測序方法
【專利說明】測序方法
[0001] 本發(fā)明涉及用于確定多核苷酸中的核苷酸堿基的序列的方法，所述多核苷酸例如 來源于天然存在的DNA或RNA。
[0002] 由于測序的單位成本下降并且越來越快的測序機(jī)器進(jìn)入市場，遺傳物質(zhì)的下一代 測序已經(jīng)對生物科學(xué)整體并且特別是對醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了顯著的影響。例如，我們同時待審的 申請WO 2009/030953公開了一種新型快速測序儀，其中特別是單鏈或雙鏈多核苷酸樣品 (例如，天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸堿基或堿基對的序列通過將其轉(zhuǎn)運(yùn)通過納米孔 基底而被讀取，所述納米孔基底設(shè)置有在納米孔的出口內(nèi)或附近并置的等離子體納米結(jié)構(gòu) (plasmonic nanostructures)。在這種裝置中，所述等離子體納米結(jié)構(gòu)限定檢測窗（基本 上是電磁場），在其中每個核苷酸堿基（任選被標(biāo)記的）又通過與入射光相互作用以特有方 式被誘導(dǎo)產(chǎn)生熒光或拉曼散射質(zhì)子。然后，在遠(yuǎn)端、多路檢測這樣產(chǎn)生的質(zhì)子，并轉(zhuǎn)換成數(shù) 據(jù)流，其信息內(nèi)容表征與所述多核苷酸相關(guān)的核苷酸堿基序列。然后，利用編程到與其集成 在一起或在與其相連的輔助計算裝置中的微處理器中的相應(yīng)軟件實施的計算算法，可以從 所述數(shù)據(jù)流恢復(fù)所述序列。
[0003] 用于快速測序多核苷酸的另一種裝置例如記述在US 6627067, US 6267872和US 6746594中。以其最簡單的形式，所述裝置利用電極，而不是等離子體納米結(jié)構(gòu)，來定義穿過 基底或在納米孔中或周圍的檢測窗。然后，電勢差穿過電極施加，并且作為時間的函數(shù)檢測 其間流動的離子介質(zhì)的電特性的變化，所述變化由多核苷酸和結(jié)合的電解質(zhì)通過納米孔電 泳轉(zhuǎn)運(yùn)所致。在所述裝置中，由于多個個體核苷酸堿基通過所述檢測窗，它們連續(xù)地阻塞和 開啟所述檢測窗，引起'阻塞事件'，這產(chǎn)生電流或流阻率的特征性波動。然后，利用這些波 動來產(chǎn)生適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)流，用于上文所述的分析。
[0004] 穩(wěn)定的小滴流（droplet stream)，尤其是微滴流（microdroplet stream)的產(chǎn) 生，是已經(jīng)用于分子生物學(xué)的另一個技術(shù)發(fā)展領(lǐng)域。例如，US7708949公開了一種用于在 油中產(chǎn)生穩(wěn)定的水滴的新型微流體方法，而例如US2011/0250597描述利用這一技術(shù)來產(chǎn) 生微滴，所述微滴含有核酸模板（典型地是多核苷酸DNA或RNA片段）和多個引物對，其 允許利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所述模板。涉及這種方法和這一領(lǐng)域的其他專利申請通 常包括 US 2010/184020, US2012/0164633, US2012/0122714, US2011/0000560, US2010/01 376163, US2010/0022414 和 US2008/0003142。J. Molecular Diagnostics (分子診斷雜 志)14 (3) 233-246 (2012)記述了該微滴PCR法在鑒定與先天性肌營養(yǎng)不良癥（congenital muscular dystrophy)相關(guān)的基因突變中的應(yīng)用。
[0005] W02007/120240 和 J. Anal. Chem.(分析化學(xué)雜志）盤 8439-8447 (2011)分別描述 了表征核酸的基于小滴的方法，其涉及焦磷酸測序。
[0006] 類似地，在分析分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用典型地包含少于1000個核苷酸長的已知 序列順序的單鏈寡核苷酸的生物探針。當(dāng)探針與靶標(biāo)的核苷酸堿基之間存在充分的序列互 補(bǔ)性時，此類探針典型地通過將其本身與靶標(biāo)（例如，來源于天然存在的病原體的DNA的靶 標(biāo)）連接而起作用。典型地，所述探針的核苷酸用可檢測元件如放射性或熒光標(biāo)記物進(jìn)行 標(biāo)記，以致當(dāng)將探針用于處理據(jù)信其中或其上已經(jīng)捕獲有靶標(biāo)的分析物溶液或基底時，通 過尋找和檢測所述檢測元件的特征性檢測特性來顯示所述靶標(biāo)的存在或不存在。
[0007] -類這樣的探針由在本領(lǐng)域中被稱為'分子指示標(biāo)（molecular beacons) '的物質(zhì) 所代表，例如，如在W002/06531或US8211644中所述的。這些探針由單鏈寡核苷酸組成，所 述單鏈寡核苷酸實際上已經(jīng)向回折疊于其自身上從而產(chǎn)生充當(dāng)探針的傳感器的剩余的單 鏈環(huán)和短莖，在所述莖中，鄰近兩個末端的核苷酸通過互補(bǔ)核苷酸堿基配對彼此結(jié)合；由此 產(chǎn)生雙鏈區(qū)域。這種布置是高度緊張的，所述布置可以連接到發(fā)夾上，其中單鏈環(huán)連接到名 義上雙鏈的寡核苷酸的同一末端的互補(bǔ)鏈。所述寡核苷酸的游離的3'和5'端（現(xiàn)在彼此 鄰近并且在莖的遠(yuǎn)端）分別連接熒光團(tuán)和猝滅劑。然后其幾何學(xué)上的彼此接近確保不產(chǎn)生 顯著的熒光。使用時，靶標(biāo)與單鏈環(huán)結(jié)合，產(chǎn)生另外的應(yīng)變，以致當(dāng)加熱所述探針時引起莖 解鏈，這使所述熒光團(tuán)和猝滅劑遠(yuǎn)離，并且允許前者發(fā)出熒光。
[0008] 我們現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了確定多核苷酸樣品中的核苷酸堿基的序列的新方法，該方法 不同于上述那些方法，并且其中來源于樣品的在流中的包含個體單核苷酸的小滴（其順序 對應(yīng)于樣品的核苷酸堿基對序列）在用特定的標(biāo)記的生物探針處理后被查詢。典型地，該 處理的結(jié)果是在每個小滴中產(chǎn)生與其中的核苷酸相關(guān)聯(lián)的特定核苷酸堿基所特有的一個 或多個可檢測元件。該方法的一個特征是使用新的生物探針，其中可檢測元件基本上是不 可檢測的，除非被一系列生化/酶反應(yīng)特異性激活，所述生化/酶反應(yīng)從所述探針釋放處于 可檢測狀態(tài)的所述可檢測元件中的一個或級聯(lián)。
[0009]因此，根據(jù)本發(fā)明，提供一種用于確定多核苷酸分析物中的核苷酸堿基的序列的 方法，所述方法特征在于下述步驟：
[0010] a.產(chǎn)生小滴流，所述小滴中的至少一些包含單核苷酸，并且其中在所述小滴流中 單核苷酸的順序?qū)?yīng)于所述分析物中核苷酸的序列；
[0011] b.向每個小滴引入多個生物探針類型，每個類型（i)包含處于不可檢測狀態(tài)的不 同的可檢測元件，并且（ii)適于捕獲組成所述分析物的不同的互補(bǔ)的單核苷酸；
[0012] c.使包含在所述小滴中的單核苷酸與其互補(bǔ)的探針結(jié)合，以產(chǎn)生占用的探針；并 且
[0013] d.使所述可檢測元件以可檢測的狀態(tài)從占用的探針釋放。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，每種生物探針包含單鏈核苷酸區(qū)，其末端連 接兩個不同的雙鏈寡核苷酸區(qū)，其中所述寡核苷酸區(qū)中的至少一個包含具有特征性檢測特 性的可檢測元件，并且其中所述可檢測元件被這樣布置在所述寡核苷酸區(qū)上，以致所述可 檢測特性的可檢測性比在相同數(shù)量的可檢測元件結(jié)合到相應(yīng)數(shù)量的單核苷酸時低。
[0015] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述可檢測元件包含熒光團(tuán)，并且所述探針本身在用 于檢測熒光團(tuán)的那些波長基本上不發(fā)熒光。因此，盡管熒光團(tuán)可能在電磁譜的大部分上表 現(xiàn)出普遍的、低水平的背景熒光，但是典型地存在其中熒光強(qiáng)度處于最大值的一個或少量 的特定波長或波長范圍（wavelength envelopes)。在特征性檢測所述焚光團(tuán)的這些最大值 中的一個或多個，基本上應(yīng)當(dāng)不產(chǎn)生熒光。在本發(fā)明的情形中，術(shù)語'基本上不發(fā)熒光'或 等價的詞語意指連接到探針的全部熒光團(tuán)在相關(guān)特征性波長或波長范圍的熒光強(qiáng)度不到 等量的游離熒光團(tuán)的相應(yīng)的熒光強(qiáng)度的25% ;優(yōu)選不到10% ;更優(yōu)選不到1%，并且最優(yōu)選 不到0. 1%。
[0016] 原則上，可以使用任何方法確保在探針的未使用狀態(tài)，所述熒光團(tuán)基本上