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發(fā)明背景

1. 發(fā)明領域

本發(fā)明涉及用于通過測序鑒定基因突變和兆堿基的核酸信息的工具、組合物和方法，并且，特別地，涉及用于通過測序分析序列、基因和完整基因組的電子媒介和程序，以及涉及所鑒定的突變和包含用于鑒定生物樣品中的突變的試劑的試劑盒。

2. 背景描述

結核病的致病物質(zhì)結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)是一種高度傳染性的細菌病原體，具有顯著的發(fā)病率和死亡率，特別是在HIV感染患者中。從1997年以來結核病在南非一直是死亡的主要原因，為與該國家逐漸增長的HIV流行關聯(lián)的統(tǒng)計量。此外，越來越多的多藥抗性(MDR)和廣泛藥物-抗性(XDR)臨床分離物（clinical isolates）案例使具有活性MTB的患者中的有效治療措施惡化。

在世界上MTB和HIV二者流行的許多資源匱乏區(qū)域，顯微鏡術依然是用于診斷MTB的基石。然而，許多具有MTB的HIV感染患者為涂片陰性，并且顯微鏡術不提供關于抗生素抗性的信息。多藥-抗性(MDR)和廣泛藥物-抗性菌株(XDR)的出現(xiàn)致使標準MTB治療方案變得無效。根據(jù)一個研究，在南非大約20%的具有HIV的TB患者具有MDR MTB?？焖贆z測MTB和開始有效治療對減少傳播和改善治療結果至關重要。Cephiad’s Gene Xpert (Xpert)的推出(roll-out)改善了MTB的診斷并提供了利福平抗性的證據(jù)，但沒有提供關于其它藥物的信息。此外，在資源匱乏環(huán)境的許多顯微鏡術實驗室中放置Xpert檢驗可能是不可行的。有效地將痰樣本運送到中心用于下一代測序(NGS)的能力提供了利用中心或地方實驗室的訓練有素的工作人員和可用的基礎設施的機會。

MDR結核病菌株耐受一線抗生素利福平(RIF)和異煙肼(INH)，而XDR MTB菌株耐受RIF和INH二者以及任何氟喹諾酮和二線可注射抗生藥物(例如，阿米卡星、卡那霉素或卷曲霉素)。所有MTB案例的約6%為MDR菌株并且南非每年持續(xù)報告更高百分比的XDR案例。當7%的感染標準MTB菌株的患者屈服于感染時，MDR結核病的死亡率上升至幾乎50%?？股乜剐訫TB菌株的出現(xiàn)強調(diào)了對快速和高準確度診斷的即時需求，特別是在非洲的發(fā)展中國家。另外遷移人口使得藥物抗性菌株的地理監(jiān)督和追蹤更加迫切。

對于MDR菌株認為基于培養(yǎng)的藥物易感性檢驗(DST)為金標準，但其費時(數(shù)周至數(shù)月)，技術上具有挑戰(zhàn)性并且成本高昂，特別是在資源有限的國家。例如，BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson Microbiology System, Silver Sparks NV, USA)為測量細菌氧消耗的自動化連續(xù)的基于培養(yǎng)的監(jiān)測系統(tǒng)，可使用制備的試劑盒進行DST，所述試劑盒對于菌株對許多抗生素的敏感性可用。用BACTEC MGIT 960獲得的DST結果可靠和可重現(xiàn)但需要處理有活力和潛在傳染性的培養(yǎng)物，數(shù)天至數(shù)周或延期直至結果可用，專門的實驗室設備以及與儀器和消耗品相關的高費用。

近年來，開發(fā)了若干用于檢測MTB藥物抗性的基于核酸的測定。一個最流行的市售可得的診斷測定為Hain LifeScience的GenoType MTBDRplus Line Probe Assay (LPA)。該檢驗利用核酸提取、PCR擴增、探針雜交和在橫向條上經(jīng)由堿性磷酸酶反應比色顯影（colorimetric visualization）。已經(jīng)顯示LPA為靈敏和特異的，但存在幾個缺點。LPA對所有抗性-相關突變的靈敏度最有可能將永遠達不到100%，因為許多賦予抗性的基因尚未被發(fā)現(xiàn)。LPA的另一個固有限制為不能檢測包含抗性和易感菌株的混合物的樣品群。檢測不到含有將一個氨基酸改變?yōu)長PA上不存在的先前未表征或未知的突變的置換突變的菌株。此外，LPA僅允許檢測最頻繁的導致抗性的突變。若菌株包含靶突變之外的突變，將會出現(xiàn)野生型帶型，導致假陰性(易感)結果。

因此，存在對用于關鍵基因，例如與一線和二線藥物抗性相關的基因的全長基因分析的快速、標準化、成本有效的方案的需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明克服了當前策略和設計相關的缺點，并由此提供用以促進和簡化測序的工具、組合物、方法和用于分析核酸的序列信息的方法，所述核酸包括全長基因和完整基因組。

本發(fā)明的一個實施方案涉及通過半導體測序和優(yōu)選地，離子激流測序分析藥物抗性突變。通過PCR擴增包含目的基因的核酸區(qū)段，處理擴增產(chǎn)物并隨后通過測序分析。對于包含RNA的核酸區(qū)段，將RNA反轉錄為DNA。測序優(yōu)選通過Ion Torrent，或包括Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM?; Life Technologies)的下一代測序儀進行。優(yōu)選地，擴增產(chǎn)物代表生物體的許多種類、菌株和/或血清型的共同的全長基因，或多個重疊基因段。將擴增產(chǎn)物測序并鑒定和定位突變。定位鑒定已知和先前未知的突變二者并且可用于跨種群追蹤藥物抗性的進展和移動。優(yōu)選地，本發(fā)明分析病原體，例如，病毒、細菌或寄生蟲的核酸。優(yōu)選所述病毒病原體為流感或HIV的致病物質(zhì)并且細菌病原體為結核病的致病物質(zhì)。核酸區(qū)段的離子激流測序為快速、有效、成本有效的全長基因分析方案提供增強的測序。藥物抗性和其它突變即時測定。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于進行基因或完整基因組的NGS測序，優(yōu)選離子激流或MiSeq?測序的工具、組合物和方法。本發(fā)明包括獲得目的生物體的DNA序列和使用多對核酸引物進行聚合酶鏈反應分析。每對引物經(jīng)設計以在相似的PCR條件下同時擴增基因組的重疊區(qū)段并且這些可作為測序反應進行或?qū)τ诙鄠€基因或整個基因組多路復用(multiplex)。優(yōu)選的引物具有相似的GC含量和總體尺寸?；蚪M的單個PCR擴增產(chǎn)生數(shù)百種擴增產(chǎn)物，其序列包括生物體的全長基因、大基因和非編碼段或整個基因組。優(yōu)選通過NGS分析這些產(chǎn)物，序列經(jīng)匹配建立整個基因或基因組的序列圖譜。

本發(fā)明另一個實施方案涉及鑒定微生物的基因組中賦予對抗微生物化合物的抗性的序列基序的方法，包括：提供從微生物的多個不同菌株或血清型獲得的多個核酸樣品；通過聚合酶鏈反應擴增多個核酸樣品的序列；通過離子激流測序獲得所擴增序列的序列信息；從獲得的序列信息鑒定至少一個微生物菌株或血清型的基因組中的多態(tài)性；和關聯(lián)鑒定的多態(tài)性與至少一個微生物菌株或血清型的表型或基因組定位以鑒定賦予對抗微生物化合物的抗性的序列基序。優(yōu)選地，所述微生物為病毒、細菌、真菌或寄生蟲，并且所述病毒為流感病毒，細菌為結核分枝桿菌。優(yōu)選地，核酸樣品在包含離液劑、去污劑、還原劑、螯合劑、緩沖劑和醇，一起以足以裂解細胞、變性蛋白、滅活核酸酶，殺死病原體和不降解核酸的量存在的水性分子轉運介質(zhì)中提供。優(yōu)選地，擴增在一步聚合酶鏈反應中使用擴增與對抗微生物化合物的抗性相關的基因或核酸區(qū)段的引物對進行，并且聚合酶鏈反應在包含以下的水性混合物中實施：熱穩(wěn)定聚合酶，包含約等量dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脫氧核苷三磷酸混合物，螯合劑，滲透壓劑，白蛋白，鎂鹽；和緩沖劑。優(yōu)選所述抗微生物化合物為抗生素。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及用通過本發(fā)明方法所鑒定的抗微生物化合物治療由至少一種微生物菌株或血清型引起的疾病或病癥的方法。優(yōu)選地，治療包括靶向殺死為疾病或病癥的致病物質(zhì)的特定病原體。同樣優(yōu)選地，有效劑量通過評估與鑒定的靶序列或序列們相關的表型特征從本發(fā)明方法確定。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于測定微生物的完整基因組序列的方法，包括：通過在包含以下的水性混合物中進行基因組的單個聚合酶鏈反應(PCR)產(chǎn)生一系列擴增子：熱穩(wěn)定聚合酶；包含約等量dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脫氧核苷三磷酸混合物；螯合劑；鹽；緩沖劑；穩(wěn)定劑和多個引物對，其中所述多個引物對的每一引物具有相似的退火溫度；通過半導體測序測序所產(chǎn)生的系列擴增子的每一，以及關聯(lián)擴增子的序列和構建基因組的完整序列。優(yōu)選地，多個引物對的每一引物包括15-25個核酸長并且每一具有約25%-50%的GC含量的引物。優(yōu)選地，每一引物對經(jīng)設計以PCR擴增擴增子，并且PCR擴增的擴增子的集合包含完整基因組序列的重疊區(qū)段。優(yōu)選地，多個引物對與基因組雜交，并且以約每500-2,000核苷酸沿基因組間隔開。優(yōu)選地，所述微生物為病毒、細菌、真菌、寄生蟲或細胞，并且所述病毒為流感病毒，細菌為結核分枝桿菌。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于一步測定核酸區(qū)段的序列的方法，包括：在核酸區(qū)段上進行聚合酶鏈反應以產(chǎn)生一系列擴增子，其中PCR包含含有以下的熱穩(wěn)定組合物：聚合酶；包含約等量dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脫氧核苷三磷酸混合物；螯合劑；鹽；緩沖劑；穩(wěn)定劑和多個引物對，其中所述多個引物對的每一引物具有5℃內(nèi)的退火溫度；通過半導體測序測序所產(chǎn)生的系列擴增子的每一，和關聯(lián)擴增子的序列并構建核酸區(qū)段的序列。優(yōu)選所述核酸區(qū)段為1 Mb長或更大，更優(yōu)選大于2或更多Mb長，更優(yōu)選5或更多Mb長并且更優(yōu)選10或更多Mb長。優(yōu)選地，多個引物對的每一引物為16-24個核苷酸長，具有約28-35%的GC含量，并且具有每一其它引物的3℃內(nèi)的退火溫度。優(yōu)選地，每一引物對經(jīng)設計以PCR擴增代表核酸區(qū)段序列的一部分的擴增子，并且PCR擴增的擴增子的集合代表所述區(qū)段的完整序列的重疊部分。優(yōu)選地，多個引物對以約800-1,200個核苷酸長的間隔與所述區(qū)段雜交。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及包含多對核酸引物的混合物，其中，當使該集合經(jīng)受與核酸區(qū)段相關的聚合酶鏈反應時，引物對的集合產(chǎn)生擴增子的集合，其中每一擴增子為約500-2,000個核苷酸長，以致在所得的擴增子集合中表示了所述區(qū)段的整個序列。優(yōu)選地，引物對集合的每一引物為約15-25個核苷酸長，具有約25-45%的GC含量，以及每一其它引物的3℃內(nèi)的退火溫度，并且引物對集合的每一引物包含與同一微生物的基因組雜交的序列。優(yōu)選地，所述微生物為病毒、細菌、寄生蟲或真菌。優(yōu)選地，所述混合物包含熱穩(wěn)定聚合酶、含有約等量dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脫氧核苷三磷酸混合物、螯合劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑和無核酸酶水。

本發(fā)明的另一個實施方案包括包含試劑容器的試劑盒，所述試劑容器優(yōu)選包含用于測序的一種或多種化學試劑、引物和聚合酶。將待分析的樣品與優(yōu)選包含足以殺死樣品中存在的所有病原體、滅活樣品中的核酸酶和維持核酸完整性致使樣品對于轉運和后續(xù)操作安全的化學組分，例如，水性裂解緩沖劑、水性或無水轉運介質(zhì)或水性PrimeStore Molecular Transport Medium?的試劑容器混合?；旌衔锟山Y合（combine）在柱，例如微型離心柱中以幫助從樣品提取核酸，所述柱可包含在試劑盒中。提取的核酸優(yōu)選與方便核酸檢驗例如PCR測序的另一種化學試劑組合物例如PrimeMix?組合。這樣的試劑組合物可包含陽性對照序列、陰性對照序列和/或與病原體存在所特有的特定靶序列(在期需的高或低嚴格性雜交條件下)特異性雜交的序列。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及實現(xiàn)本發(fā)明分析方法的計算機可讀介質(zhì)。優(yōu)選的計算機可讀介質(zhì)分析獲得的序列信息和集中信息的集合。還優(yōu)選將序列信息與從相同或相似序列的序列信息的一個或多個已知數(shù)據(jù)庫獲得的序列信息比較并鑒定為微生物提供抗生素抗性和其它表型特征的突變。

本發(fā)明的其它實施方案和優(yōu)點在隨后的描述部分列出，并且部分上，可從該描述顯而易見，或可從本發(fā)明的實踐學習。

附圖簡述

圖1 說明pncA基因序列加100側翼堿基對以及反向互補序列（reverse compliment sequence）、蛋白序列和引物序列。

圖2 說明H37RV基因菌株的核苷酸序列以及TB 16S核糖體RNA基因測序引物的序列。

圖3 說明賦予對利福平的敏感性/抗性的rpoB基因以及rpoB的正向和反向引物序列。

圖4 說明結核分枝桿菌H37Ra，完整基因組(GenBank: CP000611.1) GyrA基因以及三組正向和反向引物。

圖5 結核分枝桿菌H37Ra，完整基因組(GenBank: CP000611.1)過氧化氫酶-過氧化物酶-過氧化亞硝酸鹽酶(peroxynitritase) T katG以及三組正向和反向引物。

圖6 說明旋轉酶A和IS 6110測定的循環(huán)閾值。

圖7 說明通過循環(huán)數(shù)目相對于Ct值使用序列分離物（sequence islates）的旋轉酶A測定和IS 6110測定。

圖8 說明相對于循環(huán)閾值(ct)使用序列分離物的旋轉酶A測定和IS 6110測定。

圖9 使用多種引物對集合用離子激流測序方法學測序甲型流感基因組中取得的結果概要。

圖10 用于甲型流感(H3N2)的全基因組離子激流測序的引物對的表征。

圖11 (A) pncA的基因序列，所述序列將編碼區(qū)顯示為陰影的，和(B) PCR鋪瓦(PCR tiling)中使用的pncA正向和反向引物以及pncA區(qū)域P1-P4。

圖12 本發(fā)明方法的電子系統(tǒng)的體系結構。

發(fā)明描述

對于許多疾病和病癥的成功治療，藥物抗性菌株相關基因的快速分析是一個主要挑戰(zhàn)。新出現(xiàn)MTB藥物抗性的實時地理監(jiān)督將會促進更適當?shù)闹委煵呗?例如，藥物、抗生素、化學品)。當前，可用的分子方法例如GenoType? MTBDRplus LPA提供有限的檢測能力，特別是當新型/不常見的氨基酸置換在已知的藥物抗性區(qū)域中時或當未發(fā)現(xiàn)的氨基酸突變影響藥物抗性時。同樣，當前的方法學（包括離子激流方案）需要多步、輔助設備和增加的費用，并且為勞動密集型的。

已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)用于快速表征全長基因和基因組的簡化的半導體測序方案。本發(fā)明包括用于基因測序的標準化方案，優(yōu)選利用半導體測序并優(yōu)選全長基因的離子激流測序。所述方案使得能夠?qū)崿F(xiàn)整個編碼區(qū)域的測序，允許表征已知突變和發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)性。該方案還使得能夠測序兆堿基核苷酸信息，以致可測定細胞和生物體的完整基因組并且容易地定位和鑒定遺傳多態(tài)性。優(yōu)選地所述細胞和生物體為引發(fā)疾病的原核或真核細胞，或酵母或真菌細胞。優(yōu)選的引發(fā)疾病的生物體包括寄生蟲和真菌、病毒、細菌種類。示例性的生物體包括，但不限于，DNA病毒、RNA病毒、正或負單鏈病毒、雙鏈病毒、正粘病毒、副粘病毒、麻疹病毒(例如，麻疹)、逆轉錄病毒、黃病毒、線狀病毒、慢病毒、漢坦病毒、皰疹病毒(例如，VZV、HSV I、HSV II、EBV)、肝炎病毒(例如，A、B、C、非A、非B)、流感病毒(例如，H5N1、H1N1、H7N9)、呼吸道合胞病毒、HIV或埃博拉病毒。示例性的生物體還包括但不限于分枝桿菌(例如，結核分枝桿菌(M. tuberculosis))、炭疽芽胞桿菌（Bacillus anthracis)、瘧原蟲屬(例如，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum))、血吸蟲(例如，曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni))、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、腦膜炎球菌感染、假單胞菌感染、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)。本發(fā)明還涉及檢測和表征與病原性生物體相關但非病原性的生物體。一種或多種非病原性但相關的生物體的檢測可成為疾病不存在的最終診斷。另外，本發(fā)明的工具和方法允許鑒定和表征個體的現(xiàn)存基因組中的異常，例如可能從出生就存在的(先天性的)和可能為可遺傳的病況。這些遺傳病癥通過本發(fā)明的工具和方法是同等可檢測的和可表征的并且可通過與其它非患病個體（non-afflicted individual）的正?；?qū)φ栈蚪M比較診斷。

該相對快速的(例如，1、2或3天，或更短)、標準化的、成本有效的方案允許基因的全長分析，例如，以鑒定具有DNA、RNA、蛋白質(zhì)和/或肽序列的一個或多個變更的突變。對于為RNA的樣品序列，通常將樣品中的目的RNA序列反轉錄為DNA用于PCR分析。優(yōu)選鑒定和表征的為一個或多個為微生物提供對抗生素的抗性的基因突變。用本發(fā)明方法鑒定的優(yōu)選突變位于氨基酸編碼區(qū)中的一個或多個位點、轉錄啟動子或終止位點、終止或起始密碼子、非編碼區(qū)中的位點、剪接位點、修飾位點、轉錄或翻譯因子結合或識別位點、促成三維結構的一個或多個位點，或其組合。所分析的優(yōu)選基因包括與一線和二線MTB藥物抗性有關的MTB基因(參見圖1-5)。MTB-相關基因的優(yōu)選實例包括，例如，rpoB (利福平)、katG和inhA (異煙肼)、gyrA和gyrB (氟喹諾酮)、pncA和panD (PZA或吡嗪酰胺)以及rrs(16s) (氨基糖苷類、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、鏈霉素)和rspL (鏈霉素)。

使用本發(fā)明方法用下一代 Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM)評估在南非收集的26個地理上不同的臨床分離物，包括MDR和XDR菌株。特別感興趣的為INDELS，其為引起蛋白結構中的錯義變化的單核苷酸(A、T、G、C)的插入或缺失。將從該開發(fā)的方法學獲得的測序數(shù)據(jù)與來自培養(yǎng)的HAIN LPA和基因分型DST數(shù)據(jù)比較。該方法學第一次使得能夠測序?qū)崿F(xiàn)抗性的基因的整個編碼以及非編碼區(qū)，允許表征已知突變和發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)性。在rrs、 rpoB、 katG、 pncA、gyrA和gyr B、katG、inhA及 panD基因上鑒定到先前未表征的置換突變。

本發(fā)明為新型測序平臺，例如，下一代儀器在資源匱乏環(huán)境例如非洲、亞洲和印度中被更多利用提供了顯著的潛力。具體地，當前發(fā)明改善和簡化了預先的（up-front）實驗室制備過程。本發(fā)明的方法學不需要使用制造商所通常使用或需要的(typically utilized or required by the manufacturer)昂貴的輔助設備件。具體地，本發(fā)明的標準化程序不需要用于DNA定量的Agilient Bioanalyzer，用于乳化PCR步驟的OneTouch ePCR系統(tǒng)，或用于凝膠切除的PipinPrep。另外，由于本發(fā)明的方案涉及全-編碼基因(不必須是全基因組)的重測序，不需要Bioruptor將DNA剪切成較小的片段。另外，不需要測序整個基因組然后鑒定基因。本發(fā)明方法和工具允許預先選擇待測序的目的基因和/或區(qū)域。由于Agilent 2100 BioAnalyzer、OneTouch、PipinPrep和Bioruptor均需要額外的使用訓練，消耗有價值的實驗臺空間，并且極其昂貴，本發(fā)明代表超過常規(guī)方法學的顯著進步和改善。

本發(fā)明的測序方案在本文中使用離子激流測序例示，因為該測序方法已經(jīng)應用于結核分枝桿菌。正如認為對本領域技術人員而言清楚的，所述方案涉及半導體測序，其通過離子激流測序例示并且，同樣，涉及許多不同區(qū)域的同時測序。所述測序和核酸方法學可應用于任何系列的基因、基因組或核酸序列。

本發(fā)明還包括用于選擇用于測序目的靶的引物對的方法學。引物對優(yōu)選以匹配的對靶的退火和熔解溫度選擇。優(yōu)選地，熔解和退火溫度基于序列特征例如序列的GC含量、引物自雜交(例如，形成引物內(nèi)的發(fā)夾環(huán))的可能性，和結合位點附近的可能結構。優(yōu)選地所述引物在測序條件下不自雜交。優(yōu)選引物的GC含量為約25%-50%，更優(yōu)選約30%-40%，更優(yōu)選約25%-35%，并且還更優(yōu)選約40%-50%。因此，基于序列特征選擇靶的引物序列用于雜交，使得靶利用的所有引物對將具有相似的對靶的熔解和/或退火溫度。優(yōu)選引物序列不包含引物序列按理可能自雜交的區(qū)域。優(yōu)選引物對的退火和/或解離溫度匹配，所述溫度可在5℃內(nèi)、4℃內(nèi)、3℃內(nèi)、2℃內(nèi)、1℃內(nèi)并且更優(yōu)選退火溫度相同、熔解溫度相同或二者。引物對優(yōu)選產(chǎn)生代表靶的重疊區(qū)段的約500-約2,000核苷酸(NT)長的擴增子，更優(yōu)選約600-1,500 NT，更優(yōu)選約700-1,300 NT，更優(yōu)選約800-1,200 NT，更優(yōu)選約900-1,100 NT并且更優(yōu)選約1,000 NT。引物通常為12 NT-45 NT長，更優(yōu)選15-35 NT，并且更優(yōu)選約18-25 NT。盡管不是規(guī)則，一般較長的引物具有較低的GC含量。對于pncA基因(參見圖1)、H37RV基因種類(參見圖2)、rpoB基因(參見圖3)、GyrA基因(參見圖4)和katG基因(參見圖5)鑒定了示例性的引物對。這些引物對可用于在即用型試劑盒中組合以簡化全長基因的測序。

在本發(fā)明的一個實施方案中，確定了用于測定MDR和XDR菌株藥物抗性的結核分枝桿菌的五個基因的半導體測序方案(例如，每個分離物累積測序11.4 kb)。結核分枝桿菌rpoB基因編碼RNA依賴性DNA聚合酶的1,178氨基酸的β亞基。rpoB基因的81-bp“核心區(qū)”中的突變對結核分枝桿菌菌株中大約95%的利福平抗性負有責任。這些突變中在516 (D→V)、526 (H→Y/D)和531 (S→L)位處的三個構成該區(qū)域內(nèi)的大多數(shù)突變。本研究表征的21個利福平-抗性菌株中，11個(52.4%)攜帶rpoB基因的S531L突變，7個(33.3%)在rpoB基因的516位包含氨基酸置換，3個(14.3%)在rpoB基因的526位包含突變(表1)。在516位觀察到的最流行的rpoB置換為纈氨酸(D516V)。本發(fā)明的離子激流測序揭示7個菌株中的6個在該位置包含罕見的甘氨酸殘基(D516G) (表1)。這6個菌株通過LPA顯示為突變體和野生型帶二者均不存在(表1)。在rpoB基因的526位類似地鑒定到一個不常見的氨基酸置換。在rpoB基因的526位報道的最流行的氨基酸置換為組氨酸至酪氨酸或天冬氨酸(H526Y/D)。離子激流測序顯示3個分離物中的1個包含一個不常見的精氨酸(R)殘基(H526R)，其通過HAIN LPA顯示為野生型和突變體帶二者均不存在(表1)。盡管根據(jù)LPA檢驗樣品中野生型和突變體帶均不存在被解釋為抗性，但仍存在模糊性，因為氨基酸變化的類型未直接表征。這強調(diào)了離子激流測序?qū)剐员O(jiān)督和傳播中的MTB菌株中新型氨基酸的發(fā)現(xiàn)的效用。

表1

通過離子激流測序、Hain LPA基因分型和培養(yǎng)推斷的來自南非的26個(14個MDR、7個XDR和5個完全易感的)結核分枝桿菌分離物的ropB基因的最初900個氨基酸殘基^*中10個氨基酸突變的概要

katG基因編碼過氧化氫酶過氧化物酶，一種將異煙肼(INH)轉化為活性形式的酶。大多數(shù)異煙肼抗性與katG密碼子315 (S315T)有關，盡管inhA和nod啟動子區(qū)域中的突變也導致抗性。在評估的26個菌株中，16個(62%)在315位包含典型的絲氨酸至蘇氨酸氨基酸置換(S315T)，其賦予異煙肼抗性(表2)。這些測序結果顯示與使用HAIN LPA和培養(yǎng)DST作出的比較100%的一致性。

表2

通過離子激流測序、Hain LPA基因分型和培養(yǎng)推斷的來自南非的26個(14個MDR、7個XDR和5個完全易感的)結核分枝桿菌分離物的katG基因中的4個氨基酸突變的概要

吡嗪酰胺(PZA)為合成的煙酰胺衍生物，其從1952年以來已經(jīng)被用作一線藥物抗擊結核病。用于PZA的標準DST為復雜的，因為體外需要酸性pH，其抑制結核分枝桿菌生長并使準確的表型評估復雜化。PZA抗性歸因于編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因中的突變。這些賦予抗性的突變數(shù)目眾多，并包括氨基酸置換、移碼和終止密碼子突變。從評估的26個南非分離物表征了7個突變，包括1個沉默突變、5個氨基酸置換和1個鏈終止突變。在一個分離物中觀察到的Q122 (終止)終止突變(表3)為新的，別處尚未曾報道過。PZA表型評估的困難和沿pncA基因的突變的變異性進一步強調(diào)了離子激流基因測序評估此超變量（hyper variable）MTB基因中的突變的附加價值。

表3

通過離子激流測序和培養(yǎng)推斷的來自南非的26個(14個MDR、7個XDR和5個完全易感的)結核分枝桿菌的pncA基因中的6個氨基酸突變的概要

氟喹諾酮(FQ)在結核分枝桿菌中的主要靶為DNA旋轉酶，由gyrA和gyrB基因分別編碼的兩個A和B亞基組成的II型拓撲異構酶。位于稱為喹諾酮抗性-決定區(qū)(QRDR)的gyrA基因的短區(qū)域內(nèi)的氨基酸置換占已知FQ抗性結核病菌株的大多數(shù)。QRDR中88、90和94位的置換突變在本研究的26個序列的10個(38.5%)中觀察到(表4)。這10個菌株中的3個在gyrA基因的94位包含置換；兩個記錄為D94G置換，1個為D94Y置換。D94G和D94Y二者均已作為置換表征并且密碼子94的兩種氨基酸置換引起相似水平的FQ抗生素抗性。評估的菌株中，gyrA基因最可變，在評估的26個臨床分離物中包含9個氨基酸置換。此外，這些gyrA密碼子中的兩個(549和613)顯示異質(zhì)殘基(表4)，這為進行離子激流測序超過HAIN LPA和DST的優(yōu)點。

表4

通過離子激流測序和培養(yǎng)推斷的來自南非的26個(14個MDR、7個XDR和5個完全易感的)結核分枝桿菌分離物的gyrA基因中的10個氨基酸突變的概要

定義為已經(jīng)獲得額外的對FQ，即，氧氟沙星，和三種可注射“二線藥物”，即，阿米卡星(AMK)、卡那霉素(KAN)或卷曲霉素(CAP)中的至少一種的抗性的MDR案例的新出現(xiàn)的XDR結核病案例已經(jīng)成為全世界發(fā)展中國家的公眾健康威脅。大多數(shù)對二線藥物的抗性與16 S核糖體RNA rrs基因的密碼子1401 (A1401G)、1402 (C1402T)和1484 (G1483T)中的突變有關。對非洲MTB菌株的分析顯示26中的7個(27%)定義為XDR，如1401位的核苷酸突變(A1401G)所證明的(表4)。在來自該分析的菌株中還發(fā)現(xiàn)了492、514和878位的三個額外的核苷酸突變(表5)。G878A為新的核苷酸突變但根據(jù)DST顯示對AMK、KAN和CAP敏感。

表5

通過離子激流測序和培養(yǎng)推斷的來自南非的26個(14個MDR、7個XDR和5個完全易感的)結核分枝桿菌分離物的rrs (16s)基因中的4個核苷酸突變的概要

先前的研究顯示katG密碼子463和gyrA密碼子95中的突變?yōu)閷⒕攴诸悶榱餍胁W遺傳群1、2和3的遺傳標志，并且這些密碼子對抗生素抗性無作用。群1菌株為群2和群3菌株的遺傳祖先，其連接占優(yōu)勢的非人類分枝桿菌屬(田鼠分枝桿菌(M. microti)和牛分枝桿菌 (M. bovis) 菌株)與人非洲分枝桿菌(M. africanum)和結核分枝桿菌譜系。如katG密碼子463和gyrA密碼子95中的置換突變所證明的，本發(fā)明表征的非洲分離物的總共26中的7個(27%)、26中的18個(69%)和26中的1個(4%)分別為遺傳群1、2和3的成員。追蹤群1生物體對于MTB檢測相當重要，因為屬于遺傳群1的數(shù)個分離物缺乏插入序列1661 (IS-1661)，其為幾個基于PCR的MTB檢測測定的通用遺傳靶。

用于MTB藥物抗性的離子激流方案可容易地整合到遍及國家和地區(qū)，例如非洲、印度和中國的資源匱乏環(huán)境中。離子激流方法學不需要使用昂貴的輔助設備例如當前的離子激流方案所推薦的Pippin Prep? Workstation或Agilent 2100 BioAnalyzer、DiaGenode Bioruptor? Sonication System、Ion OneTouch System?、超速離心機。這具有重要意義，因為這些儀器以及所需的配件和消耗品可為昂貴的，需要大量實驗室足跡(footprints)，并且常常需要例行維護。

與GenoType? MTBDRplus或MTBDRsl Line Probe Assay (LPA)相反，離子激流PGM方案提供基因的全長表征，使得可能發(fā)現(xiàn)可潛在地被LPA錯過的新的氨基酸置換，因為LPA僅限于已知的突變。使用該方案，已經(jīng)在臨床領域分離物中發(fā)現(xiàn)了若干不常見的氨基酸變化。此外，離子激流序列覆蓋的廣闊深度允許發(fā)現(xiàn)分離物中的異質(zhì)或混合的菌株遺傳群。

離子激流測序的可擴縮性允許擴展以在單個芯片上包含兆堿基的額外基因。本發(fā)明的方法學可擴展超過5個全長MTB基因以包含當前構成MTB藥物抗性的所有16加（16 plus）基因。使用離子激流PGM的全長基因分析將鑒定新突變，當與表型最小抑制濃度(MIC)檢驗關聯(lián)時，其鑒定新的結核病抗性殘基以及多個突變的累積抑制作用。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及利用半導體測序方案的兆堿基序列鑒定。本發(fā)明的兆堿基測序涉及選擇擴增靶序列的不同區(qū)段的引物對，借此區(qū)段的集合代表靶序列的全部。優(yōu)選所述區(qū)段重疊達到允許比對所得擴增子而形成完整靶序列的程度。引物對優(yōu)選設計為形成具有約0.5 k-約5 k核苷酸，優(yōu)選約0.6 k-約3 k核苷酸，最優(yōu)選約0.7 k-約2 k核苷酸并且更優(yōu)選約0.8 k-約1 k核苷酸的長度的擴增子。引物對優(yōu)選GC含量（GC contact）相似，以致退火或雜交溫度相似或優(yōu)選在約5℃內(nèi)，更優(yōu)選在約2℃內(nèi)，并且更優(yōu)選在約1℃內(nèi)。還優(yōu)選雜交解離溫度相似，以致對于聚合和PCR而言退火和解離在非常相似的溫度發(fā)生。在退火和解離中，引物的長度影響溫度概況，因此優(yōu)選所有或至少大部分引物長度相似。引物長度優(yōu)選約15-30個核苷酸、更優(yōu)選約20-28個核苷酸，并且更優(yōu)選約18-25個核苷酸。盡管優(yōu)選所有的引物具有這樣的相似特征，兆堿基測序可在大于約80%的引物共享一個或多個特征，更優(yōu)選85%或更多，更優(yōu)選90%或更多，甚至更優(yōu)選95%或更多時實施。引物對可組合（assemble）在試劑盒中以方便全長測序。向從樣品獲得的核酸添加靶向擴增靶序列的引物。根據(jù)這些相似引物的使用，用一個待擴增的靶核酸與所有引物對的混合物進行PCR反應。還優(yōu)選在完全相同的混合物上進行雙份PCR分析。循環(huán)數(shù)目可為10-50或更多并且，優(yōu)選溫度循環(huán)按照常規(guī)PCR溫度和反應條件進行。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及用通過本發(fā)明方法鑒定的抗微生物化合物治療由至少一種微生物菌株或血清型引起的疾病或病癥的方法。優(yōu)選地，治療包括靶向殺死為疾病或病癥的致病物質(zhì)的特定病原體。還優(yōu)選通過評估與鑒定的靶序列或序列們相關的表型特征從本發(fā)明方法確定有效劑量，從而選擇已知或檢驗中的易感劑用于治療。優(yōu)選地，治療有效劑量可從通過本發(fā)明測序方法所獲得的測序信息確定。例如，已知某些序列，如果經(jīng)測定存在，引起某些表型特征，例如，對某些抗生素或其它治療處理的抗性或敏感性。這些序列的存在或不存在，以及序列存在的量，可提供有效治療以及用于治療的治療有效劑量的指示和指導。

本發(fā)明的另一個實施方案包括包含試劑容器的試劑盒，所述試劑容器優(yōu)選含有用于測序的一種或多種化學試劑、引物和聚合酶。將待分析的樣品與優(yōu)選包含足以殺死樣品中存在的所有病原體、滅活樣品中的核酸酶和維持核酸完整性致使樣品對于轉運和后續(xù)操作安全的化學組分，例如，水性裂解緩沖劑、水性或無水轉運介質(zhì)或水性PrimeStore Molecular Transport Medium?(在美國專利號8,084,443、8,080,645和8,097,419中描述，所有這些專利明確地通過引用結合)的試劑容器混合?；旌衔锟稍谥缥⑿碗x心柱中組合以幫助從樣品提取核酸，所述柱可包含在試劑盒中。提取的核酸優(yōu)選與方便核酸檢驗例如PCR測序的另一種化學試劑組合物例如PrimeMix?(也在2011年4月25日提交的標題為“用于檢測、鑒定和定量分枝桿菌-特異性核酸的組合物和方法”美國專利出版號2011/0281754和2012年4月26日提交的標題為“用于檢測和鑒定生物樣品中的核酸序列的組合物和方法”的國際申請出版號WO2012/149188中描述，二者通過引用特異性結合)組合。這樣的試劑組合物可包含陽性對照序列、陰性對照序列和/或與病原體存在所特有的特定靶序列(在期需的高或低嚴格性雜交條件下)特異性雜交的序列。

本發(fā)明的另一個實施方案涉及實現(xiàn)本發(fā)明方法的計算機可讀編程(參見圖12)。優(yōu)選所述計算機可讀介質(zhì)包括提供用于包含關于每一樣品的特異性和一般信息二者的格式。該信息可容易地集中和儲存。本發(fā)明方法的一個示例性的電子系統(tǒng)包括至少一個一般用途的計算裝置100，其包括處理單元(CPU) 120和將包括系統(tǒng)存儲器例如只讀存儲器(ROM) 140和隨機訪問存儲器(RAM) 150在內(nèi)的多個系統(tǒng)組件連接（couple）至處理單元120的系統(tǒng)總線110。優(yōu)選地，還可使用額外的系統(tǒng)存儲器。所述電子方法可在具有一個以上CPU 120的計算裝置上或在網(wǎng)絡連接在一起的計算裝置群或簇上操作以提供更大的處理能力。系統(tǒng)總線110可為幾種總線結構類型中的任何，包括使用各種總線體系結構的任何的存儲總線或存儲控制器、外圍總線和局部總線。ROM 140等中儲存的基本輸入/輸出(BIOS)可提供幫助在計算裝置100中的元件之間轉移信息的基本例行程序，例如在啟動期間。計算裝置100進一步包括存儲裝置例如硬盤驅(qū)動160、磁盤驅(qū)動、光盤驅(qū)動、磁帶驅(qū)動等。存儲裝置160通過驅(qū)動接口與系統(tǒng)總線110連接。驅(qū)動和相關的計算機可讀介質(zhì)提供計算機可讀指令、數(shù)據(jù)結構、程序模塊和用于計算裝置100的其它數(shù)據(jù)的非易失性儲存。基礎組件為本領域技術人員所已知并且根據(jù)裝置的類型，例如裝置是否為小的手提式計算裝置、臺式計算機、計算機服務器、手提式掃描裝置或無線裝置包括無線個人數(shù)字助理(“PDAs”)、平板裝置、具有無線網(wǎng)絡功能的或“智能”電話考慮適當變更。優(yōu)選地，所述系統(tǒng)為技術無關的。

盡管本文所述的示例性環(huán)境使用硬盤，在示例性的操作環(huán)境中也可使用可儲存計算機可訪問數(shù)據(jù)的其它類型的計算機-可讀介質(zhì)，例如磁盒、閃存卡、數(shù)字通用盤、盒式磁盤（cartridges）、隨機訪問存儲器(RAMs)、只讀存儲器(ROMs)、包含比特流的線纜或無線信號等。

為了使用戶能夠與計算裝置100交互，輸入裝置190代表任何數(shù)目的輸入機制，例如用于言語的麥克風、用于手勢或圖片輸入的觸敏屏、鍵盤、鼠標、運動輸入、言語、游戲機控制器、TV遙控器等。輸出裝置170可為本領域技術人員已知的許多輸出機制中的一種或多種，例如，打印機、監(jiān)視器、投影儀、揚聲器和繪圖機。在一些實施方案中，輸出可經(jīng)由網(wǎng)絡交互，例如上載至網(wǎng)站、電子郵件、附在或放置在其它電子文件中和發(fā)送SMS或MMS信息。在一些情況下，多式系統(tǒng)(multimodal systems)使用戶能夠提供多種輸入類型以與計算裝置100通信。通信接口180一般支配和管理用戶輸入和系統(tǒng)輸出。不限制本發(fā)明在任何具體硬件排列上操作，因此此處的基本特征可隨其發(fā)展針對改善的硬件或固件排列而容易地置換。

為了解釋的清楚性，說明性的系統(tǒng)實施方案呈現(xiàn)為包括個體功能塊(包括標記為“處理器”的功能塊)。這些塊代表的功能可通過使用共享或?qū)Ｓ玫挠布峁?，所述硬件包括，但不限于能夠?zhí)行軟件的硬件。例如圖1中呈現(xiàn)的一個或多個處理器的功能可通過單個共享的處理器或多個處理器提供。(術語“處理器”的使用不應解釋為專指能夠執(zhí)行軟件的硬件。)說明性的實施方案可包括微處理器和/或數(shù)字信號處理器(DSP)硬件、用于儲存進行下文所討論操作的軟件的只讀存儲器(ROM)和用于儲存結果的隨機訪問存儲器(RAM)。還可提供超大規(guī)模集成(VLSI)硬件實施方案，以及與一般用途DSP回路組合的定制的VLSI線路。

本發(fā)明范圍內(nèi)的實施方案可還包括用于攜帶或具有存儲于其上的數(shù)據(jù)結構或計算機-可執(zhí)行指令的計算機-可讀介質(zhì)。這樣的計算機-可讀介質(zhì)可為一般用途或?qū)Ｓ糜嬎銠C可訪問的任何可用介質(zhì)。舉例來說，而非限制，這樣的計算機可讀介質(zhì)可包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其它光盤存儲器、磁盤存儲器或其它磁存儲裝置，或可用于攜帶或存儲呈計算機-可執(zhí)行指令或數(shù)據(jù)結構形式的所需程序代碼方法的任何其它介質(zhì)。當通過網(wǎng)絡或另一種通信連接(硬連線、無線或其組合)向計算機轉移或提供信息時，計算機適當?shù)貙⑦B接視為計算機-可讀介質(zhì)。因此，任何這樣的連接均被適當?shù)胤Q為計算機-可讀介質(zhì)。上述的組合也應包括在計算機-可讀介質(zhì)的范圍內(nèi)。

計算機-可執(zhí)行指令包括，例如，引起一般用途計算機、專用計算機或?qū)Ｓ锰幚硌b置實施一定功能或功能群的指令和數(shù)據(jù)。計算機-可執(zhí)行指令還包括獨立或網(wǎng)絡環(huán)境中的計算機所執(zhí)行的程序模塊。一般而言，程序模塊包括實施特定任務或?qū)崿F(xiàn)特定抽象數(shù)據(jù)類型的例行程序、程序、對象、組件和數(shù)據(jù)結構等。計算機-可執(zhí)行指令、相關數(shù)據(jù)結構和程序模塊代表用于執(zhí)行本文所公開方法的步驟的程序代碼方法的實例。這樣的可執(zhí)行指令或相關數(shù)據(jù)結構的具體序列代表用于實現(xiàn)這樣的步驟中所描述的功能的相應活動的實例。

本發(fā)明的優(yōu)選實施方案可在具有許多種計算機系統(tǒng)配置類型的網(wǎng)絡計算環(huán)境中實踐，包括個人計算機、手提式裝置、多-處理器系統(tǒng)、基于微處理器的或可編程的消費者電子產(chǎn)品、網(wǎng)絡PCs、小型計算機、大型計算機等。網(wǎng)絡可包括因特網(wǎng)、一個或多個局域網(wǎng)(“LANs”)、一個或多個大城市區(qū)域網(wǎng)(“MANs”)、一個或多個廣域網(wǎng)(“WANs”)、一個或多個內(nèi)部互聯(lián)網(wǎng)等。實施方案還可在分布式計算環(huán)境（distributed computing environment）中實踐，其中任務由本地或通過通信網(wǎng)絡連接(通過硬線連接、無線連接，或通過其組合)的遠程處理裝置執(zhí)行。在一個分布式計算環(huán)境中，程序模塊可位于本地或遠程記憶存儲裝置二者中。

優(yōu)選地，計算機-可讀介質(zhì)與因特網(wǎng)連接并且可訪問公開可用的數(shù)據(jù)庫，例如，PubMed或GeneBank，并尋回關于要分析的微生物的序列和相關信息，包括所述微生物的一個或多個基因或部分基因的DNA、RNA和/或蛋白質(zhì)序列。將通過，例如，離子激流測序分析的序列與相同或相似微生物一個或多個(例如，1、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或甚至更大數(shù)目)已知序列或其它合成或重組序列比較。取得的結果可提供與數(shù)打、數(shù)百或甚至數(shù)千已知序列比較的基因或基因部分的快速和徹底分析。代表抗性的突變可容易并快速地測定和鑒定。

下列實施例說明本發(fā)明的實施方案，但不應視為限制本發(fā)明的范圍。

實施例

臨床分離物 從南非Pretoria大學和南非Sandringham國立傳染病研究所(NICD)的樣品存檔獲得共計26個地理上不同的臨床分離物，其代表藥物-敏感、MD和XDR結核病菌株。H37Rv MTB實驗室菌株作為貫穿方案的測序?qū)φ瞻趦?nèi)。使用的所有MTB分離物均為來自純培養(yǎng)MGIT? 960 System管(Becton Dickinson, Sparks, MD)的存檔菌株，其中使用Genotype? MTBDplus測定(HAIN LifeSciences, Germany)按照制造商的說明測定對利福平和異煙肼的基因型抗性和鑒定物種。對一線和二線藥物的表型抗性使用MGIT? 960 System如先前所描述的進行。對于氧氟沙星和卡那霉素(二線藥物)的臨界濃度分別為2.0 μg/mL和5.0 μg/mL。對一線和二線藥物的抗性使用標準診斷學算法測定。

DNA制備 MTB分離物自始至終盲式處理。將MTB樣品(0.5 mL)吸入包含1.5 mL PrimeStore Molecular Transport Medium? (一種分子轉運介質(zhì)) (Longhorn Vaccines & Diagnostics, San Antonio, TX)的冷凍管中。滅活的樣品在環(huán)境溫度下從南非轉運至美國德克薩斯州圣安東尼奧(3-4天)并儲存在5℃直至使用?？侱NA (50 μl)使用Qiagen? EZ1? Advanced Robot and EZ1 DNA Tissue Kit (Cat No. 953034)按照制造商的推薦(Qiagen Inc., Germantown, MD)從包含滅活培養(yǎng)物的PrimeStore MTM?的200 μl等分試樣純化。

引物設計 設計新的PCR引物用于擴增每一目的MTB基因的全長編碼區(qū)(表6)。

表6

用于MTB基因的全長分析的PCR擴增引物

用于rpoB (2組引物)、katG、pncA、gyrA和rrs (16s)基因擴增的引物對使用結核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組序列作為參考(GenBank登錄號NC_000962)設計。引物二級結構、熔解溫度和潛在的引物-二聚體形成使用LaserGene 9.1 (DNAStar, Madison, WI)和PrimerExpress 3.0 (Life Technologies, Foster City, CA)測定。所有的寡核苷酸均使用標準脫鹽引物合成(Integrated DNA Technologies (IDT), San Diego, CA)。

PCR擴增 對于所有MTB基因靶的擴增反應經(jīng)設計和優(yōu)化在一個標準化的熱循環(huán)參數(shù)集下使用。使用Platinum Taq DNA聚合酶、10X 緩沖劑和50 mM MgCl₂ (P/N 10966-034; Life Technologies, Foster City, CA)制備所有PCR“預混物”。擴增在包含24.1 μl Ambion無核酸酶水(Cat No. AM 9932; Life Technologies, Foster City, CA)、5 μl 10X PCR 緩沖劑、2 μl 50 mM MgCl₂ (最終2 mM)、0.4 μl PCR Nucleotide Mix Ultrapure dNTPS (對于每一dNTP最終200 μM ；P/N 77119; USB, Santa Clara, CA)、0.5 μl Platinum Taq DNA聚合酶(最終2.5單位)和2 μl引物混合物(rpoB、katG、pncA、gyrA或rrs基因；對于每一引物最終0.4 μM)的50 μl終體積反應混合物中進行。向每一34 μl的“預混物”反應混合物中加入16 μl提取的DNA以使總體積達到50 μl。反應在MicroAmp Optical 96-孔反應板(P/N N801-0560, Life Technologies, Foster City, CA)中進行并使用MicroAmp 8-Cap Strips (P/N 4323032, Life Technologies, Foster City, CA)加帽。擴增使用ABI 2720熱循環(huán)儀(Life Technologies, Foster City, CA)進行。熱循環(huán)參數(shù)為95℃ 2分鐘，接著95℃ 30秒，55℃ 15秒和72℃ 2分鐘，40個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。所得的擴增子通過在具有溴化乙錠(最終0.1 μg/mL；Cat No 161-0433; Bio-Rad, Hercules, CA)的1% (wt/vol)分子生物學級瓊脂糖(Cat No. BP1356; Fischer Scientific, Pittsburg, PA)上加入5 μl PCR產(chǎn)物與1 μl GelPilot Loading Dye 5X (P/N 1037649; Qiagen, Germantown, MD)確認。產(chǎn)物的電泳分離在1X Tris Borate-EDTA (TBE) Buffer (Cat No. 1B70153; IBI Scientific, Peosta, IA)中以0.4 mV cm²進行60分鐘。擴增子在UV透照下可視化，使用TrackIt 1 kb Plus DNA Ladder (P/N 10488-085; Life Technologies, Foster City, CA)進行大小評估?？梢暬螅瑢?i>rpoB、katG、pncA、gyrA和rrs (16s)靶對應的每一臨床分離物基因擴增的剩余PCR反應物(~45 μL)轉移至單個微量離心管中。每一臨床分離物對應的匯集的基因使用MinElute Reaction Cleanup Kit (Cat No. 28204; Qiagen, Germantown, MD)按照制造商的說明經(jīng)受PCR純化并洗脫在50 μl Low Tris-EDTA (TE) (Cat No. 602-1155-010; Life Technologies, Foster City, CA)中。DNA的濃度和純度使用NanoDrop ND 1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE)經(jīng)分光光度法測定。

離子激流文庫制備 標有條碼的文庫使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit (Cat No. 4471269, Life Technologies, Foster City, CA)和Ion Xpress DNA Barcoding 1-16 Kit (Cat No. 4468654, Life Technologies, Foster City, CA)按照改良版本的Ion Xpress Plus gDNA和擴增子文庫制備（Amplicon Library Preparation）中概述的方案產(chǎn)生。

擴增子剪切 化學剪切使用包含rpoB、katG、pncA、 gyrA和rrs (16s)基因擴增子的近似等摩爾池的1-3 μg DNA進行。DNA剪切在50 μl總反應體積中通過組合5 μl Ion Shear Plus 10X反應緩沖液、10 μl酶和35 μl匯集的DNA模板(Ion Xpress Plus Fragment Library Kit, Cat No. 4471269, Life Technologies, Foster City, CA)進行。反應混合物37℃孵育45分鐘，使用5 μl Ion Shear Stop Buffer終止，并儲存在冰上直至純化。剪切的DNA使用Agencourt Ampure XP-PCR純化小珠(P/N A63880; Beckman Coulter, Brea, CA)與Dynal磁珠架(Cat No. 123-21D; Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的推薦純化。簡言之，將99 μl Agencourt小珠與50 μl離子剪切反應物混合，室溫孵育5分鐘，放置在磁珠架上，用70% (v/v)乙醇洗滌兩次，使用12 μl Low TE Buffer (Cat No. 602-1155-010; Life Technologies Inc., Foster City, CA)洗脫。

銜接頭連接 銜接頭連接在0.2 mL低結合PCR管(P/N PCR-02-L-C; Axygen Inc., Union City, CA)中通過組合12 μl 剪切的擴增子與1.25 μl連接酶緩沖液、1.25 μl P1-IA 銜接頭混合物(Ion DNA Barcoding 1–16 Kit, Cat No. 4468654 Life Technologies, Foster City, CA)和0.2 μl DNA連接酶(Ion Xpress Plus Fragment Library Kit, Cat No. 4471269, Life Technologies, Foster City, CA)進行。將混合物上下吸5次并室溫(22-25°C)孵育30分鐘。使用Agencourt Ampure XP-PCR純化小珠(P/N A63880; Beckman Coulter, Brea, CA)與Dynal磁珠架(Cat No. 123-21D; Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的推薦純化銜接頭連接反應物并洗脫在10 μl Low TE Buffer中。

切口平移和條碼擴增 使用Ion DNA Barcoding 1–16 Kit和Ion Xpress Fragment Library Kit (分別為Part Nos. 4468654和4471269; Life Technologies, Foster City, CA)為來自每一患者樣品的擴增子池標上條碼。為了使收率最大化，通過組合40 μl Platinum PCR SuperMix High Fidelity、4.4 μl Ion Primer Mix (BC X 其中X= 條碼 1-16)和10 μl連接的DNA將反應按比例調(diào)至2x。擴增使用ABI 2720熱循環(huán)儀(Life Technologies, Foster City, CA)進行。熱循環(huán)參數(shù)包括72℃ 20分鐘，95℃ 5分鐘，接著10個循環(huán)的95℃ 15秒，58℃ 15秒和68℃ 1分鐘。擴增之后，使用MinElute Reaction Cleanup Kit (Cat No. 28204; Qiagen, Germantown, MD)按照制造商的說明純化標有條碼的樣品并洗脫在50 μl Low TE (Cat No. 602-1155-010; Life Technologies, Foster City, CA)中。DNA濃度和純度使用NanoDrop ND 1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE)通過分光光度分析測定。純化的標有條碼的樣品的范圍通常為150-300 ng/μl，A260/280純度為1.7-1.9。在單個1.5 mL無核酸酶微量離心管中組合等摩爾濃度(~2-3 μg每一標有條碼的樣品)并用于大小選擇。

大小選擇 向匯集的標有條碼的MTB文庫管中加入適當體積的GelPilot 5X Loading Dye (P/N 1037649; Qiagen, Germantown, MD)并上樣到包含溴化乙錠(最終0.1 μg/mL; Cat No 161-0433; Bio-Rad, Hercules, CA)的1 % (w/v)瓊脂糖凝膠(Cat No. BP1356; Fischer Scientific, Pittsburg, PA)上。標有條碼的文庫在1X TBE Buffer (Cat No. 1B70153; IBI Scientific, Peosta, IA)中于0.4 mV cm²電泳60分鐘并在UV透照下可視化。大小估計使用TrackIt 1 kb Plus DNA Ladder (P/N 10488-085; Life Technologies, Foster City, CA)確定。凝膠切除在UV透照下使用無菌解剖刀刀片切去75-200 bp之間的靶區(qū)域進行。將切除的瓊脂糖凝膠切片放置在無菌1.5 mL微量離心管中并使用PureLink Quick Gel Extraction Kit (Cat No. K210012; Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的說明經(jīng)受DNA純化。使用NanoDrop ND 1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE)經(jīng)分光光度法測定標有條碼的DNA文庫的濃度和純度值。對于乳液PCR推薦的文庫輸入為~140-560 x 10⁶分子/18 μl。該范圍通過使用文庫原液和無核酸酶水1:1000稀釋達到。

乳液聚合酶鏈反應(emPCR) 乳液聚合酶鏈反應使用Ion Template Preparation Kit (Cat No. 4469000; Life Technologies, Foster City, CA)通過加入582 μl無核酸酶水、200 μl 5X PCR試劑混合物、100 μl 10X PCR酶混合物、100 μ離子球顆粒（Ion Sphare Particles）和18 μl稀釋的文庫模板在1 mL反應體積中進行。充分混合制備物接著在微量離心機中短暫離心。乳液使用Ultra-Turrax Tube Drive (Life Technologies, Foster City, CA)獲得。向Ion Template Preparation Tube (Cat No. 4467226, Life Technologies, Foster City, CA)中加入總共9 mL冷凍的Emulsion Oil(Ion Torrent Preparation Kit; Cat No. 4469000, Life Technologies, Foster City, CA)。將乳液管放置和鎖定在IKA Ultra-Turrax Tube Drive上并開始。當管處于運動中（in motion）時，整個1 mL PCR預混溶液(master mix)分配入帽口(cap port)并混合5分鐘。將混合的乳液轉移至96-孔PCR板并使用ABI 2720熱循環(huán)儀(Life Technologies, Foster City, CA)使用下列熱循環(huán)參數(shù)擴增：94℃ 6分鐘，接著94℃ 30秒，58℃ 30秒和72℃ 90秒，40個循環(huán)；接著94℃ 30秒和68℃ 6分鐘，5個循環(huán)。

離子球顆粒(ISP)回收和Qubit測量 使用Ion Xpress Template Kit (Cat No. 4469001, Life Technologies, Foster City, CA)中提供的試劑按照制造商的方案(Ion Xpress Template Kit用戶指南v2.0, 18-19頁)回收離子球顆粒?；厥疹w粒的定量使用Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Foster City, CA)和Ion Sphere Quality Control Kit (Cat No. 4468656, Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的推薦(Ion Xpress Template Kit用戶指南，25-26頁)進行。模板-陽性離子球顆粒(ISPs)的最佳量在4-50%之間。所獲得的在此范圍之外的相對熒光單位(RFU)值不繼續(xù)（persued）隨后的ISP富集。

ISP富集 ISPs使用Ion Xpress Template Kit、Ion Sequencing Kit和DynaBeads MyOne Streptavidin C1小珠(分別為Cat Nos. 4469001、4468997和650.01; Life Technologies, Foster City, CA)中提供的試劑按照制造商的方案(Ion Xpress Template Kit用戶指南v2.0，15-17頁)富集。

離子激流314芯片制備和PGM測序 離子激流314芯片(Cat No. 4462923; Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的推薦(Ion Sequencing Kit用戶指南v 2.0)制備和裝載。離子激流PGM按照離子激流314芯片說明書運行，其包括65-循環(huán)測序方案，使用18兆歐姆純化水和標準壓縮氬氣驅(qū)動穿過PGM系統(tǒng)的應用流體學（fluidics）。所有的rpoB、 katG、 pncA、 gyrA和rrs基因以及相應的蛋白質(zhì)均存放入Genbank中(登錄號JX303203-JX303332)。

用于檢測TB的旋轉酶PCR vs. 6110 PCR測定在離子激流PGM上測序整個旋轉酶基因和針對OCR的旋轉酶靶（the gyrase target for OCR）也可用于鑒定導致抗性的TB突變。該第二個PCR靶允許準確分析可能不包含整個IS6110插入元件的TB菌株。盡管IS6110測定在多數(shù)菌株中具有多個基因拷貝，但一些僅具有一個。如圖6、7和8中所顯示的，與IS6110測定相比該旋轉酶測定具有普遍更高的循環(huán)閾值，這是由于在那些分離物中有多個IS6110基因拷貝，并因此更靈敏。因此通過該全基因測序的方法可追蹤任何可能的TB突變—甚至遠離檢測位點的TB突變。

表型和基因型結果 通過rpoB、 katG、 pncA、 gyrA和rrs (16s)基因的離子激流測序?qū)?6個結核分枝桿菌分離物的氨基酸表征分別在表1-5中概述，并與BACTEC? MGIT? 960 (表型)和/或HAIN GenoType? MTBDRplus (基因型) LPA比較。通過BACTEC? MGIT? 960表型分析，在26個MTB臨床分離物中，14個(54%)為MDR，7個(27%)為XDR，5個(19%)對藥物敏感。離子激流PGM測序方法顯示與通過MGIT? 960培養(yǎng)獲得的表型抗性(表1-5)和通過Hain LPA獲得的基因型rpoB和katG數(shù)據(jù)(表1，2)二者100% (26/26)一致。

rpoB基因突變 與H37Rv野生型菌株相比，在26個臨床分離物中共鑒定了10個rpoB氨基酸置換。常見的S531L突變是最流行的，但觀察到了也已知賦予對利福平的抗性的密碼子516和526中的突變(表1)。另外，在rpoB的開放閱讀框中但在81-堿基對的利福平抗性-決定區(qū)(RRDR; 表1)之外觀察到突變。在一個菌株中RRDR之外觀察到的V194I突變?yōu)橐粋€可能與利福平抗性不相關的獨特置換。在至少一個菌株中在rpoB蛋白質(zhì)的殘基位置900以外記錄了5個氨基酸置換。存在7個其中根據(jù)LPA野生型帶不存在也沒有相應突變帶的具有rpoB突變(6個在516位，1個在526位)的菌株。在這7個分離物的6個中，離子激流測序在516位處的已知突變位點中顯示一個不常見的氨基酸置換(即，甘氨酸)，在此處通常已知發(fā)生纈氨酸(V)置換(D516V) (表2)。相似地，在一個分離物中離子激流測序在526位處的已知突變位點中顯示精氨酸(R)，在此處通常發(fā)生酪氨酸(Y)或天冬氨酸(D)置換(H526Y/D)。

katG基因突變 在katG基因中觀察到4個氨基酸置換，所有抗性菌株中存在已知賦予異煙肼抗性的S315T(表2)。通過DST檢測到內(nèi)含R463L、W191R和N138H突變的臨床菌株(表2)，并且先前已經(jīng)表征。katG中463位處的置換(R463L)先前顯示對抗生素抗性無作用并且可用于將結核分枝桿菌分離物分類為遺傳群1 (Arg463)或2/3 (Leu463)。所評估的26個臨床分離物中，7個(27%)為遺傳群1的成員，如該R463L置換所證明的。

pncA基因突變 在包含pncA基因全長編碼區(qū)域的561 bps之中在至少一個菌株中記錄了7個核苷酸突變(表3)。26個菌株中的9個(34.6%)包含賦予吡嗪酰胺抗性的氨基酸突變(表3)。在一個菌株中，在核苷酸195位處表征了一個沉默(同義)核苷酸突變(C195T)。5個菌株包含先前表征的已知賦予對吡嗪酰胺的抗性的氨基酸置換(C14R、A102V、V139G、R154G和L172P)。在一個分離物中在pncA蛋白質(zhì)的殘基122處發(fā)現(xiàn)一個編碼終止密碼子的新的突變(Q122終止)(表3)，其先前未在別處報道過。

gyrA基因突變 在編碼DNA旋轉酶亞基A的2,517 bp全長gyrA基因中觀察到9個獨特突變。僅在通過gyrA中密碼子88、90和94處的置換定義的喹諾酮抗性決定區(qū)(QRDR)中包含突變的菌株中記錄了對氟喹諾酮(FQ)的抗性。在QRDR之外的區(qū)域還觀察到許多額外的突變，包括在gyrA蛋白的549和613位處的兩個“混合菌株”突變(表4)。已知95位的突變(S95T)對FQ抗性無作用，但可用于將菌株分類為遺傳群2或3。在屬于遺傳群2/3的總計19個臨床分離物中，根據(jù)對gyrA 95位的評估(T = 遺傳群2，S = 遺傳群3)，18個(96%)為群2，1個(4%)為群3。

rrs(16s)基因突變 在包含全長16s rrs基因的1,540 bps之中記錄了4個核苷酸突變。通過DST，26個中的7個(27%)臨床分離物顯示耐受氨基糖苷類，并且所有的菌株含有已知賦予抗性的A1401G突變(表5)。觀察到兩個其它的氨基酸突變(C492T和A514C)，但先前已經(jīng)顯示不抑制氨基糖苷功效。觀察到一個先前未表征的G878A核苷酸突變，但根據(jù)DST該分離物顯示為敏感的(表5)。

兆堿基測序 離子激流基因芯片測序在甲型流感病毒的完整基因組上于五種不同條件下實施，在圖9中作為路線(Tracks)鑒定。將甲型流感菌株H3N2的全病毒核酸(約14.4 kb總RNA)按如上文所討論制備，僅反轉錄或反轉錄并PCR擴增，如圖9中所示。流感病毒基因組通過反轉錄(RT)來質(zhì)量擴增（mass amplified）并且某些經(jīng)擴增的cDNA群經(jīng)受PCR。然后使用離子激流測序方案分析每一結果。RT和/或RT-PCR分析用均質(zhì)的六聚體、Uni 12和/或24不同流感-特異性引物(長度和序列二者都不同)進行。均質(zhì)的六聚體包括每一長6個核苷酸的引物的集合，借此該集合包括六個核苷酸的所有序列重復。Uni 12為包含與流感H3N2病毒基因組每一段的3′末端的12個核苷酸互補的序列的引物(5′-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG; SEQ ID NO 13)。如圖9中所顯示的，路線4用六聚體引物和Uni 12擴增和測序接著用24流感-特異性引物PCR擴增，離子激流方案測序鑒定約70%的流感基因組。

進行了額外的實驗以實現(xiàn)完整流感基因組的一步測序。開發(fā)了一系列流感-特異性引物，對于PCR反應其將會允許實施統(tǒng)一的條件。開發(fā)的引物在圖10中列出。這些引物全部對流感病毒基因組特異，引物對沿基因組以約每800-1,000堿基對長間隔(參見圖10，擴增子長度以及引物放置和序列的起始和終止位置)。所有引物長度相似，約18-23個核苷酸并且含有相似的GC含量，約22.7%-38.9%，幾乎約33% ±6%并且大部分約33% ±3%。PCR分析使用這些引物的不同集合進行，擴增產(chǎn)物使用離子激流測序方案鑒定。

pncA基因的測序 使用根據(jù)本發(fā)明沿pncA基因間隔或“平鋪”的一系列引物測定用于PZA抗性的pncA的基因序列并與用傳統(tǒng)Sanger測序取得的結果比較。圖11A中描繪了pncA基因的編碼序列，使用的引物在圖11B中以粗體和下劃線描繪。使用這些引物與離子激流方法學協(xié)同，測定了pncA的整個編碼區(qū)域(參見圖11B的P1-P4)。將使用的引物擴展至所有基因或特定區(qū)域允許一步測序整個基因組。所取得的令人驚訝的結果鑒定了2或11個混合菌株(異質(zhì))群案例，其包含野生型和突變體二者，這通過傳統(tǒng)Sanger測序?qū)z漏。通過根據(jù)本發(fā)明方法的離子激流推斷的MTB臨床分離物的pncA中的氨基酸突變的概要在表7中示出并且可與顯示用Sanger測序取得的結果的表8比較。

如表7與表8的比較所示，WC2601/2顯示T135突變，通過Sanger測序無相應突變。該突變?yōu)楫愘|(zhì)的，61%的細胞包含突變，29%為野生型。用ML1440/2，鑒定到S59P突變，通過Sanger測序無相應突變。該突變?yōu)楫愘|(zhì)的，95%包含突變，5%野生型。

藥物抗性基因直接從患者痰樣品的快速表征 本發(fā)明方法致力于對從獲自，例如，偏遠地區(qū)的患者痰樣品的藥物抗性基因進行快速表征的需求。該方法包括收集以分析分別賦予對一線藥物，利福平和吡嗪酰胺的抗性的MTB rpoB和pncA基因。該方法學采用在PrimeStore Molecular Transport Medium (MTM)中環(huán)境溫度運輸痰、直接從痰提取核酸、基因擴增和測序用于MTB藥物抗性表征。

在南非農(nóng)村痰樣品作為MTB診斷的大型前瞻性分析的一部分收集(南非Mopani的患者)。對于分子檢驗，將植絨拭子(Copan Diagnostics, Brescia, Italy)浸沒在痰中并渦旋最少5次，然后轉移至1.5 mL分子轉運介質(zhì)，PrimeStore MTM? (PS-MTM)中。PS-MTM是為安全起見滅活包括結核分枝桿菌在內(nèi)的微生物以及保存和穩(wěn)定釋放的RNA/DNA、室溫運輸?shù)呐R床轉運溶液。將包含痰的PS-MTM管使用商業(yè)貨架（commercial carrier）室溫全部從南非運輸至德克薩斯州圣安東尼奧的裝備齊全的機構里。

使用PrimeXtract kit (Longhorn Vaccines and Diagnostics, San Antonio, TX, USA)按照制造商的推薦純化總基因組DNA。MTB的實時PCR擴增使用PrimeMix TB? (PM-PCR)，一種靶向高度保守的MTB IS6110區(qū)域的包含所有的試劑混合物，來進行。

使用用于pncA和rpoB的MTB引物的PCR擴增如先前所描述的進行。用于rpoB (1,625 bps)和pncA (960 bps)的引物分別擴增包含全部ropB決定區(qū)和啟動子加pncA基因的全部編碼區(qū)的基因的一部分。對于NGS文庫制備，使用Nextera XT Sample Prep Kit制備pncA和rpoB基因擴增子。MiSeq NGS按照制造商的說明(Illumina, San Diego, CA, USA)使用MiSeq Reagent Kit (V3)以600循環(huán)進行。生物信息學使用SeqMan NGen (V8)和LaserGene (V12) Core Suite (DNAStar, Inc, USA)與H37Rv參考菌株遺傳比較進行。

在選擇用于rpoB和pncA NGS的22個樣本中，17個(77.3%)產(chǎn)生完整的DNA序列(表9)。由于部分基因測序、序列質(zhì)量差或低覆蓋深度(即，低于10X)略去總計5個樣品。產(chǎn)生全部序列的樣本具有23.5-37.4范圍內(nèi)的PCR實時值，多數(shù)具有小于30的CT值。從原始樣品獲得優(yōu)質(zhì)NGS的成功取決于提取期間回收的MTB的濃度。在進行MTB抗性基因的終點擴增之前使用定性實時PCR測定可預測NGS成功。在三個樣本中NGS未產(chǎn)生合適的數(shù)據(jù)，最有可能是因為較長的1625 bp rpoB PCR擴增子的無效擴增(表9)。

表9

來自所選擇的通過Primemix MTB實時PCR檢驗陽性的患者痰的MTB rpoB和pncA基因的離子激流測序* (N-22)

在與通過Xpert測定的那些相關的rpoB基因序列中發(fā)現(xiàn)抗性突變。根據(jù)rpoB基因NGS表征，三個樣本在rpoB決定區(qū)的526位包含經(jīng)典抗性突變。有趣地，兩個樣本包含H-526-Y并且一個包含H-526-D突變(表9)。在一個樣本(患者89)中觀察到先前已經(jīng)顯示為非-抗性賦予突變的V-194-I置換。在一個樣本的rpoB中記錄了同義沉默突變，即，C-309-T。與H37RV參考菌株相比，發(fā)現(xiàn)來自所有菌株的pncA基因序列均為野生型(表9)，除了在一個樣本中有一個新的R-2-P突變。該突變是否賦予對吡嗪酰胺的抗性尚不清楚，因為其通過Xpert或MGIT培養(yǎng)未檢測到，對于該樣本無藥物抗性數(shù)據(jù)可用。衍生該樣本的患者存在持續(xù)咳嗽和體重減輕。使用實時PCR對該患者的跟進檢驗（follow up testing）為低陽性(CT= 36.1)但Xpert和MGIT培養(yǎng)為陰性。

用靈敏的實時PCR改善MTB檢測然后迅速測序抗性基因的能力為資源匱乏區(qū)域提供了另一個機會。由于PS-MTM迅速殺死MTB并在環(huán)境溫度及以上保存DNA，可有效地轉運樣本用于實時PCR和測序以提高藥物抗性菌株的檢測和優(yōu)化患者治療。先前的研究已經(jīng)顯示測序來自從具有MDR和XDR的國家來到美國的患者的MDR菌株以鑒定已知的和新的抗性突變的益處。NGS的一個額外的優(yōu)點為覆蓋深度提供檢測一個以上的群，即，患者樣本中的異質(zhì)抗性的能力。異質(zhì)抗性表征對于患者護理為重要的，特別是如果耐受如這些的關鍵抗生素的MTB亞群成為占優(yōu)勢的患者菌株。本實施例還證明了將痰樣本有效轉運至中心和地方實驗室以提供對農(nóng)村臨床的支持的可行性。不添加額外的培訓工作人員或基礎設施，來自農(nóng)村區(qū)域的患者痰樣本可轉運至具有訓練有素的人員和現(xiàn)有技術水平裝備的實驗室以支持MTB患者護理監(jiān)督和研究。

結核分枝桿菌(MTB)藥物抗性的表征對結核病(TB)的適當治療至關重要。分子檢測和下一代測序(NGS)迅速提供新的工具以診斷和改善藥物抗性TB的治療。當我們致力于治療和根除TB時，理解在迅速改變的抗性模式中流行病學和流動人口的作用，特別是在非洲農(nóng)村環(huán)境中，為重要的。在該簡報中，使用NGS表征直接從自南非農(nóng)村收集并在PrimeStore^? MTM (PS-MTM)中室溫轉運至德克薩斯的痰的MTB rpoB和pncA藥物抗性基因。這些基因分別賦予對一線藥物，利福平和吡嗪酰胺的抗性。本工作意義深長，因為包含高質(zhì)量DNA的穩(wěn)定樣本使得能夠直接從痰快速、集中處理。

考慮本文所公開發(fā)明的說明書和實踐，本發(fā)明的其它實施方案和用途將會對本領域技術人員顯而易見。本文所引用的所有參考，包括所有的出版、美國和外國專利和專利申請，通過引用具體地和完全地結合。無論在何處使用，術語“包含”意在包括術語“由其組成”或“基本上由其組成”。此外，術語包含、包括和含有不意在限制。說明書和實施例意在考慮為僅示例性的，本發(fā)明的真實范圍和精神由隨附權利要求指示。