專利名稱：用于診斷自閉癥譜系障礙的組合物和方法
用于診斷自閉癥譜系障礙的組合物和方法相關申請本發(fā)明根據(jù)35 USC 119(e)要求2009年9月8日提交的美國臨時專利申請No. 61/240,469的優(yōu)先權。美國臨時專利申請No. 61/240，469的公開內容通過引用整體并入本文。
技術領域：
本發(fā)明總的涉及用于診斷自閉癥譜系障礙的組合物和方法。
背景技術：
自閉癥是干擾腦的社會關系和交往技能的區(qū)的正常發(fā)育的復合發(fā)育殘疾。一般而言，自閉癥兒童和成年在言語和非-言語交往，社會關系，及閑暇或游戲活動方面具有困難。自閉癥通常特征在于是全身性發(fā)育遲緩(TOD)名下的5種病癥之一，表征為幾個發(fā)育區(qū)，包括社會關系和交往技能的嚴重的和全身性損傷的神經(jīng)學病癥類別。在PDD名下的5種病癥包括孤獨性障礙，Asperger氏病癥,童年瓦解性障礙(OTD)，Rett氏病癥和未另外特定的PDD (PDD-NOS)。各這些病癥的特定診斷標準可見于American PsychiatricAssociation 發(fā)布的 American Psychiatric Association !Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders,Fourth Edition,Text Revision. Washington,DC,AmericanPsychiatric Association,2000。沒有用于自閉癥的生物學表現(xiàn)的確定的診斷測試，由此其仍僅為必需幾乎完全通過行為癥狀診斷的神經(jīng)學病癥之一。DSM-IV將自閉癥分類為由12個診斷標準表征的全身性發(fā)育遲緩(PDD)。那些標準落入3個類別社會關系障礙；交往障礙；及活動和興趣局限。自閉癥的診斷需要兒童顯示12種癥狀中的至少6種。如果兒童不符合以上給的自閉癥的定義，其可診斷為稱之為未另外特定的全身性發(fā)育遲緩(PDD-NOS)的病情。該非特定形式的全身性發(fā)育遲緩(PDD)的診斷可包括不落入以上類別的非典型類型的自閉癥，因為發(fā)作的晚齡，例如，或亞-閾值或非典型癥狀。根據(jù)DSM-IV，當自閉癥-樣行為存在時，尤其是當有嚴重的社會和言語交往技能發(fā)育損傷，但兒童不符合典型自閉癥或任何其他特定全身性發(fā)育遲緩，精神分裂癥，精神分裂型人格障礙或回避型人格障礙的標準時使用此診斷。各種劑已假定相關于自閉癥發(fā)展，包括但不限于暴露于殺蟲劑和/或可導致出生缺陷的劑。在至少一些情況中，似乎自閉癥可具有遺傳基礎。自閉癥的遺傳學呈現(xiàn)復雜性。例如，已顯示尤其是在患自閉癥或常見自閉癥行為的綜合征的患者的基因組區(qū)中存在拷貝數(shù)變異和染色體結構異常(大和小)(Abrahams and Geschwind, Nature ReviewsGenetics，2008，9 :341-355)。DNA雜交研究顯示了自閉癥群體的結構異常。許多不同基因中的遺傳變異的因果作用已推薦基于來自關聯(lián)或聯(lián)系研究的證據(jù)。尚且，基因組域關聯(lián)研究未能關聯(lián)單獨或組合作用的特定常見的變體，盡管該研究鑒定了可指其他成因基因或通路的關聯(lián)峰。有一些遺傳變異可為至少非-綜合征性自閉癥的成因的證據(jù)。由一般包括醫(yī)生和兒童的父母的團隊進行診斷兒童的評估。因為自閉癥譜系障礙的診斷是主觀的 ，可常發(fā)生兒童的誤診。由此，有對可提供是否受試者遭受自自閉癥譜系障礙的目的確定的診斷測試的未滿足的需求。發(fā)明概述本發(fā)明通常涉及用于診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的組合物和方法。本發(fā)明的方法和組合物可用于獲得或提供來自受試者的遺傳信息以便客觀地診斷受試者，或其他受試者中自閉癥譜系障礙(ASD)的存在，或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險。在一實施方式中，本發(fā)明包含診斷受試者中自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的方法。方法可包括下列步驟從來自受試者的生物學樣品(例如，組織或體液樣品)獲得核酸，及進行鑒定是否受試者的核酸中有變體序列的檢定。在某些實施方式中，方法可包括比較變體和與自閉癥譜系障礙關聯(lián)的已知的變體及測定是否變體是已之前鑒定為相關于自閉癥的變體。或者，方法可包括將變體鑒定為新的，之前未表征的或之前未描述的變體。如果變體是新變體，方法還可包括進行分析以測定是否突變預期有害于基因的表達和/或基因編碼的蛋白的功能。方法還可包括使用變體特征(即，受試者中鑒定的突變的編輯)以診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險。在一些實施方式中，方法可包括從來自受試者的組織或體液樣品獲得核酸及測序至少部分核酸以便獲得至少一種基因的樣品核酸序列。本發(fā)明的仍其他實施方式可包含用于鑒定與自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險關聯(lián)的突變(即，變體)的方法。方法可包括下列步驟鑒定待評價為具有如果突變可相關于自閉癥發(fā)展的序列的核酸。而且，方法可包括從來自患自閉癥譜系障礙的受試者的生物學樣品(例如，組織或體液樣品)獲得核酸樣品；及進行檢定以鑒定是否相比未患自閉癥譜系障礙的個體中的核酸序列，患自閉癥的受試者中的核酸序列中有突變，其中患自閉癥譜系障礙的受試者中突變的存在指示突變可相關于自閉癥譜系障礙的發(fā)展。如果變體是新變體，方法還可包括進行分析以測定是否突變預期有害于基因的表達和/或基因編碼的蛋白的功能。方法還可包括編輯一組可用于診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的變體突變。在仍其他實施方式中，本發(fā)明包含分離的核酸，其包含至少下列基因或基因組區(qū)的核酸TSC1，TSC2，MECP2，SHANK3, GRM1,GRM5, ARC, EIF4E, HOMERl，HRAS，MAP2K1, MAP2K2,RAFl, PIK3CA，PIK3R1，F(xiàn)MRl，ΡΤΕΝ, RHEB或UBE3A，其中序列包含指示或與自閉癥譜系障礙關聯(lián)的變體。下文會描述本發(fā)明的其他特征。需知，本發(fā)明的應用不限于下列權利要求，說明書和圖所示的細節(jié)。本發(fā)明能包括其他實施方式，且能以各種方式實踐或實施。

本發(fā)明的各特征，方面和優(yōu)勢將參照下列圖更加明了。圖I顯示根據(jù)本發(fā)明的一實施方式涉及mGluR信號轉導的基因。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的一實施方式的變體分級的方法。
圖 3，分圖 A-LL，描繪如 SEQ ID NO :1 38 的，TSCl，TSC2, MECP2, SHANK3, GRMl,GRM5, ARC, EIF4E, HOMERl，HRAS, MAP2K1, MAP2K2, RAFl, PIK3CA, PIK3R1, FMRl，PTEN, RHEB和UBE3A基因的DNA序列和由這些基因編碼的蛋白序列。圖 4 描繪如 SEQ ID NO :39 271 的用于鑒定 TSCl，TSC2, MECP2, SHANK3, GRMl,GRM5, ARC, EIF4E, HOMERl，HRAS, MAP2K1, MAP2K2, RAFl, PIK3CA, PIK3R1, FMRl，PTEN, RHEB和UBE3A基因中的突變的如實施例中所述使用的外顯子和側翼序列，以及序列的染色體位置。發(fā)明詳述盡管本發(fā)明的表示廣范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但特定實施例中給出的數(shù)值盡可能精確地報道。但是，任何數(shù)值，固有地含有必然獲自見于它們的相應測試測量的標·準偏差的特定誤差。而且，本文公開的全部范圍應理解為包括其中包含的任何和全部子域。例如，陳述的“I 10”的范圍應被認為包括最小值I和最大值10之間的任何和全部子域(包括端點)；這是說，始于I或更大最小值，例如I 6. I，及結束于10或更小最大值，例如，5. 5 10的全部子域。此外，任何被稱為“并入本文”的引用應理解為整體并入。還需知，如此說明書中所述，單數(shù)形式“a”，“an”和“the”包括復數(shù)個指示物，除非明白地和明確地限于一個指示物。術語“和/或”通常用于指稱至少一方或其他。在一些情況中，術語“和/或”與術語“或”互換使用。而且，術語“部分”和“片段”互換使用，以指稱多肽，核酸，或其他分子構建體的部分。“多肽”和“蛋白”在本文互換使用，以描述可包含部分或全長蛋白的蛋白分子。術語“肽”用于表示小于全長的蛋白或非常短的蛋白，除非情景另外指示。如本領域中知道，"蛋白”、“肽"、"多肽"和"寡肽"是α碳通過通過一個氨基酸的α碳的羧基和另一氨基酸的α碳的氨基之間的縮合反應形成的肽鍵連接的氨基酸(一般L-氨基酸)鏈。一般而言,構成蛋白的氨基酸按順序編號,開始于氨基末端殘基及向蛋白的羧基末端殘基的方向增加。如本領域知道，核酸序列彼此雜交的條件可描述為從低到高嚴格度。一般而言，高度嚴格雜交條件指稱在低鹽緩沖劑中于高溫洗滌雜交體。雜交可為與濾膜結合的DNA的使用本領域中的標準雜交溶液諸如O. 5Μ NaHPO4, 7 %十二烷基硫酸鈉(SDS)，于65°C及在O. 25MNaHP04, 3. 5 % SDS中洗滌，之后是依賴于探針長度從室溫到68 °C的溫度在0.1父330/0.1%303中洗漆(見例如八118油61,卩.]\16七 al. , Short Protocols in MolecularBiology,4th Ed. , Chapter 2, John Wiley & Sons, N. Y)。例如，高嚴格度洗漆包括在6XSSC/0. 05%焦磷酸鈉中，對于14個堿基的寡核苷酸探針于37°C洗滌，或對于17個堿基的寡核苷酸探針于48°C洗滌，或對于20個堿基的寡核苷酸探針于55V洗滌，或對于25個堿基的寡核苷酸探針于60°C洗滌，或對于長度約250個核苷酸的核苷酸探針于65°C洗滌?？蓪⒑怂崽结樣梅派湫院怂赝ㄟ^用，例如，[y-32p]atp的末端-標記或通過隨機引物標記并合放射性標記的核苷酸諸如[a-32P]dCTP來標記?；蛘?，探針可通過并合生物素化的或熒光素標記的核苷酸來標記，及使用鏈霉親和素或抗-熒光素抗體檢測探針。如本文所用，術語“上游”，當分子是蛋白時，是指N-端到其鄰接殘基的殘基；或當分子是核酸時，是指5’到其鄰接殘基的殘基。也如本文所用，術語“下游”，當分子是蛋白時，是指C-端到其鄰接殘基的殘基；或當分子是核酸時，是指3’到其鄰接殘基的殘基。本文公開的蛋白，多肽和肽序列全部從N-端氨基酸到C-端氨基酸排列，和本文公開的核酸序列全部從分子的5’端到分子的3’端排列。除非另外定義，本文所用的全部技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常明白的相同的含義。醫(yī)師特別參照 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)理解本領域的定 義和術語。氨基酸殘基的縮寫是本領域指稱20種常見的L-氨基酸之一中使用的標準3-字母和/或I-字母代碼。“核酸”是多核苷酸諸如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。術語用于包括單鏈核酸，雙鏈核酸，及RNA和DNA由核苷酸或核苷類似物組成的。術語“鑒定”或“百分率同一”指稱2個氨基酸序列之間或2個核酸序列之間的序列同一性。百分率同一性可通過比對2個序列來測定，且指稱在比較的序列共享的位置的相同殘基(即，氨基酸或核苷酸)數(shù)。序列比對和比較可使用本領域標準的算法(例如Smith and Waterman, 1981, Adv. AppI. Math. 2 482 ；Needleman and ffunsch, 1970, J. Mol.Biol. 48 443 ；Pearson and Lipman, 1988，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA,85 2444)或通過以公共渠道可利用的這些算法的計算機化的版本如BLAST和FASTA(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7. 0, Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison, WI)來進行。而且，通過 National Institutes of Health, Bethesda MD 可利用的ENTREZ可用于序列比較。在其他情況中，可商購的軟件，諸如GenomeQuest，可用于測定百分率同一性。當利用BLAST和空位BLAST程序時，可使用相應程序(例如，在美國生物技術信息中心的互聯(lián)網(wǎng)站可利用的BLASTN)的默認參數(shù)。在一實施方式中，2個序列的百分率同一性可為測定的使用具有I的空位權重的GCG，使得各氨基酸空位衡量為如是2個序列之間的單氨基酸錯配?；蛘?可使用是GCG(Accelrys,San Diego,CA)序列比對軟件包裝的部分的ALIGN程序(2. O版)。如本文所用，術語"保守殘基"指稱在具有相同的結構和/或功能的多個蛋白之中相同的氨基酸。保守殘基的區(qū)可對蛋白結構或功能的重要。由此，如在3-維蛋白中鑒定的連續(xù)的保守殘基可對蛋白結構或功能重要。為了發(fā)現(xiàn)保守殘基，或3-D結構的保守的區(qū)，可比較來自不同物種或相同的物種的個體的相同的或類似蛋白的序列。如本文所用，術語“類似”或“同源物”，當指稱氨基酸或核苷酸序列時，是指與野生型氨基酸序列具有一定程度的同源性或同一性的多肽。同源性比較可通過眼，或更通常，在容易可利用的序列比較程序的輔助下進行。這些可商購的計算機程序可計算2個或更多序列之間的百分率同源性(例如 Wilbur,W. J. and Lipman,D. J. , 1983,Proc. Natl. Acad. Sci.USA,80 :726-730)。例如，可采用同源序列來包括在替代實施方式中彼此至少70%同一，75%同一,80%同一,85%同一,90%同一,95%同一,97%同一或98%同一的氛基酸序列。如本文所用，術語至少90%同一包括與指示的序列具有跨90 100%同一性的序列，且包括期間的全部范圍。由此，術語至少90%同一包括與指示的序列91，91.5，92，92. 5,93,93. 5。94,94. 5,95,95. 5,96,96. 5,97,97. 5,98,98. 5，99，99· 5% 同一的序列。類似地術語“至少70%同一包括跨70 100%同一及期間的全部范圍的的序列。百分率同一性使用本文所述的算法測定。如本文所用，多肽或蛋白“結構域”包含沿著包含獨立單元的多肽或蛋白的區(qū)。結構域可依據(jù)結構，序列和/或生物學活性定義。在一實施方式中，多肽結構域可包含以基本上與其余蛋白獨立的方式折疊的蛋白區(qū)。結構域可使用結構域數(shù)據(jù)庫諸如，但不限于PFAM，PRODOM, PROS I TE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT 和 PR0CLASS 鑒定。如本文所用，基因是遺傳單元。一般而言，基因是編碼蛋白或功能RNA的部分DNA?；虻默F(xiàn)代定義是對應于遺傳單元的基因組序列的可定位的區(qū)?；蚩膳c調控區(qū)，轉錄的區(qū)及或其他功能序列區(qū)關聯(lián)。如本文所用，基因調控元件或調控序列是調控蛋白，諸如轉錄因子，結合以調控基因表·達的DNA段。該調控區(qū)常常是基因調控的上游。如本文所用外顯子是在RNA的其他部分(例如，已知為內含子的干擾區(qū))已通過RNA剪接移出之后見于成熟或處理的RNA的核酸序列。像這樣，外顯子序列通常編碼蛋白或蛋白的部分。內含子是通過RNA剪接從周圍外顯子序列除去的RNA部分。如本文所用，表達的RNA是編碼蛋白或多肽的RNA ( “編碼RNA”)，及任何其他轉錄但不翻譯的RNA ( “非-編碼RNA” )。如本文所用，微RNA是微RNA(miRNA)，是涉及基因表達的轉錄后調節(jié)的短(20 24nt)非-編碼RNA。微RNA可影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。例如，微RNA可結合于靶mRNA的3’ UTR中的互補序列及導致基因沉默。miRNA通過RNA聚合酶II作為可為蛋白-編碼或非-編碼的封頭的及多聚腺苷酸化的初級轉錄物(pri-miRNA)的部分轉錄。初級轉錄物可通過Drosha核糖核酸酶III酶切割而產(chǎn)生約70nt莖-環(huán)前體miRNA(前-miRNA),其還可通過細胞質Dicer核糖核酸酶切割而產(chǎn)生成熟miRNA和反義miRNA星(miRNA * )產(chǎn)物。可將成熟miRNA并RNA-誘導的沉默復合物(RISC)，其可通過與miRNA的不完全堿基配對識別靶mRNA，且最通常導致靶mRNA的翻譯抑制或去穩(wěn)定。如本文所用，SiRNA基本上是由約20個互補核苷酸組成的雙鏈RNA分子。siRNA通過更大雙鏈(ds) RNA分子的斷裂創(chuàng)建。siRNA可通過由siRNA與mRNA的相互作用的方式將其對應mRNA固有地分裂為2個，導致mRNA降解來抑制基因表達。siRNA也可與DNA相互作用而輔助染色沉默及異染色質擴展。如本文所用，表觀遺傳元件可通過非成為基礎的DNA序列中的變化的機理來變化基因表達。該元件可包括調控副突變，印跡，基因沉默，X染色體滅活，位置效應，重編程，轉位，母體效應，組蛋白修飾，及異染色質的元件。如本文所用，術語突變和變體互換使用以描述核酸或蛋白序列變化。如本文所用，“與自閉癥譜系障礙關聯(lián)”是指在患自閉癥的患者中相比在非-自閉癥對照中更多發(fā)現(xiàn)的變體。一般而言，該關聯(lián)的統(tǒng)計學意義可通過檢定多個患者來測定。如本文所用，目標區(qū)靶向而用于檢定DNA序列中的變體的部分染色體。用于診斷自閉癥譜系障礙的方法和組合物本發(fā)明的實施方式包含用于診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的組合物和方法。本發(fā)明的方法和組合物可用于獲得或提供來自受試者的遺傳信息以便客觀地診斷受試者中自閉癥譜系障礙的存在，或要發(fā)展自閉癥譜系障礙的其他受試者中增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險。在一實施方式中，本發(fā)明包含診斷受試者中自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的方法。方法可包括下列步驟從來自受試者的組織或體液樣品獲得核酸及進行檢定以鑒定是否受試者的核酸中有變體序列(即，突變)。在某些實施方式中，方法可包括比較變體和與自閉癥譜系障礙關聯(lián)的已知的變體及測定是否變體是已之前鑒定為相關于自閉癥的變體?；蛘?，方法可包括將變體鑒定為新的，之前未表征的變體。如果變體是新變體，方法還可包括進行分析以測定是否突變預期有害于基因的表達和/或基因編碼的蛋白的功能。方法還可包括使用變體特征(即，受試者中鑒定的突變的編輯)以診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險。在某些實施方式中，本發(fā)明包含診斷受試者中自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的方法，所述方法包括從來自受試者的組織或體液樣品獲得核酸；進行鑒定是否受試者的核酸中有變體序列，或多種 變體序列的檢定；對于檢測的各變體，測定是否變體是與自閉癥譜系障礙關聯(lián)的已知的變體或之前未描述的變體；如果變體是之前未描述的變體，測定是否變體預期對至少基因表達和/或蛋白功能之一具有有害的效應；及基于檢測的變體序列或多種變體序列診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險。在一些實施方式中，方法可包括從來自受試者的組織或體液樣品獲得核酸及測序至少部分核酸以便獲得至少一種基因的樣品核酸序列。在某些實施方式中，方法可包括比較變體和與自閉癥譜系障礙關聯(lián)的已知的變體及測定是否變體是已之前鑒定為相關于自閉癥的變體?；蛘?，方法可包括將變體鑒定為新的，之前未表征的變體。如果變體是新變體，或在一些之前表征的(即，鑒定的)變體的情況中，方法還可包括進行分析以測定是否突變預期有害于基因的表達和/或基因編碼的蛋白的功能。方法還可包括使用變體特征(即，受試者中鑒定的變體的編輯)以診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險。在本發(fā)明的各方法的實施方式中，方法可包括在多個個體中進行測定(例如，測序)以測定關聯(lián)的統(tǒng)計學意義。在本發(fā)明及本文更詳細描述的方法的各種實施方式中，測定包括至少下列之一核酸測序，雜交體捕獲和/或表觀遺傳分析。例如，在某些實施方式中，可使用下一代(大規(guī)模-并行測序)?；蛘?，可使用Sanger測序?；蛘?，可使用下一代(大規(guī)模_并行測序)及Sanger測序的組合。另外，測序包含隨合成單分子測序的至少一種。由此，在某些實施方式中，分析庫中的多個DNA樣品以鑒定顯示變異的樣品。另外，在某些實施方式中，分析多個庫中的多個DNA樣品以鑒定在至少2庫中顯示相同的變異的個體樣品。而且，在各種實施方式中，進行步驟中的核酸包括基因，RNA，外顯子，內含子，基因調控元件，表達的RNA，siRNA或表觀遺傳元件。而且，可評價包括剪接位點，轉錄因子結合，A-I編輯位點，微RNA結合位點，及功能RNA結構位點的調控元件的突變(即，變體)。在某些實施方式中，選擇用于分析變體的核酸包含選自知道或懷疑相關于一種或更多自閉癥譜系障礙的序列的序列。例如，核酸包含表I中基因之一的至少一部分?；蛘?，核酸可包含編碼涉及可在自閉癥譜系障礙(ASD)的發(fā)展中重要的生物化學通路的蛋白的基因。例如，在某些實施方式中，核酸源于編碼親代謝型谷氨酸受體信號轉導通路中的蛋白的基因。例如，在某些實施方式中，變體包含至少表2中的變體之一。由此，在本發(fā)明的方法的某些實施方式中，核酸包含至少下列之一的基因的至少一部分TSC1，TSC2，MECP2，SHANK3，GRMl，GRM5，ARC，EIF4E, HOMERl，HRAS，MAP2K1，MAP2K2,RAFl，PIK3CA,PIK3R1，F(xiàn)MRl，PTEN, RHEB或UBE3A。在一些實施方式中，核酸包含至少下列之一的基因的至少一部分TSCl, TSC2，SHANK3或HOMERl。在某些實施方式中，變體包含至少下列突變之一HOMER Ic.195G > T，M65I；HOMER I c.290C > T，S97L ；HOMER I c.425C > T，P142L ；GRM5 c.3503T> C, L1168P ；MAPK2c. 581-1G > T ；HRAS c. 383G > A, R128Q ；MECP2 c. 1477G > T, E483X。在本發(fā)明的方法的各種實施方式中，自閉癥譜系障礙可為至少下列之一非-綜合征性自閉癥，典型自閉癥，Asperger氏綜合征，Rett氏綜合征，童年瓦解性障礙，或不另外特定的全身性發(fā)育遲緩(PDD-NOS)。在某些實施方式中，自閉癥譜系障礙包含非-綜合征性自閉癥(即，顯示自閉癥癥狀、但不呈現(xiàn)自閉癥中常常發(fā)現(xiàn)的身體表現(xiàn)的患者)。本發(fā)明的方法還可包含診斷與自閉癥關聯(lián)的遺傳綜合征的存在，或增加的發(fā)展與自閉癥關聯(lián)的遺傳綜合征的風險，其中遺傳綜合征包含顯性表型。例如，在某些實施方式中，遺傳綜合征包含至少下列之一 Angelman綜合征，Prader-Willi綜合征，15qll_ql3重復，脆性X綜合征，脆性X前突變，染色體2q缺失,XYY綜合征,Smith-Lemli-Opitz綜合征，Apert綜合征，ARX基因中的突變，De Lange綜合征，Smith-Magenis綜合征，Williams綜 合征,Noonan綜合征,Down綜合征,軟腭-心-面部綜合征,肌強直營養(yǎng)不良,Steinert病，結節(jié)性硬化，Duchenne氏病,蒂莫西綜合征，IOp末端缺失，Cowden綜合征,45, X/46, XY鑲嵌現(xiàn)象，Myhre綜合征，Sotos綜合征，Cohen綜合征，Goldenhar綜合征，Joubert綜合征，Lujan-Fryns綜合征，Moebius綜合征,伊藤黑色素過少癥，I型神經(jīng)纖維瘤病，CHARGE綜合征和/或HEADD綜合征。方法可用于輔助尚未顯示ASD癥狀，或診斷不明確的個體的診斷。例如，受試者可為兒童或胎兒。用于測序核酸(DNA和RNA)的技術高度敏感，由此，可用于取自受試者的幾乎任何生物學樣品(即，組織或體液)。例如，在替代實施方式中，體液包含至少下列之一腦脊液，血,羊水,母源血,或尿。如上所述，在某些實施方式中，評價突變的基因是編碼與自閉癥發(fā)展關聯(lián)的生物化學通路中的蛋白的基因。例如，在某些實施方式中，基因涉及親代謝型谷氨酸受體通路。在一實施方式中，通路是mGluR5信號轉導通路和/或包括對mGluR5受體活性重要的基因。或者，可評價與某些類型的自閉癥綜合征相關的其他生物化學通路。例如，在某些實施方式中，可評價表I中的基因和/或基因組區(qū)的至少之一。當通路是mGluR5信號轉導通路和/或包括對mGluR5受體活性重要的基因時，DNA序列可源于表2中顯示的基因或包含基因的基因組區(qū)。在方法的某些實施方式中，評價可指示ASD的存在或增加的ASD的風險的突變的基因和/或基因組區(qū)是ARC，EIF4E，F(xiàn)MRl，GRMl，GRM5，HOMERl，HRAS，MAP2K1, MAP2K2, MECP2, PIK3CA, PIK3R1，PTEN，RAFl, RHEB,SHANK3, TSCl，TSC2和/或UBE3A。在某些實施方式中，測定中使用的天然或非-變體序列包含來自至少下列基因之一的外顯子序列ARC，EIF4E, FMRl，GRMl, GRM5, HOMERl，HRAS,MAP2K1，MAP2K2，MECP2，PIK3CA，PIK3R1，PTEN,RAFl，RHEB,SHANK3，TSCl，TSC2 和 / 或 UBE3A。例如，在某些實施方式中，評價變體的基因序列包含外顯子序列?；蛘?，可評價內含子序列或其他非-編碼區(qū)的潛在地有害的突變。在某些實施方式中，在測定中分析外顯子序列和額外的側翼序列(例如，UTR和/或內含子序列的約5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55或更多核苷酸)?；蛘呖墒褂眠@些序列的部分。在某些實施方式中，評價的基因序列包含來自至少下列基因之一的外顯子序列和/或側接內含子或UTR序列H0MER1，SHANK3, TSCl和/或TSC2。在某些實施方式中，評價的基因序列包含來自HOMERl基因的外顯子序列。該變體基因序列可包括具有表2中顯示的突變中的至少之一的序列。本發(fā)明的仍其他實施方式可包含鑒定與自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險關聯(lián)的突變的方法。方法可包括下列步驟鑒定核酸序列，諸如如果突變可相關于自閉癥發(fā)展的基因或基因組區(qū)。而且，方法可包括從來自患自閉癥譜系障礙的受試者的組織或體液樣品獲得核酸樣品；及進行檢定以鑒定是否相比未患自閉癥譜系障礙的個體中的核酸序列，患自閉癥的受試者中的核酸序列中有突變，其中患自閉癥譜系障礙的受試者中突變的存在指示突變可相關于自閉癥譜系障礙的發(fā)展?；蛘撸椒砂ǚ治鰧π伦凅w(即，之前未發(fā)現(xiàn)的突變)的選擇的基因或基因組區(qū)的序列。如果變體是新變體，或在之前鑒定的變體的一些情況中，方法還可包括進行分析以測定是否突變預期有害于基因的表達和/或基因編碼的蛋白的功能。方法還可包括編輯一組可用于診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的變體突變。由此，方法可包括鑒定與自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的·風險關聯(lián)的突變的方法，包含鑒定待評價為具有如果突變可為或相關于自閉癥發(fā)展的序列的核酸；從來自患自閉癥譜系障礙的受試者的組織或體液樣品獲得核酸樣品；及進行檢定以鑒定是否相比未患自閉癥譜系障礙的個體中的核酸序列，患自閉癥的受試者中的核酸序列中有突變，其中患自閉癥譜系障礙的受試者中突變的存在指示突變可相關于自閉癥譜系障礙的發(fā)展。在本發(fā)明的鑒定新突變的方法的實施方式中，方法可包括在多個個體中進行測定(例如，測序)以測定關聯(lián)的統(tǒng)計學意義。在某些實施方式中，突變是之前已與自閉癥譜系障礙的發(fā)展關聯(lián)的變體?；蛘?，突變可為之前未描述的變體。方法可額外地包括測定是否突變預期對至少基因表達和/或蛋白功能之一具有有害的效應。在某些實施方式中，選擇用于分析變體的核酸包含選自知道或懷疑相關于一種或更多自閉癥譜系障礙的序列的序列。例如，核酸包含表I中基因之一的至少一部分。或者，核酸可包含編碼涉及可在自閉癥譜系障礙(ASD)的發(fā)展中重要的生物化學通路的蛋白的基因。例如，在某些實施方式中，核酸源于編碼親代謝型谷氨酸受體信號轉導通路中的蛋白的基因。例如，在某些實施方式中，變體包含至少表2中的變體之一。由此，在本發(fā)明的方法的某些實施方式中，核酸包含至少下列之一的基因的至少一部分TSC1，TSC2，MECP2，SHANK3, GRMl, GRM5, ARC, EIF4E, HOMERl， HRAS, MAP2K1, MAP2K2, RAFl, PIK3CA, PIK3R1,FMRl，PTEN, RHEB或UBE3A。在一些實施方式中，核酸包含至少下列之一的基因的至少一部分TSC1，TSC2, SHANK3 或 HOMERl。在本發(fā)明的方法的各種實施方式中，自閉癥譜系障礙可為至少下列之一非-綜合征性自閉癥，典型自閉癥，Asperger氏綜合征，Rett氏綜合征，童年瓦解性障礙，或不另外特定的全身性發(fā)育遲緩(PDD-NOS)。在某些實施方式中，自閉癥譜系障礙包含非-綜合征性自閉癥?；蛘?，變體和與自閉癥關聯(lián)的(例如，遺傳關聯(lián))其他綜合征關聯(lián)，所述其他綜合征諸如至少下列之一 Angelman綜合征，Prader-Willi綜合征，15qll_ql3重復,脆性X綜合征，脆性X前突變，染色體2q缺失，XYY綜合征，Smith-Lemli-OpitZ綜合征，Apert綜合征,ARX基因中的突變，De Lange綜合征，Smith-Magenis綜合征,Williams綜合征，Noonan綜合征，Down綜合征,軟腭-心-面部綜合征，肌強直營養(yǎng)不良，Steinert病，結節(jié)性硬化，Duchenne氏病,蒂莫西綜合征，IOp末端缺失,Cowden綜合征,45, X/46, XY鑲嵌現(xiàn)象,Myhre綜合征，Sotos綜合征，Cohen綜合征，Goldenhar綜合征，Joubert綜合征，Lujan-Fryns綜合征，Moebius綜合征，伊藤黑色素過少癥，I型神經(jīng)纖維瘤病，CHARGE綜合征和/或HEADD綜合征。在各種實施方式中，在本發(fā)明及本文詳述的方法中，測定至少包括核酸測序，雜交體捕獲及表觀遺傳分析之一。例如，在某些實施方式中，可使用下一代(大規(guī)模-并行測序)?；蛘?，可使用Sanger測序?；蛘撸墒褂孟乱淮?大規(guī)模-并行測序)及Sanger測 序的組合。另外，測序包含隨合成單分子測序中的至少一種。由此，在某些實施方式中，分析庫中的多個DNA樣品以鑒定顯示變異的樣品。另外，在某些實施方式中，分析多個庫中的多個DNA樣品以鑒定在至少2庫中顯示相同的變異的個體樣品。而且，在各種實施方式中，進行步驟中的核酸包含基因，RNA，外顯子，內含子，基因調控元件，表達的RNA, siRNA或表觀遺傳元件。而且,可評價包括剪接位點,轉錄因子結合，A-I編輯位點，微RNA結合位點，及功能RNA結構位點的調控元件的突變(即，變體)。方法可用于輔助尚未顯示ASD的癥狀，或診斷不明確的個體的診斷。例如，受試者可為兒童或胎兒。用于測序核酸(DNA和RNA)的技術高度敏感，由此可用于取自受試者的幾乎任何生物學樣品(即，組織或體液)。例如，在替代實施方式中，體液包含至少下列之一腦脊液，血,羊水,母源血,或尿。再次，在某些實施方式中，評價新突變的基因是編碼與自閉癥發(fā)展關聯(lián)的生物化學通路中的蛋白的基因。例如，在某些實施方式中，基因涉及親代謝型谷氨酸受體通路。在一實施方式中，通路是mGluR5信號轉導通路和/或包括對于mGluR5受體的活性重要的基因。或者，可評價與某些類型的自閉癥綜合征相關的其他生物化學通路。例如，在某些實施方式中，可評價表I中的基因和/或基因組區(qū)的至少之一。當通路是mGluR5信號轉導通路和/或包括對于mGluR5受體的活性重要的基因時，DNA序列可源于表2中顯示的基因或包含基因的基因組區(qū)。在方法的某些實施方式中，評價可指示ASD的存在或增加的ASD的風險的新突變的基因和/或基因組區(qū)是ARC，EIF4E，F(xiàn)MRl，GRMl，GRM5，HOMERl，HRAS，MAP2K1, MAP2K2, MECP2, PIK3CA, PIK3R1，PTEN，RAF I, RHEB,SHANK3, TSCl，TSC2和/或UBE3A。在某些實施方式中，天然或非-變體序列包含來自至少下列基因之一的外顯子序列ARC，EIF4E, FMRl，GRMl，GRM5，HOMERl，HRAS，MAP2K1, MAP2K2,MECP2, PIK3CA, PIK3R1, PTEN, RAFl, RHEB, SHANK3, TSCl, TSC2 和 / 或 UBE3A。例如，在某些實施方式中，評價變體的基因序列包含外顯子序列。在某些實施方式中，在測定中分析外顯子序列和額外的側翼序列(例如，UTR和/或內含子序列的約5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55或更多核苷酸)?；蛘撸稍u價內含子序列或其他非-編碼區(qū)的潛在地有害的突變?；蛘撸墒褂眠@些序列的部分。該變體基因序列可包括具有表2中顯示的突變中的至少之一的序列。本發(fā)明的其他實施方式提供含有與自閉癥譜系障礙相關的突變的分離的基因序列。該基因序列可用于客觀地診斷受試者中自閉癥譜系障礙的存在或增加的受試者發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險。在某些實施方式中，分離的核酸可含有下列中任一種或組合的非-變體序列或變體序列ARC，EIF4E, FMRl，GRMl, GRM5, HOMERl，HRAS, MAP2K1, MAP2K2,MECP2, PIK3CA, PIK3R1, PTEN, RAFl, RHEB, SHANK3, TSCl, TSC2 和 / 或 UBE3A。例如，在某些實施方式中，基因序列包含外顯子序列。在某些實施方式中，在測定中分析外顯子序列和額外的側翼序列(例如，UTR和/或內含子序列的約5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55或更多核苷酸)。或者，可使用內含子序列或其他非-編碼區(qū)?；蛘撸墒褂眠@些序列的部分。在某些實施方式中，基因序列包含來自至少下列基因之一的外顯子序列H0MER1，SHANK3,TSCl和/或TSC2。在某些實施方式中，基因序列包含來自HOMERl基因的外顯子序列。該變體基因序列包括具有表2中顯示的突變中的至少之一的序列。在一實施方式中，分離的核酸可包含至少下列變體之一 H0MER I c. 195G > T，M65I ；H0MER lc. 290C > T，S97L ；H0MERI c.425C > T, P142L ；GRM5 c.3503T > C, L1168P ；MAPK2 c.581-1G > T ；HRAS c.383G >A, R128Q ；MECP2c. 1477G > T, E483X。自閉癥譜系障礙通常表征為全身性發(fā)育遲緩(TOD)名下的5種病癥之一。在TOD名下的5種病癥包括自閉癥(典型自閉癥),Asperger氏綜合征，Rett氏綜合征,童年瓦解性障礙，及不另外特定的全身性發(fā)育遲緩(PDD-NOS)。根據(jù)本發(fā)明，可分析知道或懷疑相關于5種病癥和/或自閉癥譜系障礙之一的一組基因。在某些實施方式中，自閉癥是非-綜合征性自閉癥。或者，可表征其他類型的自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展其他類型的自閉癥譜系障礙的風險。本發(fā)明的方法和組合物還可用于診斷或預測增加的發(fā)展與自閉癥關聯(lián)的遺傳 綜合征的風險，由此測定是否受試者受綜合征性自閉癥或非-綜合征性自閉癥或另一自閉癥譜系障礙的影響，或處于增加的發(fā)展綜合征性自閉癥或非-綜合征性自閉癥或另一自閉癥譜系障礙的風險。通常與自閉癥關聯(lián)的遺傳病癥包括，例如，Angelman綜合征，Prader-Willi綜合征，15qll_ql3重復，脆性X綜合征，脆性X前突變，染色體2q缺失，XYY綜合征，Smith-Lemli-Opitz綜合征，Apert綜合征，ARX基因中的突變，De Lange綜合征，Smith-Magenis綜合征，Williams綜合征，Noonan綜合征，Down綜合征，軟腭-心-面部綜合征，肌強直營養(yǎng)不良，Steinert病，結節(jié)性硬化，Duchenne氏病,蒂莫西綜合征，IOp末端缺失，Cowden綜合征,45, X/46, XY鑲嵌現(xiàn)象，Myhre綜合征，Sotos綜合征，Cohen綜合征，Goldenhar綜合征，Joubert綜合征，Lujan-Fryns綜合征，Moebius綜合征,伊藤黑色素過少癥，I型神經(jīng)纖維瘤病，CHARGE綜合征和HEADD綜合征。本發(fā)明的方法可利用核酸測序，雜交，定量PCR或本領域知道的其他技術，以鑒定與自閉癥譜系障礙關聯(lián)的變體。該技術的描述可見于本領域使用的教科書?；蛘撸墒褂弥T如本文詳述的較新測序技術(見例如，Bowers et al. , 2009, Nature Methods, 6 :593_595 ；Ozsolak et al. , Nature, 2009,461 :814_818)。通過利用對象診斷測試,本發(fā)明的方法大大減少和/或消除與診斷自閉癥譜系障礙的主觀方法關聯(lián)的誤診。例如，在某些實施方式中，本發(fā)明提供診斷受試者(例如，兒童或胎兒)中自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的方法，包括從受試者獲得核酸樣品及鑒定指示自閉癥譜系障礙的序列變體，重排，拷貝數(shù)變體等。序列變體可為已之前在受試者或患ASD的受試者中鑒定的序列變體?；蛘撸蛄凶凅w可為新的(即，之前未描述的)。變體的鑒定可依經(jīng)驗或可通過和與本文教導的一種或更多自閉癥譜系障礙關聯(lián)的知道的序列改變比較來制造?？蓮捏w液或組織，諸如腦脊液，血，羊水，母源血，頰拭子，痰或尿得到核酸源材料?？赏ㄟ^任何遺傳元件的分析來進行診斷，諸如但不限于基因，外顯子，內含子，基因調控元件，內含子，表達的RNA，微RNA，siRNA和表觀遺傳元件。可使用對于檢測基因的單拷貝足夠敏感的測序方法?；蚪M的仍其他元件可對于基因表達重要，且像這樣的作為可用于ASD的診斷學的變體而涵蓋。例如，對于 TSC1，TSC2, MECP2, HANK3, GRMl, GRM5, ARC, EIF4E, HOMERl,HRAS, MAP2K1, MAP2K2, RAFl, PIK3CA, PIK3R1, FMRl，PTEN, RHEB 和 UBE3A 基因，已標位包括剪接位點，轉錄因子結合，A-I編輯位點，微RNA結合位點，功能RNA結構位點的調控元件，且可評價本文所述的突變(變體)。由此，對于本發(fā)明的各方法和組合物，變體可包含包括至少下列之一的核酸序列(I) A-到-I編輯位點-腺苷-到-肌苷(A-到-I) RNA編輯在腦中呈現(xiàn)精確的區(qū)域特異性及對于正常行為必要，及已將特定編輯位點的改變相關于一系列神經(jīng)病理學，包括癲癇和精神分裂癥；(2)剪接位點-估計幾乎一半的成因突變影響前-mRNA剪接，及通過剪接缺陷導致許多神經(jīng)學疾病，包括與第17染色體聯(lián)鎖的肌強直營養(yǎng)不良和帕金森癥；(3)保守的功能RNA結構-單鏈RNA-介導的調節(jié)是結構依賴性的，及重復使用幾個核心二級結構，諸如發(fā)卡和莖-環(huán)，且這些結構的改變可影響它們導致疾病的功能，如在SEPNl-相關的肌病的典型例中；(4)確認的轉錄因子結合位點(TFBS)-EncycIopedia ofDNA Elements (編碼)計劃使用CHiP-seq確認了幾種轉錄因子與預測的轉錄因子結合位點(TFBS)的結合，及TFBS中的突變相關于幾種精神病學病癥，包括精神分裂癥及雙相情感障礙；(5)微RNA(miRNA)結合位點-miRNA越來越認識為腦發(fā)育的關鍵調節(jié)物，通過沉默靶mRNA誘導基因表達程序中的全局變換，及微RNA結合位點中的突變已牽涉Tourette綜合征和TDP43-陽性額顳癡呆；(6)多聚腺苷酸化位點-mRNA穩(wěn)定必需3個多聚腺苷酸化，及多聚腺苷酸化缺陷可間接導致它們的mRNA的改變的表達，或，罕有功能效應的直接獲得，諸如在眼咽肌肉營養(yǎng)不良中；(7)知道的調控元件-Open REGulatory ANNOtation數(shù)據(jù)庫(ORegAnno)是用于展出來自科學文獻的知道的調控元件的數(shù)據(jù)庫；(8)在目標區(qū)(ROI)中作為幾種miRNA基因編碼的miRNA基因嵌入編碼蛋白的基因之內，且miRNA基因中的多態(tài)性相關于阿爾茨海默病和精神分裂癥；(9)ROI中編碼的小核仁RNA基因-編碼蛋白的基因中持有幾個snoRNA基因，且腦特異性snoRNA的改變已相關于某些疾病，例如，Prader-Willi綜合征；(10)在胎盤哺乳動物間超保守的元件-超保守的元件已在巨大的進化壓力下，以防止經(jīng)幾百萬年的任何序列切換，及像這樣的被認為攜帶關鍵的功能作用。例如，本發(fā)明的實施方式提供診斷受試者(例如，兒童或胎兒)中自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的方法。該方法可包括從來自受試者或，在胎兒的情況中，來自其母的組織或體液樣品獲得核酸。方法還可包括下列步驟測序核酸或測定基因組排列或核酸的拷貝數(shù)以檢測是否核酸序列或基因組排列或拷貝數(shù)中有變體。方法還可包括下列步驟評定核酸序列或基因組排列或拷貝數(shù)中的變體對于自閉癥譜系障礙的臨床意義。該分析可包括受影響的群體(即，患疾病的受試者)中變體序列的關聯(lián)程度的評估。該分析也可包括突變可對基因表達和/或蛋白功能具有的效應的程度的分析。方法也可包括基于此評定的結果診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險?？墒褂迷S多不同基因組分析技術以便進行本文教導的評定。例如，其他變體的靶再測序，全基因組測序，單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析，拷貝數(shù)，表觀遺傳比較，重排，缺失和鑒定/分析可用于進行本文教導的比較和鑒定。以下例示的旨在是例證性，且本領域技術人員明白可使用任何可利用的基因組分析技術以便達到本文所述的結果。根據(jù)本發(fā)明的分析用核酸可以任何臨床可接受的方式從人樣品，例如人組織或體液得到。核酸可從成年或兒童得到，或可為胚胎物質(例如，來自母源血清或羊水的胚胎染色體物質)?？山邮苋魏谓M織或體液源，包括來自組織或流體的細胞物質，諸如粘液，血，血漿,血清,血清衍生物,膽汁,血,母源血,痰,唾液,汗,羊水,乳腺流體,尿和腦脊液(CSF)。樣品也可為拭子或精細針抽吸或活檢的組織。樣品也可為含有細胞或生物材料的培養(yǎng)基。在受試者是胎兒的實施方式中，液體樣品可從羊水或母源血得到。核酸可測序和/或測定其基因組排列和/或拷貝數(shù)以便檢測相比源于在采樣時間不知道遭受自自閉癥譜系障礙的一或更多個體的參照序列的核酸中的變體(即，突變)。如·上所述，序列變體也可依經(jīng)驗獲得。核酸可包括源于多個遺傳元件的多個核酸。本領域知道檢測序列變體或基因組排列或拷貝數(shù)的方法，及序列變體或基因組排列或拷貝數(shù)可通過本領域中知道的任何測序方法，例如，總體測序或單分子測序，及通過本領域知道的檢測基因組排列或拷貝數(shù)的任何方法，例如，陣列比較性基因組雜交來檢測。進行測序的一種常規(guī)方法是通過鏈終止和凝膠分離，如描述于Sanger等人，1977, Proc Natl Acad Sci U S A，74 :5463_67。另一常規(guī)測序方法涉及核酸片段的化學降解。見，Maxam et al. , 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. ,74:560-564。最終，方法已基于通過雜交的測序開發(fā)。見，例如，Harris等人，美國專利申請公開No. 20090156412。將各這些參考文獻通過引用整體并入本文。在某些實施方式中，測序通過Sanger測序技術進行。典型Sanger測序涉及單鏈DNA模板，DNA引物，DNA聚合酶，放射性或熒光標記的核苷酸，及終止DNA鏈延伸的修飾的核苷酸。如果標記物未附接于雙脫氧核苷酸終止子(例如，標記的引物)，或是單色標記物(例如，放射性同位素)，則將DNA樣品分為4個獨立的測序反應，含有4種標準脫氧核苷酸(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)和DNA聚合酶。向各反應僅添加4種雙脫氧核苷酸(ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP)之一。這些雙脫氧核苷酸是鏈-終止核苷酸，在DNA鏈延伸期間2個核苷酸之間的磷酸二酯鍵的形成需要缺少3’ -OH基團。但是，如果各雙脫氧核苷酸攜帶不同標記物，(例如，4種不同熒光染料)，則無需獨立反應，全部測序反應可一起進行。將雙脫氧核苷酸并合到新生，S卩，延伸，DNA鏈終止DNA鏈延伸，產(chǎn)生一套不同長度的DNA片段。然后變性新合成的及標記的DNA片段，并使用在能在鏈長度上解析單-堿基差異的變性聚丙烯酰胺-脲凝膠上凝膠電泳來依尺寸分離。如果將各4個DNA合成反應用相同的，單色標記物(例如，放射性同位素)標記，則使它們在凝膠中的4個個體，相鄰泳道之一分離，其中凝膠中的各泳道根據(jù)相應反應中使用的雙脫氧核苷酸命名，即，凝膠泳道A，T，G，C。如果利用4種不同標記物，則可將反應并入凝膠上的單泳道。然后通過放射自顯影或熒光將DNA條帶可視化，及可從X-射線膠片或凝膠像直接讀DNA序列，或連續(xù)監(jiān)控作為反應產(chǎn)物的突光經(jīng)過凝膠中的特定點。
根據(jù)加入反應而產(chǎn)生條帶或其對應直接標記物的的雙脫氧核苷酸鑒定的末端核苷酸堿基。然后使用凝膠中不同條帶的相對位置來讀(從最短到最長)指示的DNA序列?？墒褂?DNA 測序儀,諸如可從 PerkinElmer, Beckman Coulter, Life Technologies,及其他商購的那些自動化Sanger測序過程。在其他實施方式中，核酸的測序通過單-分子或源于單分子的同一性非常大的分子組的大規(guī)模并行測序(也稱之為“下一代測序”)，通過由諸如PCR的方法的擴增來實現(xiàn)。大規(guī)模并行測序例如見于Lapidus等人,美國專利號7，169，560, Quake等人,美國專利號 6，818，395，Harris 美國專利號 7，282，337 和 Braslavsky,等人，PNAS (USA)，100 3960-3964 (2003)，將它們的內容通過弓I用整體并入本文。在下一代測序中，可對核酸進行PCR或全基因組擴增，以便獲得足夠的量的分析用核酸。在一些形式的下一代測序中，無需擴增，因為方法能從未擴增的DNA評價DNA序列。一旦測定，將來自測試樣品的序列和/或基因組排列和/或基因組核酸的拷貝數(shù)與源于在它們的取樣品時間不知道遭受自自閉癥譜系障礙的一或更多個體的標準參照比較。來自測試樣品和標準參照的核酸的序列和/或基因組排列和/或基因組排列和/或拷貝數(shù)之間的·全部差異被認為是變體。在下一代(大規(guī)模并行測序)中，將全部目標區(qū)一起測序，并將各序列讀取的起源通過與參照序列比較(比對)來測定。目標區(qū)可在一個反應中共富集，或它們可獨立地富集，然后在測序之前組合。在某些實施方式中，及如本文實施例中詳述，源于測定中包括的基因的編碼外顯子的DNA序列通過隨機片段化的基因組DNA與特定RNA探針的整體雜交來富集。將相同的適配體序列附接于全部片段的末端，允許通過用一個引物對在一個反應中PCR來全部雜交-捕獲的片段的富集。將通過雜交少有效捕獲的區(qū)通過PCR用特定引物擴增。此外，用特定引物的PCR可用于擴增類似序列(“假外顯子”)在基因組中的別處存在的外顯子。在使用大規(guī)模并行測序的某些實施方式中，將PCR產(chǎn)物連接而形成DNA的長延伸物，將其剪切為短片段(例如，通過聲能)。此步驟確保片段末端貫穿目標區(qū)分布。隨后，將dA核苷酸的延伸物加入各片段的3’端，其允許片段結合到被寡(dT)引物包被的平面表面(“流動池”)。然后各片段可通過用熒光-標記的核苷酸延伸寡(dT)引物來測序。各測序循環(huán)期間，僅添加一種類型的核苷酸(A，G，T或C)，且通過使用鏈終止核苷酸允許僅一個核苷酸合并。例如，在第I測序循環(huán)期間，可添加熒光標記的dCTP。此核苷酸會僅并入需要C作為下一核苷酸的那些生長互補DNA鏈。各測序循環(huán)之后，取流動池的像以確定哪個片段延伸。合并了 C的DNA鏈會發(fā)光，而未合并C的DNA鏈會呈現(xiàn)暗。逆轉鏈終止以使生長的DNA鏈可再次延伸，及重復過程總120個循環(huán)。將像轉變?yōu)閴A基串，通常稱之為“讀取”，其重現(xiàn)各片段的3’末端25 60個堿基。然后將讀取與分析DNA的參照序列比較。由于25個堿基的任何給定串一般在人基因組中僅出現(xiàn)一次，多數(shù)讀取可與人基因組中的一個特定位置“對齊”。最終，可從可利用的讀取建造各基因組區(qū)的共有序列，及與在該位置的參照確切的序列相比。共有序列和參照之間的任何差異稱之為序列變體。鑒定自閉癥標記物的方法在某些實施方式中，本發(fā)明包含用于鑒定自閉癥標記物的方法(即，以統(tǒng)計學地顯著方式與自閉癥關聯(lián)的核酸序列中的變體)。就新標記物檢定的基因和/或基因組區(qū)可基于它們在顯示與自閉癥的聯(lián)系和/或原因的生物化學通路中的重要性來選擇?；蛘?，就標記物檢定的基因和/或基因組區(qū)可基于和與豕族中自閉癥遺傳遺傳關聯(lián)的DNA區(qū)的遺傳關聯(lián)來選擇(例如,Abrahams和Geschwind, 2008)?；蛘?可系統(tǒng)評價就標記物檢定的基因和/或基因組區(qū)，以含蓋尚未評價的染色體的某些區(qū)。如本文所述，自閉癥譜系障礙通常表征為在全身性發(fā)育遲緩(TOD)名下的5種病癥之一。在PDD名下的5種病癥包括孤獨性障礙，Asperger氏病癥，童年瓦解性障礙(CDD)7Rett氏病癥和未另外特定的I3DD (TOD-NOS)。在某些情況中，自閉癥可為非-綜合征性的。以下表I提供可就新標記物評價以根據(jù)本發(fā)明的方法診斷自閉癥譜系障礙的一組基因或基因組區(qū)。
表I
~11 ~編碼的蛋白 ~EIF4E 真核翻譯起始因子4E
EBPl真核翻譯起始因子4E-結合蛋白I
EBP2真核翻譯起始因子4E-結合蛋白2
AKTlRAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶
ΑΚΤ2RAC-β絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶
ΑΚΤ3RAC- y絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶
PRKAAl 5’ -AMP-活化的蛋白激酶催化性亞基a -1 "^PP淀粉樣蛋白前體蛋白
ARC活性-調控的細胞骨架-關聯(lián)的
ARXAristaless相關的同源框
CACNA1C 辛丐通道，電壓-依賴性，L類型，a IC亞基 CAMK2G m /鈣調素-依賴性蛋白激酶II型Y鏈 CDKL5 細胞周期蛋白-依賴性激酶-樣5 METMNNG (N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基-胍)HOS轉化
CNTNAP2 接觸蛋白-關聯(lián)的蛋白-樣權利要求
1.診斷受試者中自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的方法，方法包含 從來自受試者的組織或體液樣品獲得核酸； 進行鑒定是否受試者的核酸中有變體序列，或多種變體序列的檢定； 對于檢測的各變體，測定是否變體是與自閉癥譜系障礙關聯(lián)的已知的變體或之前未描述的變體； 如果變體是之前未描述的變體，測定是否變體預期對至少基因表達和/或蛋白功能之一具有有害的效應；以及 基于檢測的變體序列或多種變體序列診斷自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險。
2.權利要求I的方法，其中測定至少包括核酸測序，雜交體捕獲及表觀遺傳分析之一。
3.權利要求I的方法，其中進行步驟中的核酸包含基因，外顯子，內含子，基因調控元件，表達的RNA，siRNA或表觀遺傳元件。
4.權利要求I的方法，其中核酸包含選自知道或懷疑相關于一種或更多自閉癥譜系障礙的序列的序列。
5.權利要求4的方法，其中核酸包含表I中基因之一的至少一部分。
6.權利要求I的方法，其中核酸源于編碼親代謝型谷氨酸受體信號轉導通路中的蛋白的基因。
7.權利要求I的方法,其中核酸包含至少下列之一的基因的至少一部分TSC1，TSC2,MECP2, SHANK3, GRMl, GRM5, ARC, EIF4E, HOMERl, HRAS, ΜΑΡ2Κ1, ΜΑΡ2Κ2, RAFl, PIK3CA,PIK3R1, FMRl，ΡΤΕΝ, RHEB 或 UBE3A。
8.權利要求I的方法,其中核酸包含至少下列之一的基因的至少一部分TSC1，TSC2,SHANK3 或 HOMERl。
9.權利要求2的方法，其中測序包含至少隨合成單分子測序或大規(guī)模并行測序之一。
10.權利要求2的方法，其中分析庫中的多個DNA樣品以鑒定顯示變異的樣品。
11.權利要求10的方法，其中分析多個庫中的多個DNA樣品以鑒定在至少2庫中顯示相同的變異的個體樣品。
12.權利要求I的方法，其中自閉癥譜系障礙包含至少下列之一非-綜合征性自閉癥，典型自閉癥，Asperger氏綜合征，Rett氏綜合征,童年瓦解性障礙,或不另外特定的全身性發(fā)育遲緩(PDD-NOS)。
13.權利要求I的方法，其中自閉癥譜系障礙包含非-綜合征性自閉癥。
14.權利要求I的方法，還包括診斷與自閉癥關聯(lián)的遺傳綜合征的存在，或增加的發(fā)展與自閉癥關聯(lián)的遺傳綜合征的風險，其中遺傳綜合征包含顯性表型。
15.權利要求14的方法，其中遺傳綜合征包含至少下列之一Angelman綜合征，Prader-Willi綜合征，15qll_ql3重復，脆性X綜合征，脆性X前突變，染色體2q缺失，XYY綜合征，Smith-Lemli-Opitz綜合征，Apert綜合征，ARX基因中的突變，De Lange綜合征，Smith-Magenis綜合征，Williams綜合征，Noonan綜合征，Down綜合征，軟腭-心-面部綜合征，肌強直營養(yǎng)不良，Steinert病，結節(jié)性硬化，Duchenne氏病,蒂莫西綜合征，IOp末端缺失，Cowden綜合征,45, X/46, XY鑲嵌現(xiàn)象，Myhre綜合征，Sotos綜合征，Cohen綜合征，Goldenhar綜合征，Joubert綜合征，Lujan-Fryns綜合征，Moebius綜合征,伊藤黑色素過少癥，I型神經(jīng)纖維瘤病，CHARGE綜合征或HEADD綜合征。
16.權利要求I的方法，其中受試者是兒童。
17.權利要求I的方法，其中受試者是胎兒。
18.權利要求I的方法，其中體液包含至少下列之一腦脊液，血，羊水，母源血，及尿。
19.權利要求I的方法，其中變體包含至少表2中的變體之一。
20.權利要求I的方法，其中變體包含至少下列突變之一H0MER1 c. 195G > T，M65I ；HOMER I c. 290C>T,S97L ；H0MER I c. 425C > T，P142L ;GRM5 c. 3503T > C, L1168P ；MAPK2c. 581-1G > T ；HRASc. 383G > A, R128Q ；MECP2 c. 1477G > Τ, E483X。
21.鑒定與自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險關聯(lián)的突變的方法，所述方法包括 鑒定待評價為具有如果突變可為或相關于自閉癥發(fā)展的序列的核酸； 從來自患自閉癥譜系障礙的受試者的組織或體液樣品獲得核酸樣品；以及 進行檢定以鑒定是否相比未患自閉癥譜系障礙的個體中的核酸序列，患自閉癥的受試者中的核酸序列中有突變，其中患自閉癥譜系障礙的受試者中突變的存在指示突變可相關于自閉癥譜系障礙的發(fā)展。
22.權利要求21的方法，其中突變是之前已與自閉癥譜系障礙的發(fā)展關聯(lián)的變體。
23.權利要求21的方法，其中突變是之前未描述的變體。
24.權利要求21的方法，還包括測定是否突變預期對至少基因表達和/或蛋白功能之一具有有害的效應。
25.權利要求21的方法，其中評價突變的存在或缺失的核酸序列是編碼親代謝型谷氨酸受體信號轉導通路中的蛋白的基因的至少一部分。
26.權利要求21的方法，其中自閉癥譜系障礙是非-綜合征性自閉癥。
27.分離的核酸，其包含來自至少下列基因之一的變體序列TSC1，TSC2，MECP2，SHANK3，GRMl，GRM5，ARC，EIF4E,HOMERl，HRAS，MAP2K1，MAP2K2,RAFl，PIK3CA,PIK3R1，F(xiàn)MRl，PTEN, RHEB或UBE3A，其中序列包含指示自閉癥譜系障礙的變體。
28.權利要求27的分離的核酸，包含表2中描述的變體序列。
29.權利要求27的分離的核酸，包含至少下列變體之一H0MER1 c. 195G > T，M65I ；HOMER I c. 290C>T,S97L ；H0MER I c. 425C > T，P142L ;GRM5 c. 3503Τ > C, L1168P ；ΜΑΡΚ2c.581-1G > T ；HRASc. 383G > A, R128Q ；MECP2 c.1477G > Τ, E483X。
全文摘要
本發(fā)明總的涉及用于診斷自閉癥譜系障礙的組合物和方法。在某些實施方式中，本發(fā)明提供診斷受試者中自閉癥譜系障礙的存在或增加的發(fā)展自閉癥譜系障礙的風險的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102918163SQ201080046441
公開日2013年2月6日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權日2009年9月8日
發(fā)明者D·M·馬古利斯, M·F·貝爾 申請人:美國控股實驗室公司