包括(但不限于)：司徒登氏T檢驗(yàn)(students T test)、雙側(cè)T檢驗(yàn)、皮爾森秩和分析(pearson rank sum analysis)、隱馬爾可夫模型分析(hidden markov model analysis)、q-q圖分析、主分量分析、單因素ANOVA、兩因素ANOVA、LIMMA等等。

在一些情況下，準(zhǔn)確性可以通過隨著時(shí)間追蹤受試者以確定原始診斷的準(zhǔn)確性來確定。在其它情況下，準(zhǔn)確性可以按確定的方式或使用統(tǒng)計(jì)方法來確立。舉例來說，接受者工作特征(ROC)分析可以用于確定最佳試驗(yàn)參數(shù)以達(dá)成特定水平的準(zhǔn)確性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和/或假發(fā)現(xiàn)率。

在一些情況下，將SNP試驗(yàn)的結(jié)果加入數(shù)據(jù)庫中以供分子分型業(yè)務(wù)的代表或代理商、個(gè)體、醫(yī)療提供者或保險(xiǎn)提供者訪問。在一些情況下，試驗(yàn)結(jié)果包括由業(yè)務(wù)的代表、代理商或咨詢者，諸如醫(yī)療人員進(jìn)行的樣本分類、鑒別或診斷。在其它情況下，自動(dòng)地提供數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)或算法分析。在一些情況下，分子分型業(yè)務(wù)可以針對(duì)以下一者或多者給個(gè)體、保險(xiǎn)提供者、醫(yī)療提供者、研究者或政府實(shí)體開賬單：所進(jìn)行的分子分型試驗(yàn)、咨詢服務(wù)、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告或數(shù)據(jù)庫訪問。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，SNP分型的結(jié)果作為計(jì)算機(jī)屏幕上的報(bào)告或作為紙質(zhì)記錄而呈現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告可以包括(但不限于)諸如以下一者或多者的信息：與參考樣本相比所鑒別的SNP的數(shù)目、原始樣本的適宜性、診斷、診斷的統(tǒng)計(jì)置信度、特定ASD的可能性以及所提議的療法。

SNP分型的結(jié)果可以歸類為以下之一：ASD陽性、特定類型的ASD、非ASD樣本、或非診斷的(提供關(guān)于ASD的存在或不存在的不足信息)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用訓(xùn)練算法將結(jié)果歸類。本發(fā)明的訓(xùn)練算法包括已經(jīng)使用一組參考的已知ASD和正常樣本，例如，來自診斷出具有特定的ASD亞型、ASD或未診斷出具有ASD(ASD陰性)的個(gè)體的樣本開發(fā)的算法。在一些實(shí)施方案中，訓(xùn)練包括將來自第一ASD陽性樣本的SNP與第二ASD陽性樣本中的SNP相比較，其中第一組SNP包括第二組中沒有的至少一個(gè)SNP，并且SNP選自表1、2、3、6或7中所提供的SNP。

適用于樣本分類的算法包括(但不限于)k最近鄰算法、支持向量機(jī)、線性判別分析、對(duì)角線線性判別分析、上下法(updown)、樸素貝葉斯算法(naive Bayesian algorithm)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法、隱馬爾可夫模型算法、遺傳算法或其任何組合。

當(dāng)將生物樣本歸類用于ASD診斷時(shí)，通常存在來自二元分類器的兩種可能的結(jié)果。當(dāng)將二元分類器與實(shí)際真值(例如，來自生物樣本的值)相比較時(shí)，通常存在四種可能的結(jié)果。如果來自預(yù)測(cè)的結(jié)果是p(其中“p”是陽性分類器輸出，諸如ASD或特定ASD的存在)并且實(shí)際值也是p，那么其被稱為真陽性(TP)；然而，如果實(shí)際值是n，那么其被稱為假陽性(FP)。相反地，當(dāng)預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值都是n(其中“n”是陰性分類器輸出，諸如無ASD)時(shí)真陰性已經(jīng)出現(xiàn)，并且當(dāng)預(yù)測(cè)結(jié)果是n而實(shí)際值是p時(shí)是假陰性。在一個(gè)實(shí)施方案中，考慮試圖確定個(gè)人是否患有某種ASD的診斷測(cè)試。在這種情況下，當(dāng)個(gè)人測(cè)試呈陽性，但實(shí)際上不患有ASD時(shí)假陽性出現(xiàn)。另一方面，當(dāng)個(gè)人測(cè)試呈陰性，表明其健康時(shí)假陰性出現(xiàn)，此時(shí)其實(shí)際上確實(shí)患有疾病(ASD)。

疾病的陽性預(yù)測(cè)值(PPV)或精確率或驗(yàn)后概率是正確診斷的具有陽性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例。其反映了陽性測(cè)試反映所測(cè)試的基礎(chǔ)病狀的概率。然而，其值取決于疾病的流行率，這可能有變化。在一個(gè)實(shí)例中，提供以下特征：FP(假陽性)；TN(真陰性)；TP(真陽性)；FN(假陰性)。假陽性率(α)＝FP/(FP+TN)-特異性；假陰性率(β)＝FN/(TP+FN)-敏感性；功率＝敏感性＝1-β；陽性似然比＝敏感性/(1-特異性)；陰性似然比＝(1-敏感性)/特異性。陰性預(yù)測(cè)值(NPV)是正確診斷的具有陰性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例。

在一些實(shí)施方案中，主題方法的SNP分析的結(jié)果提供了所給出的診斷是正確的統(tǒng)計(jì)置信水平。在一些實(shí)施方案中，這樣的統(tǒng)計(jì)置信水平為至少約或大于約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高。

在一個(gè)實(shí)施方案中，取決于SNP雜交試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，選擇受試者用于特定ASD的治療。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇受試者用于典型自閉癥的治療。治療包括例如基因療法、RNA干擾(RNAi)、行為療法(例如，應(yīng)用行為分析(ABA)、單一嘗試訓(xùn)練(DTT)、早期集中行為干預(yù)(EIBI)、關(guān)鍵反應(yīng)訓(xùn)練(PRT)、言語行為干預(yù)(VBI)以及基于發(fā)育個(gè)體差異關(guān)系的方法(DIR))、物理療法、職業(yè)療法、感覺統(tǒng)合療法、口語療法、圖片交換溝通系統(tǒng)(PECS)、膳食治療以及藥物(例如，抗精神病劑、抗抑郁劑、抗驚厥劑、刺激劑)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇受試者用于阿斯伯格氏癥的治療。治療包括例如基因療法、RNAi、職業(yè)療法、物理療法、溝通和社會(huì)技能訓(xùn)練、認(rèn)知行為療法、口語或語言療法以及藥物(例如，阿立哌唑(aripiprazole)、胍法辛(guanfacine)、選擇性血清素再吸收抑制劑(SSRI)、利培酮(riseridone)、奧氮平(olanzapine)、納曲酮(naltrexone))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇受試者用于雷特氏癥的治療。治療包括例如基因療法、RNAi、職業(yè)療法、物理療法、口語或語言療法、營養(yǎng)補(bǔ)充劑以及藥物(例如，SSRI、抗精神病劑、β-阻斷劑、抗驚厥劑)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇受試者用于CDD的治療。治療包括例如基因療法、RNAi、行為療法(例如，ABA、DTT、EIBI、PRT、VBI以及DIR)、感覺強(qiáng)化療法、職業(yè)療法、物理療法、口語或語言療法、營養(yǎng)補(bǔ)充劑以及藥物(例如，抗精神病劑和抗驚厥劑)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇受試者用于PDD-NOS的治療。治療包括例如基因療法、RNAi、行為療法(例如，ABA、DTT、EIBI、PRT、VBI以及DIR)、物理療法、職業(yè)療法、感覺統(tǒng)合療法、口語療法、PECS、膳食治療以及藥物(例如，抗精神病劑、抗抑郁劑、抗驚厥劑、刺激劑)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇治療受試者用于基因療法以校正、置換或補(bǔ)償靶基因，例如，表1中的基因之一的野生型等位基因。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種診斷測(cè)試。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷測(cè)試包含一個(gè)或多個(gè)用于雜交試驗(yàn)中的寡核苷酸。一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸經(jīng)過設(shè)計(jì)以雜交至表1、2、3、6或7中所闡述的一個(gè)或多個(gè)SNP(例如，兩個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、十個(gè)或更多個(gè)、十五個(gè)或更多個(gè)、或二十個(gè)或更多個(gè))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸(例如，兩個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、十個(gè)或更多個(gè)、十五個(gè)或更多個(gè)、或二十個(gè)或更多個(gè))存在于微陣列上。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷測(cè)試包含一個(gè)或多個(gè)裝置、工具以及裝備，其經(jīng)過配置以收集來自個(gè)體的遺傳樣本。在診斷測(cè)試的一個(gè)實(shí)施方案中，收集遺傳樣本的工具可以包括拭子、解剖刀、注射器、刮刀、容器以及其它裝置和試劑中的一者或多者，其經(jīng)過設(shè)計(jì)以有助于遺傳樣本的收集、儲(chǔ)存和運(yùn)輸。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷測(cè)試可以包括用于收集、穩(wěn)定、儲(chǔ)存和處理遺傳樣本的試劑或溶液。用于收集、穩(wěn)定、儲(chǔ)存和處理遺傳物質(zhì)的這樣的試劑和溶液為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所公開的診斷測(cè)試可以包含微陣列設(shè)備和相關(guān)試劑、流動(dòng)池設(shè)備和相關(guān)試劑、多重下一代核酸測(cè)序儀和相關(guān)試劑，以及針對(duì)某些遺傳標(biāo)志物的存在分析遺傳樣本以及檢測(cè)和顯現(xiàn)某些遺傳標(biāo)志物所必需的額外硬件和軟件。

實(shí)施例

本發(fā)明通過參考以下實(shí)施例進(jìn)一步說明。然而，應(yīng)注意，這些實(shí)施例，如同上文所描述的實(shí)施方案一樣，是說明性的并且不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中所引用的參考文獻(xiàn)出于所有目的以其全文引用的方式并入。

除了可以通過DNA測(cè)序而鑒別的單核苷酸變體和小插入/缺失以外，更大的缺失或重復(fù)(拷貝數(shù)變體、CNV)已經(jīng)顯示在ASD的病原學(xué)中起作用[15-27]。盡管觀測(cè)到許多ASD易感CNV繼承自未受影響的親本，但擴(kuò)展的多代系譜的缺乏已經(jīng)阻礙ASD易感CNV和SNP的分離的全面分析以及其表達(dá)所必需的其它遺傳因素的表征。Utah中可用的大家族結(jié)合家族成員自愿參與遺傳研究中已經(jīng)得以鑒別孟德爾(Mendelian)與復(fù)雜疾病的大量疾病易感基因。

這項(xiàng)研究中所用的系譜是先前所公布的70家族連鎖研究的一部分[28]和評(píng)價(jià)這個(gè)集合的家族中的單個(gè)擴(kuò)展系譜的兩個(gè)更小研究[29、30]。在這個(gè)實(shí)施例中，通過進(jìn)行單體型共享分析以鑒別潛在地具有ASD易感基因的染色體區(qū)域來分析26個(gè)擴(kuò)展多代ASD家族和四個(gè)兩代多重ASD家族的成員。然后采用共享區(qū)域中的所有基因和額外的自閉癥風(fēng)險(xiǎn)基因的DNA捕獲和測(cè)序以鑒別這些家族中可能易感ASD的SNP。在大的病例/對(duì)照研究中并且針對(duì)這些家族中的分離來分析這些SNP。還評(píng)價(jià)這些家族中先前所報(bào)道的CNV的分離[27]。

方法

DNA樣本

在這項(xiàng)研究中使用來自26個(gè)擴(kuò)展多代和四個(gè)兩代Utah多重ASD系譜的總共386個(gè)DNA樣本。查明家族并且使用如先前所描述的Utah人口數(shù)據(jù)庫(UPDB)募集[28]。如先前所描述[27]，使用自閉癥診斷訪談修訂版(ADI-R)和自閉癥診斷觀察量表(ADOS)針對(duì)家族性ASD病例與無關(guān)ASD病例確定影響狀態(tài)。每個(gè)系譜中受影響的個(gè)體的平均數(shù)是7.9。此處所描述的系譜是先前所描述的那些的子組[28]。系譜細(xì)節(jié)示于表9中。

先前在病例/對(duì)照研究中所描述的總共9,000個(gè)DNA樣本[27]，包括3,000個(gè)ASD個(gè)體和6,000個(gè)對(duì)照，用于評(píng)價(jià)更廣泛的群體中的這些變體。在猶他大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(Institutional Review Board，IRB)(猶他大學(xué)IRB#：6042-96)和費(fèi)城兒童醫(yī)院(Children's Hospital of Philadelphia)IRB(CHOP IRB#：IRB 06-004886)批準(zhǔn)的方法下收集用于此處所描述的工作的所有樣本。經(jīng)由猶他大學(xué)精神科或費(fèi)城兒童醫(yī)院門診部或CHOP外展門診部募集患者和其家族。在錄入項(xiàng)目中之前使用IRB批準(zhǔn)的同意書形式從參與者或其父母獲得書面知情同意書。對(duì)于選擇不參與研究的個(gè)體或家族不存在歧視。匿名分析所有數(shù)據(jù)并且根據(jù)赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)中所表述的原則進(jìn)行所有臨床調(diào)查。

SNP微陣列基因分型

使用制造商推薦的程序?qū)θ?86個(gè)DNA樣本進(jìn)行Affymetrix 250K NspI SNP芯片基因分型。由Affymetrix基因分型控制臺(tái)軟件使用BRLMM[31]基因型調(diào)用算法調(diào)用基因型。只有調(diào)用率大于或等于99％的SNP用于進(jìn)一步分析。使用PedCheck[32]也鑒別展示孟德爾錯(cuò)誤的SNP并且將其排除在外。

共享單體型分析

對(duì)每個(gè)系譜進(jìn)行共享單體型分析，以鑒別那個(gè)系譜中在受影響的個(gè)體當(dāng)中具有顯著共享的基因組區(qū)域。HapShare算法[33]用于基于孟德爾繼承進(jìn)行單體型定相并且鑒別共享基因組區(qū)段。比較包括N個(gè)受影響的個(gè)體中的N個(gè)、N個(gè)中的(N-1)個(gè)、N個(gè)中的(N-2)個(gè)、N個(gè)中的(N-3)個(gè)等等(參看[33]中的圖4)。在兩代系譜中，在一些情況下，在所分析的所有受影響的個(gè)體中觀測(cè)到單體型的共分離，但共享區(qū)域很大，包括多達(dá)一半的染色體。因此，不選擇來自核心家族的共享區(qū)域用于測(cè)序，除非其與額外家族中所觀測(cè)的區(qū)域重疊。

定制靶向外顯子組DNA測(cè)序

NimbleGen定制序列捕獲陣列經(jīng)過設(shè)計(jì)以捕獲在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的2,000個(gè)堿基對(duì)以及在共享基因組區(qū)段內(nèi)的基因的所有外顯子和外顯子-內(nèi)含子邊界。來自單體型共享區(qū)域外部的額外23個(gè)基因從文獻(xiàn)中基于其在自閉癥或神經(jīng)元功能中的潛在作用而選擇(參看表10)。捕獲總共約1,800個(gè)基因。由范德堡大學(xué)微陣列共享資源設(shè)施對(duì)來自顯示基因組區(qū)段共享的11個(gè)家族的26個(gè)受影響的個(gè)體的DNA進(jìn)行捕獲和Illumina DNA測(cè)序。將短讀出與國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)參考人類基因組構(gòu)建36(GRCh36/hg18)比對(duì)，并且使用表4中所描述的軟件比對(duì)和變體調(diào)用方法調(diào)用變體[34-36]。選擇通過至少兩種方法檢測(cè)的潛在變體用于進(jìn)一步分析。

變體注釋

最初使用cSNP分類器，稍后并入VAAST[37]中的初步程序進(jìn)行硅片內(nèi)功能分析，以將變體歸類為同義、保守性錯(cuò)義、非保守性錯(cuò)義、無義、框移或剪接位點(diǎn)突變。稍后，使用ANNOVAR程序[38]重注釋變體。來自UCSC基因組瀏覽器的KnownGene和RefSeq基因蹤跡用于注釋功能變體，并且LiftOver工具用于將人類基因組構(gòu)建36(GRCh36/hg18)坐標(biāo)轉(zhuǎn)換成人類基因組構(gòu)建37(GRCh37/hg19)坐標(biāo)[39、40]。

定制微陣列設(shè)計(jì)和陣列處理

先前描述了包括用于2,799個(gè)功能SNP的探針和7,134個(gè)CNV探針的定制iSelect Infinium^TM II BeadChip陣列(Illumina Inc.)的設(shè)計(jì)[27]。先前在費(fèi)城兒童醫(yī)院(CHOP)的應(yīng)用基因組學(xué)中心(Center for Applied Genomics)對(duì)3,000個(gè)病例和6,000個(gè)對(duì)照樣本處理定制iSelect陣列[27]。

相同的陣列還用于在猶他大學(xué)基因組學(xué)核心設(shè)施處分析來自196個(gè)Utah發(fā)現(xiàn)組群家族成員的DNA以供家族中SNP分離的變體驗(yàn)證和分析。

陣列數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

樣本QC

如果以下任一者是真實(shí)的，那么受試者從SNP分析中扣除：(1)在基因分型之后，DNA樣本具有明顯很差的質(zhì)量，由極低調(diào)用率證明(N＝134)；(2)受試者被鑒別為三染色體21(N＝51)；(3)受試者在通過主分量分析(PCA)鑒別的高加索受試者的中心聚類之外(N＝903)[27]。

親緣關(guān)系估計(jì)進(jìn)一步指示，病例受試者和對(duì)照中的一些是數(shù)據(jù)中所表現(xiàn)的具有多個(gè)親屬的家族的一部分。所使用的樣本組群中的家族結(jié)構(gòu)的再評(píng)價(jià)隨后鑒別額外的關(guān)系。因此，僅使用每個(gè)已知家族的一個(gè)成員進(jìn)行后續(xù)關(guān)聯(lián)測(cè)試以降低由于親緣關(guān)系所致的統(tǒng)計(jì)混淆的可能性。對(duì)于這些測(cè)試，選自每個(gè)家族的受試者是位于前兩個(gè)主分量的中位數(shù)質(zhì)心最近處的個(gè)體。由于親緣關(guān)系而去除的受試者的數(shù)目是688。這使得用于關(guān)聯(lián)測(cè)試的最終樣本集包含7326個(gè)受試者，其中1541個(gè)是病例并且5785個(gè)是對(duì)照。

主分量分析(PCA)用于避免由于群體分層所致的人為結(jié)果。在Golden Helix SNP和Variation Suite(SVS)中使用默認(rèn)設(shè)置計(jì)算主分量。所有受試者都包括于計(jì)算中，樣本QC不合格的那些除外。在計(jì)算主分量之前，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)過濾SNP：對(duì)于在50個(gè)SNP的移動(dòng)窗口內(nèi)的所有SNP對(duì)，僅常染色體，調(diào)用率>0.95，次要等位基因頻率(MAF)>0.05，連鎖不平衡R²<25％。2008個(gè)SNP，包括CNV分析所用的那些，用于主分量計(jì)算。沒有基因型數(shù)據(jù)可用于參考群體。然而，自我報(bào)告的種族變量可用于大多數(shù)受試者。前兩個(gè)主分量的圖示出了受試者的主要中心聚類，其中離群組沿著兩個(gè)軸延伸。這些大致對(duì)應(yīng)于如在表型數(shù)據(jù)中自我報(bào)告的亞洲人和非裔美國人祖先。應(yīng)用簡單的離群點(diǎn)檢測(cè)算法以將受試者分層為代表最可能的高加索人和非高加索人的兩個(gè)組。這通過首先計(jì)算來自前兩個(gè)主分量向量的中位數(shù)質(zhì)心的每個(gè)受試者的笛卡爾距離(Cartesian distance)來完成。在確定距離的第三四分位數(shù)(Q3)和四分位數(shù)間距(IQR)之后，距離超過Q3+1.5×IQR的任何受試者被確定為在主聚類之外，并且因此是非高加索人。682個(gè)受試者處于非高加索人類別中。先前報(bào)道了這個(gè)PCA分析的結(jié)果的圖形表示[27]。

SNP質(zhì)量控制(QC)

在關(guān)聯(lián)測(cè)試之前，評(píng)價(jià)SNP的調(diào)用率、哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)以及等位基因頻率。調(diào)用率低于99％的所有SNP從進(jìn)一步分析中去除。沒有SNP具有顯著的哈迪-溫伯格不平衡(Hardy-Weinberg disequilibrium)。

SNP和CNV的實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)

對(duì)于SNP的分子驗(yàn)證，首先通過LightScanner高分辨率熔解曲線分析(BioFire Diagnostics Inc.)針對(duì)序列變體的存在來篩選PCR產(chǎn)物。PCR引物序列示于表3中。使用桑格法對(duì)給出異常溶解型態(tài)的任何樣本進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)序列變體的存在。對(duì)于CNV，如先前所描述使用預(yù)先或定制設(shè)計(jì)的TaqMan拷貝數(shù)試驗(yàn)(Applies Biosystems Inc.)[27]。

蛋白質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)

如先前所描述表達(dá)和純化所有GST標(biāo)記的蛋白質(zhì)[41]。為了測(cè)試Rab11FIP5與各種Rab GTPase的結(jié)合，在1μm GMP-PNP存在下將純化的重組FIP5(490-653)或FIP5(490-653)-P652L與涂布有GST、GST-Rab11a、GST-Rab4a或GST-Rab3a的谷胱甘肽小珠一起孵育。然后用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌小珠并且用1％SDS洗脫。然后通過用抗Rab11FIP5抗體進(jìn)行免疫印跡針對(duì)FIP5(490-653)的存在來分析洗脫液。還使用類似的試驗(yàn)測(cè)試Rab11FIP5(野生型或P652L突變體)二聚的能力。

轉(zhuǎn)鐵蛋白再循環(huán)的流式細(xì)胞術(shù)分析

為了測(cè)試Rab11FIP5-P652L突變體對(duì)內(nèi)吞再循環(huán)的影響，如先前所描述使用轉(zhuǎn)鐵蛋白再循環(huán)試驗(yàn)[42]。簡單地說，將表達(dá)野生型FIP5-GFP或FIP5-GFP-P652L的HeLa細(xì)胞與偶聯(lián)至Alexa488的轉(zhuǎn)鐵蛋白一起孵育。然后洗滌細(xì)胞并且與血清補(bǔ)充的培養(yǎng)基一起孵育不同的時(shí)間量。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞相關(guān)(未再循環(huán))的Tf-Alexa488。

結(jié)果

為了鑒別多重ASD家族中易感ASD的基因，采取單體型共享/定制DNA捕獲和測(cè)序方法。采取圖1中所概述的工作流程，首先鑒別在多重ASD家族中受影響的個(gè)體當(dāng)中過度共享的染色體區(qū)域。然后使用序列捕獲以鑒別處于共享區(qū)域中的基因中的潛在功能序列變體，以及鑒別額外的ASD基因。最后，評(píng)價(jià)ASD家族中的那些變體的分離，并且在一大組ASD病例和一大組對(duì)照中確定其流行率。這個(gè)工藝的細(xì)節(jié)描述于下文。

Affymetrix 250K SNP基因分型和單體型共享

對(duì)來自26個(gè)擴(kuò)展多代和4個(gè)兩代Utah多重ASD系譜的386個(gè)DNA樣本進(jìn)行SNP基因分型。不具有映射位置的SNP不包括于分析中。對(duì)于整個(gè)數(shù)據(jù)集的平均調(diào)用率是99.1％。

HapShare方法[33]用于鑒別在我們研究的30個(gè)系譜中的每一者中受影響的個(gè)體當(dāng)中具有顯著共享的基因組區(qū)域?；诿系聽柪^承僅使用信息標(biāo)志物確定父系和母系單體型。然后在每個(gè)擴(kuò)展或核心家族內(nèi)受影響的個(gè)體當(dāng)中比較這些單體型?；跀U(kuò)展系譜中的共享選擇單體型共享的十八個(gè)區(qū)域用于進(jìn)一步分析。我們?cè)谑苡绊懙膫€(gè)體當(dāng)中觀測(cè)到的共享程度和選擇用于DNA捕獲和測(cè)序的區(qū)域的坐標(biāo)示于表5中?；谒嫉倪B鎖分析使用一組重疊的家族選擇兩個(gè)額外的區(qū)域用于DNA捕獲和測(cè)序[28]。

序列捕獲、序列分析以及變體鑒別

使用來自顯示基因組區(qū)段的最佳共享的11個(gè)家族的26受影響的個(gè)體的DNA進(jìn)行捕獲和DNA測(cè)序。這些樣本包括來自具有與擴(kuò)展系譜中所鑒別的區(qū)域重疊的共享單體型的兩代系譜的個(gè)體。八百萬至九百萬個(gè)36堿基短讀出獲自每個(gè)樣本。短讀出與國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)參考人類基因組構(gòu)建36的比對(duì)揭示經(jīng)過設(shè)計(jì)的捕獲區(qū)的86％至97％的覆蓋率，其中在經(jīng)過設(shè)計(jì)的捕獲區(qū)上的平均讀出深度是30至47X。

以定向方式構(gòu)造捕獲文庫，所有捕獲探針代表相同的DNA股，并且僅從一個(gè)方向?qū)ξ膸爝M(jìn)行測(cè)序。因此，可能存在一些基因中未檢測(cè)到的額外變體。舉例來說，在分離至染色體2和14上的系譜10中的所有受影響的個(gè)體的單體型上未鑒別到變體(圖7A和7B、圖15)。盡管如此，使用表4中所示的三種方法的變體調(diào)用鑒別超過一百萬個(gè)通過三種方法中的至少兩種調(diào)用的序列變體。使用cSNP分類器的分析得以檢測(cè)2,825個(gè)SNP，包括210個(gè)無義變體、1,614個(gè)非保守性錯(cuò)義變體、35個(gè)框移變體以及966個(gè)剪接位點(diǎn)變體。

定制微陣列經(jīng)過設(shè)計(jì)以評(píng)價(jià)通過測(cè)序鑒別的變體以便(1)詢問發(fā)現(xiàn)家族中的整組功能SNP以供驗(yàn)證，和(2)進(jìn)行大規(guī)模病例/對(duì)照研究以確定變體中的任一者是否鑒別對(duì)患有ASD的兒童的廣泛群體重要的易感基因(圖1)。在陣列設(shè)計(jì)和制造之后，成功地創(chuàng)建用于2,413個(gè)變體的探針。Utah發(fā)現(xiàn)和CHOP病例/對(duì)照樣本的定制微陣列實(shí)驗(yàn)揭示2,413個(gè)變體中的584個(gè)是多態(tài)的。多態(tài)變體的完整清單示于表11中。剩余的陣列探針(1,829個(gè)變體)并未檢測(cè)非參考序列等位基因。因此，這1,829個(gè)變體由于單一末端序列數(shù)據(jù)的變體調(diào)用和比對(duì)工藝被解釋為假陽性。

在病例/對(duì)照研究中使用等位基因關(guān)聯(lián)測(cè)試來測(cè)試所有常染色體SNP變體與自閉癥的關(guān)聯(lián)。使用費(fèi)希爾氏精確檢驗(yàn)(Fisher's exact test)與卡方檢驗(yàn)評(píng)估每一者的統(tǒng)計(jì)顯著性。等位基因關(guān)聯(lián)測(cè)試檢測(cè)與作用方向無關(guān)的任何顯著結(jié)果。十一個(gè)SNP(參看圖8中的聚類)是病例所特有的或具有大于1.5的優(yōu)勢(shì)比(次要等位基因)(表6)。基于1.5的優(yōu)勢(shì)比截止優(yōu)先考慮在病例/對(duì)照研究中所觀測(cè)的變體用于額外的工作。還包括病例所特有的變體。選擇這種方法而不使用p值，因?yàn)檫@些變體太罕見以致無法基于p值選擇，并且對(duì)于相對(duì)罕見的疾病，優(yōu)勢(shì)比大約相當(dāng)于相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值。另外，僅在Utah發(fā)現(xiàn)組群中而非CHOP病例或?qū)φ罩袡z測(cè)到28個(gè)SNP(表7)。這28個(gè)SNP被認(rèn)為是潛在的ASD風(fēng)險(xiǎn)等位基因，這是因?yàn)?i)其在一般群體中是罕見的或不存在并且因此可以代表“私有突變”，(ii)其可能影響蛋白質(zhì)功能，以及(iii)其分離至高風(fēng)險(xiǎn)自閉癥系譜中的一個(gè)或多個(gè)患有自閉癥的兒童。因此，在36個(gè)不同基因中發(fā)現(xiàn)的這39個(gè)SNP被表征為潛在的自閉癥風(fēng)險(xiǎn)變體。這39個(gè)變體中的每一者定位至我們的靶向區(qū)域(表5)，并且預(yù)測(cè)39個(gè)變體中的30個(gè)通過至少一個(gè)嵌入ANNOVAR[35]中的程序，包括SIFT、Polyphen2、LRT以及MutationTaster而損壞。這些變體的分析的細(xì)節(jié)示于表12中。通過PCR擴(kuò)增子的桑格DNA測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)全部39個(gè)SNP(對(duì)于序列色譜圖，參看圖9-10)。用于變體注釋的轉(zhuǎn)錄物在表12中找到。

高風(fēng)險(xiǎn)系譜中變體的分離

為了確定所鑒別的變體的潛在顯著性，提高相關(guān)系譜中這些變體的分離模式。在選擇個(gè)體用于DNA捕獲和測(cè)序的11個(gè)系譜中的10個(gè)中鑒別潛在有害的序列變體。系譜中的幾個(gè)分離多于一個(gè)變體，指示高風(fēng)險(xiǎn)ASD系譜中的基礎(chǔ)遺傳學(xué)的復(fù)雜性。此外，這些系譜中有許多還具有在先前的工作中鑒別的CNV[27]。增添遺傳復(fù)雜性，這些CNV中有許多還分離至受影響的個(gè)體。此處示出了展示這些復(fù)雜繼承模式的五個(gè)家族(圖2-6)。具有多個(gè)變體的五個(gè)額外系譜示于圖11-15中。

系譜1(圖2)示出了共分離RAB11FIP5中的錯(cuò)義變體的兩代家族(表7)。這個(gè)變體存在于母體中并且分離至家族中全部三個(gè)男性受影響的兒童，并且不分離至未受影響的女性兒童。RAB11FIP5先前基于其在診斷出待分類的廣泛性發(fā)展障礙(PDD-NOS)的10歲男性兒童中觀測(cè)到的易位而破壞已經(jīng)作為ASD風(fēng)險(xiǎn)基因牽涉在內(nèi)[41]。在系譜1中檢測(cè)的變體引起P652L取代。脯氨酸在迄今測(cè)序的所有哺乳動(dòng)物RAB11FIP5基因中的這個(gè)殘基處保守，表明其對(duì)于蛋白質(zhì)功能是重要的。在病例/對(duì)照研究(表6)中使用定制微陣列檢測(cè)具有P652H變體的第二個(gè)體。P652L取代和P652H取代在ESP6500、1000個(gè)基因組項(xiàng)目或dbSNP137數(shù)據(jù)庫中都未觀測(cè)到(表12)。通過桑格測(cè)序確認(rèn)這些變體中的每一者(對(duì)于色譜圖，參看圖9-10)。非歐洲血統(tǒng)并且因此不包括于病例/對(duì)照研究中的額外受影響的個(gè)體也攜帶P652H變體(數(shù)據(jù)未示出)?；加凶蚤]癥并且不在任何對(duì)照中的額外個(gè)體中P652H變體的存在進(jìn)一步支持RAB11FIP5中的變體對(duì)自閉癥風(fēng)險(xiǎn)有貢獻(xiàn)的可能性。

系譜2(圖3)是具有來自兩個(gè)父體的六個(gè)受影響的個(gè)體的兩代家族。在這個(gè)系譜中，六個(gè)受影響的個(gè)體中的五個(gè)繼承C14orf2中引起I26T取代的變體。兩個(gè)額外的序列變體，在PDK4和SDR39U1基因中各一個(gè)，分別分離至三個(gè)和兩個(gè)受影響的個(gè)體。另外，先前所描述的CNV增益(OR＝3.37)[27]存在于一個(gè)受影響的個(gè)體中。C14orf2和PDK4變體母系繼承，而C7orf10和CNV是父系起源的或作為新生變體出現(xiàn)。在這個(gè)家族中檢測(cè)的變體當(dāng)中，在我們的病例/對(duì)照研究中僅觀測(cè)到C7orf10變體。然而，這個(gè)變體具有1.62的優(yōu)勢(shì)比(95％置信區(qū)間1.04-2.53)，表明在一般群體中易感自閉癥中起作用的可能性。

系譜3(圖4)也是兩代家族，具有五個(gè)受自閉癥影響的男性兒童。在這個(gè)系譜中，五個(gè)受影響的個(gè)體中的四個(gè)展現(xiàn)KLHL6基因中F154L變體的母系繼承。這個(gè)A/G核苷酸變體也在外顯子的第一核苷酸處發(fā)現(xiàn)并且因此也可能影響KLHL6主要轉(zhuǎn)錄物的剪接。除了這個(gè)變體以外，五個(gè)后代中的三個(gè)具有SPATA5L1基因中父系繼承的D303H錯(cuò)義變體，而五個(gè)中的兩個(gè)也具有ITPK1基因中母系繼承的P238L變化。一個(gè)受影響的兒童并不繼承這些變體中的任一者。值得關(guān)注的是，在群體研究中在任何病例或?qū)φ罩形从^測(cè)到在這個(gè)小家族中觀測(cè)到的變體，表明其不是常見的自閉癥易感基因座。

系譜4(圖5)是具有全部7個(gè)受自閉癥影響的男性兒童的共同祖先的六代家族。這些兒童全部處于系譜的第五或第六代中。先前使用Affymetrix10K SNP基因型數(shù)據(jù)對(duì)這個(gè)家族進(jìn)行連鎖分析[29、30]，并且鑒別顯著連鎖的三個(gè)區(qū)域。這些包括3q13.2-q13.31、3q26.31-q27.3以及20q11.21-q13.12。在這項(xiàng)研究中通過單體型共享也鑒別這三個(gè)區(qū)域(圖5，對(duì)于染色體20單體型共享，參看圖7C)。這個(gè)家族中七個(gè)受影響的個(gè)體中的四個(gè)共享P49L變體，這是染色體20q11.21上DEFB124基因中的A/G轉(zhuǎn)換的結(jié)果，與我們所觀測(cè)的單體型共享(圖7c)并且與所公布的連鎖結(jié)果一致。在我們的群體研究中在病例或?qū)φ罩形从^測(cè)到這個(gè)變體。這個(gè)系譜中一個(gè)受影響的個(gè)體并不共享DEFB124變體，而替代地具有從其父體繼承的染色體3q增益CNV，在我們的先前研究中具有3.74的優(yōu)勢(shì)比[27]。提高的優(yōu)勢(shì)比表明這個(gè)CNV是自閉癥風(fēng)險(xiǎn)基因座。

系譜4中兩個(gè)額外受影響的個(gè)體不攜帶在我們的家族中所檢測(cè)的任何變體。然而，如圖5中所指示，這兩個(gè)個(gè)體中的每一個(gè)從具有自閉癥的強(qiáng)家族史的結(jié)婚配偶遺傳，表明額外未檢測(cè)的變體的可能性。

最后，一個(gè)攜帶DEFB124變體的受影響的個(gè)體攜帶HEPACAM2基因(在我們的群體研究中優(yōu)勢(shì)比1.83，表6)、AP1G2基因(優(yōu)勢(shì)比1.67、表6)、PYGO1基因以及RELN基因中的變體。RELN變體和PYGO1變體在病例/對(duì)照研究中都未觀測(cè)到(表7)。RELN中的純合或復(fù)合雜合突變與無腦回癥相關(guān)聯(lián)[44、45]，但這個(gè)RELN缺失是具有可能歸因于這個(gè)基因座處的單倍不足的發(fā)育表型的個(gè)體的首次描述。

系譜5(圖6)是具有九個(gè)受自閉癥影響的個(gè)體(7個(gè)男性、2個(gè)女性)的四代家族。兩個(gè)變體在這個(gè)家族中特別受關(guān)注。第一個(gè)是包括NRXN1α基因的5'側(cè)接區(qū)域的CNV。這個(gè)CNV從在第二代的家族中結(jié)婚的父體繼承。這個(gè)CNV分離至診斷患有自閉癥的這個(gè)個(gè)體的四個(gè)后代中的三個(gè)。重疊的NRXN1αCNV在我們的先前工作中顯示具有14.96的優(yōu)勢(shì)比[27]，與表明NRXN1α相關(guān)變體在自閉癥以及其它神經(jīng)病癥中的作用的先前工作一致[46-48]。然而，那個(gè)CNV顯示延伸至NRXN1α的編碼區(qū)域中，而TaqMan CNV分析展示系譜5中的CNV并不如此(數(shù)據(jù)未示出)。因此，在這個(gè)家族中所觀測(cè)的NRXN1αCNV的顯著性是不確定的。

在由家族的兩個(gè)分支中的全部五個(gè)受影響的個(gè)體共享的單體型上發(fā)現(xiàn)的在這個(gè)家族中鑒別的第二變體(圖7c)是引起R3233C錯(cuò)義取代的AKAP9基因中的C/T轉(zhuǎn)換。家族的這兩個(gè)分支中無一個(gè)體攜帶NRXN1αCNV。在我們的群體研究中在4/1541病例和4/5785對(duì)照中觀測(cè)到AKAP9變體(3.76的優(yōu)勢(shì)比，95％置信區(qū)間0.94-15.03)(表6)。在核心家族中單個(gè)受影響的個(gè)體中觀測(cè)到AKAP9基因中的第二錯(cuò)義變體(系譜6，圖11)。在病例/對(duì)照研究中未觀測(cè)到這個(gè)第二AKAP9變體(表7)。蛋白質(zhì)的AKAP家族已經(jīng)表明連接神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中所涉及的不同生物路徑[49]。

系譜5還分離由多個(gè)受自閉癥影響的兒童繼承的其它變體。系譜的一個(gè)分支分離引起P158A錯(cuò)義取代的CLMN基因中的G/C顛換。這個(gè)變體在我們的病例/對(duì)照研究中得到1.67的優(yōu)勢(shì)比(95％置信區(qū)間0.73-3.84)，表明其為ASD風(fēng)險(xiǎn)等位基因。在家族的單個(gè)分支中兩個(gè)受影響的個(gè)體中觀測(cè)到ABP1基因中的變體，也是G/C顛換的結(jié)果并且引起R345P錯(cuò)義取代。這個(gè)變體母系繼承并且在系譜中別處不可見。然而，這個(gè)變體在群體研究中在1/1541病例和0/5785對(duì)照中觀測(cè)到(表6)并且在ESP6500、1000個(gè)基因組或dbSNP137數(shù)據(jù)庫中未觀測(cè)到(表12)，指示其可能是很罕見的ASD風(fēng)險(xiǎn)變體。最后，引起R64L錯(cuò)義取代的ALX1基因中的G/T顛換由單個(gè)個(gè)體父系繼承。這個(gè)變體也在系譜7中可見(圖12)并且在我們的群體研究中多次觀測(cè)到(27/1541病例和58/5785對(duì)照)，得到1.75的優(yōu)勢(shì)比(95％置信區(qū)間1.11-2.77)(表6)。這個(gè)基因的表達(dá)還可以通過與易位分離的具有智力遲鈍、語言遲緩以及小頭畸形的家族中的下游平衡易位而增加[50]。

系譜8-10示于圖13-15中。這些系譜之一，系譜10，攜帶兩個(gè)單體型(染色體2和14)，其分離至全部六個(gè)受影響的個(gè)體(圖7a-7b)。由這些區(qū)域包涵的基因的測(cè)序并不鑒別潛在的致病變體。這可能歸因于基因的一些部分的較差序列覆蓋率。然而，這些家族中受影響的個(gè)體的測(cè)序得以鑒別可以是自閉癥風(fēng)險(xiǎn)等位基因的變體。這些變體之一，引起單個(gè)受影響的個(gè)體中所觀測(cè)到的MOK基因中的Q22*變化并且從其父體繼承的G/A轉(zhuǎn)換，在我們的群體研究中觀測(cè)到并且得到3.76的優(yōu)勢(shì)比(95％置信區(qū)間0.53-26.67)(表6)。還鑒別系譜8-10中的其它變體(圖13-15)，包括僅在Utah家族中所見的一些和在家族中與我們的群體研究中所見的其它者。這些變體包括于表6和表7中。

RAB11FIP的功能分析

為了揭露Rab11FIP5-P652L變體的功能結(jié)果，Rab11FIP5結(jié)合至Rab11。Rab11是介導(dǎo)Rab11FIP5募集至內(nèi)吞膜并且為Rab11FIP5功能所需的小單體GTPase，對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)[41]。如圖16A中所示，P652L取代并不影響Rab11FIP5結(jié)合至Rab11，也不影響其對(duì)Rab11GTPase的特異性。先前顯示Rab11FIP5形成同型二聚體并且其二聚的能力也為Rab11FIP5細(xì)胞功能所需[41]。因此，測(cè)試P652L取代對(duì)Rab11FIP5二聚能力的影響。如圖16B中所示，Rab11FIP5-P652L突變體仍然能夠形成二聚體。與體外結(jié)合數(shù)據(jù)一致，F(xiàn)IP5-GFP-P652L在HeLa細(xì)胞中的內(nèi)吞定位也不受影響(圖16B-16E)。

已經(jīng)報(bào)道Rab11FIP5通過調(diào)控內(nèi)吞再循環(huán)而發(fā)揮功能[51]。為了那個(gè)目的，測(cè)試Rab11FIP5-P652L對(duì)HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的再循環(huán)的潛在影響。發(fā)現(xiàn)P652L取代并不改變?cè)傺h(huán)(圖16H)。因此，未檢測(cè)到Rab11FIP5-P652L取代的功能結(jié)果，表明核心Rab11FIP5特性不受影響。

采用基于鑒別兩代至六代ASD家族中繼承的遺傳變體的發(fā)現(xiàn)/驗(yàn)證策略，繼之以來自患有自閉癥的無關(guān)兒童和正常發(fā)育的兒童的DNA樣本中的那些變體的病例/對(duì)照分析以鑒別家族性ASD易感基因。使用單體型分析鑒別家族內(nèi)共享的基因組區(qū)段，并且DNA測(cè)序和CNV分析用于鑒別那些單體型上的潛在致病突變。隨后采用大的病例/對(duì)照研究以確定我們所鑒別的變體中的任一者是否可能在患有ASD的個(gè)體的一般群體中起作用。

先前顯示基于家族的發(fā)現(xiàn)組群中CNV的鑒別可以鑒別與一般ASD群體相關(guān)的拷貝數(shù)變體[27]。

鑒別可能影響蛋白質(zhì)功能的39個(gè)SNP，其具有表明在易感ASD中的作用的分離模式和ASD病例等位基因頻率。這些變體中的三十一個(gè)引起非保守性氨基酸取代，預(yù)測(cè)五個(gè)影響剪接(預(yù)測(cè)這些當(dāng)中的3個(gè)影響剪接與蛋白質(zhì)編碼)，并且三個(gè)引入提前終止密碼子。在AKAP9基因和JMJD7(或JMJD7-PLA2G4B融合基因)中鑒別兩個(gè)變體，并且鑒別影響RAB11FIP5基因中的相同氨基酸殘基的兩個(gè)不同變體，因此總的來說這些SNP鑒別36個(gè)潛在的ASD風(fēng)險(xiǎn)基因。

除了兩代家族以外，并且與我們的單體型共享結(jié)果一致，沒有作為ASD易感基因座牽涉在內(nèi)的序列變體或CNV分離至系譜中所有受影響的個(gè)體。這與先前的遺傳研究一致，這些研究迄今不能展示擴(kuò)展家族中單個(gè)ASD風(fēng)險(xiǎn)基因座的分離(例如參看[52])。在系譜5(圖6)中，兩個(gè)獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)變體，AKAP9中的單個(gè)核苷酸變體和NRXN1中或附近的缺失CNV，分離至家族的不同分支。在這個(gè)家族中患有ASD的個(gè)體中還發(fā)現(xiàn)其它風(fēng)險(xiǎn)變體，包括在我們的群體研究中具有大于1.5的優(yōu)勢(shì)比的兩個(gè)序列變體。這些結(jié)果表明甚至在可能預(yù)測(cè)分離具有降低的外顯率的單個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因的擴(kuò)展家族中，不同ASD易感基因座中的多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因可能是必需的。結(jié)果進(jìn)一步表明應(yīng)小心探討當(dāng)評(píng)價(jià)大家族中的自閉癥遺傳學(xué)時(shí)特定繼承模型的使用。

在我們的高風(fēng)險(xiǎn)家族中所鑒別的十一個(gè)自閉癥風(fēng)險(xiǎn)變體由來自我們的病例/對(duì)照研究的數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持。這些變體中的三個(gè)各自在單個(gè)ASD病例(出自1541個(gè)總病例)中可見并且在5785個(gè)對(duì)照中無一可見。我們?cè)诎藗€(gè)額外基因中檢測(cè)的家族性變體在ASD病例中比在對(duì)照中更常見，并且各自具有大于1.5的優(yōu)勢(shì)比。盡管這些變體是罕見的(在我們的病例/對(duì)照研究中全部具有<0.01的頻率)，但其在我們的ASD家族中受影響的個(gè)體中的鑒別和其在無關(guān)受影響的個(gè)體中增加的流行率支持其作為ASD風(fēng)險(xiǎn)基因座的作用。

若干有趣的觀測(cè)結(jié)果來自于這36個(gè)基因和其編碼的蛋白質(zhì)中的每一者的功能和機(jī)械作用的大量文獻(xiàn)綜述。許多基因先前已經(jīng)與自閉癥或其它神經(jīng)病癥相聯(lián)系或具有已知的神經(jīng)功能(表8)(36個(gè)基因中的11個(gè)，或31％)。若干其它基因的功能屬于通常被引述為與自閉癥具有相關(guān)性的路徑。這些包括編碼具有免疫功能(發(fā)炎反應(yīng))的蛋白質(zhì)的基因，和編碼對(duì)能量代謝和線粒體功能重要的蛋白質(zhì)的基因。這些群組占清單上的36個(gè)基因中的19個(gè)(53％)。其它基因具有尚未開發(fā)的功能，僅可以與基于序列相似性的功能相聯(lián)系，或在許多其它細(xì)胞或生物體過程，諸如細(xì)胞周期控制、血管生成、蛋白質(zhì)降解或金屬蛋白酶活性中具有零散作用。

RAB11FIP5

RAB11FIP5是RAS GTPase的支架蛋白的家族Rab11的成員。具體地說，RAB11FIP5已經(jīng)表征為頂端內(nèi)涵體再循環(huán)、質(zhì)膜再循環(huán)以及胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)中的關(guān)鍵作用物[55、56]。我們鑒別在六個(gè)成員的家族中三個(gè)受影響的同胞中的P652L變體，其中母體是未受影響的P652L攜帶者。在1/1541高加索ASD病例和正常發(fā)育的0/5785高加索兒童中還檢測(cè)到引起P652H取代的額外變體(表6)。這些變體修改RAB11FIP5的C端內(nèi)的保守脯氨酸。

先前在具有僅破壞RAB11FIP5基因的平衡易位[46，XY，t(2；9)(p13；p24)]的十歲男孩中觀測(cè)到RAB11FIP5的雜合破壞[41]。這個(gè)個(gè)體具有自閉癥譜系障礙PDD-NOS的臨床診斷。這種易位促使作者提出RAB11FIP5的單倍不足對(duì)受試者的ASD有貢獻(xiàn)[43]。已經(jīng)在突觸前與突觸后致密物中檢測(cè)到與RAB11和其存在緊密相結(jié)合的RAB11FIP5工作，其中Rab11在確定長期抑郁的突觸強(qiáng)度中起關(guān)鍵作用[57]，調(diào)控去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸[58]，實(shí)現(xiàn)突觸谷氨酸受體再循環(huán)[59]，并且響應(yīng)BDNF調(diào)控樹突分支[60、61]。所有這些功能已經(jīng)表明是ASD的病原學(xué)的顯著貢獻(xiàn)者[62、63]并且進(jìn)一步支持突變?cè)谧鳛锳SD風(fēng)險(xiǎn)等位基因的RAB11FIP5中的作用。

AKAP9

AKAP9是充當(dāng)PKA、其效應(yīng)物以及磷酸化標(biāo)靶的支架伴侶的超過50個(gè)蛋白質(zhì)的家族的成員。AKAP9，也稱為Yotiao，主要在心臟和腦中表達(dá)，其中編碼的蛋白質(zhì)充當(dāng)PKA、蛋白磷酸酶I、NMDA受體、心臟鉀通道亞單位KCNQ1、IP3R1以及特定同種型的腺苷酸環(huán)化酶的支架[64-68]。由AKAP介導(dǎo)的這些多聚蛋白支架的亞細(xì)胞定位和組裝據(jù)信是功能所必需的，因?yàn)锳KAP與其效應(yīng)物之間的相互作用的破壞導(dǎo)致活性損失。在KCNQ1的情況下，AKAP9與KCNQ1之間的相互作用的損失導(dǎo)致潛在致命的心臟病狀、長QT綜合癥，其也在KCNQ1本身的功能損失突變的情況下發(fā)生[69]。

我們鑒別AKAP9基因中的兩個(gè)變體。這些變體引起編碼的蛋白質(zhì)中的R3233C和R3832C取代。這兩個(gè)變體與自閉癥一致并且在兩個(gè)無關(guān)擴(kuò)展ASD系譜中發(fā)現(xiàn)(圖6、圖11)。R3233C變體另外在我們的病例/對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)。從五個(gè)主要自閉癥GWAS研究鑒別的基因和從替代性方法產(chǎn)生的自閉癥候選基因的新近元研究，諸如大規(guī)模CNV研究，將AKAPS列為連接由生物信息學(xué)鑒別的許多路徑的中心整合基因家族[49]。給出其在定位突觸后支架中的PKA、腺苷酸環(huán)化酶同種型以及NMDAR中的作用，AKAP9代表如同其更好表征的配對(duì)物AKAP5一樣，可以在突觸傳遞和可塑性、谷氨酸能受體功能調(diào)控和再循環(huán)以及樹突棘形態(tài)中發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)[70]。

含有潛在的ASD風(fēng)險(xiǎn)等位基因的兩個(gè)基因(MOK、TRPM1)由我們的先前研究中所觀測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)CNV部分或完全包涵[27]。這表明相同的基因可能受具有相同或相似的表型結(jié)果的不同遺傳機(jī)制影響。含有這些基因的CNV兩者都是拷貝數(shù)損失。此處所描述的MOK序列變體是無義變化，而TRPM1變體是錯(cuò)義變化。這些結(jié)果與歸因于這兩個(gè)基因座處的單倍不足的MOK和TRPM1作用一致。

盡管自閉癥的可遺傳性相當(dāng)高，但我們的數(shù)據(jù)顯示眾多遺傳變體甚至在單一家族中仍可能賦予ASD風(fēng)險(xiǎn)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與全基因組測(cè)序研究的結(jié)果一致，這項(xiàng)研究使用隱性模型與模型非依賴性分析以鑒別具有兩個(gè)受影響的個(gè)體的ASD家族中的若干潛在ASD風(fēng)險(xiǎn)變體[71]。與迄今鑒別的大量潛在ASD風(fēng)險(xiǎn)基因一致，這個(gè)單一多重ASD[71]家族中鑒別的基因中無一與我們的研究中鑒別的基因重疊。我們的研究通過鑒別30個(gè)2-6代高風(fēng)險(xiǎn)ASD家族中的單體型共享區(qū)域中的序列變體而增添這種復(fù)雜性。我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步展示在很大的多代家族中，額外的風(fēng)險(xiǎn)變體從系譜中結(jié)婚的個(gè)體進(jìn)入家族的可能性很高。

這項(xiàng)研究首先使用經(jīng)驗(yàn)方法以鑒別共享的基因組區(qū)段，繼之以序列變體檢測(cè)以鑒別一大組自閉癥家族中潛在的ASD風(fēng)險(xiǎn)變體。鑒別584個(gè)在我們的高風(fēng)險(xiǎn)家族中可能易感自閉癥的非保守性錯(cuò)義、無義、框移以及剪接位點(diǎn)變體。鑒別36個(gè)基因中的39個(gè)DNA序列變體，其潛在地代表ASD風(fēng)險(xiǎn)基因。觀測(cè)到這些變體中的十一個(gè)在一組1541個(gè)無關(guān)自閉癥兒童和5785個(gè)對(duì)照中具有大于1.5的優(yōu)勢(shì)比。RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的三個(gè)變體各自在單個(gè)病例中而不在任何對(duì)照中觀測(cè)到。這些變體在公共序列數(shù)據(jù)庫中也不可見，表明其可能是罕見的致病ASD變體。只有在高風(fēng)險(xiǎn)ASD家族中觀測(cè)到二十八個(gè)額外的罕見變體。總的來說，這39個(gè)變體將36個(gè)基因鑒別為ASD風(fēng)險(xiǎn)基因。在這些家族中先前檢測(cè)的序列變體和拷貝數(shù)變體的分離揭示復(fù)雜的模式，其中僅RAB11FIP5變體分離至一個(gè)兩代系譜中所有受影響的個(gè)體。發(fā)現(xiàn)一些受影響的個(gè)體具有多個(gè)潛在的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，包括序列變體和CNV，表明這些家族中自閉癥的高發(fā)病率可以由多個(gè)基因座處的變體最好地解釋。

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表4：序列比對(duì)和變體檢測(cè)方法.

表5：選擇用于基于單體型共享進(jìn)行測(cè)序的染色體區(qū)域.在給出多個(gè)數(shù)字的情況下，多個(gè)家族共享重疊的單體型。*指示第九個(gè)受影響的個(gè)體稍后未顯示共享相同單體型的家族。

表7：僅在高風(fēng)險(xiǎn)ASD家族中觀測(cè)到的序列變體.*指示得到無義密碼子的突變。使用標(biāo)準(zhǔn)單字母氨基酸命名。

表8.具有在ASD兒童中發(fā)現(xiàn)的變體的基因的生物功能/路徑

表9

30個(gè)Utah ASD家族的概述

*注意，一些個(gè)體在家族之間重疊，因此基因分型的個(gè)體的總數(shù)小于這個(gè)表格中的總數(shù)。

表11

*********

雖然所描述的發(fā)明內(nèi)容已經(jīng)參考其特定實(shí)施方案加以描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，在不脫離本發(fā)明的真正精神和范圍的情況下可以作出各種改變并且可以替代等效物。另外，可以作出許多修改以使特定的情形、物質(zhì)、物質(zhì)組合物、工藝、工藝步驟適于所描述的發(fā)明內(nèi)容的客觀精神和范圍。所有這樣的修改欲處于隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

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